KR100973470B1

KR100973470B1 - 칼시토닌-폴리포스페이트의 복합체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100973470B1
Application number: KR1020080056376A
Authority: KR
Inventors: 이상길; 이혜은; 최광진; 강재선; 권병수
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-16
Filing date: 2008-06-16
Publication date: 2010-08-02
Also published as: KR20090130655A

Abstract

본 발명은 칼시토닌의 안정성을 높일 뿐만 아니라 지속적인 방출을 나타내는 칼시토닌-함유 복합체, 즉 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체 및 그의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체는 칼시토닌의 아민기(-NH₂)와 상기 폴리포스페이트의 인산기(-P=O) 사이에 이온결합이 형성된 이온 복합체(ionic complex) 형태로서, 수성 매질 중에서 15일 이상의 장기간 동안 칼시토닌이 지속적인 방출을 나타냄으로써, 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 복합체는 가혹 조건에서 보관한 후에 복강투여할 경우, 칼시토닌을 동일한 방법으로 투여한 경우에 비하여 더욱 우수한 혈중 칼슘 농도 저하 효과를 나타냄으로써, 칼시토닌의 안정성을 크게 증가시킬 수 있다.

칼시토닌, 폴리포스페이트

Description

칼시토닌-폴리포스페이트의 복합체 및 그의 제조방법{Complex of calcitonin-polyphosphate and process for preparing the same}

본 발명은 칼시토닌의 안정성을 높일 뿐만 아니라 지속적인 방출을 나타내는 칼시토닌-함유 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물에 관한 것이다.

칼시토닌은 32개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드로 포유류 갑상선의　부여 세포와 어류, 조류 등의 새후선에서 분비된다. 칼시토닌은 뼈의 칼슘을 제거하는 파골세포의 활동을 억제시키고 상대적으로 조골세포의 활동을 증가시켜 칼슘의 흡수를 도와주고 신장에서 칼슘이 재흡수되는 것을 억제하여 소장에서의 칼슘 흡수를 억제하는 기능을 함으로써, 골다공증의 예방 및 치료에 유용하다(Int. J. Pharm., 186 1999 pp 205-213, Int. J. Pharm., 200 2000 pp 107-113).

칼시토닌은 높은 친수성과 큰 분자량 때문에 장 점막에서의 흡수율이 낮아 생체이용율이 0.1% 정도로 매우 낮기 때문에 비강분무제나 주사제로 주로 사용되고 있다. 그러나 전자는 투약이 불편하고 감기나 코에 이상이 있을 경우 사용이 어려우며, 후자는 환자들에게 주사에 대한 공포 및 통증을 수반하고 메스꺼움, 안면홍조와 같은 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Int. J. Pharm., 218 2001 pp 93-102, J. Control. Rel., 106 2005 pp 298-308, Int. J. Pharm., 296 2005 pp 122-132).

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 리포좀; 혹은 지방산 및 생분해성 고분자를 이용한 나노 입자화; 양이온성 계면활성제 등과 생분해성 고분자를 이용한 미립자 등을 포함한 다양한 연구가 수행된 바 있으나(대한민국 특허등록 제10-0593861호, 대한민국 특허등록 제10-0452752호 등), 유기용매 사용으로 인한 환경오염 문제, 산업적 규모로 적용하기가 곤란한 제조의 복잡성 문제 등의 해결이 당업계에 요구된다. 특히, 간단한 방법으로 칼시토닌의 안정성 뿐만 아니라 생체내에서 지속적으로 방출을 제어할 수 있는 수단의 개발이 당업계에 요구되고 있다.

본 발명자들은, 칼시토닌의 안정성을 높일 수 있을 뿐만 아니라 지속적인 방출 특성을 나타낼 수 있도록 제제화가 가능한 방법으로서 실제 생산현장에서 손쉽게 적용될 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도, 칼시토닌을 다가 음이온(polyanion) 중 하나인 폴리포스페이트와 복합체를 형성시킬 경우, 칼시토닌의 안정성을 크게 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 수성 매질에서 장기간 동안 지속적인 방출을 나타냄으로써 방출-제어형 제형으로 제제화할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 복합체를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체가 제공된다:

식 중, R은 수소 또는 알칼리 금속이고, m은 1 ∼ 5의 정수이다.

상기 복합체에 있어서, R은 소듐 또는 칼륨, 더욱 바람직하게는 소듐일 수 있으며, m이 1일 수 있다. 또한, 상기 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 몰비는 1 : 0.1∼15, 더욱 바람직하게는 1 : 5∼10의 범위일 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 물 중에서 칼시토닌과 상기 화학식 1의 폴리포스페이트를 반응시켜 이온결합을 형성시키는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 생성되는 침전물을 분리하는 단계를 포함하는 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체의 제조방법이 제공된다. 상기 제조방법은 단계(b)에서 얻어진 침전물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체를 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체는 칼시토닌의 아민기(-NH₂)와 상기 폴리포스페이트의 인산기(-P=O) 사이에 이온결합이 형성된 이온 복합체(ionic complex) 형태로서, 수성 매질 중에서 15일 이상의 장기간 동안 칼시토닌이 지속적인 방출을 나타냄으로써, 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 복합체는 가혹 조건에서 보관한 후에 복강투여할 경우, 칼시토닌을 동일한 방법으로 투여한 경우에 비하여 더욱 우수한 혈중 칼슘 농도 저하 효과를 나타냄으로써, 칼시토닌의 안정성을 크게 증가시킬 수 있다.

본 발명은 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체를 제공한다:

<화학식 1>

상기 화학식 1의 폴리포스페이트에 있어서, R은 소듐 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 소듐이다. 또한, 상기 m은 1 ∼ 3의 정수일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1이다. 상기 화학식 1의 폴리포스페이트는 상업적으로 구입(예를 들어, 시그마-알드리치 등) 가능하다.

상기 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 몰비는 1 : 0.1∼15의 범위일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 5∼10의 범위일 수 있다. 특히, 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 몰비가 1 : 5∼10의 범위일 경우, 별도의 나노입자화를 위한 처리 없이도, 얻어지는 복합체의 수성 매질 중에서의 입자 크기를 300 nm 이하(구체적으로는 약 220∼225 nm)의 나노입자 크기로 조절할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 발견되었다. 이렇게 약물의 입자를 나노입자로 제조할 경우 경구투여시 위장관에서의 흡수율을 높일 수 있으며, 주사시에도 마이크로스피어 등이 큰 입자도로 인해 나타내는 통증의 문제를 줄일 수 있다.

본 발명에 따른 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체는 칼시토닌의 아민기(-NH₂)와 상기 폴리포스페이트의 인산기(-P=O) 사이에 이온결합이 형성된 이온 복합체(ionic complex) 형태로서, 수성 매질 중에서 15일 이상의 장기간 동안 칼시토닌이 지속적인 방출을 나타냄으로써, 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 복합체는 가혹 조건에서 보관한 후에 정맥 주입할 경우, 칼시토닌을 동일한 방법으로 투여한 경우에 비하여 더욱 우수한 혈중 칼슘 농도 저하 효과를 나타냄으로써, 칼시토닌의 안정성을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 발견되었다.

본 발명은 또한 상기 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 (a) 물 중에서 칼시토닌과 상기 화학식 1의 폴리포스페이트를 반응시켜 이온결합을 형성시키는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 생성되는 침전물을 분리하는 단계를 포함하는 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체의 제조방법을 제공한다.

단계(a)의 상기 반응은 칼시토닌 수용액 중에 화학식 1의 폴리포스페이트 수용액을 교반하면서 서서히(예를 들어, 약 1.2ml/min) 가함으로써 수행될 수 있다. 반응온도는 크게 제한되는 것은 아니나, 칼시토닌 수용액 중에 화학식 1의 폴리포스페이트 수용액을 가한 후 1 내지 10 ℃, 더욱 바람직하게는 약 4 ℃에서 약 24 시간 동안 교반하는 것이 심한 교반에 의한 펩타이드 또는 단백질의 응집현상을 방지할 수 있으므로 바람직하다. 단계(a)에서 생성되는 침전물은 원심분리 등의 통상의 방법으로 분리할 수 있으며, 필요할 경우 분리된 침전물을 감압건조, 동결건조 등의 건조방법, 더욱 바람직하게는 동결건조하는 단계를 추가로 포함함으로써 분말 형태의 복합체를 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체를 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 상기 복합체의 함량은 치료학적으로 유용한 칼시토닌의 함량을 제공하기에 충분한 양으로 함유될 수 있으며, 예를 들어 50 내지 1,000 IU/day의 범위일 수 있다. 물론, 상기 복합체의 함량은 복합체 중의 칼시토닌 함량, 원하는 골다공증 치료 목적, 환자의 나이, 상태, 체중, 투여경로 등에 따라 상이할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 폐흡입, 정맥 주사, 복강 주사, 근육 주사 등의 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한 다양한 제형으로 제제화될 수 있으며, 예를 들어 경구용 액제 및 폐흡입 분말형태, 주사용 액제, 사용시 멸균증류수에 용해 및/또는 현탁시켜 사용하는 건조제제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학 적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 칼시토닌과 트리폴리포스페이트 나트륨염과의 복합체 (1:15)

칼시토닌과 트리폴리포스페이트(화학식 1에서 R=Na, m=1)의 반응 몰비를 1 : 15로 하여 복합체를 제조하였다. 즉, 1ml의 탈이온수에 칼시토닌 10 mg을 용해시켜 얻어진 용액을 주사기에 넣은 후, 등속주입장치를 이용하여 23 gage needle을 통과시켜 1.2ml/min의 속도로, 트리폴리포스페이트(화학식 1에서 R=Na, m=1) 160 mg을 10 ml의 탈이온수에 용해시켜 얻어진 용액에 교반하면서 가하였다. 반응 혼합물을 4 ℃에서 24시간 동안 교반한 다음, 20,000 rpm으로 30 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다 (상기 상층액은 시험예 1의 결합효율 측정에 이용하였다). 얻어진 잔류물을 동결건조한 뒤, 냉장 보관하였다.

실시예 2. 칼시토닌과 트리폴리포스페이트 나트륨염과의 복합체 (1:10)

칼시토닌과 트리폴리포스페이트(화학식 1에서 R=Na, m=1)의 반응 몰비를 1 : 10으로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 복합체를 제조하였다.

실시예 3. 칼시토닌과 트리폴리포스페이트 나트륨염과의 복합체 (1:5)

칼시토닌과 트리폴리포스페이트(화학식 1에서 R=Na, m=1)의 반응 몰비를 1 : 5로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 복합체를 제조하였다.

실시예 4. 칼시토닌과 트리폴리포스페이트 나트륨염과의 복합체 (1:1)

칼시토닌과 트리폴리포스페이트(화학식 1에서 R=Na, m=1)의 반응 몰비를 1 : 1로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 복합체를 제조하였다.

실시예 5. 칼시토닌과 트리폴리포스페이트 나트륨염과의 복합체 (1:0.5)

칼시토닌과 트리폴리포스페이트(화학식 1에서 R=Na, m=1)의 반응 몰비를 1 : 0.5로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 복합체를 제조하였다.

실시예 6. 칼시토닌과 트리폴리포스페이트 나트륨염과의 복합체 (1:0.1)

칼시토닌과 트리폴리포스페이트(화학식 1에서 R=Na, m=1)의 반응 몰비를 1 : 0.1로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 복합체를 제조하였다.

시험예 1. 복합체의 결합효율 측정

실시예 1 내지 6에서 복합체 제조과정 중에 얻어진 상층액에서 미반응의 칼 시토닌 함량을 Bicinchonic Acid (BCA) 분석방법(Anal. Biochem., 1985 150 pp76-85)으로 측정하여, 복합체를 형성한 칼시토닌의 양을 계산하였다. 그 결과는 도 1과 같으며, 도 1로부터 트리폴리포스페이트와 칼시토닌의 결합 효율이 95% 이상으로 매우 높음을 알 수 있다.

시험예 2. 복합체의 수용액 상에서의 입자크기 측정

실시예 1 내지 6에서 얻어진 복합체를 증류수 10 ml에 0.01%의 농도가 되도록 현탁한 뒤 3 ml을 취하여 석영 셀에 넣은 뒤 입자도 분석기를 이용하여 입자 크기 및 분산도(Polydispersity index)를 측정하였으며, 그 결과는 도 2 및 표 1과 같다. 또한, 실시예 1 내지 6에서 얻어진 복합체를 시차주사열량계(SEM)로 측정한 결과는 도 3과 같다.

실시예	입자크기(nm)	분산도(Polydispersity index, PI)
1	663.05±78.43	0.328±0.036
2	223.12±12.10	0.292±0.028
3	224.74±10.26	0.278±0.022
4	367.44±40.18	0.272±0.039
5	401.9±32.03	0.296±0.045
6	648.68±61.03	0.278±0.041

상기 표 1의 결과로부터, 칼시토닌과 폴리포스페이트와의 몰비가 1 : 5∼10의 범위일 경우, 별도의 나노입자화를 위한 처리 없이도, 얻어지는 복합체의 입자 크기를 300 nm 이하의 나노입자 크기로 조절할 수 있음을 알 수 있다.

시험예 3. 복합체의 특성 분석 (FT-IR 및 DSC 분석)

실시예 3에서 얻어진 복합체(칼시토닌:트리폴리포스페이트=1:5, 몰비), 칼시토닌, 및 트리폴리포스페이트 각각을 KBr과 혼합하여 펠렛을 제조한 후, FT-IR 분석을 실시하였으며, 또한 DSC 분석(10℃/min의 속도로 30∼300℃까지 스캔)을 실시하였다. 그 결과는 각각 도 4 및 도 5와 같다.

도 4의 FT-IR 분석 결과로부터, 칼시토닌의 아민기(-NH₂)와 트리폴리포스페이트의 인산기(-P=O) 사이에 이온결합이 형성되었음을 알 수 있으며, 또한, 도 5의 DSC 분석결과로부터 칼시토닌과 트리폴리포스페이트 사이에 이온결합이 형성되었음을 확인할 수 있다.

시험예 4. 복합체의 in - vitro 방출 시험

실시예 3에서 얻어진 복합체(칼시토닌:트리폴리포스페이트=1:5, 몰비)의 방출시험을 수행하였다. 즉, 실시예 3에서 얻어진 복합체 1.5 mg을 pH 7.4 인산 완충액(PBS) 0.5 ml에 넣고, 37 ℃ 항온조에서, 정해진 시간 간격마다 10,000 rpm, 4 ℃, 4분간 원심 분리하여 상징액 300㎕를 채취하고, 37 ℃의 새로운 pH 7.4 PBS 300 ㎕를 넣어 주었다. 채취한 상징액 300㎕ 중에 함유된 칼시토닌의 함량을 BCA 방법으로 측정한 결과는 도 6과 같다. 도 6으로부터, 본 발명에 따라 얻어진 복합체로부터 칼시토닌이 15일 이상 지속적으로 방출되는 것을 알 수 있다.

시험예 5. 복합체의 혈중 칼슘 저하 효능 시험

칼시토닌; 및 실시예 3에서 얻어진 복합체(칼시토닌:트리폴리포스페이트=1:5, 몰비)를 55 ℃의 가혹조건에서 일주일 동안 보관한 뒤, 각각의 시료를 인산완충액(PBS)에 녹여 7∼8주령의 랫트(체중: 250∼280 g)에 복강 투여하여 혈중 칼슘 농도 저하 효능을 비교하였다. 랫트의 경정맥에 폴리에틸렌 관을 삽관하고 수술 후 완전히 회복시킨 후, 칼시토닌 및 복합체를 각각 복강투여하였다. 칼시토닌은 칼시토닌 0.956mg을 생리식염수 10ml에 분산하여 100g 무게당 0.1ml을 복강투여하였으며, 상기 복합체는 칼시토닌 0.956 mg에 해당하는 양(실시예 3에서 복합체 형성시 얻어진 상층액을 분석하여 역산하여 계산)을 취하여 생리식염수 10 ml에 분산하여 100g 무게당 0.1ml을 복강투여하였다. 투여 후 일정 시간별로 경정맥으로부터 혈액을 채취하여, 혈액 중 칼슘의 양을 정량하였으며, 그 결과는 도 7과 같다. 놀랍게도, 본 발명에 따라 얻어진 복합체를 투여한 경우, 칼시토닌을 단독으로 투여한 경우에 비하여 혈중 칼슘 저하 효능이 유의성 있게 우수함을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따라 복합체 형태로 제조할 경우, 칼시토닌의 안정성이 크게 증가함을 나타낸다.

도 1은 칼시토닌(sCT)과 트리폴리포스페이트(TPP)의 몰비별 복합체의 형성 효율을 측정한 결과를 나타낸다.

도 2는 칼시토닌(sCT)과 트리폴리포스페이트(TPP)의 몰비별 복합체의 수용액 중 입자 크기 및 분산도를 측정한 결과를 나타낸다.

도 3은 칼시토닌과 트리폴리포스페이트와의 복합체를 시차주사현미경으로 측정한 결과를 나타낸다. A 내지 F는 각각 실시예 1 내지 6에서 제조한 복합체의 SEM 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 복합체(Complex), 칼시토닌(sCT), 트리폴리포스페이트(TPP)의 FT-IR 분석 결과를 나타낸다.

도 5는 본 발명에 따른 복합체(Complex), 칼시토닌(sCT), 트리폴리포스페이트(TPP)의 DSC 분석 결과를 나타낸다.

도 6은 본 발명에 따른 복합체의 in - vitro 방출 양상을 측정한 결과를 나타낸다.

도 7은 본 발명에 따른 복합체(complex) 및 칼시토닌(sCT)를 각각 55 ℃ 가혹조건에서 일주일 보관 후 랫트에 복강 주사하였을 때, 혈중 칼슘 농도 저하효과를 측정한 결과를 나타낸다.

Claims

칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체:

<화학식 1>

식 중, R은 수소 또는 알칼리 금속이고, m은 1 ∼ 5의 정수이다.
제1항에 있어서, R이 소듐 또는 칼륨인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, m이 1인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 몰비가 1 : 0.1∼15의 범위인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 몰비가 1 : 5∼10의 범위인 것을 특징으로 하는 복합체.
(a) 물 중에서 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트를 반응시켜 이온결합 을 형성시키는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 생성되는 침전물을 분리하는 단계를 포함하는 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체의 제조방법:

<화학식 1>

식 중, R은 수소 또는 알칼리 금속이고, m은 1 ∼ 5의 정수이다.
제6항에 있어서, 단계(b)에서 얻어진 침전물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 칼시토닌과 화학식 1의 폴리포스페이트와의 복합체를 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료를 위한 방출-제어형 약학 조성물:

<화학식 1>

식 중, R은 수소 또는 알칼리 금속이고, m은 1 ∼ 5의 정수이다.