KR100968382B1

KR100968382B1 - 내염성이 우수한 오셔노바실러스 속 균주 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100968382B1
Application number: KR1020100014871A
Authority: KR
Inventors: 김종식; 피영태
Original assignee: 김종식; 피영태
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2010-07-09

Abstract

　본 발명은 내염성이 우수한 신규한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주에 관한 것이다.
본 발명에 의한 신규한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주는 내염성이 우수하여, 염분이 높은 토양에서의 식물 재배 또는 염분이 높은 토양의 개량 등에 폭넓게 사용될 수 있어 유용하다.

Description

내염성이 우수한 오셔노바실러스 속 균주 및 그의 용도{OCEANOBACILLUS SP. STRAIN HAVING EXCELLENT SALT-RESISTANCE AND USE THEREOF}

　본 발명은 내염성이 우수한 신규한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주를 포함하는 미생물 비료 또는 토양 개량제에 관한 것이다.

우리나라는 인구는 많으나 전국토의 60% 이상이 산지이므로, 경제발전에 따라 소요되는 새로운 공업 단지, 주택 단지, 항만 등에 필요한 용지를 공급하기 어려운 실정이다. 이에 따라, 필요한 용지 공급을 위해 간척지 또는 바다를 매립하여 이들 용지를 공급하는 사업이 추진되고 있다. 공업단지(광양, 여천공단), 해양도시(송도경제특구 등), 공항 및 항만(인천국제공항, 광양항), 해양 리조트(군장, 무안, 고창 CC), 쓰레기매립장(김포동아쓰레기 매립장), 위해시설지구(LNG 가스저장소, 영광원자력발전소), 간척농경지조성(새만금 간척지, 영상강하구언 간척지) 등이 그러하다. 국내 매립지의 토지이용계획은, 매립 초기에는 주로 산업시설 조성이 목적이었으나, 최근에는 환경에 대한 새로운 인식과 쾌적한 생활환경 조성을 위하여 많은 조경 수목이 식재되고 있다.

간척지나 임해매립지는, 보통 중장비를 이용하여 산을 깎아 흙을 채취하여 바다를 매립하거나 매립 예정지 밖에 있는 바닷속의 모래, 준설토, 건설잔토, 쓰레기나 폐기물, 산 흙 등과 같은 재료를 펌프로 빨아올려 준설한다. 그런데, 상기 재료로 매립된 토양은 유효 심토 부족, 배수불량에 의한 과습, 지반 침하, 입단 구조 불량, 토양 수분 부족, 입도의 불규칙, 식물 양분 결핍, 염류의 상존(준설토 0.73ds/m 객토 0.36ds/m 범위), pH의 이질성(준설토의 경우 pH7.5, 객토의 경우 pH6.6 정도), 낮은 유기물함량(OM 0,5∼1.0) 등과 같은, 정상적인 수목생장에는 적합하지 않은 물리화학적 성질을 가진다. 또한, 상기 토양은 염분이 과다하여 미생물이 생존하기에 적합하지 않아, 수목 등의 식물이 생장하기 위해 필요한 유효미생물이 부족하다는 생물학적 특성을 가진다.

이에, 간척지나 바다매립지의 물리화학적 특성을 개선하고자 하는 연구 개발이 이루어지고 있다. 그 예로, 차단공법, 사구법과 사주법, 담수, 석고포설 등의 방법이 제시되고 있다(표 1 참조).

구분		적용방법	염분피해 해소법	장점	단점
물리적	차단공법	자갈층포설 PE비닐차단	염분함유수분 이동제한	물리적 염분제거 (모세관 찬, 염분용탈)	자갈의 수요가 많고 화학적 염분제거 불가능
	사구법 사주법	모래층 충진 모래기둥 설치	수분 이동제한 관수에 염분배수	물리적 염분제거(배수력 높음)	모래의 수요가 많음
	담수	염분을 담수 중에　 확산 ·용출	담수로 염분을 용탈시키는 방법	표층염분제거 가능	물 소요량이 많음 심토층 염분 제거 곤란
화학적	석고포설	토양포설	상승 나트륨과 염을 제거	화학적 염분 제거 가능	물리성 불량함
물리적 화학적	건설폐기물 에 석고, 제오라이트 코팅처리	토양층 하부에 염분차단제 실시	모세관차단: 염분차단, 배수, 석고, 점토질 염분용탈	물리적·화학적 염분차단 가능	건설폐기물 코팅 화학적, 생물학적 분해에 의한 토양오염 우려

<표 1.염분차단공법 연구개발 사례>

그러나, 상기 방법에 의하여도 간척지 등의 염분 제거가 불가능하거나, 염분 차단은 가능하나 토양이 오염될 우려가 있는 등의 문제점이 있다.

본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 구체적으로는, 간척지로부터 내염성이 우수한 미생물을 분리·동정하여 상기 미생물의 내염성을 이용한 토양 개량제, 미생물 비료, 식물생장 촉진제를 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해, 고농도의 염에 대한 내염성이 우수한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 간척지로부터 내염성이 있는 균주를 순수분리하는 단계, 분리된 세균 중 우수한 내염성을 갖는 균주를 선별하여 동정하는 단계, 동정된 세균의 내염성과 생육특성을 파악하는 단계, 동정된 균주의 내염성 정도를 측정하는 단계를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주, 상기 균주의 균체나 배양액, 및 이를 포함하는 미생물 비료 또는 토양 개량제를 제공한다.

본 발명의 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주는 간척지, 바다매립지, 비닐하우스 염류집적지와 같은 높은 염류에 의해서 식물생육이 어려운 환경에서도 생존 가능하므로, 상기 균주를 포함하는 미생물 비료 또는 토양 개량제를 제조하는데 적합하다.

도 1은 본 발명의 신규한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의해 분리된 신규의 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주의 염(NaCl) 농도에 따른, 액체 배지(Marine broth와 10% Tryptic soy broth)에서의 생존 여부를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 의해 분리된 신규의 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주의 염(NaCl) 농도에 따른, 고체 배지(Marine agar와 10%TSA)에서의 생존 여부를 나타낸 그래프이다.
도 4는 간척지의 토양 시료로부터 분리된 본 발명의 신규한 오셔노바실러스 속 GB11 균주를 투과형 전자 현미경으로 관찰한 것이다.

본 발명자들은 간척지나 염분이 과다한 토양에서도 생존이 가능하여, 식물 생장 또는 토양의 물리 화학적 성질을 개량할 수 있는 균주를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 내염성이 우수한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주를 간척지로부터 분리·동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 신규한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 신규한 균주는 간척지의 토양시료로부터 분리되었으며, 실시예의 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 미생물의 동정은 그의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다.

본 발명에서, 간척지의 토양 시료로부터 균주를 분리하기 위해, Marine agar 배지를 사용하였다. 상기 배지에서 간척지 토양 시료를 인산완충액으로 희석한 후, 고체 배지에 희석단계별로 도말하였다. 배양샤레에 약 50 콜로니를 형성하는 샤레들로부터 형태 및 크기가 다른 균주를 선발한 후, 선발된 균주를 대상으로 NaCl 농도에 따른 내성실험을 수행하고, 그 외, 온도, pH를 측정하여, 28~37℃ pH 6~10 및 1~20% NaCl의 농도에서도 좋은 성장을 보이는, 내염성이 가장 우수한 균주를 분리하였다. 상기 분리된 균주를 순수 분리하여 단일 균주 GB11을 선별하였다. 순수 분리된 균주를 동정한 결과, 균주는 호기성, 그람-양성, 호염성이며, 세포의 크기는 1∼1.5mm로서 형태는 간균형, 극편모에 의한 운동성이 있는 형태학적 특성을 가지고 있었다. 또한, 서열목록 1에 기재된 DNA 서열을 가지며, 높은 염분 농도에서도 안정적으로 생장이 가능한 특징을 나타냈다(도 2, 도 3, 실시예 3 참조).

한편, 종명을 확인하기 위해, 상기 균주 GB11을 분자 유전학적인 방법으로, 16S rRNA를 암호화하고 있는 세균의 특이 프라이머를 이용하여 자동염기서열분석기를 사용하여 분석한 결과, 상기 GB11 균주는 오셔노바실러스(Oceanobacillus sp.) 속으로 동정되었다(도 1참조).

따라서, 본 발명자들은 상기 동정된 균주를 "오셔노바실러스속(Oceanobacillus sp.) GB11"라고 명명하고, 이를 한국생명공학연구원, 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 2008년　 11월 14일자로 기탁번호“KCTC18150P”를 부여받았다.

본 발명의 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주는 간척지, 바다매립지, 비닐하우스, 염류집적지 등의 염이 고농도로 집적된 토양에서 생존 가능할 뿐 아니라(도 2, 도 3, 실시예 3 참조), 다양한 효소를 생산할 수 있는 능력이 있으므로(표 3 참조), 상기 균주 또는 상기 균주의 균체 또는 그 배양액을 포함하는 미생물 비료 또는 토양 개량제를 제조하는데 적합하다.

본 발명에서 '미생물 비료'는 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주, 또는 상기 균주의 균체 또는 그 배양액을 유효성분 또는 첨가제로 함유하는 비료를 모두 포함한다.

본 발명에서 '토양 개량제'는 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주, 또는 상기 균주의 균체 또는 그 배양액을 유효성분 또는 첨가제로 함유하는 조성물로, 토양 특히, 간척지, 바다매립지, 비닐하우스 및 염류 집적지와 같은 염분이 많은 토양의 개량을 목적으로 사용될 수 있는 것이면 모두 포함한다. 한편, 일반적으로 시중에서 토양 개량을 위하여 사용하고 있는 성분과 본 발명에 의한 균주, 또는 상기 균주의 균체나 배양액을 함께 사용할 수도 있다. 함께 사용 가능한 성분으로는, 본 발명에 의한 미생물의 운반체나 서식처로서의 역할을 잘 수행할 수 있는 것을 사용하는 것이 좋다. 예컨대, 숯가루, 밀기울, 제오라이트, 목탄, 이탄, 피트모스, 펄라이트 등을 사용할 수 있다. 숯가루는 토양물리성 개선, 비료성분의 흡착효과 이외에 많은 공극을 갖고 있어 유용한 토양미생물의 서식처로서 이용할 수 있는 공간을 제공할 수 있다. 또한 식물생육에 필요한 양분인 칼륨, 칼리 등과 붕소와 같은 미량원소를 함유하여 식물생장을 촉진하면 태양광선 흡수를 높여주므로 지온상승 효과 등이 있어 식물 생육에 유리하게 작용할 수 있다. 밀기울은 질산태 질소함량을 현저하게 낮혀주고, 암모니아태 질소의 질소 함량을 현저히 높여주는 효과가 있다. 따라서, 토양에 밀기울을 처리하면 토양 미생물의 번식을 왕성하게 하여 토양 중의 질산태 질소를 미생물체의 생체질소(Biomass N)로 고정하거나 암모니아태 질소로 환원시킬 수 있을 것으로 사료된다. 제오라이트는 지력보강, 보비력증진, 보수력 증진, 유해가스 흡착, 미량요소 공급, 건묘육성, 토양의 활성화, 악취제거 등의 그 효과가 식물 생육에 유리하게 작용할 수 있다. 목탄은 다공성 자재로서 밭토양에 시용할 때 토양물리성 및 미생물상 개선에 의한 증수 효과를 위하여 사용할 수 있다. 이탄(泥炭, peat)은 배양토(상토)의 원료로 주로 사용되는 것으로, 이끼류, 갈대, 사초 등의 화본과식물, 때로는 소나무, 자작나무 등의 수목질의 유체가 분지에 두껍게 퇴적하여 물의 존재 하에서 균류 등의 생물화학적인 변화를 받아 분해, 변질된 것이다. 피트모스(土炭, peatmoss)는 물이끼가 오랫동안 물 속의 지층 속에 갇혀있으면서 공기가 차단되어 완전히 썩지 못하고 부분적으로 탄화(부분적으로 분해)되어 만들어 진 것이다. 액상이 75%까지로 물을 지니는 성질이 좋고 알갱이 사이에 공기를 지닐 수 있는 공간이 풍부하여 통기성이 우수하다. 피트모스는 무게에 비해 최대 20배까지 물을 흡수할 수 있어 식물은 필요한 만큼 수분을 서서히 그리고 오랫동안 이용할 수 있다. 양분 보존 능력이 높고 지효성으로 흙속의 유기물 생성을 도우며 자체유기물이 분해되어 지속적인 효과를 유지한다는 장점이 있다. 펄라이트(pearlite)는 하얀 각각의 알갱이들은 아주 많은 작은 기포들로 채워진다. 알갱이 표면은 작은 공극으로 뒤덮여 있기 때문에 아주 큰 표면적을 갖게 된다. 펄라이트는 보비력과 보수력이 우수하고 식물의 뿌리가 적절히 이용할 수 있도록 해주며, 알갱이의 물리적 모양은 최적의 통기성과 배수성을 제공하는 공기의 통로가 형성된다. 식물의 밑에 뿌려두면 햇빛을 반사시켜 광합성량을 증가시킬 수 있다.

상기 미생물 비료와 토양 개량제는 액상, 분말 등 다양한 형태로 제조될 수 있다. 액상으로 제조되는 미생물 비료의 경우, 식물의 종자에 침지 또는 분무하여 이용할 수 있으며, 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화하여 사용할 수도 있다. 그러나 이에 제한되지 않으며, 여러 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주, 또는 상기 균주의 균체 또는 그 배양액을 유효성분 또는 첨가제로 함유하는 비료를 모두 포함한다. 이를 포함하는 미생물 비료 또는 토양 개량제는, 염분이 높은 토양에서 활발한 생존양식을 보이는 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주를 포함하므로, 환경친화적이며, 토양에 토착하고 있는 토양 미생물군집 (microbial community)의 활성을 높이고, 토양 미생물군집의 활성에 따른 활발한 대사작용에 의해서 생산되는 다당류 등의 대사물질들에 의해서 토양의 구성체인 부식산 및 점토가 서로 결합하도록 하므로, 궁극적으로는 토양 입단화를 촉진하여 토양구조도 개선할 수 있다. 따라서, 척박한 토양의 토양 개량을 위하여 본 발명에 의한 미생물 비료 또는 토양 개량제를 사용할 수 있다는 장점이 있다.

따라서, 상기 본 발명에 의한 미생물 비료 또는 토양 개량제에 의하면, 염분이 높은 토양에서도 식물의 생장을 촉진할 수 있어, 식물의 생장률 및 활착률을 증진시킬 수 있으며, 다른 미생물의 성장을 촉진할 수 있어 토양의 생물학적 성질을 개량할 수 있으므로, 식물 생장을 촉진하는 방법 또는 토양을 개량하는 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명에서 '식물 생장을 촉진하는 방법'이란, 식물의 생장률 또는 활착률을 증진시키거나, 식물이 기반으로 하고 있는 토양 내의 미생물의 종류 또는 수를 증진시키는 방법 등을 포함한다.

본 발명에서 '토양을 개량하는 방법'이란, 토양 내의 미생물의 종류 또는 수를 증진시키는 방법, 미생물의 대사작용에 위해 생산되는 다당류 등의 대사산물에 의하여 토양구조를 증진시키는 방법 등을 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 　 간척지에서 오셔노바실러스 속 GB11 균주의 분리

본 발명은 간척지에서 높은 내염성을 가지고 유기물 분해기능이 우수한 균주를 분리하기 위하여 간척지 토양 시료를 배지 (Marine agar) (NaCl 19.45g, MgCl₂ 8.8g, Peptone 5.0g,　Na₂SO₃ 3.24g, CaCl₂ 1.8g, 효모 추출물 1.0g, KCl 0.55g, NaHCO₃ 0.16g, 구연산 철 0.1g, KBr 0.08g, SrCl₂ 0.03g, H₃BO₃ 0.02g, Na₂HPO₄ 8mg, Na₂SiO₃ 4.omg, NH₄NO₃ 1.6mg, 아가 15g) 및 10% TSA (Tryptic soy agar) 배지 (Pancreatic digest of casein 1.5g, Papaic digest of soybean 0.5g, NaCl 5.0g, Agar 15g)를 증류수로 녹이고 1L로 채워서 121℃, 15분간 고온 멸균시켜 고체 배지를 제조한 뒤, 상기 제조된 고체 배지에 토양시료를 인산 완충액에 희석해서 도말하였다. 28℃와 37℃에서 48 시간 동안 배양하여 1차적으로, 형태와 색이 다른, 총 37 종의 균주를 선발했다.

상기 선발된 균주의 생장에 필요한 온도, pH, NaCl농도를 측정한 결과, 10~45℃ 온도, pH6~10, 1~20％ NaCl 농도에서 각각 좋은 성장을 보였다. 즉, 상기 조건이 충족되는 넓은 범위에서 상기 선발된 균주가 응용될 수 있는 가능성이 있음을 확인하였다.

상기 선발된 37 종의 균주를 대상으로 NaCl을 포함한 고체 배지 및 액체 배지에서 NaCl의 농도별 실험을 통해, 높은 NaCl 농도에서도 좋은 증식을 보이는 염내성이 뛰어난 균주 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주를 최종적으로 선발하고 계대배양을 통하여 균주의 활성을 확인하고 다음 실험을 위하여 글리세롤 저장법(glycerol stock)으로 보존하였다.

[ 실시예 2] - 분리된 오셔노바실러스 속 GB11 균주의 동정

실시예 1에서 분리된, 호염성 균주를 동정하였다. 16S rRNA를 암호화하고 있는 세균의 특이 프라이머를 제작하여 PCR로 증폭하여 얻은 약 1.5Kb의 DNA 조각을 자동염기서열분석기를 사용하여 분석하였다. 염기서열 분석은 (주)마크로젠에 의뢰하여 수행하였다. 포워드 프라이머(Forward primer)와 리버스 프라이머(Reverse primer)의 서열은 다음과 같다.

518F: 5' CCAGCAGCCGCGGTAATACG 3'

800R: 5' TACCAGGGTATCTAATCC 3'

분석 결과, 상기 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주의 DNA 염기서열(서열번호1)은 Oceanobacillus cibarius A34(EF660762)와 1415 염기 중, 1391 염기가 일치하여 98%의 상동성을 보였으며, Oceanobacillus chironomi LMG 23627(DQ298074)와는 1464 염기 중, 1394 염기가 일치하여 95%의 상동성을 보였다. Virgibacillus carmonensis LMG 20964 (AJ316302) 와는 1460 염기 중 1373 염기가 일치하여 94%의 상동성을 보였다(도 1 참조).

또한, 상기 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주의 분자계통학적 분류를 위해서 RDP II(Ribosomal Database Project II)에서 GB11균주와 가장 상동성이 높은 오셔노바실러스(Oceanbacillus)의 대표적인 표준균주(Type strain)와 바실러스(Bacillus)의 대표적인 표준균주의 염기서열을 다운로드하였다. 다운로드한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주의 염기서열과 GB11균주의 염기서열을, 미국 버클리 국립연구소에서 운영하는 Greengenes 웨사이트 (www.greengenes.lbl.gov)에서 다중서열정렬(Multiple sequence alignment)하였다. 상기 다중서열정렬을 수행하여 얻어진 결과를 계통해석하기 위해, MEGA4(www.megasoftware.net)를 이용하여 계통도를 작성했다. 계통도의 신뢰도를 얻기 위해서 1000번의 Bootstrap test를 하였으며 계통도에 보이는 수치가 이를 설명하고 있다. 근린결합법 (Neighbor-Joining)으로 계통도를 제작하여, 이를 도 1에 나타냈다.

또한, 본 발명에 의한 신규한 오셔노바실러스 GB11 균주는 호기성, 그람-양성, 호염성이었으며, 생화학적 특성은 표 2와 같았다. Vitek II(bioMerieux)과 Biolog를 이용하여 효소활성 및 탄소원이용능 등을 실험한 결과, 다양한 효소를 생산할 수 있는 능력 및 탄소원이용능이 있음을 알 수 있었다(표2).

기질 ( Substrate )	GB11	기질( Substrate )	GB11
α-사이클로덱스트린		D-트레할로오스	＋
β-사이클로덱스트린		투라노스
덱스트린	＋	자일리톨	＋
글리코겐		D-자일로스
이눌린		아세트산
만난		α-하이드록시 부티릭산
트윈 40 (tween 40)		β-하이드록시 부티릭산
트윈 80(tween 80)		γ-하이드록시 부티릭산
N-아세티-D-글루코사민	＋	ρ-하이드록시 페닐 아세트산
N-아세틸-D-만노사민		α-케토 글루타르산
아미다인 (amygdain)		α-케토 발레르산
L-아라비노스		락타미드 젖산 메틸 에스테르
D-아라비톨	＋	L-젖산
알부틴		D-말산
셀로비오스		L-말산
D-프룩토스	＋	메틸 피루베이트	＋
L-푸코스		모노메틸 숙시네이트
D-갈락토오스		프로피온산
D-갈락투론산		피루브산
겐티오비오스		숙시남산
D-글루콘산		숙신산
α-D-글루코오스	＋	N-아세틸 L-글루탐산
m-이노시톨		알라닌아미드 (alaninamide)
α-D-락토오스		D-알라닌
락툴로오스		L-알라닌
말토오스	＋	L-알라닐글리신 (L-alanylglycine)
말토트리오스		L-아스파라긴
D-만니톨	＋	L-글루탐산
D-만노오스	＋	글리실-L-글루탐산
D-멜레치토스		L-피로글루탐산
D-멜리비오스		L-세린
α-메틸-D-갈락토시드		퓨트레신(putrescine)
β-메틸-D-갈락토시드		2,3-부탄디올
3-메틸 글루코오스		글리세롤	＋
α-메틸-D-글루코오스		아데노신
β-메틸-D-글루코오스		2-데옥시 아데노신
α-메틸-D-만노시드		이노신
팔라티노스		티미딘
D-시코스 (D-psicose)	＋	우리딘
D-라피노스		아데노신-5'-1인산염
L-람노스		티미딘-5'-1인산염
D-리보오스	＋	우리디엔(uridien)-5'-1인산염
D-살리신		프룩토오스-6-인산염
세도헵툴로산		글루코오스-1-인산염
D-소르비톨	＋	글루코(glucoe)-1-인산염
스타키오스		글루코(glucoe)-6-인산염
수크로오스		D-L-α-글리세롤인산
D-타가토스

<표 2.오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주의 생화학적 특성>

효소	GB11
알라닌 아릴아미다아제
Ala-Phe-Pro 아릴아미다아제	＋
알카린 포스파타아제	＋
아르기닌 디하이드로라아제
엘마	＋
L-아스파라테이트 아릴아미다아제
L-루신-아릴아미다아제	＋
L-리신-아릴아미다아제
L-피로글루탐산 아릴아미다아제 (Pyrase)	＋
L-피롤리도닐-아릴아미다아제	＋
페닐알라닌 아릴아미다아제	＋
포포릴 콜린 (Phophoryl Cholilne)
포스파티딜이노시톨 포스포리파아제 C
프롤린 아릴아미다아제
티로신 아릴아미다아제	＋
우레아제
α-갈락토시다아제
α-글루코시다아제
α-만노시다아제
β-갈락토시다아제
β-글루코시다아제
β-만노시다아제
β-N-아세틸-글루코사민다아제
β-자일로시다아제

<표 3.균주 GB 11의 효소 활성>

상기의 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성을 바탕으로, 본 균주를 신규한 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.)에 속하는 균주로 확정하고 GB11로 명명하였다. 참고로, 상기 GB11 균주의 퀴논은 MK-7이었고, 대표적인 지방산은 14:0 ISO, 15:0 ISO, 15:0 ANTEISO, 16:0 ISO, 17:0 ANTEISO였다. 상기 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2008년 11월 14일에 기탁하고 균주번호 KCTC18150P를 부여받았다.

[ 실시예 3] 　 오셔노바실러스 GB11 의 내염성 시험

오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주가 간척지에서 재차 생존할 수 있는지를 알아보기 위해, 염 농도를 달리하여 생존율을 측정하여, 그 결과를 도 2와 도 3에 나타내었다.　고체 배지 시험에서, 0%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%의 NaCl 을 녹여서 제조한 배지 (Marine agar)와 10% TSA (Tryptic soy agar)에, 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주를 각각에 접종하여 생존 시험을 하였다. 그 결과, 20%의 NaCl이 녹은 배지를 제외한 15%의 NaCl을 포함하는 나머지 배지에서는 모두 생존하였다. 또한 액체 배지 시험에서, 0%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%의 NaCl을 각각 녹인 뒤 제조한 배지 (Marine broth)와 10% TSB (Tryptic soy broth)에, 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11 균주를 각각의 배지에 접종하여 48시간까지 6시간 간격으로 염내성을 관측하였다. 그 결과, 5%와 10% 농도의 NaCl이 녹은 배지에서 가장 높은 생존률을 보였음을 알 수 있었다(도 2 참조). 10% TSB (Tryptic soy broth) 배지의 경우, 2%와 5%의 NaCl을 포함하는 배지에서 시간이 경과함에 따라 생장률이 증가하였다. 5%와 10% NaCl을 포함하는 배지에서는 지속적인 생장률을 보였다(도 3 참조). 상기 결과를 환산하면 0.5 내지 2.5M의 범위의 높은 염농도에서 상기 균주가 생존할 수 있다는 것이므로, 중도호염성 세균으로 분류할 수 있다. 한편, 고체 배지, 특히 10% TSA (Tryptic soy agar) 배지에 대한 내염성 시험에서는, 온도가 높아짐에 따라 생존율이 떨어졌다(표 4 참조). ○은 생존을 보이며, X는 생존하지 않았음을 나타낸 것이다.

	28℃	37℃	40℃	45℃	50℃
Marine agar	○	○	○	○	X
10% TSA	○	○	X	X	X

<표 4.배양온도와 배지와의 관계>

[ 실시예 4] 　 오셔노바실러스 GB11 균주의 식물 생장 촉진 효과

전북 무안군의 새만금 매립지에서 임해매립지 토양을 채취한 것을 준비하였다.　피트(50%), 피트모스(20%), 펄라이트(5%), 제오라이트(5%), 숯가루(10%), 쌀겨(5%), 탈지강(5%)을 잘 혼합한 토양 개량제를 준비하였다. 상기 혼합하여 제조한 토양 개량제는 접종되는 미생물의 운반체나 서식처로서의 역할을 하며, 토착미생물의 서식처를 제공하는데 사용된다.

포트에 임해 매립지 토양: 토양 개량제: 표토 (밭토양)을 4.5:4.5:1의 비율로 밑 부분부터 고르게 뿌려서 깔아서, 포트의 하부층에 임해매립지 토양, 그 상부에 토양개량제, 그 상부에 밭토양이 위치하도록 하였다. 밭토양은 장기간 농약과 비료를 투여하지 않은 토양을 선별하여 사용하였다.

상기와 같이 매립지 토양: 토양 개량제: 밭토양이 깔린 포트를 4개 준비하고, 그 외 간척지 토양으로만 채운 하나의 포트를 준비하였다. 준비한 포트 모두에 공시 작물로서 항암쌈배추를 정식하였다. 배추의 생산은 비닐 하우스 (10℃) 내에서 실시하였다 (온도는 자동으로 조절되는 시설이었다). 정식 후, 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11을 포함하는 배양액을 포트에 관주하였다. 포트 내에 포함되는 토양의 전체 중량 대비 0.5%, 1.5%, 2.5%로 본 발명에 의한 GB11 균주 배양액을 매립지 토양, 토양 개량제, 밭토양이 깔린 3개의 포트에 각각 관주하였으며, 아무것도 투여하지 않은 포트는 대조군으로 하였다. 모든 시험구는 3반복으로 시험하였다. 관주 후, 항암쌈배추의 생장 촉진 정도를 5주 후에 관찰하여 하기 표 5에 나타내었다.

처리구	엽수(개)	엽폭(cm)	엽장(cm)	엽중(g)	건근중(g)
간척지 토양¹	-	-	-	-	-
대조구	4.67	2.37	4.07	3.05	0.13
0.5%	6.00	3.10	5.97	5.97	0.21
1.5%	5.33	2.73	4.77	3.82	0.49
2.5%	5.33	2.67	5.23	4.43	0.41

¹ 고사했음.

<표 5.오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11을 포함하는 배양액이 항암쌈배추의 생육에 미치는 영향>

상기 결과로부터 알 수 있듯이, 간척지 토양만 포함하는 포트에서는 식물이 생장할 수 없었으나, 본 발명에 의한 미생물이 첨가된 토양에서는 식물의 생존률이 높다. 또한, 단순히 토양 개량제만 첨가된 경우에 비하여, 본 발명에 의한 미생물이 토양 개량제와 혼합하여 사용되는 경우, 더 높은 생장률을 보였다. 그 외, 1.5중량%의 배양액이 첨가될 때, 대조군에 비하여 3.8 배의 건근량을 보인다는 것을 확인하였다.

이로부터, 본 발명에 의한 미생물은 식물의 활착률을 증진시키는데 기여한다는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 의한 방법에 따라 분리·동정된 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주는 간척지 및 바다매립지, 비닐하우스 염류집적지와 같은 높은 염류에 의한 식물생육이 어려운 환경에서도 안정적으로 생존 가능하므로, 미생물 비료 또는 토양 개량제 등의 식물 생장 또는 토양 개량을 목표로 하는 조성물의 첨가제로서 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11균주는 식물의 생장 촉진, 염류 집적지의 환경오염 저감, 식물의 생장률 및 활착률을 증진시킬 수 있어 농가 및 간척지 조성 등에도 큰 도움을 줄 수 있어 유용하다.

한국생명공학연구원

KCTC18150

20081114

서열목록 전자파일 첨부

Claims

내염성을 갖는 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11(KCTC18150P).
제 1항의 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11을 포함하는 미생물 비료.
삭제
제2항의 미생물 비료를 이용하여 식물 생장을 촉진하는 방법.
제 1항의 오셔노바실러스 속(Oceanobacillus sp.) GB11을 포함하는 토양개량제.
삭제
제 5항에 있어서, 상기 토양은 간척지, 바다매립지, 비닐하우스 및 염류집적지 중에서 선택된 것인 토양개량제.
제 5항의 토양개량제를 이용하여 간척지, 바다매립지, 비닐하우스 또는 염류집적지의 토양을 개량하는 방법.