KR100935611B1 - 유전성 빈혈 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

유전성 빈혈 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전성 빈혈 치료제 스크리닝 조성물 및 이를 이용하는 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 퍼록시레독신 Ⅱ(Peroxiredoxin Ⅱ, Prx Ⅱ)가 적혈구에서 산소를 운반하는 헤모글로빈(Hemoglobin)과 결합하여 산화적 스트레스로부터의 공격을 방어하여 적혈구의 수명을 유지하고, 유전성 빈혈의 근본 원인인 헤모글로빈 단백질의 분해집성(aggregation)을 저해하여 헤모글로빈의 안정성을 회복시킬 수 있는 효과가 있으므로, 헤모글로빈의 분해집성을 저해하거나 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈의 결합정도를 증진시키는 물질을 검색함으로 유전성 빈혈 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
퍼록시레독신 Ⅱ, 적혈구, 산화적 스트레스, 헤모글로빈, 유전성 빈혈

Description

유전성 빈혈 치료제의 스크리닝 방법{A screening method of the treatment agent for inherited anemia}
본 발명은 유전성 빈혈 치료제 스크리닝 조성물 및 이를 이용하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
퍼록시레독신(Peroxiredoxin, Prx)은 생체 내에서 과산화수소 및 알킬 하이드로퍼록사이드의 스캐빈저(scavenger)이다(Chae, H. Z. et al., Proc . Nat . Acad . Sci. 91: 7017-7021, 1994). 포유동물에서는 타입 I ~ VI 퍼록시레독신 아이소자임이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 조직의 다양한 부분에서 관찰된다(Rhee. SG, et al., IUBMB Life 52: 35 ~ 41, 2001). 이것은 세포 내에서 강한 항산화 활성을 나타낸다. 퍼록시레독신 타입 VI를 제외하고 이미 알려진 모든 퍼록시레독신은 전자 공여자(electron donor)로서 티오레독신(thioredoxin)을 이용하고, 그래서 티오레독신 퍼록시다제로서 알려져 있었다. 이들의 항산화 활성에 더하여, 퍼록시레독신은 세포 증식 및 분화, 자연킬러세포(natural killer cell) 활성의 증강, 라디칼 에 민감한 단백질의 보호, 힘(heme) 대사과정 및 세포간 신호전달과 같은 많은 세포의 기능들에 연관되어 있으며(Nemoto Y. et al., Gene 91: 261 ~ 265, 1990; Prosperi MT, et al., Genomics , 19: 236 ~ 241, 1994; Tsuji K, et al., Biochem J. 307: 377 ~ 381, 1995; Shau H, et al., Immunogenetics , 40:129~134,1994; Watabe S, et al., Biochem Biophys Res Commun . 213: 1010 ~ 1016, 1995; Iwahara S, et al., Biochemistry 34: 13398 ~ 13406, 1995; Wen ST, et al., Genes Dev . 11: 2456 ~ 2467, 1997), 배양한 동물세포에서의 퍼록시레독신의 생화학적 특성은 세포내 산화 환원 전위(redox-potential)를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것 중의 하나임을 보여준다.
퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, Prx Ⅱ)는 항산화 단백질로, 혈소판유도성장인자(platelet-derived growth factor, 이하, PDGF)와 상피세포유도성장인자(epidermal growth factor, EGF)를 포함하는 성장인자들에 의해 생성되는 세포내 H2O2를 H2O로 환원시켜 제거하는 퍼록시다아제이다. 퍼록시레독신 Ⅱ는 세포질에 많이 존재하며, 단백질의 C-말단부위를 통해 인테그랄 막단백질 또는 세포막에 결합하는 것으로 알려져 있으며, H2O2에 높은 친화성(Km for H2O2 < 10μM)을 가진다. 또한, 퍼록시레독신 Ⅱ는 적혈구에서 많이 발현이 되고, 세포 내에서 활성산소종(reactive oxygen species: ROS)-매개된 손상에 대하여 보호하는 역할을 한다고 알려져 있고, 헤모글로빈 축적 전에 적혈구 분화 초기 단계에서 유도된다고 알려져 있다(Rabilloud T, et al., Biochem J. 312: 699 ~ 705, 1995). 상기에서 PDGF는 H2O2의 세포 내 생성을 통하여 다양한 신호전달 단백질들의 타이로신 인산화를 조절하는 성장인자로, 특히 혈관재형성(vascular remodeling) 동안 평활근세포(smooth muscle cells)의 증식과 이동에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이때 PDGF에 의한 신호전달 과정에서 생성되는 H2O2를 제어하는 조절자로서 퍼록시레독신 Ⅱ가 보고되어 있으나 이와 관련한 보다 상세한 기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다.
유전성 악성빈혈인 지중해빈혈 및 겸상적혈구빈혈의 적혈구는 정상인보다 산소 보유력이 약하여 저 산소 상태로 활성산소(ROS)를 많이 생성한다. 이 활성산소의 영향으로 헤모글로빈이 분해되고 엉겨서 비정상적인 적혈구가 된다. 환자는 이 비정상적인 적혈구에 의해 소혈관이 막히고, 이어서 용혈현상이 발생한다. 임상증상으로는 비장비대, 황달, 빈혈, 백혈구증가, 궤양과 심한통증 등이 나타난다. 또한 용혈에 인한 혈색소의 철성분이 내장에 침착되어 간 신장 등 내장에 심한 손상을 초래한다.
유전성 빈혈환자는 전 세계적으로 수억 명이나 된다. 지금까지 적용 또는 시도되고 있는 치료방법으로는 수혈치료, 비장제거치료, 유전자치료, 항산화제투여, 골수이식 등이 있다. 그러나 상기 치료방법에 의한 효과는 환자에 따라서 천차만별이다. 유전자치료는 아직 연구단계이고, 골수이식은 적당한 골수를 찾기 어려운 문제가 존재할 뿐만 아니라 수혈치료 후의 면역반응 때문에 실패하는 경우가 많다. 최근 많이 연구되고 있는 치료방법으로는, 치료 타겟을 찾고 타겟에 대한 조절제를 개발하여 질병을 치료하는 것이다.
본 발명자들은 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질이 산화적 스트레스로부터의 적혈구 손상을 보호하는 기능에 대해서 보고한바 있다(Tae-Hoon Lee, et.al., Blood 101(12), pp.5033-5038, 2003). 그러나 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질이 헤모글로빈과 직접 결합하여 보호한다는 보고는 없다.
이에, 본 발명자들은 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자가 결손된 동종접합체 (homozygote) 마우스와 유전성 빈혈인 지중해빈혈 및 겸상적혈구빈혈 환자의 적혈구를 이용하여, 퍼록시레독신 Ⅱ가 헤모글로빈과 결합하여 적혈구의 기능을 보호하는 새로운 작용기전을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈을 유효성분으로 함유하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈을 유효성분으로 함유하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 스크리닝용 조성물을 이용한 유전성 빈혈 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
퍼록시레독신 Ⅱ는 적혈구에서 산소를 운반하는 헤모글로빈(Hemoglobin)과 결합하여 산화적 스트레스로부터의 공격을 방어하여 적혈구의 수명을 유지하고, 유전성 빈혈의 근본 원인인 헤모글로빈 단백질의 분해집성(aggregation)을 저해하여 헤모글로빈의 안정성을 회복시킬 수 있는 효과가 있으므로, 헤모글로빈의 분해집성을 저해하거나 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈의 결합정도를 증진시키는 물질을 검색함으로 유전성 빈혈 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 "하인즈바디(Heinz body)"는 손상된 헤모글로빈의 침전물을 의미한다.
본 발명에 있어서 "단백질 분해집성(protein aggregation)"은 폴리펩티드사슬이 생화학적 또는 구조적 요인으로 부분적으로 폴딩되지 않은 상태의 손상된 단백질 집단을 의미한다.
본 발명은 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈을 함유하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 퍼록시레독신 Ⅱ는 적혈구에서 헤모글로빈과 결합하여 산화적 스트레스로부터 적혈구손상을 보호한다.
본 발명에서는 퍼록시레독신 Ⅱ와 하인즈바디의 연관성을 알기 위해 정상 마우스, 퍼록시레독신 Ⅰ 유전자 결손 마우스 및 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 혈액을 각각 채취한 후 브릴리언트 크레실 블루(brilliant cresyl blue) 염색약을 처리하여 적혈구를 관찰한 결과, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 혈액에서는 정상 마우스 및 퍼록시레독신 Ⅰ 유전자 결손 마우스에 비해 하인즈바디가 30 ~ 40% 더 많이 관찰되었다(도 1 참조). 따라서 퍼록시레독신 Ⅱ가 결핍됨으로써 헤모글로빈에 대한 보호 작용이 저해되고, 결국 산화적 스트레스를 받은 헤모글로빈이 침전되어 하인즈바디를 형성한 것을 알 수 있다.
본 발명에서는 퍼록시레독신 Ⅱ가 적혈구의 수명을 연장시키는데 영향을 미치는지 알기 위해, 상기 3종류의 마우스 정맥에 각각 Biotin-X-NHS 적혈구 접착물질을 주사한 후 5일 간격으로 채혈하여 FACS(fluorescence-activated cell sorter)기기로 측정한 결과, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스 적혈구의 수명이 5일 및 10일 때 정상 마우스 및 퍼록시레독신 Ⅰ 유전자 결손 마우스에 비해 50% 수준으로 감소하였음을 알 수 있었다(도 2 참조).
본 발명에서는 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈 사이의 상호결합에 대하여 알아보기 위해, 정상 마우스와 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스 각각의 적혈구에서 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈의 항체를 이용하여 면역침전반응을 한 후 상기 면역침전산물을 웨스턴블럿(western blot)하여 관찰한 결과, 정상 마우스 적혈구에서는 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈은 서로 결합하고 있었으나 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스 적혈구에서는 결합을 나타내는 밴드가 보이지 않았다(도 3 참조). 전자현미경으로 관찰한 결과에서도 정상 마우스의 적혈구 세포질과 세포막에서는 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈의 상호 결합을 관찰할 수 있었다(도 4 참조).
본 발명에서는 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈 사이의 결합이 인간에서도 적용되는지 알아보기 위해, 정상인, 지중해빈혈 정도가 중간인 환자 및 심한 환자, 겸상적혈구 빈혈 정도가 중간인 환자 및 심한 환자 각각의 적혈구로부터 상기와 같은 면역침전반응 후 웨스턴블럿하여 관찰한 결과, 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈은 서로 결합하고 빈혈 정도가 심할수록 결합된 퍼록시레독신 Ⅱ의 양이 감소함을 알 수 있었다(도 7 및 도 8 참조).
본 발명에서는 퍼록시레독신 Ⅱ의 결핍에 의한 활성산소종(ROS)의 생성수준에 미치는 영향을 알아보기 위해, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자　결손 마우스 및 정상 마우스에서 회수한 각각의 적혈구를 여러 농도의 H2O2로 처리한 후 DCFDA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)와 반응시켜 그 형광도를 FACS(fluorescence-activated cell sorter)로 측정함으로써 활성산소의 수준을 조사하였다. 그 결과, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 적혈구가 정상 마우스의 적혈구에 비하여 활성산소의 수준이 훨씬 높음을 확인하였다(도 5 참조).
본 발명에서는 퍼록시레독신 Ⅱ가 헤모글로빈의 분해집성의 정도에 미치는 영향을 알아보기 위해, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자　결손 마우스 및 정상 마우스의 각각의 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하여 여러 농도의 과산화수소(H2O2)로 처리한 후 스펙트로메터(spectrometer)로 헤모글로빈의 분해집성의 정도를 측정하였다. 그 결과 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자　결손 마우스의 헤모글로빈 분해집성 정도는 정상 마우스에 비해 높았으나 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여함에 따라 분해집성 정도가 정상인 수준으로 회복되었다(도 6 참조). 따라서 퍼록시레독신 Ⅱ의 보호 작용은 퍼록시레독신 Ⅱ의 샤페론(chaperon) 기능이라는 것을 알 수 있다.
본 발명에서는 상기 분해집성의 정도에 미치는 영향이 인간의 적혈구에 적용되는지 알아보기 위해, 정상인, 지중해빈혈 환자 및 겸상적혈구빈혈 환자 각각의 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하여 상기와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과 지중해빈혈 및 겸상적혈구빈혈 환자의 헤모글로빈 분해집성 정도는 정상인에 비해 높았으나 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여함에 따라 분해집성 정도가 정상인 수준으로 회복되었다(도 9 및 도 10 참조).
본 발명에서는 상기 분해집성 측정실험에서 지중해빈혈 및 겸상적혈구빈혈 환자의 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈의 결합상태를 알아보기 위해, 면역침전반응 후 웨스턴블럿으로 관찰한 결과, 결합정도는 산화적 스트레스에 의해 감소하였고, 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여함에 따라 증가함을 알 수 있었다(도 11 및 도 12 참조).
따라서, 퍼록시레독신 Ⅱ는 헤모글로빈과 결합하여 산화적 스트레스로부터 헤모글로빈을 보호하고, 빈혈환자의 적혈구와 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 적혈구에서 퍼록시레독신 Ⅱ가 과산화수소에 의한 단백질 분해집성을 저해하여 유전성 빈혈을 치료하는 기능이 있음을 알 수 있다.
상기 결과들을 바탕으로, 본 발명은 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈을 함유하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 퍼록시레독신 Ⅱ는 서열번호 2의 아미노산 구조를 갖는 단백질, 또는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열 중 선택된 하나로부터 발현된 단백질, 퍼록시레독신 Ⅱ와 동등한 생리적 활성을 나타내는 퍼록시레독신 Ⅱ 폴리펩티드 단편 중 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 퍼록시레독신 Ⅱ는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한 다.
상기 스크리닝 조성물은 퍼록시레독신 Ⅱ 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검물질을 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈이 포함된 조성물에 첨가하는 단계;
2) 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈의 결합정도를 측정하는 단계; 및
3) 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈의 결합정도를 증진시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검물질을 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈이 포함된 조성물에 첨가하는 단계;
2) 헤모글로빈의 분해집성을 측정하는 단계; 및
3) 헤모글로빈의 분해집성을 억제하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 피검물질은 통상적인 선정방식에 따라 유전성 빈혈 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물 등이 될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈의 결합정도를 증진시키나 헤모글로빈의 분해집성을 억제하는 기능을 나타내는 피검물질은 유전성 빈혈 치료제 후보물질이 될 수 있다.
상기와 같은 유전성 빈혈 치료제 후보물질은 이후의 유전성 빈혈 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 퍼록시레독신 Ⅱ와 헤모글로빈의 결합정도를 증진시키나 헤모글로빈의 분해집성을 억제하는 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 유전성 빈혈 치료제를 개발할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 제조
퍼록시레독신 Ⅱ　단백질이 발현되지 않는 동종접합체(homozygote) 마우스(Prx Ⅱ-/- 마우스)는 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자의　6개 엑손을 모두 neo 유전자로 대체한 표적 벡터를 줄기세포(JI)에 유전자 적중시킨 후 C57BL/6 마우스 수정란에 미세주입하여 제조한 129/SvJae 이형접합체(heterozygote) 마우스[T. H. Lee et al ., Blood 101, 5033 ~ 5038, Jun 15, 2003), 국내특허출원(출원번호 : 2002-7094)]로부터 유래된 마우스이다. 상기 마우스는 SPF 배리어 시스템(SPF barrier system)에서 온도 22±1℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 10 ~ 20회/시간, 형광등 조명 12 시간/하루(오전 8시 점등 ~ 오후 8시 소등)으로 사육하였다.
<실시예 2> 퍼록시레독신 Ⅰ 유전자 결손 마우스의 제조
상기 퍼록시레독신 II 유전자 결손 마우스[T. H. Lee et al ., Blood 101, 5033-8(Jun 15, 2003)]와 동일한 방법으로 퍼록시레독신 I 유전자 결손 마우스를 제조한 후 동일한 조건으로 사육하였다.
<실험예 1> 퍼록시레독신 I 또는 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 하인즈바디 관찰
상기 실시예에서 제조된 퍼록시레독신 I 유전자 결손 마우스, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스 및 정상 마우스의 혈액을 채취하여 브릴리언트 크레실 블루(brilliant cresyl blue) 염색약을 처리하여 적혈구를 염색한 후 관찰하였다. 그 결과 대조군인 정상마우스 및 퍼록시레독신 I 결핍 마우스의 적혈구에서는 하인즈바디가 발견되지 않는 반면, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 적혈구는 30 ~ 40%가 하인즈바디를 지닌 것으로 관찰되었다(도 1 참조).
< 실험예 2> 적혈구의 수명 측정
퍼록시레독신 I 유전자 결손 마우스, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스 및 정상 마우스의 정맥에 Biotin-X-NHS 적혈구 표면 접착물을 주사한다. 주사 후 5일 간격으로 채혈하여 적혈구에 접착된 Biotin-X-NHS 양을 FACS[fluorescence- activated cell sorter(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)]로 측정하였다. 상기 기기는 살아있는 적혈구, 즉 Biotin-X-NHS 접착된 적혈구만 검출된다. 이 원리를 이용하여 적혈구의 수명을 측정하였다. 그 결과 대조군인 정상마우스 및 퍼록시레독신 I 결핍 마우스의 적혈구에 비해 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스 적혈구의 수명이 5일 및 10일 때 정상 마우스 및 퍼록시레독신 Ⅰ 유전자 결손 마우스에 비해 50% 수준으로 감소하였음을 알 수 있었다(도 2 참조).
< 실험예 3> 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질과 헤모글로빈과의 상호결합 증명
<3-1> 마우스 적혈구 실험
정상 마우스 및 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자결손 마우스 적혈구의 세포질 내용물을 추출하고 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질과 헤모글로빈의 항체를 이용하여 면역침전반응을 수행하였다. 면역침전산물을 회수하여 웨스턴블럿(western blot)방법을 통해 관찰한 결과, 정상 마우스 적혈구에서는 퍼록시레독신 Ⅱ　단백질과 헤모글로빈은 서로 결합하고 있었으나 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스 적혈구에서는 결합을 나타내는 밴드가 보이지 않았다(도 3 참조). 따라서 퍼록시레독신 Ⅱ　단백질과 헤모글로빈이 상호 결합한다는 사실을 확인하였다.
<3-2> 인간 적혈구 실험
상기 <3-1>의 결과가 인간에서도 적용되는지 알아보기 위하여 정상인, 지중해 빈혈 정도가 중간인 환자 및 심한 환자, 겸상적혈구 빈혈 정도가 중간인 환자 및 심한 환자 각각의 적혈구로부터 상기와 같은 면역침전반응 후 웨스턴블럿하여 관찰한 결과, 퍼록시레독신 Ⅱ　단백질과 헤모글로빈은 서로 결합하고 빈혈 정도가 심할수록 결합된 퍼록시레독신 Ⅱ　단백질의 양이 감소함을 알 수 있었다(도 7 및 도 8 참조).
< 실험예 4> 전자현미경에 의한 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질과 헤모글로빈의 위치 관찰
정상 마우스 적혈구를 3% 글루타알데하이드(glutaraldehyde)와 3% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)가 함유된 0.1M 카코딜레이트 완충액(cacodylate buffer)(pH 7.2)으로 고정하고 퍼록시레독신 Ⅱ 단일항체 및 Hb-항체(Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany)로 인큐베이트한 다음, 실온에서 2시간 콜로이달 골드(colloidal gold)가 부착된 2차 항체로 반응시킨 다음 전자현미경[Tecnai G2 Spirit Twin transmission electron microscope(FEI company, USA)과 JEM ARM 1300S high-voltage electron microscope(JEOL, Japan)]으로 관찰하였다. 그 결과, 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질과 헤모글로빈이 함께 결합되어 세포질과 세포막에 존재하고 있음을 확인하였다(도 4 참조).
< 실험예 5> 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질과 활성산소의 관계
퍼록시레독신 Ⅱ 유전자　결손 마우스 및 정상 마우스 적혈구를 DCFDA[2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFDA, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)]로 15분간 반응시킨 다음, 여러 농도의 H2O2로 처리하여 FACS[fluorescence-activated cell sorter(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)]로 DCFDA의 형광도를 측정함으로써 활성산소의 수준을 조사하였다. 그 결과, 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자 결손 마우스의 적혈구가 정상 마우스의 적혈구에 비하여 활성산소의 수준이 훨씬 높음을 확인하였다(도 5 참조).
< 실험예 6> 헤모글로빈 분해집성( protein aggregation )의 정도 측정
<6-1> 마우스 적혈구의 헤모글로빈 실험
퍼록시레독신 Ⅱ 유전자　결손 마우스와 정상 마우스의 각각의 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하여 여러 농도의 과산화수소를 30분간 처리하고 스펙트로포토메터 360 nm의 파장으로 분해 집성된 단백질을 측정하였다. 그 결과 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자　결손 마우스의 헤모글로빈 분해집성 정도는 정상 마우스에 비해 높았으나 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여함에 따라 분해집성 정도가 정상인 수준으로 회복되었다(도 6 참조).
<6-2> 인간 적혈구의 헤모글로빈 실험
정상인, 지중해 빈혈 환자 및 겸상적혈구 빈혈 환자 각각의 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하여 상기와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과 지중해빈혈 및 겸상적혈구빈혈 환자의 헤모글로빈 분해집성 정도는 정상인에 비해 높았으나 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여함에 따라 분해집성 정도가 정상인 수준으로 회복되었다(도 9 및 도 10 참조).
< 실험예 7> 산화적 스트레스에 의한 헤모글로빈과 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질의 결합
상기 분해집성 측정실험에서 지중해빈혈 및 겸상적혈구빈혈 환자의 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질과 헤모글로빈의 결합상태를 알아보기 위하여 면역침전반응 후 웨스턴블럿으로 관찰하였다. 그 결과 결합정도는 산화적 스트레스에 의해 감소하였고, 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여함에 따라 증가함을 알 수 있었다(도 11 및 12 참조).
도 1은 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자결손 마우스의 적혈구가 정상 마우스 및 퍼록시레독신 I 유전자결손 마우스의 적혈구에 비해 산화적 스트레스의 마커인 하인즈바디(Heinz body)라는 헤모글로빈침전 물질이 더 많이 생성됨을 나타낸 그림이고,
도 2는 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자결손 마우스의 적혈구 수명이 정상마우스 및 퍼록시레독신 I 유전자결손 마우스보다 짧다는 것을 나타낸 그래프이고,
도 3은 퍼록시레독신 Ⅱ가 헤모글로빈과 결합하고 있음을 확인하는 면역침전실험에서의 웨스턴블럿(western blot) 결과를 나타내는 그림이고,
도 4는 전자현미경을 통하여 퍼록시레독신 Ⅱ가 헤모글로빈과 상호 결합하여 함께 위치하고 있음을 나타내는 그림이고,
+/+: 정상 마우스
Prx Ⅱ-/-: 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자결손 마우스
Prx I-/- : 퍼록시레독신 I 유전자결손 마우스
IP: 면역 침전(immunoprecipitation)
WB: 웨스턴블럿(western blot)
β-Hb: 베타-헤모글로빈
α-Hb: 알파-헤모글로빈
Cytosol: 세포질
PM: 세포막(plasma membrane)
도 5는 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자결손 마우스 적혈구가 산화적 스트레스에 의해 활성산소의 수준이 대조군에 비해 더 높음을 나타내는 그래프이고,
도 6은 인간 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질 투여에 의해 퍼록시레독신 Ⅱ 유전자결손 마우스의 헤모글로빈이 산화적 스트레스의 공격에 대하여 정상적인 마우스 수준으로 회복됐음을 나타내는 그래프이고,
hPrx Ⅱ: 인간 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질
H2O2: 과산화수소(hydrogen peroxide)
도 7은 인간 유전성 악성빈혈인 지중해 빈혈환자의 헤모글로빈과 퍼록시레독신 Ⅱ의 결합이 정상인에 비해 많이 감소되어 있다는 것을 나타내는 웨스턴블럿(western blot)의 결과를 나타내는 그림이고,
도 8은 인간 유전성 악성빈혈인 겸상적혈구 빈혈환자의 헤모글로빈과 퍼록시레독신 Ⅱ의 결합이 정상인에 비해 많이 감소되어 있다는 것을 나타내는 웨스턴블럿(western blot)의 결과를 나타내는 그림이고,
Normal: 정상인간의 적혈구
THA: 지중해빈혈(thalassemia) 적혈구
Intermediate: 빈혈정도가 중간 정도인 지중해 빈혈 환자의 적혈구
Major: 빈혈정도가 심한 지중해 빈혈 환자의 적혈구
SCA: 겸상적혈구빈혈(sickle cell anemia) 환자의 적혈구
도 9는 지중해 빈혈 환자의 헤모글로빈이 산화적 스트레스 공격을 받을 때 정상적인 헤모글로빈보다 불안정하나 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여하면 정상 수준으로 회복되었음을 나타내는 그래프이고,
도 10은 겸상적혈구 빈혈 환자의 헤모글로빈이 산화적 스트레스 공격을 받을 때 정상적인 헤모글로빈보다 매우 불안정하나 퍼록시레독신 Ⅱ 재조합 단백질을 투여하면 정상 수준으로 회복되었음을 나타내는 그래프이고,
도 11은 지중해빈혈 환자의 헤모글로빈이 산화적 스트레스의 공격을 받을 때 헤모글로빈과 퍼록시레독신 Ⅱ의 결합이 점차 감소되고 있음을 나타내는 그림이고,
도 12는 겸상적혈구 빈혈 환자의 헤모글로빈이 산화적 스트레스의 공격을 받을 때 헤모글로빈과 퍼록시레독신 Ⅱ의 결합이 점차 감소되고 있음을 나타내는 그림이다.
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Claims (5)

  1. 퍼록시레독신 Ⅱ(Peroxiredoxin Ⅱ, Prx Ⅱ) 및 헤모글로빈을 함유하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝용 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 퍼록시레독신 Ⅱ는 서열번호 2의 아미노산 구조를 갖는 단백질, 또는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열 중 선택된 하나로부터 발현된 단백질, 퍼록시레독신 Ⅱ 단백질과 동등한 생리적 활성을 나타내는 퍼록시레독신 Ⅱ 폴리펩티드 단편 중 선택된 1종 이상인 유전성 빈혈 치료제 스크리닝용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 퍼록시레독신 Ⅱ는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝용 키트.
  4. 1) 피검물질을 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈이 포함된 조성물에 첨가하는 단계;
    2) 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈의 결합정도를 측정하는 단계; 및
    3) 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈의 결합정도를 증진시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝 방법.
  5. 1) 피검물질을 퍼록시레독신 Ⅱ 및 헤모글로빈이 포함된 조성물에 첨가하는 단계;
    2) 헤모글로빈의 분해집성을 측정하는 단계; 및
    3) 헤모글로빈의 분해집성을 억제하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 유전성 빈혈 치료제 스크리닝 방법.
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