KR100945784B1 - Ｃ형 간염 바이러스의 중합효소 ｎｓ５ｂ를 저해하는 c형 간염 바이러스 치료제 - Google Patents

Ｃ형 간염 바이러스의 중합효소 ｎｓ５ｂ를 저해하는 c형 간염 바이러스 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 중합효소(polymerase)를 저해(inhibition)하는 펩티드(peptide)에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 중합효소 NS5B에 특이적으로 부착하여 중합효소로서의 기능을 저해하는 펩타이드에 관한 것이다.
C형 간염 바이러스(HCV), 중합효소 NS5B, 펩티드

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 중합효소 ＮＳ５Ｂ를 저해하는 C형 간염 바이러스 치료제{The HCV treatment material inhibiting polymerase NS5B of HCV}
본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 중합효소(polymerase)를 저해(inhibition)하는 펩티드(peptide)에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 중합효소 NS5B에 특이적으로 부착하여 중합효소로서의 기능을 저해하는 펩티드에 관한 것이다.
Hepatitis C virus(HCV)는 전 세계적으로 널리 퍼져있는 C형 간염 바이러스이며, 일반적으로 숙주(host)의 면역 시스템(immune system)을 피해가며 감염된 개인의 70% 이상을 지속적인 감염상태로 유지시킨다. 주로 수혈에 의해 감염되며, 감염된 후 만성으로 진행될 경우 간경화나 간암으로까지 진행되는 것으로 보고되고 있다. HCV는 여러 유전자형(genotype)이 있으며 돌연변이(mutation)가 잘 일어나서 유전적 변이(genetic variation)에 의해 만성 간염의 경우 reinfection, coinfection 등이 일어나기도 한다. 이 때문에 HCV의 효과적인 백신(vaccine) 개발 이 어려움을 겪고 있다. 현재 치료 방법으로는 alpha interferon과 ribavirin을 병용하고 있지만 HCV의 유전자형(genotype)에 따라 그 효과도 다양하고, 재발의 가능성과 부작용이 존재한다.
이에 새로운 HCV 치료제의 개발이 요구된다.
HCV는 Flaviviridae 과(family) 내에서 Hepacivirus 속(genus)에 속하며 약 9.6kb의 positive single strand RNA genome을 가진다. HCV genome이 일단 세포(cell) 내로 감염(infection)되면 숙주(host)의 리보솜(ribosome)을 이용하여 cap independent translation을 하여 하나의 polyprotein을 만든다. HCV genome의 5’UTR(untranslated region)에는 IRES(internal ribosomal entry site)라는 secondary structure가 존재하는데 여기에 리보솜(ribosome)이 결합(binding)하여 cap independent translation을 한다. Polyprotein이 만들어지면 host와 HCV 자신의 protease를 이용하여 각각의 functional protein으로 cleavage한다. HCV polyprotein의 C terminal 부분에 위치하는 RNA dependent RNA polymerase인 NS5B는 HCV가 자신의 게놈(genome)을 주형(template)으로 복제(replication)하는 데 필수적인 효소(enzyme)이다. 그래서 NS5B는 anti-HCV drug discovery target으로 적합하다.
NS5B는 fingers, palm, and thumb subdomain으로 구성된 오른손 모양의 구조를 지녔다. Palm domain에, 모든 RNA polymerase에서 존재하는 active site인 GDD motif가 존재하며, fingers and thumb domain에서 RNA template과 상호작용을 한 다. Fingers domain에서 뻗어나온 두 개의 루프(loop)인 fingertips가 thumb domain에 contact하게 되면 RNA polymerase로서의 active form을 형성하게 된다.
이러한 HCV polymerase를 저해하는 small chemical은 수십 건이 보고되었으나, 변이가 심한 바이러스의 특징을 고려할 때 더욱 많은 수의 저해제 후보군이 필요하다. 본 발명에서는 이러한 작업의 일환으로 phage display peptide library를 스크린하여 저해효과를 가지는 peptide를 선별해 내었다.
위에서 밝힌 바에서 분명해졌듯이, 본 발명의 목적은 C형 간염 바이러스에 의한 질환을 치료할 수 있는 펩타이드의 서열을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus)의 중합효소 NS5B 억제제는, 아미노산의 서열이 서열목록 2(WSRPRSL)와 같이 구성된 펩티드인 것을 특징으로 한다.
아래의 설명 및 도면에서 살피는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 HCV NS5B polymerase에 특이적으로 부착하는 일련의 펩티드를 확보하였으며, 그중 서열목록 2의 Pep2가 HCV NS5B polymerase와 상호작용하는 것과 Pep2의 존재하에 HCV NS5B polymerase의 효소작용이 현저히 저하됨을 확인하였다.
본 발명은, phage display peptide library를 스크린하여 HCV NS5B polymerase에 특이적으로 부착하는 peptide의 서열을 확보하고, 그중 대표 peptide가 HCV NS5B polymerase의 효소작용을 억제함을 확인한 것이다.
이하 본 발명을 구체적인 실시예와 함께 설명한다.
<실시예 1> HCV NS5B polymerase에 특이적으로 부착하는 peptide의 선별
- Purification of recombinant NS5B.
Hydrophobic C terminus 21 amino acids를 제거한 HCV NS5B gene을 hexahistidin tag가 있는 pET21-a(+)에 클로닝(cloning)하였다. 그 후 E.coli BL21(DE3)에 transformation하고 Ni-NTA affinity chromatography를 이용하여 NS5B를 정제하였다. 이후 poly U sepharose chromatography를 이용하여 다시 한번 정제하였다.
- Random peptide library 제작
Random insert 는 JH1 (5'-TGC GAC GCG GCC CAG CCG GCC TGC (NNK)7 TGC GCG GCC GCA GGT GC, 서열목록 6)과 JH2 (5'-GCG CAC CTG CGG C, 서열목록 7) oligomer로 annealing을 65℃에서 15분간 denaturation 한 뒤 서서히 상온으로 내렸다. 이 partial double strand insert를Klenow fragment로 37℃에서 2시간 이상 elongation 하였다. 이 random insert는 Bgl I 과 Not I 으로 digestion하고 pCANTAB 5E 는 Sfi I 과 Not I 으로 digestion하여 ligation하였다. 그리고 E. coli TG1에 ligation한 반응물을 transformation하였다.
이렇게 11mer는 제작을 하였고, 7mer는 NEB의 Ph.D 7mer kit을 사용하였다.
-Biopanning
96 well plate에 purify한 10ug의 정제한 NS5B polymerase를 coating 시켰다. 이후 TBST (0.05% Tween 20 in 50mM TBS)로 세 번 washing하고 blocking buffer를 채운다. 1시간 상온에서 blocking한 후 TBST로 다시 세 번 washing한다. 이 후 random peptide가 display된 phage를 coating된 well에 1시간 30분간 반응시켰다. 이후 TBST로 10번 washing 후, elution buffer(pH 2.2 glycine-HCl) 100ul를 넣어 9분간 incubation하여 peptide에 binding한 phage를 elution하였다. 1M Tris-HCl(pH 9.1) buffer 15ul를 섞어 중성화한 후 overnight culture한 host strain ER2738에서 elution한 phage를 37℃에서 4시간 30분간 shaking incubation하여 증폭하였다. 증폭이 끝나면, 5분간 원심분리하여 cell을 가라앉히고, supernatant의 phage를 얻어내었다. 이것을 다른 tube로 옮겨 담고, total volume의 1/5로 PEG/NaCl을 넣어주고 4℃에서 1시간 동안 precipitation을 하였다. 12000rpm으로 15분간 원심분리 하고 supernatant를 제거하였다. Pellet에 total volume의 1/5로 TBS buffer를 넣고 한 번 더 PEG/NaCl을 total volume의 1/5로 넣어주고 4℃에서 침전반응을 하였다. 12000rpm에서 15분간 원심분리한 후 supernatant를 제거하고 남은 pellet을 TBS buffer에 녹인 후 0.2% sodium azide를 섞어서 4℃에 보관하였다. 이후 이 과정을 5번 반복하였다. 그리고 phage plaque을 얻고 QIAprep Spin M13 Kit(Quiagen)을 이용해서 M13 DNA를 isolation 하고, DNA sequencing(Macrogen)을 의뢰하였다.
표 1은 phage display peptide library를 HCV NS5B polymerase를 표적으로 biopanning 한 후에 얻어진 peptide들의 서열을 나타낸 것이다.
Figure 112008005955567-pat00001
<실시예 2> HCV NS5B polymerase 와 pep2 의 상호작용 확인
-Yeast two-hybrid assay
Matchmaker two-hybrid system 3 protocol(Clontech)에 의해서 pGAD-NS5B와 pGBK-pep을 사용하여 수행하였다. Yeast reporter strain인 AH109의 colony를 YPD medium에서 30℃ overnight culture 한 후 300ml YPD(2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose)로 transfer하여 optical density가 0.4~0.6이 될 때까지 키운다. Yeast cell을 harvest하여 D.W.로 wash하고 1XTE/LiAc buffer(0.1M Tris-Cl, 10mM EDTA + 1M Lithium acetate)로 resuspension한다. 이렇게 만들어진 competent cell에 준비된 construct, sperm carrier DNA, 그리고 PEG/LiAc solution(40% PEG, 1XTE, 1XLiAc)을 넣어주어 30℃에서 30분 shaking한다. heat shock(42℃, 15분)을 한 뒤, 얼음에 옮겨 2분간 둔다. 그리고 cell을 harvest후, 1XTE로 suspension하여 적당한 SD배지(-Trp/-Leu D.O SD medium; 0.67% nitrogen base without amino acid, 2% agar, D.O amino acid, 2% glucose, 1X histidine)에 plating하고 30℃에서 5~6일 incubation하여 colony를 관찰한다. Reporter gene발현 여부를 보기 위해 형성된 colony를 histidine이 첨가되지 않은 배지에 옮겨 키우고 형성된 colony를 이용하여 α-gal assay를 수행하였다. -Trp/-Leu/-His D.O SD 배지에서 자란 colony를 30℃에서 250rpm으로 OD600에서 0.5-1.0까지 키운다. 14,000rpm에서 2분간 spin하여 cell을 가라앉힌 후, supernatant를 새로운 tube로 옮겨assay buffer(1X NaOAc buffer; 0.5M Sodium acetate(pH4.5), 0.3% PNP-α-gal solution)를 넣어 주고 30℃에서 2시간 동안 incubation한다. Incubation후, stop buffer(1M Na2CO3)를 넣어 반응을 중지시키고 sample을 410nm에서 optical density를 측정한다.
-Cell culture와 transfection
Colocalization에 사용된 cell line은 hamster kidney cell인 BHK-21이었고, RT-PCR과 real time RT-PCR에 사용된 cell line은 human hepatoma cell에 HCV subgenomic replicon이 유지되는 cell 이다. 두 cell line 모두 10% fetal bovine serum(Hyclone), 1% penicillin G/streptomycin(Hyclone)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(Hyclone)을 이용하여 culture한다. Huh7 HCV subgenomic replicon cell line인 경우엔 G418(Sigma)을 100ug/ml을 첨가하여 subgenomic replicon을 유지하였다.
Transient transfection은 6 well plate에 BHK-21 cell을 5X104cell/well로 seeding후 24시간 후에 pcDNA4V5-NS5B 1ug과 pECFP-pep 1ug을 Lipofectamin 2000 (invitrogen) 5ug과 serum free DMEM media 100ul에 넣고 상온에서 20분간 incubation 하였다. 이후 각 well에 2ml씩 complete media를 넣고, mixture를 넣었다. 24시간 후 immunostanning을 수행하였다. Huh 7 subgenomic replicon cell line은 6 well에 1X105cell/well로 seeding 하였다. 그리고 24시간 후에 각 well당 pcDNA-GST, pcDNA-GSTpep을 1ug씩과 모든 well에 transfection efficiency를 normalize 하기위해 β-Gal gene을 가진 pCH110 (Parmacia) 0.5ug씩을 Lipofectamin 2000을 이용하여 transfection하였다.
-Immunostanning
Peptide를 CFP에 fusion 시키기 위해 pECFP-C1 (clontech)에 Bgl II, BamH I enzyme site를 사용해서 oligomer annealing으로 cloning 하였다. oligomer [peptide for-5'-GAT CTT GGT CGC GCC CGC GGT CAC TTT AAG(서열목록 8), peptide rev-5'-GAT CCT TAA AGT GAC CGC GGG CGC GAC CAA(서열목록 9)] 10pmole씩을 섞어서 94℃에서 2분 둔 뒤 상온으로 떨어뜨리면서 annealing한 후, vector와 T4 DNA ligase (promega)를 이용하여 ligation하였다. NS5B는 V5 tag가 있는 pcDNA4V5 (invitrogen)에 cloning하였다. BHK-21 cell line에 pcDNA4V5-NS5B와 pECFP-pep을 cotransfection시켰다. 그리고 24시간 후에 disc 에 있는 cell을 fixing solution(3.7% paraformaldehyde, 1N NaOH in PBS)으로 상온에서 15분간 fixation하였다. 이후 permeabilization(0.5% triton X-100 in PBS)을 상온에서 5분간 하였다. Washing solution(0.1% triton X-100 in PBS)로 10분간 세 번 washing을 한 후 blocking solution(10% calf-serum, 0.5% gelatin in PBS)으로 30분간 cover slip을 blocking하였다. 그 후 Washing solution으로 5분간 세 번 washing하고, V5 antibody(invitrogen)를 1:100으로 상온에서 1시간 처리하였다. 이후 washing을 10분간 세 번 수행하고, TRITC가 conjugation된 secondary antibody(Jackson ImmunoResearch)를 1:100으로 1시간 처리하고 10분간 세 번 washing 하였다. 다음으로 mounting solution(10mg/ml p-phenylenediamine, 20% glycerol, pH 8.5)으로 mounting 하고, confocal microscope(Bio-rad)으로 cell을 관찰하였다.
-ELISA
96well plate에 purify한 NS5B 4ug과 coating buffer (0.1M NaHCO3 pH8.6)로 100ul 넣고 4℃에서 overnight하여 coating하였다. NS5B가 coating 된 well을 PBST (0.05% Tween 20 in PBS)로 세 번 washing 한 뒤 blocking buffer (3% skim milk in PBST)로 blocking 하였다. 그 후에 PBST로 세 번 washing 하고, purify한 GST, GST-pep을 각각 dose dependent(40, 400, 100, 4000, 8000ng)하게 100ul씩 채웠다. 상온에서 두 시간 동안 incubation 한 후, 세 번 washing하고 HRP-conjugated anti-GST antibody (Amersham)를 처리하였다. 한 시간 동안 상온에서 incubation한 후, 다시 washing을 하였다. 2,2‘-Azino-bis(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid)(Sigma)를 100ul 넣고 발색반응을 보았다. 이후 405nm에서 plate reader(Bio rad)로 측정하였다.
<실시예 3> Pep2 는 HCV NS5B polymerase 의 효소작용을 억제한다.
-Realtime RT"]PCR
Mammalian cell에서 발현시킬 수 있는 pcDNA3 vector에 GST fusion peptide를 cloning 하였다. pGEX-pep에서 GST fusion peptide를 PCR한 후 EcoR V, Xho I site를 이용하여 cloning 하였다.Huh7 HCV subgenomic replicon cell line에 pcDNA-GSTpep을 transfection한 후 24시간 후 total RNA를 RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용하여 isolation 하였다. 이후 random hexamer를 primer로 사용해서 superscript II(invitrogen)로 reverse transcription을 수행하였다. 이후 real-time PCR (bio-rad)을 수행하였다. HCV replicon probe(5'-6FAM-CCACATTACGGCGGTGTCGGCT-BHQ1, 서열목록 10)와 primer(5'-TTCCATG CTCACCGACCC, 5'-CGCCCATCTCCTGCCG, 서열목록 11 및 12)를 사용하였고, normalization factor로 사용한 human GAPDH gene의 probe(5'-6FAM-CCGACGCCTGCTTCACCACCTT-BHQ1, 서열목록 13)와 primer (5'-AAACCTGCCAAATATGATGACAT, 5'-GCCCAGGATGCCCTTGA, 서열목록 14 및 15)를 사용하여 95℃에서 3분 동안 denaturation 하고, 이 후 95℃ 30초, 59.3℃ 30초로 40 cycle을 real time PCR을 수행하였다.
-western blot
Huh7 HCV subgenomic replicon cell line에 pcDNA-GST, pcDNA-GSTpep을 각 각 2ug씩 transient transfection 하였다. 24시간 후 RIPA buffer (50mM Tris-Cl pH8.0, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 150mM NaCl)를 200ul씩 넣고 ice에서 30분간 incubation하여 cell을 lysis 시켰다. 이 후 protein 정량을 bradford assay(Bio rad)로 해서 같은 양을 12% acrylamide gel에 loading하였다. 이 후 nitrocellulose membrane으로 transfer한 후 blocking buffer (3% skim milk in TBST)로 상온에서 한 시간 blocking하였다. TBST(10mM Tris-Cl pH8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 10분간 세 번 워싱(washing)한 후, mouse anti-NS5A antibody (Chemicon), HRP-conjugation anti-GST antibody(Amersham), anti-α-actin antibody(Santa Cruz Biotechnology)로상온에서 1시간 incubation 하였다. TBST로 10분간 세 번 wash 후에, mouse HRP secondary antibody(Sigma)를 1시간 처리 후, ECL detection system (Amersham)으로 detection하였다.
이상 살펴본 바와 같이, HCV NS5B polymerase에 특이적으로 부착하는 일련의 peptide를 확보하였으며, 이중 Pep2가 HCV NS5B polymerase와 상호작용하는 것을 여러 방법으로 확인하였고, Pep2의 존재하에 HCV NS5B polymerase의 효소작용이 현저히 저하됨을 확인하였다(도면 및 그 간단한 설명 기재 참조).
도 1은 HCV NS5B polymerase와 pep2간의 상호작용을 나타내는 yeast two hybrid assay의 결과이다. NS5B와 pep2는 서로 상호작용하여 test strain인 yeast가 test 배지에서 성장하도록 했다.
도 2에서는 BHK21 cell line에 pcDNA4V5NS5B, pEGFP-Pep2을 각각 transient transfection하고 24시간 후 V5 antibody, TRITC secondary antibody를 이용하여 NS5B(red)를 염색하였다. Selected peptide EGFP가 fusion되어 있어 fluorescence를 나타내었다. 그리고 confocal microscopy로 확인한 결과 두 단백질이 같은 위치에서 상호작용하고 있음을 확인하였다.
도 3에서는 Pep2에 GST를 fusion시킨 후, NS5B와의 interaction을 확인하였다. NS5B를 4ug coating한 후 GST or Pep2-GST을 dose dependent(40, 400, 1000, 4000, 8000ng)하게 binding시 켜주고 GST antibody를 이용하여 ELISA를 수행한 결과 두 단백질의 상호작용을 확인하였다.
도 4에서는 HCV replicon cell line에 GST or Pep2-GST을 transient transfection시켰다. 24시간 후 real-time RT-PCR을 통해서 RNA 양을 비교한 결과 Pep2가 존재할 때에 HCV replicon RNA의 양이 현저히 감소함을 확인하였다.
도 5에서는 도 4와 같은 조건에서 Western blot을 수행하여, replicon에 의하여 생성되는 NS5A 단백질의 양이 pep2의 존재하에 현저히 감소함을 확인하였다.
<110> Lee Sang Hwan ; INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANKUK UNIVERSTIY OF FOREIGN STUDIES <120> The peptide inhibiting polymerase NS5B of HCV <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep1 <400> 1 Cys Ala Thr Arg Leu Gly Arg Ser Ser Arg Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep2 <400> 2 Trp Ser Arg Pro Arg Ser Leu 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep3 <400> 3 Thr Gly Pro Leu Pro Lys Glu 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep4 <400> 4 Cys Met Ala Phe Phe Ile Ser Arg Trp Arg Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep5 <400> 5 Asn Tyr Asn Leu Ser Arg Asn Leu Thr Trp Phe Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH1 <400> 6 tgcgacgcgg cccagccggc ctgcnnknnk nnknnknnkn nknnktgcgc ggccgcaggt 60 gc 62 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2 <400> 7 gcgcacctgc ggc 13 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer3 <400> 8 gatcttggtc gcgcccgcgg tcactttaag 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer4 <400> 9 gatccttaaa gtgaccgcgg gcgcgaccaa 30 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV replicon probe <400> 10 ccacattacg gcggtgtcgg ct 22 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV replicon primer 1 <400> 11 ttccatgctc accgaccc 18 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV replicon primer 2 <400> 12 cgcccatctc ctgccg 16 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GAPDH gene probe <400> 13 ccgacgcctg cttcaccacc tt 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GAPDH gene primer 1 <400> 14 aaacctgcca aatatgatga cat 23 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GAPDH gene primer 2 <400> 15 gcccaggatg cccttga 17

Claims (1)

  1. 아미노산의 서열이 서열목록 2(WSRPRSL)와 같이 구성된 펩티드인 것을 특징으로 하는,
    C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus) 치료제.
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KR1020080007427A KR100945784B1 (ko) 2008-01-24 2008-01-24 Ｃ형 간염 바이러스의 중합효소 ｎｓ５ｂ를 저해하는 c형 간염 바이러스 치료제

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20040180333A1 (en) 2000-12-22 2004-09-16 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Self-replicating RNA molecule from hepatitis C virus
US20050187165A1 (en) 2003-11-12 2005-08-25 Scola Paul M. Hepatitis C virus inhibitors
US20070010455A1 (en) 2005-07-11 2007-01-11 Piyasena Hewawasam Hepatitis C virus inhibitors

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