KR100920749B1 - 초분광 이미지 시스템을 이용하는 정량적 세포 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system) 및 이를 이용한 정량적 세포 분석방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 초분광 이미지 시스템은 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과될 수 있는 빛의 파장을 연속적으로 변환시킬 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 부착시킨 광학시스템과 이미지를 취득(image acquisition)하고 분석하는 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템으로 구성되어 있다. 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하여 경미하게 초점을 흐린 이미지(unfocussed image)를 얻고 배경 보정을 한 뒤 이미지 속 모든 세포에 대한 역치 매개변수들(threshold parameters)를 걸어주고 부위 선별을 하게 되면 전체 이미지 속에서 역치 매개변수를 만족시키는 모든 세포를 자동적으로 선택할 수 있어서 얻을 수 있어 이미지 속 모든 세포들을 정량적으로 계수(count) 할 수 있어 정량적인 세포 생존능력 분석(quantitative cell viability), 약물 스크리닝(drug screening) 또는 유세포 분석 (Flow cytometric analysis)에 유용하게 이용될 수 있다.
초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system), 초점을 흐린 이미지(unfocussed image), 정량적인 세포 분석(quantitative cellular assays)

Description

초분광 이미지 시스템을 이용하는 정량적 세포 분석방법{A quantitative method for cellular assays based on hyperspectral imaging system}
본 발명은 초분광 이미지 시스템 및 이를 이용한 정량적 세포 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 파장 가변형 필터에 기초한 광학시스템과 이미지 취득 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템으로 구성된 초분광 이미지 시스템 및 이를 이용한 정량적 세포 분석방법에 관한 것이다.
생화학적인 분석에 있어서 복합성은 세포를 기초로 하는 스크리닝 분석, 특히 세포 반응을 유발하는 약물에 관련된 스크리닝 분석법이 활발히 이용되는데 크게 기여하였다. 지난 수십 년간 세포를 기초로 하는 다양한 분석법[트리판 블루 염료 방출 분석(trypan blue dye exclusion assay)과 같은 세포 생존능력 또는 세포 독성 분석, LDH-방출 분석, ATP 정량 분석, MTS 또는 레사주린(resazurin) 분석, 세포자살 및 세포괴사 분석, 사이토카인 분석, 카스페이스(caspase)분석 등]이 확립되었다. 상기 분석 중 일부는 정량적인 분석을 위해서 수동적인 방법을 이용 한다. 이는 데이터 분석을 위해 불필요하게 많은 시간을 소요하고 사용자 간 변이 때문에 실험결과의 통계적 신뢰가 낮다. 따라서, 자동화된 정량 방법, 저렴한 비용, 휴대 가능성, 간단하고 일반화된 기준 및 다양한 세포 분석의 적용가능성을 개발하는 것이 요구되었다.
암의 화학치료의 임상적 발전은 새로운 약 및 최소의 독성을 가진 약 내성에 저항하는 처리 방법을 개발하기 위한 고 처리량(high throughput) 약물 스크리닝 방법을 요구하였다. 최근에 급속한 생체 외 스크리닝 방법은 생체 내 약 반응을 예측하고 동물을 기초로 하는 실험을 최소화하기 위한 약 개발을 위해 이용되었다. 그러나 생체 외 분석은 생화학적 분석에 의해서는 예측될 수 없는 많은 복잡한 약물 유발 세포 경로를 유발한다. 예를 들면, 캐스페이스 활성(caspases activation), 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptors, ErbB3) 및 포스파티딜세린 구체화(phosphatydilserine externalization)는 괴저성 현상(Necrotic event)과 밀접하게 관련된 세포자살 경로의 가장 복잡한 현상이다. 상기 복잡성은 세포 생존능력 또는 세포독성 측정을 통해 약물 유발 세포반응을 예측하는, 세포를 기초로 하는 스크리닝 분석의 보편화에 크게 기여하였다. 상기 분석법 중 일부는 측정 가능한 신호를 발생시키기(예를 들면, ATP 정량 또는 LDH-방출 분석) 위해 단지 몇 분만 요구되며, 또한 결과를 얻기 위해 장시간 배양 또는 수동적인 수를 세는 방법을 요구하는 분석(예를 들면, MTS 또는 레자주린(resazurin) 분석)에 비해 결점을 줄일 수 있는 이점을 가진다. 트리판 블루 염 료 배척 분석(trypan blue dye exclusion assay)은 세포 생존 능력 측량을 위한 세포배양 및 생물반응장치 실험에서 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나, 이런 수동적인 방법은 염색되거나 염색되지 않은 세포들을 낱낱이 세는 시간이 오래 걸리고 현미경 검사법의 주관적인 성질 때문에 사용자마다 차이가 있을 수 있으며, 낮은 통계적 확신 때문에 때로는 더 적은 세포 수를 셈으로써 결과가 과대평가가 될 수 있다.
지난 수십 년간 화학요법의 약 독성에 의한 세포죽음 활동을 결정하는데 있어서 주요 변화가 발생하였다. 화학요법의 약은 질병 치료의 결정적인 역할 이외에 면역독성, 신경 독성 및 신장 독성을 포함하는 심한 부작용(갑작스런 죽음)을 일으킬 수 있다. 이는 수동적인 퇴행과정(괴사)의 결과일 수 있다. 암의 악화를 예방하기 위해서 암세포는 프로그램된 세포죽음(세포자살)을 겪을 필요가 있다. 생리적인 상황에서는 세포자살은 염증 없이 발생할 수 있다. 대조적으로 병리학적인 상황에서는 이차괴사의 개시 및 키모카인(chemokine)과 사이토카인(cytokine) 형성의 자극 때문에 종종 염증을 유발한다. 그러므로 세포자살을 일으키는데 이용되는 항암제의 높은 농도는 세포자살 및 세포괴사에 의한 세포죽음의 결과인 염증을 유발할 수 있다. 다약제 내성(multidrug resistance, MDR)의 최근 개념은 항암제 치료에 있어서 특히 중요하다. 다약제 내성은 수많은 항암제로 처리한 후에도 생존하는 종양세포의 능력의 결과이다. 다약제 내성으로부터 고통받는 환자들은 높은 화학요법 약의 농도 때문에 정상적인 조직에 여러 손상을 경험하게 된다. 이 는 세포 독성 효력은 동일한 자극으로 암 및 정상 세포 모두에서 일어나는 비 선택적인 활성 때문에 발생한다.
근래에는 키나아제(JNK and p38) 매개 경로를 통한 세포자살과 함께 항암제에 의한 조직 손상에 대한 연구결과가 발표되었다. 캄토테신(camptothecin, CAM) 및 나린제닌(naringenin, NAR)과 같은 식물 이차 대사산물들은 항염증 및 항산화적 성질을 통해 세포자살을 유도하는 것과는 별도로, 포유류 및 양서류의 세포에서 세포독성(세포괴사)를 일으키는 것으로 보고되었다. 최근에는 퇴행성 신경세포 중에 세포사멸이후 세포괴사로 이어지는 세포죽음을 겪게 되는 하이브리드 형태의 세포죽음이 발표되었다. 따라서, 만약 종양(괴사) 과정이 세포자살 과정으로 이해된다면, 진단에 있어서 질병상태에 대한 잘못된 진단을 내릴 수 있다. 특히, 단지 몇 분 동안만 지속하는 세포에서는 더욱 더 그럴 가능성이 높다.
신약 개발의 초기 단계의 주요 스트레스는 생체 내 및 생체 외 모델을 이용하여 후보 약들의 독성 효과를 최소화하기 위한 세포죽음 경로를 명료하게 밝히는 것이다. 그러나 생체 내 모델을 이용한 세포자살 탐지는 장기적인 실험절차 때문에 비용이 많이 소요된다. 또한, 세포자살 세포의 이질성 및 짧은 반감기는 생체 내 모델 시스템에서의 정량 측정을 제한한다. 한편, 세포죽음 동력 (Dynamics)을 조사하는 생체 외 세포를 기초로 하는 분석은 식세포가 없는 환경에서 세포막이 색소에 투과성을 가지는 세포자살 후기 단계에 의해 복잡하게 된다. 그러므로 세포자살 초기단계에서 이차 괴사에 이르는 빠른 악화로 인해 발생하는, 즉 세포자살 상태이면서도 색소 투과로 말미암아 괴사 상태의 세포로 판단되어 실존 세포사멸 세포 수 보다 더 적은 세포사멸 세포 수로 잘못 계수되는 상황이 발생할 수 있다. 따라서 현재는 이러한 세포사멸 세포 수에 대한 잘못된 계수를 예방하기 위해서 세포죽음 경로에 대한 구별이 세포생존도 측정과 동시에 이루어질 수 있는 신속한 진단 시스템이 개발되어야 한다는 필요성이 크게 증대되고 있다. 세포죽음의 경로를 구별하기 위해 이용되는 대부분의 기술들은 이미지 또는 분광 분석 중 어느 하나에 기초를 둔다. 그러나 상기 기술들은 각각이 이점과 단점을 가지고 있다. 유리 필터 및 브로드밴드 여기 소스(broadband excitation sources)를 기초로 하는 진단 시스템은 낮은 분광 해상도(spectral resolution)의 문제점을 가지고 있다. 그러므로 상기 진단 시스템으로 다양한 형광물질(fluorophore)을 이용하여 세포죽음의 경로를 구별하는 것은 괴사과정을 세포사멸 과정으로 잘못 인식할 수 있게 된다. 다른 일반적인 분광 기술은 하나의 분석점 뿐만 아니라 분광범위 내 모든 파장에서 신호 감지를 제공하기 때문에 세포 죽음 경로의 동시적 구별을 제공하지 않는다. 유세포측정법(Flow Cytometry)은 각각 다른 파장 영역에 해당하는 각각의 검출기들에서 탐지된 신호를 기록함으로써 세포자살 및 세포괴사를 밝히기 위한 신속한 도구로써 현재 선호되고 있다. 그러나 이러한 방법들 중 어떤 방법도 데이터로써 세포 이미지를 제공할 수는 없다. 현재까지 세포들을 보여주는 전체 이미지로부터, 실험자가 원하는 파라미터(Parameter)를 만족시키는 세포들만을 선택적으로 구분하여 그 세포 수를 정량적으로 계수(Count)할 수 있는 자동화된 방법은 존재하지 않는다.
이에 본 발명자들은 이미지와 스펙트럼을 동시에 얻을 수 있는 초분광 이미지 시스템에 기초하여 실험자가 원하는 파라미터를 만족시키는 세포들만을 정확하게 선별적으로 선택하여 이를 정량적으로 자동 계수할 수 있는 새로운 형태의 세포 이미지 측정 장치를 개발함으로써 이를 기초로 세포 생존도, 세포자살 및 세포괴사 구분 및 이에 기초한 항암제 약물 스크리닝에 적용할 수 있는 새로운 세대의 세포 이미지 분석법을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 초분광 이미지 시스템 및 이를 이용한 데이터 취득 및 정량적 세포 분석방법을 제공한다.
본 발명은 이미지 취득(image acquisition) 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템이 설치된 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과되는 빛의 파장을 신속하게 조절할 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 접목시킨 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하는 데이터 취득 및 정량적 세포 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하는 세포 생존능력 분석방법(cell viability assay)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하는 세포사멸 억제제의 스크리닝방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하는 유세포 분석방법(flow cytometric analysis)을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하는 세포사멸 촉진제의 스크리닝방법을 제공한다.
본 발명으로 얻은 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과되는 빛의 파장을 빠른 속도로 조절할 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 접목시킨 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system)은 이미지 취득(image acquisition) 및 분석을 위한 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템을 갖추고 있으며, 배경 보정에 선행되어 경미하게 초점을 흐린 이미지(unfocussed image)를 기초로 하여 역치 매개변수를 걸어준 뒤 부위 선별을 통해서 전체 이미지에 걸친 모든 물체에 대한 역치 매개변수들(threshold parameters)의 동등한 분배를 얻을 수 있으므로 자동적으로 물체를 계수할 수 있어, 정량적인 세포 생존도 분석(quantitative cell viability) 및 약물 스크리닝(drug screening) 등에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 신속하게 고 처리량이 가능하고 비용이 저렴하고 자동화 및 간단한 조작이 가능함으로써 산업상 이용가능성이 크다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, '이미지 플랜(image plane)'은 렌즈가 이미지를 형성하는 위치를 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, '배경 보정(background correction)'은 잡음을 제거하여 위하여 원하는 이미지에서 배경을 제거하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, '역치 조정(threshold adjustment)'은 이미지 분절의 가장 단순한 방법으로서 흑백 이미지에서 각각의 화소값이 한계값보다 높으면“물체" 화소이라고 하고 한계값보다 낮으면 "배경" 화소라고 하며, 전형적으로 물체 화소는“1”로 주어지고, 배경 화소는“0”로 주어지는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, '너비 감소(width deduction)'는 너비 매개변수의 한계를 조정하여 다른 배양 오염물들은 제외하고 이상적인 세포만을 선택하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, '가상 형성(creating mask)'은 선택된 세포의 이중 이미지를 형성하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, '물체 주변 부위(region around the object)'는 부위측정을 위한 물체의 주변 부위를 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, '부위 측정(region measurement)'은 표적으로 하는(본 실험에서는 세포) 물체를 역치 조정을 통해서 선택하고 그에 대한 측정을 하는 과정을 의미한다.
아울러, 본 발명에 있어서, 'Z 위치(position)'는 샘플과 대물렌즈 사이의 거리를 의미한다.
본 발명은 이미지 취득(image acquisition) 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템이 설치된 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과되는 빔의 파장을 조절할 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 접목시킨 초분광 이미 지 시스템(hyperspectral imaging system)을 제공한다.
상기 초분광 이미지 시스템은 하기와 같은 구조로 이루어져 있다.
샘플을 놓는 플랫폼;
이온 레이저 빔을 방출하는 이온 레이저 광원 또는 필터를 채용한 백색광원;
상기 이온 레이저 광원 또는 상기 백색광원으로부터 방출된 입사광의 입사량을 줄이는 ND(neutal density) 필터;
상기 ND 필터를 통과한 입사광을 정제하는 간섭필터(interference filter);
상기 간섭필터를 통과한 입사광을 대물렌즈 방향으로 반사하고 대물렌즈로부터 모아진 형광빔을 통과시키는 이색 반사경(dichromatic mirror);
입사광의 초점을 맞추고 상기 샘플로부터 여기된 형광빔을 모으는 대물렌즈;
상기 이색 반사경을 통과한 형광빔을 반사하는 프리즘;
상기 프리즘을 통과한 형광빔의 직경을 줄이는 렌즈;
상기 렌즈를 통과한 형광빔의 파장을 시간에 따라 조절할 수 있는 가변형 필터;
상기 가변형 필터를 통과한 빔의 흩어지는 것을 방지하는 롱-패스 필터(long-pass filter);
상기 롱-패스 필터를 통과한 형광빔을 검출하는 CCD 카메라; 및
상기 CCD 카메라에 의해 검출한 형광빔의 이미지 취득 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템,
본 발명에 있어서, 상기 이온 레이저 빔은 Ar 이온 레이저로부터 나오는 488nm 빔을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 수은(Hg) 및 크세논(Xenon) 등의 백색광도 포함한다. 백색광의 경우는 광학필터를 이용하여 특정 파장범위의 빔을 여기원으로 선택할 수 있다. 또한 상기 대물렌즈는 분석 프로토콜에서 높은 통계적 신뢰를 달성하는 60X 대물 렌즈를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 가변형 필터는 음향광학 파장 가변형 필터(Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF) 또는 액정 가변형 필터(Liquid crystal tunable filter, LCTF)를 포함하는 모든 가변형 필터를 이용할 수 있으나 AOTF를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 상기 AOTF는 복굴절 결정(birefringent crystal)을 통해서 특정 파장에서 회절된 빔(diffracted beam)의 전송을 허용하여 파장을 신속하게 스캐닝할 수 있다. 특정 파장에서 형광 이미지는 AOTF 진동수를 스위핑(sweeping)하는 기능에 의해 CCD 카메라에 의해 취득된다. AOTF는 460 nm에서부터 근적외선(Near IR) 파장, 보다 바람직하게는 463 nm ~ 688 nm 파장에 이르는 파장범위의 빛을 투과시킬 수 있는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 AOTF는 0.1 ~ 30 nm의 파장간격, 보다 바람직하게는 0.5 nm ~ 2 nm 파장간격으로 초당 하나의 이미지를 얻는 속도로 스캐닝할 수 있는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. AOTF 진동수 스위핑 및 CCD 이미지 취득은 동시에 진행되어, 각각의 파장들에서 형광 방출에 대응하는 각각의 CCD 이미지를 특정시간 동안(예로 1분) 연속적으로 AOTF의 스캐닝을 통해 얻을 수 있다. 스택 이미지(stack image), 초점을 흐린 이미지(unfocussed image), 초점을 맞춘 이미지(focussed image) 및 배경 보정을 위한 이미지(image for background correction)의 각각의 샘플을 동일한 X 및 Y 축에서 캡쳐할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하여 세포 이미지를 얻고 이를 통해 원하는 데이터를 취득하고 정량적으로 세포를 분석하는 방법을 제공한다.
1) 공초점 현미경의 샘플 플랫폼에 세포시료를 올려놓은 다음, 대물렌즈의 높이를 조절하여, 초점을 맞춘 이미지 및 초점을 경미하게 흐린 이미지를 CCD 카메라를 통해 취득하고 배경 보정을 위하여 배지만 포함된 배지시료에 대한 이미지를 CCD 카메라를 통해 취득하여 상기 공초점 현미경에 연결된 컴퓨터 시스템을 이용하여 파일로 저장하는 단계;
2) 상기 단계 1)을 통해 저장된 파일을 상기 컴퓨터 시스템에 탑재된 이미지 분석 소프트웨어를 통해 로딩한 후, 상기 초점을 경미하게 흐린 이미지에 대한 배경보정을 수행하는 단계;
3) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 1)에서 배경 보정된 이미지에 대하여 역치 조정을 수행하는 단계;
4) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 3)에서 역치 조정된 이미지로부터 원하지 않는 물체를 제거하는 단계;
5) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 4)에서 원하지 않는 물체 가 제거된 이미지로부터 원하는 물체인 세포의 이미지 형성을 위한 가상(mask)을 형성하는 단계;
6) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 5)의 가상으로부터 세포 주변 이미지를 형성하는 단계; 및
7) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 세포 주변 이미지를 이용하여 세포수를 계수하는 단계,
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 공초점 현미경은 상기 초분광 이미지 시스템인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 초점을 맞춘 이미지는 물체의 주변 및 이들의 상대적인 배경으로부터 그레이 스케일 값(gray scale value)을 기초로 하기 때문에 전체 이미지에 걸친 역치 매개변수의 동등한 분배가 불가능하다. 세포는 세포 표면의 구조가 울퉁불퉁한 모양으로 되어있으며 이러한 구조가 세포 전체에 걸쳐서 일정하게 분포하지 않는 불균등한 구조의 세포 형태를 가지고 있으며 이러한 불균등한 세포 형태는 초점을 맞춘 이미지의 그레이 스케일 값에 작은 차이를 발생시키고, 이는 전체 이미지에 걸친 역 매개변수를 통해 선택한 단일세포의 동등한 밝기 분배를 할 수 없게 만든다. 상기 결과는 역치 조정을 통해서 원하는 특정 부위 세포 이미지를 선택할 때 원하는 단일 세포가 지역에 따라 다르게 존재하는 밝기의 차이로 선택되지 못하는 경우를 발생시키며 따라서 원하는 전체 세포수를 원활하게 측정하고자 하는 정량적 세포 이미지 분석을 불가능하게 만든다. 실험에서 이용하는 소프트웨어는 역치 매개변수 조건을 만족시키는 세포를 자동적으로 선택 할 수 있으나 이처럼 역치 매개변수의 동등한 분배가 없는, 즉 단일 세포내에서의 밝기 분포의 차이가 큰 경우에는 소프트웨어 처리 시 원하는 단일 세포가 자동적으로 선택되지 못하는 결과를 초래하여 자동적으로 세포 수를 계수하는 정량적 측정을 불가능하게 만든다. 반면에, 경미하게 초점을 흐린 이미지는 초점으로부터 약간의 편차를 가지고 세포 이미지를 얻기 때문에 세포 형태에 의한 지역 위치에 따른 약간의 밝기의 차이를 최소화한다. 이는 전체 물체에 걸쳐서 역치 매개변수의 동등한 분배를 얻을 수 있기 때문에 이를 통해 역치 매개변수를 만족시키는 원하는 단일 세포를 보다 정확하게 선택할 수 있게 해주며 이를 통해 전체 이미지에 나타난 많은 세포 중에서 원하는 역치 매개변수 조건을 만족시키는 세포 수를 자동적으로 계수(Count)하는 것을 가능케 하며 이를 통해 통계적 정량적 세포 분석을 이룩할 수 있다. 상기 경미하게 초점을 흐린다는 의미는 세포 외곽선에 대한 뚜렷한 상이 맺히도록 하는 것이 아니라, 세포의 윤곽에 대한 상이 맺힐 정도로 초점에서 벗어나도록 대물렌즈의 시료로부터의 거리를 조절한다는 의미이다(도 2a 참조).
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 배경 보정은 초점을 흐린 세포 이미지로부터 배경에 해당하는 이미지를 소거(Subtract)한 것이다. 배경 이미지는 동등한 조건에서 샘플, 즉 세포 없이 초점을 흐린 이미지에서 얻을 수 있다. 배경 보정을 통해서 원하는 이미지로부터 약한 밝기 강도의 분배 차이를 무시할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 역치(threshold) 조정은 세포를 제외한 주변부의 노이즈를 제거하기 위한 것으로, 특정 역치 이상의 밝기를 나타내는 화소 이외의 이미지를 제거하는 역할을 수행하며 통상의 이미지 프로세싱 프로그램에 기본 적으로 포함되어 있다. 이때 상기 역치 값은 소프트웨어의 기본 값으로 정할 수 있으며 세포 이외의 이미지를 제거하기 위해 임의의 값으로 설정할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 원하지 않는 물체는 혈청 응고제 또는 파괴된 세포 물질일 수 있으나 이에 한정되지 않고 원하는 물체, 즉 세포 이외의 모든 것을 의미한다. 원하지 않는 물체의 제거는 이미지의 너비 감소 또는 밝기를 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 5)의 분석대상 세포의 수는 300 내지 2000개인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 이미지 분석 소프트웨어는 메타모프®(MetaMorph®)인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 등고선(contour) 외곽선 추출 알고리즘이 탑재된 어떠한 범용 이미지 분석 소프트웨어도 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 7)의 세포수의 계수는 광학 밀도(optical density), 평균 그레이 값(average gray value), Z 위치(Z 위치), 각(angle), 거리(distance), 부위(area), 너비(width), 경과 시간(elapsed time), 단계 레벨(stage label), 파장(wavelength), 부위 레벨(region level), 강도(intensity S/N), 역치 부위(threshod area)로 이루어진 군으로부터 선택되는 매개변수를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 데이터 취득 및 정량분석 방법은 세포사멸 및 세포괴사를 동시에 모니터할 수 있으며, 세포들의 상대적인 형광 강도 및 3차원(3D)적 시각화 효과를 이용 하여 세포자살 및 세포괴사의 형태 감별을 할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
1) 세포에 세포죽음 경로를 유도하는 시약을 처리하는 단계;
2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소로 염색시키는 단계; 및
3) 상기 세포 분석방법으로 전체 세포수 및 죽은 세포수를 계수하는 단계를 포함하는 세포 생존능력 분석방법(cell viability assay)을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포는 백혈병 세포인 HL-60를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포죽음 경로를 유도하는 시약은 살리실산나트륨(sodium salicylate), 나린제닌(naringenin) 또는 캄토테신(camptothecin)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)이고 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 세포 이미지를 이용하여 정량적 세포 생존능력을 분석하기 위하여, 백혈병 세포인 HL-60 세포를 여러 농도의 항암제 살리실산나트륨(sodium salicylate)으로 각각 처리한 후, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)에 서 배양한 후 본 발명의 초분광 이미지 시스템으로 분석하였으며 세포들의 형광 강도 및 세포 형태를 이용한 3차원적 세포 이미지를 분석하였다. PI로 염색된 세포들(죽은 세포들)의 실제수를 자동적으로 정량하기 위해 백색광 이미지와 비교하여 세포 생존 능력(%)으로 나타내었다. 그 결과 상기 살리실산나트륨이 처리 농도가 높을수록 세포 생존능력이 감소하는 것을 정량적으로 분석 가능함을 알 수 있었으며, PI 염색된 세포(죽은 세포)는 PI 최대 방출에서 각각의 피크를 나타내는 점에서 효율적으로 정량적 분석이 가능함을 알 수 있었다(표 1 및 도 3 참조).
12시간 동안 살리실산나트륨으로 처리한 HL -60 세포주의 효과
샘플 세포 생존능력(%)
도 C1 대조군 92
도 C2 2.5 mM 살리실산나트륨 83
도 C3 5 mM 살리실산나트륨 69
도 C4 10 mM 살리실산나트륨 45
또한, 본 발명은
1) 세포에 세포죽음 경로를 유도하는 시약 및 피검 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소로 염색시키는 단계;
3) 상기 세포 분석방법으로 전체 세포수와 죽은 세포수를 계수하는 단계; 및
4) 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 죽은 세포수가 감소된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포사멸 억제제의 스크리닝방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포는 백혈병 세포인 HL-60를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포죽음 경로를 유도하는 시약은 살리실산나트륨(sodium salicylate), 나린제닌(naringenin) 또는 캄토테신(camptothecin)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 약물에 의해 유발되는 세포 반응을 모니터하기 위해 항암제인 캄토테신(camptothecin, CAM) 및 나린제닌(naringenin, NAR)를 이용하였으나 이에 한정되지 않고 모든 항암제에 적용된다. 캄토테신(camptothecin, CAM)은 유형 IB DNA 토포이소머라아제(topoisomerase) 효소와 선택적인 상호작용에 의해 암세포주에서 세포자살 캐스케이드를 유도하는 것으로 알려져 있고, 나린제닌(naringenin, NAR)은 항산화 및 항증식 효력이 있으며, Hl-60 세포에서 세포자살을 유도하고 CYP3A4 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)이고 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 세포사멸 억제제의 스크리닝분석을 위해서, HL-60 세포를 상기 캄토테신 및 나린제닌으로 처리한 후 PI 및 Annexin-Qdot로 염색한 후 본 발명의 초분광 이미지 시스템으로 분석하였다. 그 결과 본 발명의 초분광 이미지 시스템은 상기 약들(캄토테신 및 나린제닌)이 갑작스런 세포 죽음을 유도하였고 상기 약들의 농도에 의해 세포자살 및 세포괴사 둘 모두가 일어나는 것을 알 수 있었다. 또한, 세포괴사의 세포들로부터 세포자살의 세포들을 분명히 구별할 수 있음을 확인하였다. PI 및 Annexin-Qdot로 염색한 모든 세포는 전체 방출 파장 범위(523 ~ 618 nm)에 걸쳐서 시각화하였고, 세포 죽음의 초기 세포괴사 또는 후기 세포자살 단계를 나타내었다. 따라서 본 발명의 초분광 이미지 시스템은 세포자살 및 세포괴사 사이 세포죽음의 하이브리드 형태를 모니터하기에 효율적임을 알 수 있다(도 4 및 도 5 참조).
세포 독성은 약 개발에 있어서 실패의 주요 요인이다. 약 개발은 약의 효력, 최소의 독성 및 특정 표적의 선택성을 목표로 한다. 본 발명의 초분광 이미지 시스템은 약이 유발하는 세포 죽음 경로 사이를 구별하기 위한 신속하고 실행가능한 기술임을 확인하였다. 상기 시스템은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있고, 세포 이미지에서 Qdot(Qunatum dot)을 적용하여 세포 이미지를 얻을 경우에도 세포를 Annexin-Qdots으로 성공적으로 라벨링할 수 있으며, 세포의 PS 모이어티들의 동등한 분배를 달성하였고 이를 통해 단일 세포내 균일한 밝기 분포를 얻을 수 있었다. 463 ~ 688 nm의 스펙트럼 범위 내에서 취득한 형광 이미지는 광안전 검출 및 초분광 해상도를 가지는 초기 세포자살, 후기 세포자살 및 세포괴사의 세포현상을 신속하고 명백하게 구별할 수 있음을 확인하였다. 상기 특징은 특정 항암제를 이용하여 약 유발 세포 죽음 경로를 밝히는데 있어서 중요한 전망을 제공한다. 예를 들면, 시중에 있는 약을 사용하여 약 유발 세포 죽음 경로를 구별함으로써 생체 외 항암제의 특성을 분석할 수 있는 것이다. 또한, 세포 죽음 경로에 관련된 기작을 이해함을 통해 약 개발의 초기 단계에서 중요한 선택을 촉진할 수 있다. 또한, 다양한 Qdot 접합물을 이용하는 초분광 이미지 시스템을 통하여 여러 막 수용체 및 세포 경로의 동시적인 시뮬레이션에 관한 새로운 정보를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 세포를 형광성 색소로 염색시키는 단계; 및
2) 상기 세포 분석방법으로 형광성 색소로 염색된 세포를 계수하는 단계를 포함하는 유세포 분석방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 형광성 색소는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소 및/또는 세포괴사에 특이적인 형광성 색소인 것을 특징으로 한다. 상기 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)인 것이 바람직하며, 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 세포는 두 가지 이상의 항체로 표지된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 상기 초분광 이미지 시스템이 유세포 분석을 할 수 있는지 알아보기 위하여, HL-60 세포주에 만소난 에프(Mansonan F), Z-IETD-FMK 및 캄토테신(camptothecin)을 각각 처리한 후, PI 및 Annexin-Qdot로 염색한 후 본 발명의 초분광 세포 이미지 시스템 및 상업용 유세포 분석기(flow cytomery)를 이용하여 세포자살 및 세포괴사의 정량적 측정을 각각 시행하여 그 결과를 비교하였다. 상기 결과, 본 발명의 초분광 이미지 시스템을 이용한 데이터는 상업용 유세포 분석기에 의한 데이터에 비교해 서로 높거나 낮게 측정되는 차이가 있었으나 정도가 미미해 거의 차이를 보이지는 않았다. 따라서 본 발명의 초분광 이미지 시스템은 유세포 분석에 이용될 수 있음을 확인하였다(표 2 및 도 6 참조). 한가지 주목해야 할 점은 이러한 유세포 분석은 상업용 유세포 분석기가 제공하는 정량적 분석이외에도 본 발명을 통해 세포 이미지를 제공할 수 있으므로 상업용 유세포 분석기의 성능에 한 차원(세포 이미지)이 추가된 보다 유용한 데이터를 제공한다.
세포자살 및 세포괴사의 정량적 측정
퍼센트 사분면 통계: 총 세포 372
FC HSIA FC HSIA FC HSIA FC HSIA
도면 샘플 UL UR LL LR
도 6 a1) 대조군 4.30 0.00 0.00 1.10 97.72 92.20 1.80 3.50
도 6 a2) M-10 0.21 0.80 25.62 3.76 10.30 44.89 63.87 50.53
도 6 a3) M-10 & Z-IEDT -FMK 0.03 0.27 5.08 2.41 67.25 66.66 26.92 30.64
도 6 a4) M-5 0.00 1.61 9.06 5.64 53.93 50.53 37.01 42.20
도 6 a5) M-5 & CAM-50 0.12 0.80 13.65 4.57 41.61 36.82 44.62 57.79
FC: 유세포 분석, HSIA: 초분광 이미지 분석
M: 만소난 에프(Mansonan F), CAM: 캄토테신(camptothecin)
UL: 위쪽 왼쪽, UR: 위쪽 오른쪽, LL: 아래쪽 왼쪽, LR: 아래쪽 오른쪽
아울러, 본 발명은
1) 세포에 피검 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광 색소로 염색하는 단계;
3) 상기 세포 분석방법으로 전체 세포수와 죽은 세포수를 계수하는 단계; 및
4) 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 죽은 세포수가 증가된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포괴사 또는 세포사멸 촉진제의 스크리닝방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물인 것이 바람직하며, 상기 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 초분광 이미지 시스템의 제조
도 1에서 보는 바와 같이, Ar 이온 레이저(Melles Griot Laser Group, 35-LAP-431-220)로부터 나오는 488-nm 빔은 샘플 스테이지에 거치된 세포 배양 플레이트에 있는 세포를 자극하는데 사용되었다. 반사경 부위에 위치하고 있는 간섭 필터(Olympus, U-MGFPHQ, exciter)에 의해 정제된 레이저 빔은 이색 반사경에 의해 반사되고 60X 현미경 대물 렌즈(Olympus)로 처리된 세포에 초점을 맞추었다. 세포자살 및 세포괴사의 세포로부터의 형광 방출은 동일한 현미경 대물 렌즈에 의해 모아지고, 이색 반사경에 의해 통과되고, 프리즘에 의해 반사되었다. AOTF(Brimrose, TEAF10-0.45-0.7-S) 앞에 위치된 렌즈는 형광 빔 직경을 줄이기 위해 사용되어 전체 형광 빔이 10 X 10 mm의 AOTF 창을 통과하였다. AOTF는 복굴절 결정(birefringent crystal)의 사용을 통해서 특정 파장에서 회절빔(diffracted beam)의 전송을 허용하였다. 게다가 회절빔은 파장은 신속하게 스캐닝될 수 있다. AOTF로부터 전송된 형광빔은 CCD 카메라에 의해 검출되었다. 롱-패스 필터(long-pass filter)는 레이저의 흩어짐을 없애기 위해 CCD 카메라의 앞에 위치하였다. CCD 카메라의 노출시간은 1초로 하였다. 특정 파장에서 형광 이미지는 AOTF 진동수를 스위핑하는 기능으로 CCD 카메라에 의해 취득하였다. AOTF는 3.75nm 간격 및 초당 1 이미지 프레임의 스캐닝 비율로 463 nm ~ 688 nm 스펙트럼 부위에서 스캐닝하였다. AOTF 진동수 스위핑 및 CCD 이미지 취득은 동시에 운영되어, 각각의 파장들에서 형광 방출에 대응되는 각각의 CCD 이미지의 총 60 프레임들은 AOTF에 의해 스캔화된다. 전체 스캐닝 과정은 1분 안에 완성되었다. 스택 이미지, 초점을 흐린 이미지, 초점을 맞춘 이미지 및 배경 보정을 위한 이미지의 각각의 샘플은 동일한 X 및 Y 축에서 캡쳐할 수 있었다.
< 실시예 2> 초분광 이미지 시스템을 이용한 세포 생존능력 측정
<2-1> 세포배양
백혈병 세포에서 세포죽음 경로를 유발하는 약을 특정하기 위해서, 백혈병 세포인 HL-60 세포주를 한국 세포주 은행(KCLB® Seoul, Korea)으로부터 취득하였고 세포배양 플라스크(25 cm2, NunclonTM Delta Surface, Denmark)에 열에 의해 불활성된 FBS(10% v/v), 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate)(24 mM), 페니실린(penicillin)(60 ㎍/ml) 및 스트렙토마이신(streptomycin)(100 ㎍/ml)로 보충한 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 세포들은 5% CO2(US AutoFlowTM, NuAire, MN, USA)를 포함하는 37℃의 습한 인큐베이터에서 표준 조건으로 배양되었다. 상기 세포들(4.5 x 105 cells/ml)은 살리실산나트륨(sodium salicylate), 나린제닌(naringenin) 및 캄토테신(camptothecin)의 3가지 항암제로 처리하였다. 약을 처리하기 전에, 세포들은 배수기 성장(log-phase growth)을 위해 하루 동안 배양하였다.
<2-2> 세포 생존능력 측정
살리실산나트륨(1 M)을 살균되어 이온이 제거된 물에서 제조되었다. 상기 HL-60 세포는 12시간 동안 1 ~ 10 mM 범위의 다양한 농도의 살리실산나트륨으로 처리되었다. 살리실산나트륨을 처리한 후, 세포(1 x 105)는 PBS(phosphate buffer saline, 10 mM, pH 7.0)로 두번 세척하였고 암실에서 실내온도로 15분 동안 5 ㎕의 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)(PI, Cat No. 556453, BD Biosciences)로 배양하였다. 마지막으로 세포 현탁액은 원심분리하였고, 펠릿(pellet)은 10 ㎕의 PBS에서 용해시켰고 초분광 이미지 시스템으로 분석하였다.
상기 초분광 이미지는 공초점 현미경의 초점을 경미하게 흐리게 맞춘 후 스캐닝하였으며, 이렇게 스캐닝된 이미지를 메타모프 소프트웨어(MetaMorph software, Molecular Devices Corp., USA)를 통해 업로드 한 뒤, 상기 소프트웨어의 보정툴을 이용하여 세포수를 측정하였다. 구체적으로, 먼저 세포가 없는 배양접시를 대상으로 스캐닝한 이미지를 배경으로 지정하여, 배경보정을 수행한 후, 배경조정된 초점을 흐린 이미지에 대하여 역치값을 정하여 역치 미만의 이미지는 제거하였다. 이 때 상기 소프트웨어에서 기본 지정된 역치값으로 모든 세포에 대한 영역지정이 될 수 있도록 하였다. 상기 역치가 조정된 이미지를 대상으로 영역선택을 수행하여, 세포 주변 부위를 생성하였다. 상기 세포 주변 부위는 스택 이미지 파일에서 저장 및 로딩하였고 PI의 최대 방출에 대응되는 이미지 플랜은 PI 염색된(죽은) 세포들의 실제수를 정량하기 위해 백색광 방식 이미지와 비교하였다. 데이터는 세포 생존능력(%)으로 나타내었다. 무처리된 대조군 및 상기 살리실산나트륨으로 처리된 실험군은 로딩된 부위의 상대적인 PI 형광 강도를 분석하였다. 상기 살리실산나트륨으로 처리된 세포의 정량적인 세포 생존 능력의 결과는 표 1에 나타내었다. 더 나은 이해를 위해, 특정 세포부위의 PI 형광 강도를 AOTF 필터링 파장으로 분류하였다. PI 염색된 세포(죽은 세포)는 PI 최대 방출에서 별개의 피크를 나타낼 수 있는 점에서 정량적 세포 생존 능력 분석이 가능함을 확인하였다(도 3 및 표 1 참조).
< 실시예 3> 초분광 이미지 시스템을 이용한 세포자살 및 세포괴사 분석
<3-1> 세포 배양
1M 나린제닌(naringenin) 및 1 mg/ml 캄토테신(camptothecin)의 저장액은 디메틸술폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)에서 제조되었다. 실험 직전, 20 ㎕의 캄토테신(camptothecin) 저장액은 28.7 uM의 사용액을 만들기 위해 2 ㎖의 PBS에 추가하였다. 세포는 6시간 동안 캄토테신(camptothecin)(150 & 287nM) 및 12시간 동안 나린제닌(naringenin)(0.5 mM)으로 처리하였다. 세포들(1 x 105)은 PBS(phosphate buffer saline, 10 mM, pH 7.0)로 두 번 세척하였고 PS에 Annexin V가 결합하는 것이 가능하기 위해 100 ㎕의 칼슘-풍부 결합 완충용액(calcium-enriched binding buffer)(BD Biosciences)에서 재현탁하였다. 세포 현탁액은 5 ㎕의 Annexin V-Biotin(Cat No. 556418, BD Biosciences)로 암실에서 15분 동안 실내온도로 배양하였다. 세포들은 세포 현탁액으로부터 고정되지 않은 Annexin V-Biotin을 제거하기 위해 다시 세척되었고 100 ㎕의 결합 완충용액에서 재현탁하였다. 그 후 암실에서 실내온도로 15분 동안 10 nM의 Qdot-streptavidin 접합물(Cat No. Q10141MP, Invitrogen) 및 10 ㎕의 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)(Cat No. 556453, BD Biosciences)과 함께 배양하였다. 마지막으로 세포 현탁액은 원심분리 하였고 펠릿(pellet)은 10 ㎕의 PBS에서 용해시켰고 초분광 이미지 분석하였다. 일부 Qdot(quantum dots)의 집단은 표적 유생분자(biomolecule)와 부적합한 결합을 하기 때문에 잘못된 결과를 나타낸다. 또한, 세포막에 있는 PS 모이어티는 Annexin V 분자 주변에 Qdot(Qunatum dot)의 자가집단 때문에 잘 인식되지 못한다. 그러므로 Qdot(Qunatum dot)은 결합 완충용액으로 용해시키고 염색 전에 와동(vortex) 시킨다.
<3-2> 세포자살 및 세포괴사 분석
바이오틴(biotin)과 스트렙타비딘(streptavidin) 사이 강한 결합을 이용하여, PS 모이어티는 스트렙타비딘(streptavidin)-코딩된 Qdot(Annexin-Qdot)에 결합된 Annexin-V(칼슘-의존성 PS-결합 35-kDa 단백질)-바이오틴(biotin)으로 라벨링하였다. 광안전 Qdot 라벨링에 의해 세포막에 PS 모이어티의 시각화는 세포자살의 세포의 증거로 이용되었고, 반면 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)은 세포괴사 세포에 이용되었다. Qdot 및 PI의 형광 방출 스펙트럼의 차이는 AOTF를 이용하는 실시간 스펙트럼 이미지를 통해 초기 세포자살, 후기 세포자살 및 세포괴사 세포들 사이 구별을 하기 위해 사용되었다. 이미지 데이터를 이해하기 위해 염색된 세포의 평균 형광 신호 강도들은 메타 이미지 소프트웨어(Meta Imaging software)에 의해 취득하였다.
나린제닌(naringenin) 및 캄토테신(camptothecin)으로 처리한 HL-60 세포는 모두 세포자살 경로를 유도하였다. 세포자살 세포들은 세포괴사 세포와 함께 존재하는 것이 관찰되었다. Qdot을 가지는 집단을 고려하여, 캡쳐된 이미지는 Qdot으로 성공적으로 라벨링하고 세포자살 세포막에 획일적으로 분배되는 것을 확인하였다. Apo 1, Apo 2 및 Apo 3 세포들은 523 nm에서 최대 강도를 가지는 세포막 주위의 밝은 형광 고리로 나타났다. 이는 세포자살 세포막에 있는 PS 모이어티가 Annexin-Qdot에 의해 선택적으로 염색되어 Qdot 최대 방출인 523 nm에서 형광 고리를 형성한 것으로 추정된다. 또한, PI 1, PI 2 및 PI 3 세포들은 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)의 최대 방출인 617 nm에서 상기 세포들에서 선택적인 PI 염색을 나타내는 최대 형광 강도를 나타내었다.
세포에 할로겐 빔(백색광)을 조사하고 AOTF 필터링 파장(523 nm)에서 취득한 이미지는 중첩된 이미지로 나타내었다. PS의 외부현상을 가지는 초기 세포자살 세포들은 세포막의 기포형성(membrane blebbing) 및 염색체의 응축(chromatin condensation)현상을 나타내었다. 초기 세포자살의 세포들은 Annexin-Qdot에 선택적이었고 PI 필터링 파장(617 nm)에서는 나타내지 않았다.
본 발명의 초분광 이미지를 통해서 조정하는 신속한 이미지화 및 선택적인 파장은 초기 세포 자살 세포들에의 필수 염료(PI)의 결합이 가능하고, 세포자살 과정의 형태 변화를 통해서 세포자살을 세포괴사와 구별할 수 있었다. 상기 초분광 이미지는 전체 스펙트럼 범위에 걸쳐서 염색된 세포들을 1분 안에 분석이 가능하였고 Qdot를 이용하는 초분광 이미지는 세포의 과열을 예방할 수 있었다. 취득한 데이터는 형광물질들 사이 초분광 해상도를 이용하는 초분광 이미지에 의해 Annexin-Qdot(세포자살) 및 PI(세포괴사)의 효율적인 구별을 할 수 있었다. 초분광 이미지는 초기 세포자살 세포의 2차 세포괴사로의 빠른 악화 때문에 시각화하기 어려운 세포죽음 경로의 효율적, 동시적 및 신속한 구별을 제공할 수 있음을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).
<3-3> 세포자살 및 세포괴사 측정 비교
HL-60 세포주에 만소난 에프(Mansonan F), Z-IETD-FMK 및 캄토테신(camptothecin)을 단독 또는 병용 처리한 후 본 발명의 초분광 이미지 시스템과 유세포 분석기(flow cytomery)를 이용하여 세포자살 및 세포괴사의 정량적 측정을 하여 비교하였다. 상기 결과, 본 발명의 초분광 이미지 시스템을 이용한 데이터는 유세포 분석기에 의한 데이터에 비교해 서로 높거나 낮게 측정되는 차이가 있었으나 큰 차이를 보이지는 않았다(도 6 및 표 2 참조). 도 6에서, 좌측 판넬은 본 발명의 초분광 이미지 시스템을 이용하여 세포의 세포괴사 및 세포사멸 상태를 분석한 그래프로서, X축은 Qdot으로 염색된 세포의 형광세기를 나타내고, Y축은 프로피디움 요오드화물로 염색된 세포의 형광세기를 나타낸다. 우측 판넬은 전형적인 유세포분석기를 이용하여 세포의 세포괴사 및 세포사멸 상태를 분석한 그래프이다. 양쪽 판넬 모두 좌상귀에 표시된 세포들은 세포괴사 상태에 있는 세포들이고, 우하귀에 표시된 세포들은 세포사멸 상태에 있는 세포를 의미하며, 우상귀에 표시된 세포들은 세포사멸을 경유하여 세포괴사에 이른 세포를 의미한다.
도 1은 음향광학 파장 가변형 필터(Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF)를 접목시킨 현미경으로 구성된 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system)의 구조를 나타내는 그림이고,
도 2는 초분광 이미지 시스템을 이용하여 취득한 세포의 이미지를 나타내는 그림이다:
a: 바탕 보정 후 경미하게 초점을 흐린 이미지;
b: 역치 이미지; 및
c: 초점을 맞춘 이미지,
도 3은 초분광 이미지 시스템을 이용하여 취득한 정량적인 세포 생존능력을 나타내는 그림이다:
A1: 백생광에서의 형광 강도 및 세포형태를 기초로 하는 총 세포들의 3차원적 세포 이미지;
A2: 617 nm(PI용 최대 방출)에서 캡쳐된 세포로서 PI에 염색된 죽은 세포들만 나타내는 이미지;
B1: 대조군의 상대적인 PI 형광 강도를 나타내는 그래프;
B2: 약 처리된 군의 상대적인 PI 형광 강도를 나타내는 그래프;
C: 12시간 동안 살리실산 나트륨으로 처리된 세포에서 PI에 염색된 죽은 세포들만 나타내는 그림:
C1: 0 mM의 살리실산 나트륨으로 처리된 세포의 생존을 보여주는 이미지(생존율: 92%)
C2: 2.50 mM의 살리실산 나트륨으로 처리된 세포의 생존을 보여주는 이미지(생존율: 83%)
C3: 5.00 mM의 살리실산 나트륨으로 처리된 세포의 생존을 보여주는 이미지(생존율: 69%)
C4: 10.00 mM의 살리실산 나트륨으로 처리된 세포의 생존을 보여주는 이미지(생존율: 45%)
D: AOTF 필터링 파장에 따른 상대적인 PI 형광 강도를 나타내는 그래프,
도 4는 초분광 이미지 시스템을 이용하여 취득한 세포자살 및 세포괴사의 세포의 이미지를 나타내는 그림이다:
a: 6시간 동안 150 nM의 캄토테신(camptothecin)으로 처리한 세포 의 463 ~ 688 nm의 스펙트럼 범위에서 나타내는 이미지; 및
b: 523 nm(세포자살 세포) 및 617 nm(세포괴사 세포)에서 형광 활성의 피크를 나타내는 그래프,
도 5는 초분광 이미지 시스템을 이용하여 취득한 세포자살 및 세포괴사의 세포의 이미지를 나타내는 그림이다:
a: 6시간 동안 287 nM의 캄토테신(camptothecin)으로 처리한 세포 의 463 ~ 688 nm의 스펙트럼 범위에서 나타내는 이미지; 및
b: 12시간 동안 나린제닌(naringenin)(0.5 mM)으로 처리한 세포 의 463 ~ 688 nm의 스펙트럼 범위에서 나타내는 이미지.
도 6은 만소난 에프(Mansonan F), Z-IETD-FMK 및 캄토테신(camptothecin)을 단독 또는 병용 처리한 후 세포자살 및 세포괴사의 정량적인 측정을 나타내는 그래프이다:
왼쪽 판넬: 본 발명의 초분광 이미지 시스템을 이용하여 측정한 그래프; 및
오른쪽 판넬: 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 측정한 그래프.

Claims (29)

  1. 샘플을 놓는 플랫폼;
    이온 레이저 빔을 방출하는 이온 레이저 광원 또는 필터를 채용한 백색광원;
    상기 이온 레이저 광원 또는 상기 백색광원으로부터 방출된 입사광의 입사량을 줄이는 ND(neutal density) 필터;
    상기 ND 필터를 통과한 입사광을 정제하는 간섭필터(interference filter);
    상기 간섭필터를 통과한 입사광을 대물렌즈 방향으로 반사하고 대물렌즈로부터 모아진 형광빔을 통과시키는 이색 반사경(dichromatic mirror);
    입사광의 초점을 맞추고 상기 샘플로부터 여기된 형광빔을 모으는 대물렌즈;
    상기 이색 반사경을 통과한 형광빔을 반사하는 프리즘;
    상기 프리즘을 통과한 형광빔의 직경을 줄이는 렌즈;
    상기 렌즈를 통과한 형광빔의 파장을 시간에 따라 조절할 수 있는 가변형 필터;
    상기 가변형 필터를 통과한 빔의 흩어지는 것을 방지하는 롱-패스 필터(long-pass filter);
    상기 롱-패스 필터를 통과한 형광빔을 검출하는 CCD 카메라; 및
    상기 CCD 카메라에 의해 검출한 형광빔의 이미지 취득 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템으로 이루어진 초분광 이미지 시스템.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 가변형 필터는 음향광학 파장 가변형 필터(Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF) 또는 액정 가변형 필터(Liquid crystal tunable filter, LCTF)인 것을 특징으로 하는 초분광 이미지 시스템.
  4. 제 3항에 있어서, 음향광학 파장 가변형 필터(Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF)는 463 nm ~ 근 적외광에 이르는 스펙트럼 부위를 0.1 ~ 30 nm 파장 간격으로 초당 하나의 이미지 프레임으로 스캐닝하는 것을 특징으로 하는 초분광 이미지 시스템.
  5. 1) 공초점 현미경의 샘플 플랫폼에 세포시료를 올려놓은 다음, 대물렌즈의 높이를 조절하여, 초점을 맞춘 이미지 및 초점을 경미하게 흐린 이미지를 CCD 카메라를 통해 취득하고 배경 보정을 위하여 배지만 포함된 배지시료에 대한 이미지를 CCD 카메라를 통해 취득하여 상기 공초점 현미경에 연결된 컴퓨터 시스템을 이용하여 파일로 저장하는 단계;
    2) 상기 단계 1)을 통해 저장된 파일을 상기 컴퓨터 시스템에 탑재된 이미지 분석 소프트웨어를 통해 로딩한 후, 상기 초점을 경미하게 흐린 이미지에 대한 배경보정을 수행하는 단계;
    3) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 1)에서 배경보정된 이미지에 대하여 역치 조정을 수행하는 단계;
    4) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 3)에서 역치 조정된 이미지로부터 원하지 않는 물체를 제거하는 단계;
    5) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 4)에서 원하지 않는 물체가 제거된 이미지로부터 원하는 물체인 세포의 이미지 형성을 위한 가상(mask)을 형성하는 단계;
    6) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 5)의 가상으로부터 세포 주변 이미지를 형성하는 단계; 및
    7) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 세포 주변 이미지를 이용하여 세포수를 계수하는 단계를 포함하는 세포 분석방법.
  6. 제 5항에 있어서, 분석대상 세포수는 300 내지 2000개인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  7. 제 5항에 있어서, 세포사멸 및 세포괴사를 동시에 모니터하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상대적인 형광 강도를 이용하여 세포자살 및 세포괴사의 형태 감별을 하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  9. 제 5항에 있어서, 3차원(3D)적 시각화 효과를 이용하여 세포자살 및 세포괴사의 형태 감별을 하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  10. 제 5항에 있어서, 이미지 분석 소프트웨어는 메타모프®(MetaMorph®)인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 공초점 현미경은 제 1항의 이미지 분석 시스템인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  12. 제 5항에 있어서, 원하지 않는 물체의 제거는 이미지의 너비 감소 또는 밝기를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  13. 제 5항에 있어서, 세포수의 계수는 광학 밀도(optical density), 평균 그레이 값(average gray value), Z 위치(Z 위치), 각(angle), 거리(distance), 부위(area), 너비(width), 경과 시간(elapsed time), 단계 레벨(stage label), 파장(wavelength), 부위 레벨(region level), 강도(intensity S/N), 역치 부위(threshod area)로 이루어진 군으로부터 선택되는 매개변수를 이용하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  14. 1) 세포에 세포죽음 경로를 유도하는 시약을 처리하는 단계;
    2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소로 염색시키는 단계; 및
    3) 상기 제 5항의 분석방법으로 전체 세포수 및 죽은 세포수를 계수하는 단계를 포함하는 세포 생존능력 분석방법(cell viability assay).
  15. 제 14항에 있어서, 세포는 백혈병 세포인 HL-60인 것을 특징으로 하는 세포 생존능력 분석방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 단계 1)의 세포죽음 경로를 유도하는 시약은 살리실산나트륨(sodium salicylate), 나린제닌(naringenin) 또는 캄토테신(camptothecin)인 것을 특징으로 하는 세포 생존능력 분석방법.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 단계 2)의 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)이고 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)인 것을 특징으로 하는 세포 생존능력 분석방법.
  18. 1) 세포에 세포죽음 경로를 유도하는 시약 및 피검 물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소로 염색시키는 단계;
    3) 상기 제 5항의 분석방법으로 전체 세포수와 죽은 세포수를 계수하는 단계; 및
    4) 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 죽은 세포수가 감소된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포사멸 억제제의 스크리닝방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 단계 1)의 세포는 백혈병 세포인 HL-60인 것을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 단계 1)의 세포죽음 경로를 유도하는 시약은 살리실산나트륨(sodium salicylate), 나린제닌(naringenin) 또는 캄토테신(camptothecin)인 것을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  21. 제 18항에 있어서, 상기 단계 2)의 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)이고 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)인 것을 특징으로 하는 스 크리닝방법.
  22. 1) 세포를 형광성 색소로 염색시키는 단계; 및
    2) 상기 제 5항의 분석방법으로 형광성 색소로 염색된 세포를 계수하는 단계를 포함하는 유세포 분석방법.
  23. 제 22항에 있어서, 형광성 색소는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소 및/또는 세포괴사에 특이적인 형광성 색소인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.
  25. 제 23항에 있어서, 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.
  26. 제 22항에 있어서, 세포는 두 가지 이상의 항체로 표지된 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.
  27. 1) 세포에 피검 물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광 색소로 염색하는 단계;
    3) 상기 제 5항의 분석방법으로 전체 세포수와 죽은 세포수를 계수하는 단계; 및
    4) 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 죽은 세포수가 증가된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포괴사 또는 세포사멸 촉진제의 스크리닝방법.
  28. 제 27항에 있어서, 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물인 것을 특징으로 하는 스크리닝방법
  29. 제 27항에 있어서, 상기 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타 비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.
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