KR100978705B1

KR100978705B1 - 폐암 치료

Info

Publication number: KR100978705B1
Application number: KR1020047014610A
Authority: KR
Inventors: 도시히로 노구찌; 아께미 바바
Original assignee: 다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2002-03-18
Filing date: 2003-03-17
Publication date: 2010-08-30
Also published as: AU2003221036A1; EP1488795A4; CN1652800A; JPWO2003077932A1; CN100400046C; ES2381408T3; KR20040097178A; US20050119196A1; EP1488795A1; ATE545423T1; EP1488795B1; US7091189B2; WO2003077932A1; JP4786871B2; DK1488795T3; CN101185652A; CN101185652B; JP2011168621A

Abstract

본 발명은 암루비신 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 다른 폐암 치료제 (이리노테칸, 비노렐빈, 겜시타빈 등)과 병용함으로써 폐암에 대한 항종양 효과를 향상시킴과 동시에 부작용을 감소시킨 치료제를 제공한다. 상기 치료제에 의해 폐암을 유효하게 치료할 수가 있다.

암루비신, 폐암 치료제, 이리노테칸, 비노렐빈, 겜시타빈

Description

폐암 치료 {Remedies for Lung Cancer}

본 발명은 다른 폐암 치료제와 병용하여 폐암을 치료하기 위한 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 유효 성분으로 하는 치료제에 관한 것이다.

암루비신((+)-(7S,9S)-9-아세틸-9-아미노-7-[(2-디옥시-β-D-에리트로-펜트피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,11-디히드록시-5,12-나프타센디온)은 하기 화학 구조식으로 나타내는 안트라사이클린계 화합물이다(일본 특허 공고 평 3-5397호, US 4673668).

<화학식>

암루비신은 생체 내에서 쉽게 환원되어 13 위치 수산화체인 대사체 (암루비시놀)가 생성되지만 이 암루비시놀은 암루비신보다 종양 세포 증식 억제 작용이 상당히 강하다. 이 밖의 안트라사이클린계 화합물인 독소루비신이나 다우노마이신으로도 환원 대사체가 생성되지만 반대로 활성은 감소한다(Cancer Chemother. Pharmacol., 30, 51-57 (1992)). 암루비신은 심독성에 대해서도 토끼 만성 실험 모델에 있어서 독소루비신보다도 훨씬 약하다(Invest. New Drug, 15, 219-225 (1997)).

안트라사이클린계 화합물은 유사한 구조를 갖고 있지만, 이하와 같이 그 적응증이나 작용 기전 등이 다르다고 알려져 있다. 다우노루비신 및 이다루비신은 백혈병에 대한 효능을 갖지만 고형암에 대한 효능을 갖지 않는다. 한편, 독소루비신, 에피루비신, 피라루비신 및 아크라루비신은 고형암에 대한 효능을 갖고 있다. 다우노루비신 및 독소루비신은 DNA 합성과 RNA 합성을 동일한 정도로 저해하지만 아크라루비신 및 마르셀로마이신은 DNA 합성보다 RNA 합성을 더 강하게 저해하고, 항종양 효과의 발현 기전이 전혀 다르다 (JJSHP, 27, 1087-1110(1991)). 이와 같이, 암의 종류에 따라서 동일 안트라사이클린계 약제라도 유효성이 다르고, 또한 동일 항암제라도 암의 종류에 따라서 유효성이 다르다고 알려져 있다. 따라서 어떤 특정한 종양(암)에 대해서 특정한 항암제가 유효한지 아닌지는 구체적으로 실험으로 확인할 필요가 있다.

암루비신에 대해서는 인간 T세포 백혈병 MOLT-3 세포주와 인간 골육종 MG-63 세포주에 대하여 염산 암루비신과 시스프라틴 등의 병용에 의해 상가적인 효과를 나타내는 것이 보고되어 있다 (Investigational New Drugs, 14, 357-363 (1996)). 또한, 마우스 백혈병 P388 세포주를 사용한 실험에 의해 암루비신과 시스프라틴의 생체 내의 계에서의 병용 효과도 보고되어 있다 (야나기 요시가즈 등, 암학회 요지집, 강연 No. 2168 (1989)). 그러나 암루비신과 다른 폐암 치료제와의 병용에 의 한 폐암의 치료 및 그의 부작용에 대해서는 아무것도 알려져 있지 않다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 폐암에 대한 항종양 치료제 효과를 향상시키고, 부작용을 저감시킨 치료제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 예의 검토한 결과, 암루비신과 다른 폐암 치료제를 병용하면 각 약제의 단제에서의 부작용의 증가 없이 폐암을 현저히 치료할 수 있고, 또한 암루비신과 다른 폐암 치료제의 병용에서, 치료 효과를 유지하면서 각각의 투여량을 감한 경우는, 부작용이 극적으로 감소될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 암루비신을 활성 대사체의 암루비시놀으로 변환시키는 카르보닐환원효소 1 유전자가 폐 정상 세포 및 백혈병 세포에서보다도 소세포 폐암, 폐선암, 폐편평 상피암, 폐대세포암 등의 폐암 세포에서 발현량이 더 많으며, 따라서 폐암 세포에서는 폐정상 세포나 백혈병 세포에서보다도 선택적으로 암루비신이 암루비시놀로 변환되어 작용을 보이고, 따라서 부작용이 감소된다는 것을 발견하였다.

이상의 지견에 의하여 본 발명은 완성되었다. 즉, 본 발명은 하기와 같다.

[1] 다른 폐암 치료제와 병용하여 폐암을 치료하기 위한 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 유효 성분으로 하는 치료제.

[2] [1]에 있어서, 폐암이 소세포 폐암, 폐선암, 폐편평상피암 또는 폐대세포암인 치료제.

[3] [1]에 있어서, 폐암이 소세포 폐암 또는 폐편평상피암인 폐암 치료제.

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되 는 염이 염산 암루비신인 치료제.

[5] [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 있어서, 다른 폐암 치료제가 이리노테칸, 노기테칸, 비노렐빈, 빈크리스틴, 겜시타빈, 5-FU, 파크리탁셀, 도세탁셀 또는 ZD 1839인 치료제.

[6] [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 있어서, 다른 폐암 치료제가 이리노테칸, 비노렐빈, 겜시타빈, 파크리탁셀, 도세탁셀 또는 ZD 1839인 치료제.

[7] [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 있어서, 다른 폐암 치료제의 투여와 동시에, 분리하여, 또는 계속하여 투여되는 치료제.

[8] [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 있어서, 다른 폐암 치료제를 투여하거나, 또는 투여 예정인 폐암 환자를 위한 폐암 치료제.

[9] [1] 내지 [8] 중 어느 한 항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 약 60 내지 약 150 mg/m²1회 또는 2 내지 5 회로 나누어 투여되도록 포장된 치료제.

[10] [9]에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 약 80 내지 약 130 mg/m²1회 투여되도록 포장되어 있는 치료제.

[11] [9]에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 약 110 내지 약 13O mg/m²1회 투여되도록 포장되어 있는 치료제.

[12] [9]에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 1 일 1 회 약 25 내지 약 50 mg/m²을 3 일간 투여되도록 포장되어 있는 치료제.

[13] [9]에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 1 일 1 회 약 30 내지 약 45 mg/m²을 3 일간 투여되도록 포장된 치료제.

[14] [9]에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 1 일 1 회 약 35 내지 약 45 mg/m²를 3 일간 투여되도록 포장된 치료제.

[15] [12] 내지 [14] 중 어느 한 항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 3 일간 연일 투여되는 치료제.

[16] [1] 내지 [15] 중 어느 한 항에 있어서, 다른 폐암 치료제가 그 최대 내량의 약 0.4 배 내지 약 1.0 배의 양, 또는 그 최고 투여량의 약 0.4 배 내지 약 1.0 배의 양으로 병용되기 위한 치료제.

[17] [1] 내지 [16] 중 어느 한 항에 있어서, 부작용에 의해서 다른 폐암 치료제에 의한 치료를 계속할 수 없는 폐암 환자로서, 부작용이 경감되는 양의 상기 다른 폐암 치료제의 투여를 받고 있는 환자를 위한 치료제.

[18] 다른 폐암 치료제와 병용하여 폐암을 치료하기 위한 치료제의 제조를 위한 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염의 용도.

[19] 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염 및 다른 폐암 치료제를 투여함에 의한 폐암의 치료 방법.

본 발명의 폐암 치료제는 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 유효 성분으로 하는 폐암 치료제로서 다른 폐암 치료제와 병용된다.

암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염은, 예를 들면 문헌[J. 0rg. Chem., 52, 4477-4485 (1987)]에 따라서 제조할 수 있다. 암루비신의 약학상 허용되는 염으로서는 산 부가염 및 염기 부가염을 들 수 있다. 산부가염으로서는, 예를 들면 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 요오드화 수소산염, 질산염, 인산염 등의 무기산염; 시트르산염, 옥살산염, 아세트산염, 포름산염, 프로피온산염, 벤조산염, 트리플루오로아세트산염, 푸마르산염, 말레산염, 타르타르산염, 아스파라긴산염, 글루타민산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 캄포르술폰산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 염기 부가염으로서는, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염 등의 무기염기염; 트리에틸암모늄염, 트리에탄올암모늄염, 피리디늄염, 디이소프로필암모늄염 등의 유기 염기염 등을 들 수 있다. 바람직한 약학상 허용되는 염으로서 염산염 등을 들 수 있다.

암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염의 최대 내량은 염산 암루비신으로 말하면 마우스의 경우 25 mg/kg (75 mg/m²)이고, 인간의 경우 1 일 1 회의 단회 투여로 13O mg/m², 3 일 연일 투여로서는 1 일당 50 mg/m²이다.

다른 폐암 치료제는 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염 이외의 임의의 폐암 치료제일 수 있고, 예를 들면 DNA 토포이소머라제 I 저해제 (이리노테칸, 노기테칸 등), 튜블린 중합 저해제 (비노렐빈, 빈크리스틴 등), 대사 길항제 (겜시타빈, 5-FU 등), 튜블린 탈중합 저해제 (파크리탁셀, 도세탁셀 등) 및 티로신키나제 저해제 (ZD 1839 등) 등을 들 수 있다.

바람직한 다른 폐암 치료제는 예를 들면 이하의 화합물 등을 들 수 있다.

이리노테칸 (Irinotecan):

일본 특허 공개 소 60-19790, US 4604463, J. Clin. 0ncol., 11, 909 (1993)

노기테칸 (Nogitecan):

EP 0 321 122 B1

비노렐빈 (Vinorelbine):

일본 특허 공개 소 55-31O96, US 4307100, Cancer Letters, 27, 285 (1985)

빈크리스틴 (vincristine)

겜시타빈 (Gemcitabine):

US 4808614, Cancer Treat. Rev., 19, 45-55 (1993)

5-FU (5-Fluorourasil)

파크리탁셀 (paclitaxel):

J. Am. Chem. Soc., 93, 2325-2327 (1971)

도세탁셀 (docetaxel):

J. Natl. Cancer Inst., 83, 288-291 (1991)

ZD 1839(4-(3-클로로-4-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린; 일반명 게피티니브; 상품명 이렛사):

Drugs 2000: 60 Suppl. 1, 33-40

이리노테칸의 마우스에서의 최대 내량은 120 mg/kg, 인간에서의 최고 투여량 은 예를 들면 1 주간 간격 투여로는 150 mg/m², 3 주간 간격 투여로는 350 mg/m²이다. 비노렐빈의 마우스에서의 최대 내량은 16 mg/kg, 인간에서의 최고 투여량은 25 mg/m²이다. 겜시타빈의 마우스에서의 최대 내량은 3OO mg/kg/dose, 인간에서의 최고 투여량은 10OO mg/m²이다. 파크리탁셀의 마우스에서의 최대 내량은 12.5 mg/kg/dose, 인간에서의 최고 투여량은 21O mg/m²이다. 도세탁셀의 마우스에서의 최대 내량은 3O mg/kg/dose, 인간에서의 최고 투여량은 70 mg/m²이다. ZD 1839의 마우스에서의 최대 내량은 200 mg/kg, 인간에서의 최대 내량은 700 mg/일 인간에서의 최고 투여량은 500 mg/일 정도이다.

폐암은 예를 들면 소세포 폐암, 폐선암, 폐편평상피암, 폐대세포암, 카시노이드(carcinoid), 선양낭포암, 점표피암, 악성 혼합 종양 등을 들 수 있다. 이 중에서 본 발명의 폐암 치료제가 바람직한 효과를 나타내는 것의 예로서 소세포 폐암, 폐선암, 폐편평상피암, 폐대세포암 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 소세포 폐암 및 폐편평상피암을 들 수 있다.

마우스를 사용한 실시예 1 내지 3의 결과로부터 하기의 것이 발견되었다.

(1) 염산 암루비신 최대 내량의 0.5 배량 (12.5 mg/kg), 및 다른 폐암 치료제의 최대 내량의 0.5 배량을 병용한 경우, 각각의 단제의 최대 내량 투여군과 비교하여 동일한 정도의 항암 효과가 있고, 한편 이들의 부작용은 상당히 감소하였다.

(2) 염산 암루비신 최대 내량의 0.8 또는 1.0 배량 (20 또는 25 mg/kg), 및 다른 폐암 치료제의 최대 내량의 0.8 또는 1.0 배량을 병용한 경우 각각의 단제의 최대 내량 투여군과 비교하여 강력한 항암 효과가 있었고, 한편, 이들의 부작용은 증가 없이 동일한 정도이었다.

이와 같이, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염의 최대 내량의 약 0.5 내지 약 1 배량 및 다른 폐암 치료제의 최대 내량 (또는 최고 투여량)의 약 0.5 내지 약 1 배량을 병용함에 의해서, 이 폐암 치료제 및 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염의 부작용이 증가하지 않거나, 때로는 부작용이 감소되어, 안전하고 충분한 항암 효과를 얻을 수 있다. 예를 들면 상기 폐암 치료제 또는 암루비신의 부작용이 문제가 되는 경우는, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염의 최대 내량의 약 0.5 내지 약 1 배량 및 다른 폐암 치료제의 최대 내량 (또는 최고 투여량)의 약 0.5 내지 약 1 배량의 범위 중에서 보다 낮은 투여량을 사용할 수 있고, 한편, 다른 폐암 치료제 또는 암루비신의 부작용이 문제가 되지 않는 경우는 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염의 최대 내량의 약 0.5 내지 약 1 배량 및 다른 폐암 치료제의 최대 내량 (또는 최고 투여량)의 약 0.5 내지 약 1 배량의 범위 중에서 보다 높은 투여량을 이용하여 최대의 항암 효과를 안전하게 얻을 수 있다.

인간의 폐암의 치료에서, 환자의 상태, 연령, 체중 등에 따라 적절하게 변경되지만 예를 들면 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 약 6O 내지 약 15O mg/m² 및 다른 폐암 치료제를 그 최대 내량 (또는 최고 투여량)의 0.4 배 내지 1.0 배의 양으로 병용할 수가 있다. 상기 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염은 예를 들면 약 60 내지 약 150 mg/m²을 1회 또는 2 내지 5회로 나누어 투여할 수가 있다. 바람직한 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염의 투여 스케줄은 예를 들면 1회 투여, 1 일 1 회 3 일간 투여 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 1일 1회 3일간 연일 투여를 들 수 있다. 단회 투여를 할 때의 투여량은 예를 들면 약 80 내지 약 13O mg/m²의 범위를 들 수 있고, 바람직하게는 약 110 내지 약 130 mg/m²의 범위를 들 수 있고, 특히 바람직하게는 약 120 mg/m² 등을 들 수 있다. 3 일간 연일 투여를 할 때의 1일 당의 투여량은, 예를 들면 약 25 내지 약 5O mg/m²의 범위를 들 수 있고, 바람직하게는 약 30 내지 약 45 mg/m²의 범위를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 약 35 내지 약 45 mg/m²의 범위를 들 수 있고, 특히 바람직하게는 약 40 mg/m², 약 45 mg/m² 등을 들 수 있다.

병용되는 다른 폐암 치료제의 투여량은 예를 들면 단회 투여로 그 최대 내량 또는 최고 투여량의 약 0.4 배 내지 약 1.0 배의 범위를 들 수 있고, 바람직하게는 단회 투여로 그 최대 내량 또는 최고 투여량의 약 0.5 배 내지 약 0.9 배의 양을 들 수 있다. 예를 들면, 이리노테칸으로서는 약 75 내지 약 135 mg/m²가, 비노렐빈으로서는 약 12.5 내지 약 22.5 mg/m²이, 겜시타빈으로서는 약 50O 내지 약 9OO mg/m²이, 파크리탁셀로서는 약 105 내지 약 190 mg/m²이, 도세탁셀로서는 약 35 내지 약 63 mg/m²이, ZD 1839로서는 약 350 내지 약 630 mg/일 정도를 들 수 있다. ZD 1839로서는 최고 투여량보다 상당히 낮은 투여량으로도 효과를 나타낸다는 것이 알려져 있기 때문에 약 125 내지 약 630 mg/일 정도로 병용 효과를 나타낼 수 있다. 또한 이들 다른 폐암 치료제는 수회로 나누어 1 일 또는 수일 동안 투여할 수 있다.

다른 폐암 치료제에 의한 치료 중인 환자로, 그 폐암 치료제의 부작용 등 때문에 치료를 계속할 수 없다고 판단된 경우는 그 부작용이 경감되는 투여량의 해당 폐암 치료제를 투여하고, 또한 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 투여함으로써 해당 폐암 치료제의 부작용을 감소시켜 치료를 속행할 수가 있다. 그 부작용이 경감되는 양의 해당 폐암 치료제로서는 예를 들면 그 최대 내량 (또는 최고투여량)의 약 0.4 배 내지 약 0.8 배의 양을 들 수 있고, 바람직하게는 그 최대 내량 (또는 최고 투여량)의 약 0.4 배 내지 약 0.6 배의 양을 들 수 있다.

본 발명의 폐암 치료제에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염은 다른 폐암 치료제의 투여와 동시에, 분리하여, 또는 계속하여 투여된다. 분리하여 또는 계속하여 투여되는 경우는, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 다른 폐암 치료제보다 먼저 투여할 수도, 후에 투여할 수도 있다. 그 때의 양 투여의 간격은, 적절하게 정할 수 있지만 예를 들면 1 내지 수 시간, 십 내지 수십 시간, 1 내지 수일, 1 주간 등으로 할 수 있다. 예를 들면, 암루비신 또는 그 약학상 허용 되는 염과, 다른 폐암 치료제를 동일한 날에 투여하는 것이 환자의 통원 등의 시간을 생각하면 바람직하다.

본 발명의 폐암 치료제는 환자의 증상, 연령, 체중, 투여 형태, 병용되는 다른 폐암 치료제의 투여량, 투여 횟수 등에 따라서 적절하게 변화되지만 상기 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염 및 다른 폐암 치료제의 투여 후 양 투여를, 약 7 일간 내지 약 60 일의 간격을 두고 반복하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 약 2 주간 내지 약 4 주간 마다, 더욱 바람직하게는 약 3 주간 마다 반복하는 것이 좋다.

암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염은 통상적으로 비경구적 (예를 들면 정맥 내, 동맥 내, 피하, 근육 내 주사, 방광 내, 복강 내, 흉강 내, 국소적, 경직장적, 경피적, 경비적 등)으로 투여할 수가 있다. 바람직하게는, 정맥 내 투여를 들 수 있다. 또한 경구 투여에 이용할 수 있고, 경구 투여를 위한 형태로서는 예를 들면 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 산제, 액제, 시럽제 또는 현탁제 등을 들 수 있다.

다른 폐암 치료제는 통상적으로 비경구적 (예를 들면, 정맥 내, 동맥 내, 피하, 근육 내 주사, 방광 내, 복강 내, 흉강 내, 국소적, 경직장적,경피적, 경비적 등)으로 투여할 수가 있다. 바람직하게는 정맥 내 투여를 들 수 있다. 또, 경구 투여할 수 있고, 경구 투여를 위한 형태로서는 예를 들면 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 산제, 액제, 시럽제 또는 현탁제 등을 들 수 있다.

본 발명의 폐암 치료제에 있어서는, 또 다른 폐암 치료제, 방사선 요법, 외과적 수단 등을 조합할 수도 있다. 또한, (a) 유효 성분으로서 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 포함하는 제1의 조성물, 및 (b) 유효 성분으로서 다른 폐암 치료제를 포함하는 제2의 조성물을 포함하는 폐암 병용 치료를 위한 키트로 할 수도 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

염산 암루비신 및 이리노테칸의 병용에 의한 항종양효과

6 주령의 누드 마우스 (59 마리)에 인간 소세포 폐암 LX-1 세포주를 피하 이식하였다. 종양 이식 11 일 후에 종양 용적이 약 100 내지 300 mm³가 된 36 마리를 1 군 6 마리씩 6개의 군으로 나누었다. 그 날, 「비히클군」에는 시스테인 완충액을, 「염산 암루비신 단독 투여군」에는 염산 암루비신 최대 내량 (25 mg/kg)을, 「이리노테칸 단독 투여군」에는 이리노테칸 최대 내량 (120 mg/kg)을, 「병용군 (0.5×MTD)」에는 염산 암루비신 최대 내량의 0.5 배량 및 이리노테칸 최대 내량의 0.5 배량을 「병용군 (0.8×MTD)」에는 염산 암루비신 최대 내량의 O.8 배량 및 이리노테칸 최대 내량의 0.8 배량을, 「병용군 (1×MTD)」에는 염산 암루비신 최대 내량 및 이리노테칸 최대 내량을 각각 정맥 내 투여하였다. 그 후, 23 일간 마우스의 종양 용적과 체중을 측정하였다.

염산 암루비신은 시스테인 완충액 (0.4 mg/mL의 L-시스테인 염산염 1 수화물, 6.25 mg/mL의 젖당을 포함한다)에 의해 2.5 mg/mL가 되도록 용해하고, 또한 이것을 시스테인 완충액으로 희석하여 2.0 및 1.25 mg/mL의 용액을 제조하고, 각각 10 mL/kg의 액량을 투여하여 염산 암루비신 최대 내량, 그의 0.8 배량 및 그의 0.5 배량으로 투여하였다.

이리노테칸은 (주)다이이찌 세이야꾸로부터 구입한 토포테신 주사(20 mg/mL 함유)를 120, 96 및 60 mg/kg의 액량으로 투여함에 의해 이리노테칸 최대 내량, 그의 0.8 배량 및 그의 0.5 배량으로 투여하였다.

도 1 및 도 2에, 병용군 (0.5×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를, 각각 염산 암루비신 단독 투여군과 이리노테칸 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

도 3 및 도 4에, 병용군 (0.8×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를, 각각 염산 암루비신 단독 투여군과 이리노테칸 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

도 5 및 도 6에, 병용군 (1×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를, 각각 염산암루비신 단독 투여군과 이리노테칸 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

표 1에, 각 군의 종양 증식률의 최소 T/C％ 값을 나타낸다. 최소 T/C％ 값은 이하와 같이 계산하였다.

최소 T/C％치: 비히클 투여군의 종양 증식률^*)에 대한 각각의 투여군의 종양증식률^*)의 비율(％)의 측정 기간 중의 최저치.

*) 종양 증식률: 약제 투여 시점의 종양 용적의 1 군 6 마리의 평균치에 대 한 각 측정 시점의 종양 용적의 1 군 6 마리의 평균치의 비율.

투여	최소 T/C(%) 평균 ±SD
염산 암루비신 25 mg/kg	40.79 ±5.92
이리노테칸 120 mg/kg	45.61 ±12.94
염산 암루비신 25mg/kg + 이리노테칸 120mg/kg	24.24 ±5.48
염산 암루비신 20mg/kg + 이리노테칸 96 mg/kg	28.17 ±3.85
염산 암루비신 12.5mg/kg + 이리노테칸 60 mg/kg	45.05 ±4.74

1. 병용군 (0.5×MTD)의 결과

도 1에 나타낸 바와 같이, 병용 투여의 항종양 효과는 각각의 단제의 최대 내량 투여군과 비교하여 동일한 정도의 효과이었다. 즉, 최소 T/C％ 값은 염산 암루비신 단독 투여군으로서는 40.79 ％, 이리노테칸 단독 투여군으로서는 45.61 ％ 이지만, 병용군 (0.5×MTD)의 경우는 45.05 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면 도 2에서 나타낸 바와 같이, 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여, 이리노테칸 단제 투여군과 동일한 정도이었다.

2. 병용군 (0.8×MTD)의 결과

도 3에 나타낸 바와 같이, 종양의 감소가 보이고, 병용 투여의 항종양 효과는 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여, 강한 항종양 효과를 나타내었다. 즉, 최소 T/C％치는 염산 암루비신 단독 투여군은 40.79 ％, 이리노테칸 단독 투여군은 45.61 ％이지만, 병용군 (0.8×MTD)의 경우는 28.17 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 염산암 루비신 단독 투여군과 동일한 정도이었다.

3. 병용군 (1×MTD)의 결과

도 5에 나타낸 바와 같이, 0.8 배량의 경우와 같이 종양의 감소가 보이고, 병용 투여의 항종양 효과는, 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여 강한 항종양 효과를 나타냈다. 즉, 최소 T/C％ 값은 염산 암루비신 단독 투여군은 40.79 ％, 이리노테칸 단독 투여군은 45.61 ％이지만, 병용군 (1×MTD)의 경우는 24.24 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면, 도 6에서 나타낸 바와 같이, 일시적으로 3 g 정도의 체중 감소가 보이지만 회복하였다.

<실시예 2>

염산 암루비신과 비노렐빈과의 병용에 의한 항종양 효과

실시예 1과 동일하게 하여, 염산암루비신과 비노렐빈과의 병용에 의한 항종양 효과를 시험하였다. 다만, 인간 소세포 폐암 LX-1 세포주 대신에 인간 폐편평 상피암 QG-56 세포주를 사용하여 비노렐빈의 최대 내량을 16 mg/kg으로 하였다. 비노렐빈은 (주)교와 핫꼬 고교로부터 구입한 나베르빈 주사(10 mg/mL 함유)를 16, 12.8 및 8 mL/kg의 액량으로 투여함으로써 비노렐빈 최대 내량, 그의 O.8배량, 및 그의 0.5 배량으로 투여하였다. 또한 5주령의 누드 마우스 (100 마리)를 사용하였다.

도 7 및 도 8에 병용군 (0.5×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를 각각 염산 암루비신 단독 투여군과 비노렐빈 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

도 9 및 도 10에, 병용군 (0.8×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를 각각 염산암루비신 단독 투여군과 비노렐빈 단독 투여군의 데이터와 함께 나타낸다.

도 11 및 도 12에, 병용군 (1×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를 각각 염산 암루비신 단독 투여군과 비노렐빈 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

표 2에, 각 군의 종양 증식률의 최소 T/C％치를 나타내었다.

투여	최소 T/C(%) 평균 ±SD
염산 암루비신 25 mg/kg	37.73 ±7.56
비노렐빈 16 mg/kg	38.24 ±12.87
염산 암루비신 25mg/kg + 비노렐빈 16 mg/kg	27.15 ±8.14
염산 암루비신 20mg/kg + 비노렐빈 12.8 mg/kg	31.10 ±13.48
염산 암루비신 12.5mg/kg + 비노렐빈 8 mg/kg	42.43 ±20.08

1. 병용군 (0.5×MTD)의 결과

도 7에 나타낸 바와 같이, 병용 투여의 항종양 효과는 각각 단제의 최대 내량 투여군과 비교하여 동일한 정도의 효과이었다. 즉, 최소 T/C％치는 염산 암루비신 단독 투여군은 37.73 ％, 비노렐빈 단독 투여군은 38.24 ％이지만, 병용군 (0.5×MTD)의 경우는 42.43 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면, 도 8에서 나타낸 바와 같이, 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여, 체중 감소는 거의 없고 부작용의 증강은 보이지 않았다.

2. 병용군 (0.8×MTD)의 결과

도 9에 나타낸 바와 같이, 종양의 감소가 보이고, 병용 투여의 항종양 효과는 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여, 강한 항종양 효과를 나타내었다. 즉, 최소 T/C％치는 염산 암루비신 단독 투여군은 37.73 ％, 비노렐빈 단독 투여군은 38.24 ％이지만, 병용군 (0.8×MTD)의 경우는 31.10 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 양 단독 투여군과 동일한 정도이었다.

3. 병용군 (1×MTD)의 결과

도 11에 나타낸 바와 같이, 0.8 배량의 경우와 동일하게 종양의 감소가 보이고, 병용 투여의 항종양 효과는 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여, 강한 항종양 효과를 나타내었다. 즉, 최소 T/C％치는 염산 암루비신 단독 투여군은 37.73 ％, 비노렐빈 단독 투여군은 38.24 ％이지만, 병용군 (1×MTD)의 경우는 27.15 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면, 도 12에 나타낸 바와 같이, 일시적으로 1.4 g 정도의 체중 감소가 보이지만 회복되었다.

<실시예 3>

염산 암루비신 및 겜시타빈의 병용에 의한 항종양효과

실시예 2와 동일하게 하여 염산 암루비신과 겜시타빈의 병용에 의한 항종양 효과를 시험하였다. 단, 겜시타빈의 최대 내량을 300 mg/kg/일로 하고, 1 주간에 1 회 복강내 투여를 2 사이클 투여하였다. 겜시타빈은 (주)닛본 일라이 릴리로부터 구입한 젬자루 주사(200 mg/바이알 함유)를 300, 240 및 150 mL/kg의 액량으로 투여하는 것으로, 겜시타빈 최대 내량, 그의 0.8 배량 및 그의 0.5 배량으로 투여하였다. 또한, 5 주령의 누드 마우스 (80 마리)를 사용하였다.

도 13 및 도 14에, 병용군 (0.5×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를, 각각 염산 암루비신 단독 투여군과 겜시타빈 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

도 15 및 도 16에, 병용군 (0.8×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를, 각각 염산 암루비신 단독 투여군과 겜시타빈 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

도 17 및 도 18에, 병용군 (1×MTD)의 종양 용적과 체중의 변화를, 각각 염산 암루비신 단독 투여군과 겜시타빈 단독 투여군의 데이터와 함께 나타내었다.

표 3에, 각 군의 종양 증식률의 최소 T/C％치를 나타내었다.

투여	최소 T/C (%) 평균 ±SD
염산 암루비신 25 mg/kg	51.06 ±16.56
겜시타빈 300 mg/kg i.p. 2q7d	69.47 ±26.06
염산 암루비신 25 mg/kg + 겜시타빈 300 mg/kg	41.33 ±15.12
염산 암루비신 20 mg/kg + 겜시타빈 240 mg/kg	34.27 ±14.05
염산 암루비신 12.5 mg/kg + 겜시타빈 150 mg/kg	56.67 ±18.87

1. 병용군 (O.5×MTD)의 결과

도 13에 나타낸 바와 같이, 병용 투여의 항종양 효과는 각각의 단제의 최대 내량 투여군과 비교하여 동일한 정도의 효과이었다. 즉, 최소 T/C％치는 염산 암루비신 단독 투여군은 51.06 ％, 겜시타빈 단독 투여군은 69.47 ％ 이지만, 병용군 (0.5×MTD)의 경우는 56.67 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면 도 14에서 나타낸 바와 같이, 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여 겜시타빈의 투여량 반감에 기인한다고 생각할 수 있는 강한 부작용의 경감 효과가 얻어졌다.

2. 병용군 (0.8×MTD)의 결과

도 15에 나타낸 바와 같이, 종양의 감소가 보여 병용 투여의 항종양 효과는 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여, 강한 항종양 효과를 나타냈다. 즉, 최소 T/C％치는 염산 암루비신 단독 투여군은 51.06 ％, 겜시타빈 단독 투여군은 69.47 ％이지만, 병용군 (0.8×MTD)의 경우는 34.27 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면, 도 16에서 나타낸 바와 같이, 염산 암루비신 단제의 최대 내량 투여군과 동일한 정도의 부작용이었다.

3. 병용군 (1×MTD)의 결과

도 17에 나타낸 바와 같이, 0.8 배량의 경우와 동일하게 종양의 감소가 보이고 병용 투여의 항종양 효과는 각각의 단제의 단독 투여군과 비교하여 강한 항종양 효과를 나타내었다. 즉, 최소 T/C％치는 염산 암루비신 단독 투여군은 51.06 ％, 겜시타빈 단독 투여군은 69.47 ％이지만, 병용군 (1×MTD)의 경우는 41.33 ％이었다.

부작용은 동물의 체중 감소로 평가하면, 도 18에서 나타낸 바와 같이, 겜시타빈 단제의 최대 내량 투여군과 동일한 정도의 부작용이었다.

이상의 실시예 1 내지 3과 같이, 염산 암루비신과 이리노테칸, 비노렐빈 및 겜시타빈의 병용에 있어서 부작용이 저감되어, 현저한 치료 효과가 확인되었다. 또한, 도 1 내지 18에서 알 수 있는 바와 같이 병용의 효과는 투여 시간으로부터 2주간의 사이에 특히 현저하게 나타나고, 3 주간 후에는 거의 효과가 소멸한다. 따라서 약 2 주간 내지 약 4 주간 후에 재차 투여를 반복하는 것이 바람직하고, 특히 약 3 주간 후에 재투여하고, 그 후에도 계속하는 것이 바람직하다고 생각된다.

실시예 1과 동일하게 하여, 파크리탁셀 (최대 내량은 12.5 mg/kg/dose)에 대해서도 염산 암루비신과의 병용 효과를 확인할 수가 있다. 또한, ZD 1839 (최대 내량은 200 mg/kg)에 대해서도 세포주를 인간 편평상피암인 A431 대신에 실시예 1과 동일한 실험을 행함으로써 염산 암루비신과의 병용 효과를 확인할 수가 있다.

<실시예 4>

염산 암루비시놀 및 이리노테칸의 생체외 병용 효과

인간 비소세포 폐암 세포를 사용하여 염산 암루비시놀 및 염산 이리노테칸의 생체외에 있어서의 병용 효과를 조사하였다.

인간 비소세포 폐암 세포주 A 549를 ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 입수하였다. D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Mediunm) 배지, 10 ％ 소 태아 혈청 (FCS)을 함유하는 배지로써 인간 비소세포 폐암 세포주 A 549를 계대 배양하였다. 배양은 37 ℃, 5 ％ CO₂로써 인큐베이터 중에서 실시하였다. 이후의 실험에도 본 배지를 사용하였다.

피검 물질은 이하와 같이 제조하였다.

염산 이리노테칸을 다이이찌세이야꾸 가부시끼 가이샤로부터 입수하고, 사용 시에 배지에서 2 배 단계 희석하여 사용하였다.

암루비시놀은 문헌 기재의 방법 (Ishizumi et al., J. 0rg. Chem., 52, 4477-4485 (1987))에 의해서 제조하였다. 염산 암루비시놀은 급속 냉동고 (-80 ℃)에서 보존되어 있는 것을 약 1 mg씩 칭량하여 냉동고 (-20 ℃)에서 보존하였다. 사용 시에 1 mg/㎖가 되도록 증류수로 용해하고, 여과 멸균 후, 배지에서 2 배 단계 희석하여 사용하였다.

계대 중의 인간 비소세포 폐암 세포주 A 549를 트립신 처리하고, 배지에 현탁 후, 96 웰 플레이트에 파종하였다. 파종 농도는 5×10² 세포/0.1 ㎖/웰로 하였다. 파종 후, 37 ℃, 5 ％ CO₂로써 인큐베이터 중에서 하룻 밤 배양하였다(O 일).

단제 평가군에는 피검 물질 희석액 0.05 ㎖/웰과 배지 0.05 ㎖/웰을 첨가하고, 병용 평가군에는 염산 암루비시놀 희석액 0.05 ㎖/웰과 염산 이리노테칸 희석액 0.05 ㎖/웰을 첨가하였다(1 일). 약제 처리군은 n=3, 비처리 (대조)군은 n=6으로 행하였다.

4 일째까지, 37 ℃, 5 ％ CO₂로써 인큐베이터 속에서 배양하였다.

4 일째에 각 웰에 0.02 ㎖의 WST 용액 (인산 완충액 (PBS)에, 1.3 mg/㎖ WST-1 (2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트레졸륨, 나트륨 염) 및 0.14 mg/㎖ 1-메톡시 PMS (1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸설페이트를 함유하는 용액)을 첨가하였다. 그 후, 2 내지 4 시간, 37 ℃, 5％ CO₂로 인큐베이터 속에서 배양하여 마이크로플레이트 리더 모델 3550-UV (Biorad사)로 흡광도를 측정하여 생세포수를 측정하였다.

이하의 식으로 증식률 f를 계산하였다.

f=(각 약제 농도에서의 흡광도의 평균치)/(약제 농도 0 mg/㎖의 흡광도의 평균치)

흡광도: A₄₂₀-A₆₃₀

log (약제 농도)에 대하여 1og ((1/f)-1)를 플로트하고, 최소 2 승법으로 회귀 직선을 그어, 그 기울기 m과 X 절편을 구하였다. Exp (X절편의 값)이 IC₅₀치 (5O ％의 세포 증식 억제에 필요한 약제의 농도)가 된다. 병용 처리 시의 염산 암루비시놀과 염산 이리노테칸의 농도비는 1:25로서 각각 m과 IC₅₀치를 구하였다 (이후, IC₅₀치를 D_m으로 표기하고, 염산 암루비시놀에 대해서는 첨자 1, 염산 이리노테칸에 대해서는 첨자 2로 나타내었다. 예: D_m1).

특정 증식 억제율 (fa)를 얻기 위해서 필요한 염산 암루비시놀 및 염산 이리노테칸의 농도 D를 식 1로부터 구하였다. 단제에서의 농도를 Df₁, Df₂ 및 병용 시에서의 농도를 Dx₁, Dx₂로 하고, 식 2로부터 CI(Combination index)를 산출하였다 (M. Pegram et al., Oncogene, 18, 2241-2251 (1999)).

D=D_m×{fa/(1-fa)}^1/m<식 1>

CI=Dx₁/Df₁+Dx₂/Df₂+(Dx₁×Dx₂)/(Df ₁×Df₂) <식 2>

CI=1은 상감 효과, CI<1은 상승 효과, CI>1은 길항 효과로 판단된다.

도 19에 염산 암루비시놀과 이리노테칸의 생체외 병용 효과를 나타낸다. 횡축은 증식 억제율 fa, 종축은 CI를 나타낸다. 도 19에 나타낸 바와 같이 CI는 fa=0.1 내지 0.9의 범위에서 1 보다 작은 값을 나타내고, CI에 의한 병용 효과의 판정으로서는 염산 암루비시놀과 염산이리노테칸과의 병용으로 강한 상승 효과가 확인되었다.

<실시예 5>

정상 및 종양 조직에서의 카르보닐 리덕타제 유전자 발현의 변동 해석

인간 폐정상 조직 69 샘플과 인간의 폐선암 조직 44 샘플, 폐편평상피암 조직 32 샘플, 폐대세포암 조직 5 샘플 및 백혈병 세포 18 샘플로부터 각각 제조한 총 RNA를 사용하여 DNA 칩을 해석하였다. DNA 칩 해석은 아피메트릭스(Affymetrix)사 유전자 칩 인간 게놈 U95A, B, C, D, E를 사용하여 행하였다. 구체적으로는 해석은 (1) 총 RNA에서의 cDNA의 제조, (2) 해당 cDNA에서 라벨화 cRNA의 제조, (3)라벨화 cRNA의 단편화, (4) 단편화 cRNA와 프로브 배열과의 혼성화, (5) 프로브 배열의 염색, (6) 프로브 배열의 스캔 및 (7) 유전자 발현의 해석의 순서로 수행되었다.

(1) 총 RNA에서의 cDNA의 제조

인간 폐정상 조직 69 샘플과 인간의 폐선암 조직 44 샘플, 폐편평상피암 조직 32 샘플, 폐대세포암 조직 5 샘플 및 백혈병 세포 18 샘플로부터 제조한 각 총 RNA 10 ㎍ 및 T7-(dT) 24 프라이머(Amersham사 제조) 100 pmol을 포함하는 11 μL 의 혼합액을, 70 ℃에서 10 분간 가열한 후, 빙상에서 냉각하였다. 냉각 후, cDNA 합성을 위한 슈퍼스크립트 선택 시스템(Super Script Choice System for cDNA Synthesis)(Gibco-BRL사 제조)에 포함되는 5×제1스트랜드 cDNA 완충액 4 μL, 이 키트에 포함되는 0.1M DTT(dithiothreitol) 2 μL 및 이 키트에 포함되는 10 mM dNTP 혼합 1 μL를 첨가하여 42 ℃에서 2 분간 가열하였다. 또한, 이 키트에 포함되는 슈퍼스크립트(SuperScript) II RT 2 μL (40O U)를 첨가하여 42 ℃에서 1 시간 가열한 후, 빙상에서 냉각하였다. 냉각후, DEPC 처리수 (나카라이테스크사 제조) 91 μL, 이 키트에 포함되는 5 ×제2스트랜드 반응 완충액 30 μL, 1O mM dNTP 혼합 3 μL, 이 키트에 포함되는 이.콜리 DNA 리가아제(Ligase) 1 μL (1O U), 이 키트에 포함되는 이.콜리 DNA 중합효소 I 4 μL (40 U) 및 이 키트에 포함되는 이.콜리 RNaseH 1 μL (2 U)를 첨가하여 16 ℃에서 2 시간 반응시켰다. 계속해서 이 키트에 포함되는 T4 DNA 중합효소 2 μL (10 U)를 가하고, 16 ℃에서 5 분간 반응시킨 후, 0.5 M EDTA 10 μL를 첨가하였다. 계속해서 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 용액 (닛뽄진사 제조) 162 μL를 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액을 미리 실온, 14,00O rpm, 30 초간 원심 분리하여 놓은 상고정겔 라이트(Phase Lock Gel Light)(엣펜도르프사 제조)에 옮겨 실온으로 14,000 rpm, 2 분간 원심 분리한 후, 145 μL의 수층을 엣펜도르프 튜브로 옮겼다. 얻어진 용액에 7.5 M 아세트산암모늄 용액 72.5 μL 및 에탄올 362.5 μL를 가하여 혼합한 후, 4 ℃, 14,000 rpm, 20분간 원심 분리했다. 원심 분리후, 상청액을 버리고, 제조한 cDNA를 포함하는 DNA 펠릿을 얻었다. 그 후, 이 펠릿에 80 ％ 에탄올 O.5 mL를 첨가하여 4 ℃, 14,00O rpm, 5 분간 원심 분리한 후, 상청액을 버렸다. 재차 동일한 조작을 행한 후, 이 펠릿을 건조시켜 DEPC 처리수 12 μL에 용해하였다.

이상의 조작에 의해, 인간 폐정상 조직 69 샘플과 인간의 폐선암 조직 44 샘플, 폐편평상피암 조직 32 샘플, 폐대세포암 조직 5 샘플 및 백혈병 세포 18 샘플유래의 총 RNA로부터 cDNA를 취득하였다.

(2) cDNA으로부터 라벨화 cRNA의 제조

상기 (1)에서 제조한 각 cDNA 용액 5 μL에, DEPC 처리수 17 μL, 키트(Bio Array High Yield RNA Transcript Labeling Kit(ENZO사 제조))에 포함되는 10×HY 반응 완충액 4 μL, 이 키트에 포함되는 10×바이오틴 표지된 리보뉴클레오티드 4 μL, 이 키트에 포함되는 10×DTT 4 μL, 이 키트에 포함되는 10×RNA 분해효소 억제제 혼합 4 μL 및 이 키트에 포함되는 20×T7 RNA 중합효소 2 μL를 혼합하여 37 ℃에서 5 시간 반응시켰다. 반응 후, 이 반응액에 DEPC 처리수 60 μL를 가한 후, 키트(RNeasy Mini Kit)를 사용하여 첨부 프로토콜에 따라 제조한 라벨화 cRNA를 정제하였다.

(3) 라벨화 cRNA의 단편화

상기 (3)에서 정제한 각 라벨화 cRNA 20 ㎍을 포함하는 용액에 5× 단편화 완충액(200 mM 트리스-아세트산, pH 8.1 (Sigma사 제조), 50O mM 아세트산칼륨 (Sigma사 제조) 및 150 mM 아세트산마그네슘 (Sigma사 제조)) 8 μL를 가하여 얻어지는 반응액 40 μL를, 94 ℃에서 35 분간 가열한 후, 얼음 중에 두었다. 이에 대하여 라벨화 cRNA를 단편화하였다.

(4) 단편화 cRNA와 프로브 배열의 혼성화

상기 (3)에서 얻은 각 단편화 cRNA 40 μL에 5 nM 콘트롤 올리고 B2 (Amersham사 제조) 4 μL, 100 ×콘트롤 cRNA 칵테일 4 μL, 헤링 스펌 DNA (Promega사 제조) 40 ㎍, 아세틸화 BSA (Gibco-BRL사 제조) 200 ㎍, 2×MES 혼성화 완충액(20O mM MES, 2M[Na⁺], 40 ,mM EDTA, 0.02 ％ 트윈 20 (Pierce사 제조), pH 6.5-6.7) 200 μL 및 DEPC 처리수 144 μL를 혼합하여 400 μL의 혼성화 칵테일을 얻었다. 얻어진 각 혼성화 칵테일을 99 ℃에서 5 분간 가열하고 또한 45 ℃에서 5 분간 가열하였다. 가열 후, 실온에서 14,000 rpm, 5 분간 원심 분리하여, 혼성화 칵테일 상청액을 얻었다.

한편, 1×MES 혼성화 완충액으로 채운 인간 게놈 U95 프로브 배열(Affymetrix사 제조)를, 혼성화 오븐 내에서, 45 ℃, 60 rpm으로 10 분간 회전시킨 후, 1×MES 혼성화 완충액을 제거하여 프로브 배열을 제조하였다. 상기에서 얻어진 혼성화 칵테일 상청액 200 μL를 이 프로브 배열에 각각 첨가하고, 혼성화 오븐 내에서 45 ℃, 60 rpm으로 16 시간 회전시켜 단편화 cRNA와 혼성화된 프로브 배열을 얻었다.

(5) 프로브 배열의 염색

상기 (4)에서 얻은 혼성화된 프로브 배열의 각각으로부터 혼성화 칵테일을 회수 제거한 후, 비엄격 세척 완충액(6×SSPE(20×SSPE(나카라이테스크사 제조)를 희석), 0.O1 ％ 트윈(Tween) 20 및 0.005 ％ 소포제 O-30 (Sigma 사 제조))로 채웠 다. 다음으로, 비엄격 세척 완충액 및 엄격 세척 완충액(100 mM MES, 0.1M NaCl 및 0.01 ％ 트윈 20)을 셋팅한 유전자 칩 플루이딕 스테이션(Gene Chip Fluidics Station) 400 (Affymetrix사 제조)의 소정의 위치에, 단편화 cRNA와 혼성화된 프로브 배열을 장착하였다. 그 후, 염색 프로토콜 EuKGE-WS2에 따라서 1차 염색액 (10 ㎍/mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE) (Molec μ Lar Probe사 제조), 2 mg/mL 아세틸화 BSA, 100 mM MES, 1M NaCl (Ambion사 제조), 0.05 ％ 트윈 20 및 0.005 ％ 소포제 O-30), 및 2차 염색액 (100 ㎍/mL, Goat IgG (Sigma사 제조), 3 ㎍/mL 바이오티닐화 항-스트렙타비딘 항체(Vector Laboratories사 제조), 2 mg/mL 아세틸화 BSA, 1OO mM MES, 1M NaCl, O.05 ％ 트윈 20 및 0.005 ％ 소포제 O-30)으로 각각 염색하였다.

(6) 프로브 배열의 스캔, 및 (7) 유전자 발현 해석

상기 (5)에서 염색한 각 프로브 배열을 HP 유전자 배열 스캐너(Affymetrix사 제조)에 제공하여 염색 패턴을 판독하였다.

염색 패턴을 바탕으로 유전자 칩 워크스테이션 시스템(Affymetrix사 제조)에 의해서 프로브 배열 상의 카르보닐리환원효소 1 유전자의 발현을 해석하였다. 다음으로, 해석 프로토콜에 따라서 표준화 및 유전자 발현을 비교 해석하였다.

그 결과, 인간 백혈병 세포는 카르보닐환원효소 1의 발현 빈도는 11 ％(18 예 중 2 예)이고, 발현량 중앙치는 -39가 되어, 거의 발현하지 않은 것이 발견되었다. 한편, 인간 폐조직의 카르보닐환원효소 1의 발현 빈도는 선암, 편평상피암, 대세포암 및 정상 조직으로서는 각각 55 ％ (44 경우 중 24 경우), 63 ％ (32 경우 중 20 경우), 40 ％ (5 경우 중 2 경우) 및 32 ％ (69 경우 중 22 경우)이고, 또한 발현량은 각각 51, 96, 34 및 22이고, 폐정상 조직에 비교하여 폐암 조직에서 카르보닐환원효소 1의 발현이 강화되고 있으며, 특히 폐선암과 편평상피암의 발현량은 폐 정상 조직의 발현량의 2 배 및 4 배 이상인 것이 발견되었다.

도 1은 염산 암루비신의 최대 내량 (MTD)의 0.5 배량과 이리노테칸의 최대 내량의 0.5 배량을 병용한 경우의, 소세포 폐암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 이리노테칸 단독 투여군, ▲은 병용 투여군을 나타낸다.

도 2는 염산 암루비신의 최대 내량의 0.5 배량과 이리노테칸의 최대 내량의 0.5 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 이리노테칸 단독 투여군, ▲는 병용 투여군을 나타낸다.

도 3은 염산 암루비신의 최대 내량의 0.8 배량과 이리노테칸의 최대 내량의 0.8 배량을 병용한 경우의, 소세포 폐암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 이리노테칸 단독 투여군, ◆은 병용 투여군을 나타낸다.

도 4는 염산 암루비신의 최대 내량의 0.8 배량과 이리노테칸의 최대 내량의 0.8 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 이리노테칸 단독 투여군, ◆는 병용 투여군을 나타낸다.

도 5는 염산 암루비신의 최대 내량의 1.O 배량과 이리노테칸의 최대 내량의 1.0 배량을 병용한 경우의, 소세포 폐암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 이리노테칸 단독 투여군, ●는 병용 투여군을 나타낸다.

도 6은 염산 암루비신의 최대 내량의 1.O 배량과 이리노테칸의 최대 내량의 1.0 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 이리노테칸 단독 투여군, ●는 병용 투여군을 나타낸다.

도 7은 염산 암루비신의 최대 내량의 0.5 배량과 비노렐빈의 최대 내량의 0.5 배량을 병용한 경우의, 폐편평상피암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 비노렐빈 단독 투여군, ▲는 병용 투여군을 나타낸다.

도 8은 염산 암루비신의 최대 내량의 0.5 배량과 비노렐빈의 최대 내량의 0.5 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 비노렐빈 단독 투여군, ▲는 병용 투여군을 나타낸다.

도 9는 염산 암루비신의 최대 내량의 0.8 배량과 비노렐빈의 최대 내량의 0.8 배량을 병용한 경우의, 폐편평상피암의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 비노렐빈 단독 투여군, ◆는 병 용 투여군을 나타낸다.

도 10은 염산 암루비신의 최대 내량의 0.8 배량과 비노렐빈의 최대 내량의 0.8 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 비노렐빈 단독 투여군, ◆는 병용 투여군을 나타낸다.

도 11은 염산 암루비신의 최대 내량의 1.0 배량과 비노렐빈의 최대 내량의 1.0 배량을 병용한 경우의, 폐편평상피암의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 비노렐빈 단독 투여군, ●은 병용 투여군을 나타낸다.

도 12는 염산 암루비신의 최대 내량의 1.O 배량과 비노렐빈의 최대 내량의 1.0 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 비노렐빈 단독 투여군, ●는 병용 투여군을 나타낸다.

도 13은 염산 암루비신의 최대 내량의 0.5 배량과 겜시타빈의 최대 내량의 0.5 배량을 병용한 경우의, 폐편평상피암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 겜시타빈 단독 투여군, ▲는 병용 투여군을 나타낸다.

도 14는 염산 암루비신의 최대 내량의 O.5 배량과 겜시타빈의 최대 내량의 0.5 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 겜시타빈 단독 투여군, ▲는 병용 투여군을 나타낸다.

도 15는 염산 암루비신의 최대 내량의 0.8 배량과 겜시타빈의 최대 내량의 0.8 배량을 병용한 경우의, 폐편평상피암의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 겜시타빈 단독 투여군, ◆은 병용 투여군을 나타낸다.

도 16은 염산 암루비신의 최대 내량의 0.8 배량과 겜시타빈의 최대 내량의 0.8 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 겜시타빈 단독 투여군, ◆는 병용 투여군을 나타낸다.

도 17은 염산 암루비신의 최대 내량의 1.0 배량과 겜시타빈의 최대 내량의 1.0 배량을 병용한 경우의, 폐편평 상피암의 증식 억제 효과를 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 겜시타빈 단독 투여군, ●는 병용 투여군을 나타낸다.

도 18은 염산 암루비신의 최대 내량의 1.0 배량과 겜시타빈의 최대 내량의 1.0 배량을 병용한 경우에 있어서의, 부작용으로서의 체중 감소 작용을 나타낸다. 직선은 비히클군, □는 염산 암루비신 단독 투여군, △는 겜시타빈 단독 투여군, ●은 병용 투여군을 나타낸다.

도 19는 염산 암루비시놀과 이리노테칸의 생체외 병용 효과를 나타낸다. 횡축은 증식 억제율을 나타내는 fa 값으로 하고, 종축을 CI (combination index)값으로서 fa 값이 0.1부터 0.9까지를 플로팅하였다.

본 발명에 의해, 폐암 환자를 치료하기 위해서 유용한 염산 암루비신과 다른 폐암 치료제의 병용 치료제가 제공된다. 다른 폐암 치료제와의 병용에 의해 염산암루비신의 항종양 효과를 향상시킬 수 있음과 동시에 이 폐암 치료제의 부작용을 감소시킨 암 치료가 가능하게 된다.

Claims

이리노테칸, 비노렐빈, 겜시타빈 중 어느 하나와 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 유효 성분으로 하는 폐암 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 폐암이 소세포 폐암, 폐선암, 폐편평상피암 또는 폐대세포암인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 폐암이 소세포 폐암 또는 폐편평상피암인 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 염산 암루비신인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 60 내지 150 mg/m²1회 또는 2 내지 5 회로 나누어 투여되도록 포장된 약학 조성물.
제5항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 80 내지 130 mg/m²1회 투여되도록 포장된 약학 조성물.
제5항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 110 내지 13O mg/m²1회 투여되도록 포장된 약학 조성물.
제5항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 1 일 1 회 25 내지 50 mg/m²을 3 일간 투여되도록 포장된 약학 조성물.
제5항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 1 일 1 회 30 내지 45 mg/m²을 3 일간 투여되도록 포장된 약학 조성물.
제5항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 1 일 1 회 35 내지 45 mg/m²를 3 일간 투여되도록 포장된 약학 조성물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 3 일간 연일 투여되는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 최대 내량이 120 mg/kg이고 최고 투여량이 1주간 간격 투여로는 150 mg/m², 3주간 간격의 투여로는 350 mg/m²인 이리노테칸, 최대 내량이 16 mg/kg이고 최고 투여량이 25 mg/m²인 비노렐빈, 최대 내량이 300 mg/kg이고 최고 투여량이 1000 mg/m²인 겜시타빈 중 어느 하나가 그 최대 내량의 0.4 배 내지 1.0 배의 양, 또는 그 최고 투여량의 0.4 배 내지 1.0 배의 양으로 병용되기 위한 약학 조성물.
암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 유효 성분으로 하는, 이리노테칸, 비노렐빈, 겜시타빈 중 어느 하나의 폐암 치료 효과 증강용 약학 조성물.
제13항에 있어서, 폐암이 소세포 폐암, 폐선암, 폐편평상피암 또는 폐대세포암인 약학 조성물.
제13항에 있어서, 폐암이 소세포 폐암 또는 폐편평상피암인 약학 조성물.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염이 염산 암루비신인 약학 조성물.
유효 성분으로서 암루비신 또는 그 약학상 허용되는 염을 포함하는 제1 조성물, 및 유효 성분으로서 이리노테칸, 비노렐빈, 겜시타빈 중 어느 하나를 포함하는 제2 조성물을 포함하는, 폐암 병용 치료를 위한 키트.
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