KR100901091B1

KR100901091B1 - 티아졸리논 2-치환된 퀴놀린

Info

Publication number: KR100901091B1
Application number: KR1020077005967A
Authority: KR
Inventors: 리 천; 샤오칭 천; 크리스토프 미슈
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2009-06-08
Also published as: CA2579348A1; KR20090031797A; JP2008513398A; US7241893B2; US20060063804A1; KR20070043886A; WO2006029863A1; BRPI0515451A; CN101018785A; EP1791836A1; MX2007002721A; RU2395509C2; RU2007114126A; AU2005284294A1

Abstract

본 발명은 화학식 (Ⅰ) 의, 퀴놀린 고리가 2 위치에 치환된, 티아졸린 치환된 퀴놀린 유도체 (여기서 유도체는 CDK1 항증식성 활성을 보이고 따라서 항암 제제로서 유용함), 상기 화합물을 함유하는 약학 조성물뿐만 아니라 이의 제조 방법을 제공한다.

티아졸린, 티아졸리논, 퀴놀린, 항암 제제, 항증식성, CDK 저해제, 암 치료를 위한 약학 조성물.

Description

티아졸리논 2-치환된 퀴놀린 {THIAZOLINONE 2-SUBSTITUTED QUINOLINES}

본 발명의 분야는 퀴놀린 고리가 2-치환된, 티아졸리논 치환된 퀴놀린 유도체에 관한 것으로, 이 유도체는 CDK1 항증식성 활성을 보이고 항암 제제로써 유용하다.

시클린-의존성 키나아제 (CDK) 는 G1 정지기 (세포 분열의 새로운 주기시작 (round) 을 위한 DNA 복제의 유사분열 및 발현 간의 갭 (gap)) 로부터 S 기 (활성 DNA 합성 기간) 까지의 진행, 또는 활성 유사분열 및 세포 분열이 발생하는, G2 상으로부터 M 상으로까지의 진행과 같은 세포 주기의 상이한 상 (phase) 간의 이행 (transition) 을 조절하는 데 결정적 역할을 하는 세린-트레오닌 단백질 키나아제이다. (예를 들어, Science, 274:1643 - 1677 (1996); 및 Ann . Rev . Cell Dev. Biol, 13:261 - 291 (1997) 에 발표된 논문 참조). CDK 복합체는 조절 시클린 하부단위 (예를 들어, 시클린 A, Bl, B2, Dl, D2, D3 및 E) 및 촉매적 키나아제 하부단위 (예를 들어, CDK1, CDK2, CDK4, CDK5 및 CDK6) 의 연합을 통해 형성된다. 그 명칭이 내포하는 바와 같이, CDK 는 시클린 하부단위에 대해 절대 의존성을 나타내어 이들의 표적 기질을 인산화시키고, 상이한 키나아제/시클린 쌍은 세포 주기의 특정 상을 통한 진행을 조절하는 기능을 한다.

상기된 바와 같이, 이들 단백질 키나아제는 다양한 세포 기능을 조절하는 단백질 (효소) 의 부류이다. 이는 단백질 기질 상의 특정 아미노산의 인산화에 의해 이루어지며 기질 단백질의 입체형태적 변경을 일으킨다. 입체형태적 변화는 기질의 활성 또는 다른 결합 파트너와의 상호 작용 능력을 조정한다. 단백질 키나아제의 효소 활성이란 키나아제가 기질에 인산염기를 부가하는 속도를 의미한다. 이는, 예를 들어, 생성물로 전환되는 기질의 양을 시간의 함수로써 결정하여 측정할 수 있다. 기질의 인산화는 단백질 키나아제의 활성-부위에서 일어난다.

상기한 특성의 관점에서 볼 때, 이들 키나아제는 세포 증식, 분화 및 이동을 일으키는 성장 인자 신호 전달의 전파에서 중요한 역할을 한다. 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 는 종양 촉진 혈관생성의 중요 매개체로써 인식되어 왔다. VEGF 는 2 개의 고친화력 수용체를 통한 신호에 의해 내피 세포를 활성화시키는데, 이중 하나는 키나아제 삽입 도메인-함유 수용체 (KDR) 이다. (Hennequin L. F. 등, J. Med . Chem . 45(6):1300 (2002) 참조). FGF 는 FGF 수용체 (FGFR) 를 통한 신호에 의해 내피 세포를 활성화시킨다. 고형 종양은 새로운 혈관 (혈관생성) 의 형성에 의존하여 성장한다. 따라서, 성장 신호 전달을 방해하여, 혈관생성을 늦추거나 방지하는, FGFR 및 KDR 수용체의 저해제는 고형 종양의 예방 및 치료에 유용한 제제이다. (Klohs W.E. 등, Current Opinion in Biotechnology, 10:544 (1999) 참조).

CDK1 과 같은 CDK 는 세포 분화의 일반적 활성제로 작용하기 때문에, CDK1 의 저해제가 항증식성 제제로써 이용될 수 있다. 이들 저해제는, 제어되지 않은 세포 주기 진행의 억제에 치료적 개입을 발현하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 하기 화학식 Ⅰ 의 화합물:

[식 중

R₁ 은 수소, 저급 알킬, 아릴옥시-저급 알킬, -C(O)₂[CH₂CH₂O]_P-R₉, -[CH₂CH₂O]_V-R₈, 또는 R₂-(X)_n- 이고;

X 는 저급 알킬렌, 히드록시-저급 알킬렌, 시클로-저급 알킬렌, 아릴 저급 알킬렌, 카르복시-저급 알킬렌, 아미도 저급 알킬렌, 모노- 또는 디- 할로-저급 알킬렌, 아미노-저급 알킬렌, 모노- 또는 디- 저급 알킬 아미노-저급 알킬렌 또는 이미도-저급 알킬렌이고;

R₂ 는

이고:

(식 중

는 아릴 고리; 탄소 원자 3 내지 6 개를 함유하는 시클로알킬; 탄소 원자 3 내지 5 개 및 산소, 질소 및 황으로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유하는 4 내지 6 원 헤테로시클로알킬 고리; 또는 산소, 황 및 질소로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유하는 5 또는 6 원 헤테로방향족 고리이고;

R₅, R₆ 및 R₇ 은 히드록시, 저급 알킬-술폰, 히드록시-저급 알킬, 수소, 저급 알킬, 할로겐, 퍼플루오로-저급 알킬, 저급 알콕시, 아미노, 모노- 또는 디- 저급 알킬 아미노로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 치환기 R₅, R₆ 및 R₇ 중 둘이 고리

상의 인접한 탄소 원자 상에서 치환될 때, 이들 두 치환기가 이들과 인접하고, 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 아릴 고리; 3 내지 6 원 시클로알킬; 4 내지 6 원 헤테로시클로알킬 고리; 또는 4 내지 6 원 헤테로방향족 고리를 형성하고; 여기서 상기 헤테로시클로알킬 고리 및 상기 헤테로방향족 고리는 산소, 질소 또는 황으로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유함);

R₄ 는 수소, -(O)_k(CH₂CH₂O)_y-R₁₀,

또는 -O-(CH₂)_mR₁₄ 이고;

R₁₉ 는 수소이고;

R₂₀ 은 수소, 저급 알킬 또는

이고;

는 아릴 고리; 탄소 원자 3 내지 6 개를 함유하는 시클로알킬; 산소, 황 및 질소로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유하는 4 내지 6 원 헤테로고리형 알킬 고리; 또는 산소, 황 및 질소로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유하는 5 내지 6 원 헤테로방향족 고리이고;

R₈ 및 R₉ 는 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;

R₁₀ 및 R₁₁ 은 저급 알킬이고;

R₁₄ 는 퍼플루오로-저급 알킬이고;

R₁₇ 및 R₁₈ 은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는

이고;

n 및 k 는 0 내지 1 의 정수이고;

w, y 및 z 는 0 내지 3 의 정수이고;

p 는 0 내지 6 의 정수이고;

v 및 m 은 1 내지 6 의 정수임];

또는 R₂ 가 헤테로방향족 고리 내에 질소를 함유하는 화합물의 N-옥사이드, R₂ 가 헤테로시클로알킬 고리 또는 헤테로방향족 고리 내에 황을 함유하는 술폰;

또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 CDK, 특히, CDK1 의 활성을 저해한다는 것을 발견하였다.

그러한 제제를 함유하는 이들 발명의 제제 및 약학 조성물은, 제어되지 않거나 원하지 않는 세포 증식, 예컨대 암, 자가면역 질환, 바이러스 질환, 진균 질환, 신경변성 장애 및 심장혈관 질환에 연관된 다양한 질환 또는 장애 상태의 치료에 유용하다.

CDK, 특히 CDK1 의 활성을 저해하고/하거나 조정하는 것은, 이들 화학식의 화합물 및 이들 화합물을 함유하는 조성물을, 키나아제 활성에 의해 조정되는 질환의 치료에서, 특히 암을 치료하는 항-종양 제제로써 유용하게 만든다.

본원에 지적된 바와 같이, 화학식 I 의 화합물은 잠재적 항-증식 제제로써, CDK, 특히 CDK1 의 활성을 조정하고/하거나 저해하는데 유용하여, 제어되지 않거나 비정상인 세포 증식에 연관된 암 또는 기타 질환의 치료를 위한 항-종양 제제를 제공한다.

화학식 I 의 화합물 중에서, 하기 화학식 Ⅰ-A 의 화합물:

[식 중 R₁' 은 수소, 또는 저급 알킬, 또는 저급 알콕시 알킬이고, R₄, R₁₉ 및 R₂₀ 은 상기와 같음]; 또는

이의 약학적으로 허용가능한 염 및 하기 화학식 Ⅰ-B 의 화합물:

[식 중

R₁" 은 R₂'-(X')_n- 이고;

n, R₄, R₁₉ 및 R₂₀ 은 상기와 같고; 및

X' 는 저급 알킬렌, 히드록시-저급 알킬렌, 시클로-저급 알킬렌, 또는 모노- 또는 디- 할로 저급 알킬렌이고;

R₂' 은

이고;

(식 중

는 아릴 고리; 탄소 원자 3 내지 6 개를 함유하는 시클로알킬 고리; 탄소 원자 3 내지 5 개 및 산소, 질소 및 황으로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유하는 4 내지 6 원 헤테로시클로알킬 고리; 및 산소, 황 및 질소로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유하는 5 또는 6 원 헤테로방향족 고리이고;

R₅' 및 R₆' 은 히드록시, 저급 알킬-술폰, 히드록시-저급 알킬, 수소, 저급 알킬, 할로겐, 퍼플루오로-저급 알킬, 저급 알콕시, 아미노, 모노- 또는 디- 저급 알킬 아미노로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택됨)];

또는 R₂' 이 헤테로방향족 고리 내에 질소를 함유하는 화합물의 N-옥사이드, R₂' 이 헤테로 고리 또는 헤테로방향족 고리 내에 황을 함유하는 술폰;

또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 바람직하다.

화학식 Ⅰ 및 Ⅰ-B 의 화합물에서, R₁, R₁", R₂ 및 X 는 아릴 부분을 함유하는 치환기인 경우, 바람직한 아릴 부분은 페닐이다. 본원에서 이용될 때 할로겐은 모든 네 가지 할로겐 예컨대, 염소, 플루오르, 브롬 및 요오드를 포함한다.

본 명세서에서, 단독으로 또는 조합으로 사용되는, 용어 "저급 알킬" 은 탄소 원자 1 내지 6 개를 함유하는 1 가의 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 의미한다.

용어 "시클로알킬" 은 시클로저급 알킬 치환기를 의미하며, 이는 1 가의 비치환된 3- 내지 6-원 포화 카르복실 탄화수소 고리를 의미한다. 바림직한 시클로알킬 치환기로 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로헥실 등이 있다.

용어 "저급 알콕시" 는 탄소 원자 1 내지 6 개를 함유하는 저급 알킬로부터 형성된 직쇄 또는 분지쇄 알콕시기, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시 등을 의미한다.

용어 "아릴" 은 1 가의 단일- 또는 두고리형 (bicyclic) 비치환된 방향족 탄화수소 고리, 예컨대 페닐 또는 나프틸을 의미하고, 이때 페닐이 바람직하다.

용어 "헤테로시클로알킬" 은 탄소 원자 3 내지 4 개 및 산소, 질소 또는 황으로 구성된 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 또는 2 개를 함유하는 4 내지 6 원 단일고리형 포화 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로시클릭 알킬기 중에 모르폴리닐, 테트라히드로, 티오피란일 또는 테트라히드로 피란일이 포함된다.

용어 "헤테로방향족 고리" 는 탄소 원자 4 내지 5 개 및 산소, 질소 또는 황으로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 2 개를 함유하는 1 가의 5 또는 6 원 단일고리형 헤테로방향족 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로방향족기 중에 티오페닐, 티오아졸, 피리딘일, 퓨란일 등이 포함된다.

용어 "시클로-저급 알킬렌" 은 상기 정의된 바와 같은 2 가의 시클로알킬기를 의미한다.

용어 "저급 알킬렌" 은 탄소 원자 1 내지 6 개를 함유하는 2 가의 포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 치환기를 나타낸다.

용어 "아릴-저급 알킬렌" 은 상기에 정의된 바와 같은 아릴기로 치환된, 바람직하게 단일치환된, 상기에 정의된 바와 같은 저급 알킬렌기를 나타낸다. 예로 벤질, 1-페닐에틸 또는 2-페닐에틸이 있다.

용어 "카르복시-저급 알킬렌" 은 카르복시 라디칼로 치환된, 바람직하게 단일치환된, 상기에 나타낸 바와 같은 저급 알킬렌 치환기를 나타낸다.

용어 "히드록시-저급 알킬렌" 은 아미도 저급 알킬렌이 이용되는 히드록시기로 치환된, 바람직하게 단일치환된, 저급 알킬렌 치환기를 나타내어, 아미도 치환기로 치환된 상기 개시된 저급 알킬렌 치환기를 나타낸다.

용어 "모노- 또는 디- 할로-저급 알킬렌" 치환기는 저급 알킬렌 사슬에서 탄소 원자 1 개 또는 2 개가 단일치환되거나 또는 이중치환된 상기에 정의된 바와 같은 저급 알킬렌 치환기를 나타내고, 상기 치환기는 할로겐이다.

용어 "할로겐" 은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도를 의미한다.

용어 "모노- 또는 디- 저급 알킬 아미노-저급 알킬렌" 치환기는 저급 알킬렌 사슬에서 탄소 원자 1 개 또는 2 개가 단일치환 또는 이중치환된, 상기에 정의된 바와 같은 저급 알킬렌 치환기를 나타내고, 상기 치환기는 모노- 또는 디- 저급 알킬 아미노기이다.

용어 "아미노-저급 알킬렌" 은 아미노기로 치환된, 바람직하게 단일치환된 상기에 정의된 바와 같은 저급 알킬렌 치환기를 나타낸다.

용어 "아미도-저급 알킬렌" 은 아미도기가 하나의 위치 상에 치환된 상기 정의된 바와 같은 저급 알킬렌 치환기를 나타낸다.

용어 "이미도-저급 알킬렌" 은 이미도기가 하나의 위치 상에 치환된 상기 정의된 바와 같은 저급 알킬렌 치환기를 나타낸다.

용어 "아릴옥시" 는 아릴이 상기와 같은 아릴옥시 치환기를 나타낸다. 바람직한 아릴기는 페닐이고 바람직한 아릴옥시는 페녹시이다.

용어 "퍼플루오로-저급 알킬" 은 저급 알킬기의 모든 수소가 불소로 치환된 또는 대체된 임의의 저급 알킬기를 의미힌다. 바람직한 퍼플루오로-저급 알킬기로 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필 등이 있고, 이때 트리플루오로메틸이 특히 바람직하다.

용어 "약학적으로 허용가능한 염" 은 생물학적 유효성 및 화학식 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 V 의 화합물의 특성을 보유하고, 적절한 비독성 유기 또는 무기산, 또는 유기 또는 무기 염기로부터 형성되는 통상의 산-부가 염 또는 염기-부가 염을 의미한다. 산-부가염의 샘플에는 무기산 예컨대 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 술팜산, 인산 및 질산으로부터 유도된 것, 및 유기산 예컨대 p-톨루엔술폰산, 살리실산, 메탄술폰산, 옥살산, 숙신산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산 등으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기-부가 염의 샘플에는 암모늄, 칼륨, 나트륨 및 테트라메틸암모늄 히드록사이드와 같은 4 차 암모늄 히드록사이드로부터 유도된 것들이 포함된다. 약학적 화합물 (즉, 약물) 의 염으로의 화학적 개질은 화합물의 개선된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 가용성을 수득하기 위한, 약제사에게 공지된 기술이다. 예를 들어, H. Ansel 등, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (제 6 판, 1995), pp. 196 및 1456 - 1457 를 참조한다.

본 발명에 따르면 화학식 I 의 화합물은 반응식 1 에 따라 제조될 수 있고, 여기서 명확히 달리 기술하지 않으면 기술한 R₁, R₄, R₁₉ 및 R₂₀ 은 상술한 의미를 갖는다.

[반응식 1]

본 발명에 따르면, 화학식 Ⅱ 의 화합물은, 노베나겔 (Knoevenegel) 반응을 통해, 화학식 Ⅲ-A 의 화합물 (로다닌 (2-티옥소-티아졸린-4-온)) 과 반응하여, 화학식 Ⅳ 의 화합물을 제조한다. 노베나겔 반응을 수행하는데 통상적인 임의의 조건이 상기 축합을 수행하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 이 반응은 알칼리 금속 아세테이트 및 아세트산의 존재 하 환류 온도에서 수행된다.

상기 합성의 다음 단계에서, 생성된 화학식 IV 의 치환된 티아졸리딘은 메틸화제로 처리되어, 화학식 IV 의 화합물 상의 티오기를 메틸화시켜 화학식 V 의 화합물을 제조한다. 바람직한 메틸화제는 아이오도메탄이다. 상기 반응은 유기 아민 염기 예컨대 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 내에서 수행된다. 상기 반응을 수행하는데 있어서 온도 및 압력은 중요하지 않아서 상기 반응은 실온 및 대기압에서 수행될 수 있다. 실제로 상기 반응의 수행에 있어서, 티오기를 메틸화시키는 통상적인 임의의 조건이 이용될 수 있다.

상기 합성의 다음 단계에서, 화학식 V 의 화합물이 화학식 VI 의 화합물과 반응하여 화학식 I 의 화합물이 제조된다. 화학식 VI 의 화합물은 아민이고 메틸티오기의 아민 치환에 통상적으로 이용되는 임의의 방법이 상기 반응의 수행에 이용될 수 있다. 하나의 실시태양에 따르면 상기 치환은 통상적인 용매 예컨대 아세토니트릴의 존재 하에서 화학식 VI 의 화합물을 화학식 V 의 화합물과 반응시켜 수행한다. 일반적으로, 상기 반응은 아민 염기 예컨대 디이소프로필에틸아민의 존재 하에서 수행된다.

다른 한편으로, 화학식 I 의 화합물은 화학식 Ⅱ 의 화합물을 하기 화학식 Ⅶ 의 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다:

(식 중 R₁ 은 상기와 같음)

화학식 I 의 화합물의 제조를 위한 화학식 Ⅶ 의 화합물과 화학식 Ⅱ 의 화합물의 반응이 폐쇄계 내 150 ℃ 내지 250 ℃ 의 고온에서 고 비점의 유기 용매 예컨대 벤젠 또는 톨루엔 내에서 수행된다. 이와 같은 방식으로, 상기 반응은 고온 및 고압 하에서 수행된다. 상기 반응은 R 기가 사슬 X, 또는 고리 P 에서 할로겐을 함유하는 화학식 I 의 화합물을 제조하고자 할 때 특히 유리하다. 화학식 Ⅶ 의 화합물은 하기 화학식 Ⅵ 의 화합물과 화학식 Ⅲ-A 의 화합물의 반응을 통한 직접 대체에 의해 직접 형성될 수 있다:

(식 중 R₁ 은 상기와 같음).

대체 반응은 일반적으로 화학식 Ⅸ 의 티에닐 화합물의 티에닐기에 대한 활성제의 존재 하에 및 아민 염기의 존재 하에 수행된다. 바람직한 활성제로 염화 수은 (mercuric chloride) 이 있다. 상기 반응은 비활성 유기 용매 내에서 수행된다. 임의의 통상적인 비활성 유기 용매 에컨대 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드 등이 사용될 수 있다. 상기 반응의 수행에 있어서, 아민 염기, 예컨대 디이소프로필에틸아민이 이용된다. 상기 반응의 수행에 있어서, 온도 및 압력은 중요하지 않아서 상기 반응은 실온 및 대기압에서 수행될 수 있다. 상기 반응의 수행에 있어서, 티에닐기를 아민기로 대체하는 임의의 통상적인 방법이 사용될 수 있다.

화학식 Ⅵ 의 화합물 (여기서 R₁ 이 X 이고 X 가 히드록시 저급 알킬렌임) 에 있어서, 상기 화합물은 알칼리 금속 보로히드라이드로 환원시킴으로써 해당 아미노산 또는 아미노산 에스테르로부터 제조될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 히드록시 저급 알킬렌 화합물은 리튬 알루미늄 히드라이드로 환원시킴으로써 해당 시아노 카르복시산 에스테르로부터 제조될 수 있다. 환원은 시아노기를 아미노기로, 에스테르기를 히드록시기로 환원시킨다. 상기 환원은 화학식 Ⅵ 의 화합물이 화학식 V 의 화합물과 반응하기 전에 일어나야 한다.

다른 한편으로, 화학식 Ⅵ 의 화합물 (여기서, R₁ 이 R₂X- 이고 X 가 카르복시 저급 알킬렌, 아미도 저급 알킬렌 또는 이미도 저급 알킬렌임) 에 있어서, 상기 화합물은 해당하는 화학식 Ⅵ 의 화합물을 상기와 같은 화학식 V 의 화합물 또는 화학식 Ⅲ-A 의 화합물과 반응시킴으로써 화학식 I 의 화합물로 직접 전환시킬 수 있다.

고리

또는

이 고리

또는

을 형성하는 질소 함유 고리내의 질소 원자의 N-옥사이드에 있어서, 상기 N-옥사이드는 산화에 의해 3 차 고리 질소 원자로부터 형성될 수 있다. 3 차 질소 원자를 N-옥사이드로 산화시키는 임의의 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 산화제는 메타-클로로퍼벤조산 (MCPBA) 이다.

R₁ 이 수소인 화학식 Ⅰ 의 화합물은 노베나겔 반응을 통해 화학식 Ⅱ 의 화합물을 화학식 Ⅶ 의 화합물과 반응시켜 화학식 Ⅳ 의 화합물을 제조함으로써 제조될 수 있다. 노베나겔 반응을 수행하는데 통상적인 임의의 조건이 상기 축합을 수행하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 상기 반응은 알칼리 금속 아세테이트 및 아세트산의 존재 하 환류 온도에서 수행된다. 화학식 Ⅶ 의 화합물과, R₂₀ 이

인 화학식 Ⅱ 의 화합물 간의 노베나겔 반응에서, R₂₀ 은 아미드를 형성한다. 상기 아미드는 가수분해되어 R₂₀ 이 수소인 화학식 Ⅰ 의 화합물의 2 위치에 아민을 형성한다. 노베나겔 반응에서 이용되는 염기는 아미드기를 가수분해하여 해당 아민을 제조한다.

본 발명에 따르면 R₄ 가 수소인 화학식 Ⅱ 의 화합물, 즉 하기 화학식 Ⅱ- A 의 화합물:

(식 중 R₁₉ 및 R₂₀ 은 상기와 같음)

은 반응식 2 에 따라 하기 화학식 Ⅹ 의 화합물로부터 제조될 수 있다:

(식 중 R₁₉ 및 R₂₀ 은 상기와 같음).

[반응식 2]

3-에톡시-아크릴로일 클로라이드로 4-아이오도아닐린으로부터 제조될 수 있는 화학식 Ⅹ 의 화합물은 황산으로 처리함으로써 화학식 XI 의 화합물로 고리화된다. 일반적으로, 상기 반응은 비활성 용매 예컨대 디클로로메탄에서 수행된다. 고리화는 황산의 이용을 통해 화학식 Ⅹ 의 화합물의 에테르 부분에서 알파, 베타 불포화 이중 결합을 통해 달성된다. 상기 반응의 수행에 있어서, 온도 및 압력은 중요하지 않아서 상기 고리화 반응은 실온 및 대기압에서 수행될 수 있다.

옥소 치환기를 함유한 고리화된 화학식 XI 의 화합물은 염소화 제제 예컨대 옥시염화인 (phosphorous oxychloride) 으로 처리함으로써 염소화된 화학식 XII 의 화합물로 전환시킬 수 있다. 일반적으로 액체인 고비점의 염소화 제제 예컨대 옥시염화인을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 방법으로 반응 혼합물은 환류되어 우수한 수율로 옥소 치환기를 염화물로 전환할 수 있다. 옥소기를 염화기로 전환하는 통상적인 임의의 조건이 상기 반응을 수행하는데 이용될 수 있다. 상기 반응의 다음 단계에서, 화학식 XII 의 화합물은 암모늄 히드록사이드와 반응하여 화학식 XIII 의 화합물을 제조한다. 상기 반응은 1 내지 4 시간 동안 100 ℃ 내지 200 ℃ 의 온도, 바람직하게 150 ℃ 의 온도에서 압력 하에 암모늄 히드록사이드와 반응시킴으로써 수행된다. 원한다면, R₁₉ 및 R₂₀ 치환기를 갖는 2 차 아민은 화학식 XII 의 화합물을 치환된 아민과 반응시킴으로써, 또는 1 차 아민을 저급 알킬을 갖는 2 차 아민으로 전환시키는 임의의 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.

치환기를 갖는 화학식 Ⅱ-A 의 2-아미드 치환 화합물은 1 차 아민 화합물을 산염화물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 합성의 다음 단계에서, 화학식 XIII 의 화합물은 페닐 고리 상에 아이오도기를 CHO 치환기로 전환하는 포르밀화 반응을 이용하여 화학식 Ⅱ-A 의 화합물로 전환된다. 상기 반응은 촉매로써 팔라듐 아세테이트를 사용한 염기의 존재 하 디페닐 프로필 포스핀 (dpp) 의 존재 하에 화학식 XIII 의 화합물을 일산화탄소와 반응시킴으로써 수행된다. 상기 반응의 수행에 있어서, 일산화탄소는 60 내지 100 ℃ 의 온도에서 압력 하에 반응 혼합물에 첨가된다. 일반적으로 70 내지 80 psi 의 압력이 상기 반응의 수행에 사용된다. 일산화탄소와의 반응에 의하여 페닐 고리 상에 할로겐화기를 알데히드로 전환하는 임의의 통상적인 방법은 상기 전환을 수행하는데 사용될 수 있다.

화학식 Ⅰ 의 2,4 이중치환된 화합물, 하기 화학식 Ⅱ-B 의 중간체의 합성:

(식 중 R₂₀' 은

이고, R₄ 및 R₁₁ 은 상기와 같음)

은 하기 반응식 3 (식 중 R₂₀' 및 R₄ 가 상기와 같음) 에 따라 수행될 수 있다.

[반응식 3]

화학식 XVII 의 화합물은 화학식 XVI 의 화합물을 하기 화학식 ⅩⅩ 의 카르복시산의 반응성 유도체와 반응시킴으로써 화학식 XVI 의 화합물 (화합물 XVI 의 제조는 실시예 2 에 기재되었음) 로부터 제조될 수 있다:

(식 중 R₁₁ 은 상기와 같음).

반응성 카르복시산 유도체 예컨대 할로겐화물 또는 무수물과의 반응에 의해 아민을 아미드 전환하는 임의의 통상적인 방법이 상기 반응을 수행하는 데 이용될 수 있다. 히드록시기를 함유하는 화학식 XVII 의 화합물은 화학식 XVII 의 화합물의 히드록시 자리를 화학식 Ⅰ 의 화합물의 4-위치의 배치를 원하는 R₄ 치환기의 할로겐화물과 반응시킴으로써 화학식 XVIII 의 화합물로 전환될 수 있다. 상기 반응은 비활성 유기 용매 매질에서 환류 조건 하에 해당 할로겐화물 및 화학식 XVII 의 화합물을 반응시킴으로써 수행된다. 히드록시기를 할로겐화물과 반응시키는 임의의 통상적인 방법이 상기 반응을 수행하는데 사용될 수 있다. 상기 합성의 마지막 단계에서, 화학식 XVIII 의 화합물은 포르밀화 반응를 이용하여 화학식 Ⅱ-B 의 화합물로 전환되어 페닐 고리 상에 아이오도기가 CHO 치환기로 전환된다. 상기 반응은 상술한 바와 같이, 60 ℃ 내지 140 ℃ 의 온도에서 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 촉매를 사용한 염기의 존재 하에 화학식 XVIII 의 화합물을 일산화탄소와 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 반응을 수행하는데 있어서 일산화탄소가 압력 하에 반응 매질에 첨가된다. 40 내지 80 psi 의 압력이 일반적으로 이용된다. 일산화탄소와의 반응에 의하여 페닐 고리 상에 할로겐화물기를 알데히드로 전환하는 포르밀화 반응의 임의의 통상적인 방법은 화학식 XVIII 의 화합물을 화학식 Ⅱ-B 의 화합물로 전환시키는데 사용될 수 있다.

화학식 Ⅰ 의 화합물 및 화학식 Ⅰ-A 및 화학식 Ⅰ-B 의 화합물을 포함하는 이의 실시태양 중에서 아릴기를 갖는 상기 화합물은 모든 아릴 치환기가 바람직하게 페닐이다.

화학식 Ⅰ-A 의 화합물의 부류의 실시태양 중에서 R₁ 이 수소인 화학식 Ⅰ-A 의 화합물이 바람직하다. 상기 부류의 화합물의 특히 바람직한 실시태양은 R₄ 가 -(O)_k(CH₂CH₂O)_y-R₁₀ 인 화합물이다.

상기 경우에서, R₂₀ 이

인 화합물이 특히 바람직하다.

화학식 Ⅰ-B 의 화합물의 실시태양 중에서, n 이 0 이고 R₂' 이 시클로저급 알킬고리 특히 시클로프로필인 상기 부류의 화합물이 바람직하다. 상기 부류의 화합물 중에서 R₄ 가 -(O)_k(CH₂CH₂O)_y-R₁₀ 인 화합물이 바람직하다. 상기 부류의 화합물에서 R₂₀ 이

인 화합물이 특히 바람직하다.

본 발명의 다른 실시태양은 n 이 1 이고 X 가 저급 알킬렌, 히드록시-저급 알킬렌, 시클로-저급 알킬렌 또는 모노- 또는 디- 할로-저급 알킬렌인 상기 화학식 Ⅰ-B 의 화합물이다. 상기 경우에서, R₄ 는 바람직하게 -(O)_k(CH₂CH₂O)_y-R₁₀ 이다.

상기 바람직한 실시태양에서, R₂₀ 이

인 화합물이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 대안적으로 또는 화학식 I 의 화합물에 부가하여, 활성 성분으로써 약학적으로 허용가능한 프로드러그 (prodrug), 약학적으로 활성인 대사물질, 및 그러한 화합물 및 대사물질들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 그러한 화합물, 프로드러그, 다합체 (multimer), 염 및 대사물질은 본원에서 때때로 "활성제" 또는 "제제" 로 총칭된다.

고체인 제제의 경우, 당업자는 본 발명의 화합물 및 염이 상이한 결정 또는 다형체 (polymorphic form) 로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명 및 특정된 화학식의 범주 내에 있도록 의도됨을 이해할 것이다.

본 발명의 활성제의 치료적 유효량은 단백질 키나아제 CDK1 의 조정 또는 조절에 의해 조정되는 질환의 치료에 사용될 수 있다. "유효량" 이란, 진핵 세포, 예를 들어, 포유류, 곤충, 식물 또는 진균 세포의 증식을 현저히 저해하고/하거나 탈-분화 (de-differentiation) 를 방지하는 제제의 양을 의미하는 것으로 의도되며, 지시된 용도, 예를 들어, 특정 치료적 처치에 효과적이다.

그러한 양에 해당하는 주어진 제제의 양은 특정 화합물, 질환 상태 및 이의 경중도, 치료가 필요한 대상체 또는 숙주의 특성 (예를 들어, 체중) 과 같은 인자에 따라 달라지지만, 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 투여되는 특정 제제, 투여 경로, 치료되는 상태, 및 치료되는 대상체 또는 숙주를 포함하는, 주변 환경의 특정 상황에 따라 당업계에 공지된 방식으로 통상적으로 결정될 수 있다. "치료함" 은 CDK1 단백질 키나아제의 활성에 의해, 적어도 부분적으로 영향을 받는 포유류 (예를 들어, 인간) 와 같은 대상체 내의 질환 상태를 적어도 완화시키는 것을 의미하는 것으로 의도되며 하기를 포함한다: 특히 포유류가 질환 상태에 걸리기 쉬운 것으로 밝혀졌지만, 아직 질환에 걸린 것으로 진단되지는 않은 경우, 질환 상태가 포유류에서 발생하는 것을 방지하는 것; 질환 상태를 조절 및/또는 저해하는 것; 및/또는 질환 상태를 완화시키는 것.

본 발명은 추가로, 본 발명의 제제를 투여함으로써, 예를 들어 포유류 조직에서, 단백질 키나아제 CDK1 활성을 조절 또는 저해하는 방법에 관한 것이다. 항증식제로서의 제제의 활성은 공지의 방법에 의해, 예를 들어 MTT 분석에서의 전체 세포 배양물을 이용하여 용이하게 측정될 수 있다. CDK1 단백질 키나아제 활성의 조절제로서의 본 발명의 제제의 활성은 생체 내 (in vino) 및/또는 시험관 내 (in vitro) 분석을 포함하는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 활성 측정에 적합한 분석의 예에는, 국제 공개공보 제 WO 99/21845 호; 문헌 [Parast 등, Biochemistry, 37, 16788 - 16801 (1998); Connell-Crowley 및 Harpes, Cell Cycle: Materials and Methods, (Michele Pagano, ed. Springer, Berlin, Germany) (1995)]; 국제 공개공보 제 WO 97/34876 호; 및 국제 공개공보 제 WO 96/14843 호에 기재된 것들이 포함된다. 이러한 특성은, 예를 들어, 하기 실시예에서 기술되는 생물학적 시험 절차의 하나 이상을 이용하여 평가될 수 있다.

본 발명의 활성제는 후술되는 바와 같이 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효한 조정, 조절 또는 저해량의 화학식 I 의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 비활성 담체 또는 희석제를 포함한다. 약학 조성물의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 제제의 효능 있는 수준은 항증식 능력을 포함하는 치료적 이점을 제공하도록 제공된다. "효능 있는 수준" 이란 증식이 저해 또는 제어되는 수준을 의미한다. 상기 조성물은 투여 방식, 예를 들어, 비경구 또는 경구 투여에 적절한 단위 투여 형태로 제조된다.

본 발명의 제제는 활성 성분으로서의 치료적 유효량의 제제 (예를 들어, 화학식 I 의 화합물) 를 통상적인 절차에 따라 적절한 약학적 담체 또는 희석제와 조합함으로서 제조된 통상의 투여 형태로 투여될 수 있다. 상기 절차는 성분들을 적절한 만큼 원하는 제제로 혼합, 과립화 및 압축 또는 용해하는 것을 포함할 수 있다.

사용되는 약학적 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 담체의 예로는 락토스, 수크로스, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등이 있다. 액체 담체의 예로는 시럽, 땅콩 오일, 올리브유, 물 등이 있다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같이 당업계에 공지된 시간-지연 또는 시간-방출 물질을, 단독으로 또는 왁스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸 메타크릴레이트 등과 함께 포함할 수 있다.

다양한 약학적 형태가 사용될 수 있다. 따라서, 만약 고체 담체를 사용한다면, 제제를 정제화하거나, 분말 또는 펠렛 형태로 경질 젤라틴 캡슐 내에 또는 트로키제 또는 로젠지 형태로 넣을 수 있다. 고체 담체의 양은 다양할 수 있다. 만약 액체 담체를 이용한다면, 제제는 시럽, 에멀젼, 연질 젤라틴 캡슐, 앰플 또는 바이알 내의 멸균 주사 용액 또는 현탁액, 또는 비수성 액체 현탁액의 형태일 것이다.

안정한 수용성 투여 형태를 수득하기 위해, 본 발명 제제의 약학적으로 허용가능한 염을 유기 또는 무기산의 수용액에 용해시킬 수 있다. 만약 용해성 염 형태가 입수가능하지 않다면, 제제는 적절한 공용매 또는 공용매들의 조합에 용해될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 제제의 실제 투여량은 이용되는 특정 복합체, 제형되는 특정 조성물, 투여 방식 및 특정 부위, 숙주 및 치료되는 질환에 따라 달라질 것이다. 주어진 일련의 상태에 대한 최적 투여량은 제제에 대한 실험 데이터의 측면에서 통상의 투여 측정 시험을 이용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 예를 들어, 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화 (levigating), 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조와 같은 통상의 기술을 이용하여, 약학 조성물의 제조에 대해 일반적으로 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약학 조성물은 활성 화합물을 약학적으로 이용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제로부터 선택될 수 있는, 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 이용하여 통상의 방식으로 제형화될 수 있다.

경구 투여용으로, 화합물은 화합물을 당업계에 공지된 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 용이하게 제형화할 수 있다. 그러한 담체는 본 발명의 화합물을 치료되는 환자에 의해 경구 섭취되기 위한, 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화할 수 있게 한다. 활성 성분 (제제) 과 혼합된 고체 부형제를 이용하고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 적절한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여, 원한다면, 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로서, 경구용 약학적 제제를 수득할 수 있다.

본 발명은 이제 추가로 하기에 동반되는 실시예에 의해 설명되며, 본 발명의 범위를 결코 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

5-[1-(2-아미노-퀴놀린-6-일)- 메트 -(Z)- 일리덴 ]-2-((1R,2S)-2- 페닐 - 시클로프 로필아미노)-티아졸-4-온; 트리플루오로 -아세트산과의 화합물

3-에톡시-N-(4-아이오도-페닐)-아크릴아미드의 제조

옥살일 클로라이드의 용액 (40 g, 0.555 mol) 에 0 ℃ 에서 에틸 비닐에테르 (105.6 g, 0.84 mol) 을 서서히 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 0 ℃ 에서 및 12 시간 동안 실온에서 교반하였다. 회전 증발기로 용매를 어느 정도 제거한 후, 흑색 혼합물을 30 분 동안 120 ℃ 에서 환류시켰다. 회전 증발기와 뒤이은 오일 펌프로 용매를 제거한 후, 3-에톡시-아크릴로일 클로라이드 (69.9 g) 를 추가 정제 없이 다음 단계 반응에 직접 이용되는 흑색 액체로서 수득하였다.

메틸렌 클로라이드 (85 mL) 중 4-아이오도아닐린 (14 g, 64 mmol) 및 피리딘 (10.5 mL, 128 mmol) 의 혼합물에 3-에톡시-아크릴로일 클로라이드 (10 g, 75 mmol) 를 첨가하였다. 5 시간 동안 교반한 후, 추가의 3-에톡시-아크릴로일 클로라이드 (5 g, 38 mmol) 및 피리딘 (10.5 mL, 64 mmol) 을 첨가하였다. 2 일 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물 (3 × 100 mL) 로 세정하고, MgSO₄ 로 건조하고 농축하여 3-에톡시-N-(4-아이오도-페닐)-아크릴아미드 (11.32 g, 56 %) 를 흑색 오일로서 수득하였다. LC-MS m/e 318 (MH⁺).

6-아이오도-1H-퀴놀린-2-온의 제조

황산을 3-에톡시-N-(4-아이오도-페닐)-아크릴아미드 (11.3 g, 36 mmol) 에 교반하며 서서히 첨가하였다. 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 얼음에 서서히 부었다 (~ 300 g). 침전물을 여과로 수합하고, 물로 세정하고 건조하였다. 속성 (flash) 크로마토그래피 (Merck Silica gel 60, 230 - 400 메쉬, 메 틸렌 클로라이드 중 0 % - 15 % 메탄올, 40 분 이내) 로 6-아이오도-1H-퀴놀린-2-온 (7.23 g, 75 %) 를 흑색 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 272 (MH⁺).

2-클로로-6-아이오도-퀴놀린의 제조

옥시염화인 (25 mL) 중 6-아이오도-1H-퀴놀린-2-온 (6.23 g, 23 mmol) 의 혼합물을 2 시간 동안 N₂ 하에 환류시켰다. 냉각 후, 용매를 회전 증발기와 뒤이은 오일 펌프로 제거하였다. 포화 소듐 바이카보네이트 (100 mL) 를 서서히 첨가하였다. 고체를 여과로 수합하고, 포화 소듐 바이카보네이트, 물로 세정하고 건조하여 2-클로로-6-아이오도-퀴놀린 (5.78 g, 87 %) 을 흑색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/e 290 (MH⁺).

6-아이오도-퀴놀린-2-일아민의 제조

암모늄 히드록사이드 (28 %, 20 mL) 중 2-클로로-6-아이오도-퀴놀린 (1 g, 3.46 mmol) 의 현탁액을 압력 튜브 하에서 3 일 동안 140 ℃ 에서 가열하였다. 냉각 후, 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 고체를 여과로 수합하고, 물로 세정하고 건조하여 6-아이오도-퀴놀린-2-일아민 (0.78 g, 84 %) 을 흑색 고체로서 수 득하였다. LC-MS m/e 271 (MH⁺).

2-아미노-퀴놀린-6-카르브알데히드의 제조

압력 튜브에서 건조 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL) 중 6-아이오도-퀴놀린-2-일아민 (200 mg, 0.74 mmol), 트리에틸아민 (0.26 mL, 1.85 mmol), 디페닐프로필포스핀 (dpp, 17 μL, 0.074 mmol) 및 팔라듐(Ⅱ) 아세테이트 (17 mg, 0.074 mmol) 의 혼합물을 10 분 동안 실온에서 75 psi 로 일산화탄소 하에 교반하였다. 트리헥시릴란 (0.53 mL 1.5 mmol) 의 첨가 후, 혼합물을 4 시간 동안 80 ℃ 에서 75 psi 로 일산화탄소 하에 교반하였다. 반응을 25 ℃ 로 냉각시키고나서 메틸렌 클로라이드 (2 × 50 mL) 로 추출하였다. 조합된 유기층을 물 (3 × 50 mL) 로 연속하여 세정하고, 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 속성 크로마토그래피 (Merck Silica gel 60, 70 - 230 메쉬, 에틸 아세테이트) 로 2-아미노-퀴놀린-6-카르브알데히드 (30 mg, 24 %) 를 고체로서 산출하였다.

2-((1R,2S)-2-페닐-시클로프로필아미노)-티아졸-4-온의 제조.

아세토니트릴 (20 mL) 중 (1R,2S)-2-페닐-시클로프로필아민 히드로클로라이드 (0.85 g, 5 mmol) 및 로다닌 (2-티옥소-티아졸린-4-온) (0.68 g, 5 mmol) 의 현탁액에 실온에서 (N,N-디이소프로필에틸아민)(DIEA) (2.61 mL, 15 mmol) 을 첨가하였다. 그 다음, 상기 용액을 0 ℃ 로 냉각하고 염화 제 2 수은 (1.35 g, 5 mmol) 을 10 분의 기간 동안 두 분취로 첨가하였다. 첨가 후, 현탁액을 실온으로 데우게 하고 2 일 동안 교반하였다. 생성된 흑색 고체를 셀라이트의 플러그를 통해 여과하고 에틸 아세테이트 (500 mL) 로 세정하였다. 여액을 진공 하에서 제거하고 미정제 잔류물을 물 (100 mL) 및 에틸 아세테이트 (100 mL) 로 희석하였다. 두 층으로 분리되고, 물 층을 에틸 아세테이트 (2 × 100 mL) 로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 염수 용액 (brine solution) 으로 세정하고 무수 황화 마그네슘으로 건조하였다. 건조제의 여과 및 진공 하에 용매의 제거로 미정제 잔류물을 수득하고 이를 Biotage 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용함으로서 정제하여 0.474 g (42 % 수율) 의 2-((1R,2S)-2-페닐-시클로프로필아미노)-티아졸-4-온을 백색 무정형 고체로서 수득하였다: EI-HRMS m/e C₁₂H₁₂N₂OS (M⁺) 에 대한 계산치 232.0670, 측정치 232.0665.

5-[1-(2-아미노-퀴놀린-6-일)-메트-(Z)-일리덴]-2-((1R,2S)-2-페닐-시클로프로필아미노)-티아졸-4-온의 제조; 트리플루오로-아세트산과의 화합물

톨루엔 (1 mL) 중 2-아미노-퀴놀린-6-카르브알데히드 (30 mg, 0.174 mmol) 및 2-((1R,2S)-2-페닐-시클로프로필아미노)-티아졸-4-온 (26 mg, 0.11 mmol) 의 현탁액에 벤조산 (3 mg, 0.011 mmol) 및 피페리딘 (3 μL, 0.011 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 20 분 동안 마이크로파로 150 ℃ 까지 가열하였다. 실온으로 냉각 후, 고체를 여과로 수합하고, 톨루엔으로 세정하고 건조하였다. 미정제 생성물을 HPLC (Reverse C18, 10 분 동안 물 중 10 % - 90 % 아세토니트릴) 로 정제하여 5-[1-(2-아미노-퀴놀린-6-일)-메트-(Z)-일리덴]-2-((1R,2S)-2-페닐-시클로프로필아미노)-티아졸-4-온; 트리플루오로-아세트산 (36 mg, 84%) 과의 화합물을 황색 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 271 (MH⁺).

실시예 2

5-(2-아미노-4- 에톡시 -퀴놀린-6- 일메틸렌 )-2-[2-(3- 플루오로 - 페닐 )- 에틸아미노 ]-티아졸-4-온:

6-브로모-1H-벤조[d][1,3]옥사진-2,4-디온의 제조

아세토니트릴 (1.3 l) 중 2-아미노-5-브로모-벤조산 (280 g, 1.3 mol) 의 용액을 50 - 55 ℃ 로 데웠다. 디클로로메탄 (720 ml) 중 피리딘 (206 g, 2.61 mol) 및 트리포스겐 (128.8 g, 0.43 mol) 의 용액을 동시에 적가하였다. 첨가의 완료 후, 혼합물을 추가의 2 시간 동안 50 - 55 ℃ 에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 물을 첨가하였다. 침전물을 여과로 수합하고, 연속하여 물 및 냉각된 디클로로메탄으로 세정하고나서, 진공 하에 건조하여 목적 생성물 6-브로모-1H-벤조[d][1,3]옥사진-2,4-디온 (304 g, 98 %) 을 산출하였다. 상기 물질을 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.

2-아미노-6-브로모-퀴놀린-4-올의 제조

(N,N-디메틸포름아미드) (DMF) (400 ml) 중 6-브로모-1H-벤조[d][1,3]옥사진-2,4-디온 (90 g, 0.373 mol) 의 용액을 50 - 60 ℃ 에서 DMF (150 ml) 중 말로니트릴 (37 g, 0.41 mol) 및 트리에틸아민 (41.4 g, 0.41 mol) 의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 50 - 60 ℃ 로 유지하였다. 얼음으로 역급냉된 0.2 N HCl (400 ml) 은 침전물을 생성하였다. 상기 물질을 여과로 분리하고 진공 건조하였다. 그 다음 8 N KOH (2 l) 에 용해하고, 용액을 40 시간 동안 환류하였다. 실온으로 냉각 후, 혼합물을 HCl 로 중화하고, 생성된 침전물을 여과하고 공기 건조하여 2-아미노-6-브로모-퀴놀린-4-올 (95 g, 97 %) 을 담황색 고체로서 산출하였다. 상기 물질을 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.

N-(6-브로모-4-히드록시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드의 제조

빙초산 (300 ml) 중 2-아미노-6-브로모-퀴놀린-4-올 (29.4 g, 0.12 mol), 무 수초산 (36.7 g, 0.36 mol) 및 황산 (20 ml) 의 혼합물을 30 분 동안 환류하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고나서, 물에 부었다. 침전물을 여과로 분리하고 건조하여 N-(6-브로모-4-히드록시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (32 g, 93 %) 를 갈색 고체로서 산출하였다. 상기 물질을 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.

N-(6-브로모-4-에톡시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드의 제조

아세토니트릴 (250 ml) 중 N-(6-브로모-4-히드록시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (32 g, 0.114 mol), 에틸 아이오다이드 (26.77 g, 0.171 mol) 및 탄산 칼륨 (130 g, 0.912 mol) 의 혼합물을 2 시간 동안 환류하였다. 용매를 증발시키고 잔류물을 물로 저작하였다 (triturate). 침전물을 여과로 수합하고 건조하여 N-(6-브로모-4-에톡시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (28 g, 80 %) 를 담황색 고체로서 산출하였다. 상기 물질을 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.

N-(4-에톡시-6-포르밀-퀴놀린-2-일)-아세트아미드의 제조

아세토니트릴 (30 ml) 중 테트라키스(트리페닐프로스핀)팔라듐 (Pd(PPh₃)₄) 및 포름산 나트륨 (5 g, 48 mmol) 을 질소로 세정하였다. DMSO (30 ml) 중 N-(6-브로모-4-에톡시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (2.5 g, 8.12 mmol) 의 용액을 고무마개 (rubber septum) 를 통해 첨가하였다. 용기를 일산화탄소의 대기 (50 psi) 하에 두고, 밀봉하고 30 분 동안 120 ℃ 로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 아세트니트릴을 감압 하에 증발시켰다. 물을 첨가하고 생성된 침전물을 여과로 수합하고 건조하여 목적 알데히드 N-(4-에톡시-6-포르밀-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (0.8 g, 40 %) 를 담황색 고체로서 산출하였다.

5-(2-아미노-4-에톡시-퀴놀린-6-일메틸렌)-2-[2-(3-플루오로-페닐)-에틸아미노]-티아졸-4-온의 제조

아세트산 중 (1.5 ml) N-(4-에톡시-6-포르밀-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (실시예 2e, 50 mg, 0.19 mmol) 의 용액을 60 분 동안 180 ℃ 에서 마이크로파 생성기에서 2[2-(3-플루오로-페닐)-에틸아미노]-티아졸-4-온 (69 mg, 0.29 mmol) 및 아세트산 나트륨 (63 mg, 0.77 mmol) 로 처리하였다. 물 (0.5 ml) 을 첨가하고 반응 혼합물을 15 분 동안 140 ℃ 에서 마이크로파 처리하였다. 혼합물을 1 N NaOH 로 급냉하였다. 침전물을 흡입 여과로 수합하고, 연속하여 물, 에테르 및 디클로로메탄으로 세정하였다. 그 다음 미정제 침전물을 DMF 에 용해하고 농축하여 건조하였다. 상기 물질을 뜨거운 디옥산으로 저작하고 여과하였다. 모 액체를 감압 하에 농축하여 생성물 5-(2-아미노-4-에톡시-퀴놀린-6-일메틸렌)-2-[2-(3-플루오로-페닐)-에틸아미노]-티아졸-4-온 (23 mg, 28 %) 을 분말로서 산출하였다. LC-MS m/e 437 (MH⁺)

실시예 3

2-아미노-5-(2-아미노-4- 에톡시 -퀴놀린-6- 일메틸렌 )-티아졸-4-온:

아세트산 (1.5 ml) 중 N-(4-에톡시-6-포르밀-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (실 시예 2e, 50 mg, 0.19 mmol) 의 용액을 45 분 동안 180 ℃ 에서 마이크로파 생성기에서 유사티오히단토인 (pseudothiohydantoin) (34 mg, 0.29 mmol) 및 아세트산 나트륨 (63 mg, 0.77 mmol) 으로 처리하였다. 혼합물을 1 N NaOH 및 디클로로메탄 간에 분할하였다. 목적 생성물을 함유한, 물 층을 농축하여 건조하고 미정제 잔류물을 RP HPLC 로 정제하여 생성물을 TFA 염 (5 mg, 8 %) 으로서 산출하였다. LC-MS m/e 315 (MH⁺)

실시예 4

N-(4- 에톡시 -6-{4-옥소-2-[( 테트라히드로 -피란-4- 일메틸 -아미노)-4H-티아졸-5-일 리덴메 틸]-퀴놀린-2-일})- 아세트아미드 :

c-(테트라히드로-피란-4-일)-메틸암모늄 아세테이트의 제조

DME (125 ml) 중 테트라히드로-4H-피란-4-온 (7.5 g, 75 mmol) 및 토실메틸이소시아나이드 (16.05 g, 82.4 mmol) 의 냉각 (빙수조) 용액을 t-부틸 알코올 (250 ml) 중 칼륨 t-부톡사이드 (16.8 g, 150 mmol) 의 현탁액으로 처리하였다. 반응 혼합물을 3^1/2 시간 동안 실온에서 교반하고나서, 에테르 (250 ml) 로 희석하였다. 혼합물을 물 및 염수로 연속하여 세정하고나서, 황산 나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 미정제 생성물을 고진공 하에 분자 증류 (short path distillation) 에 의해 정제하여 니트릴 (2.98 g) 을 무색 오일로서 수득하였다. 상기 물질을 1 M 보란/테트라히드로퓨란 (THF) (134 ml, 134 mmol) 에 용해하고, 밤새 실온에서 교반하였다. 과량의 보란을 메탄올 (실온, 1 시간) 을 첨가하여 급냉시키고, 혼합물을 농축하여 건조하였다. 잔류물을 4 N HCl/디옥산에 용해하고, 1 시간 동안 실온에서 교반하고나서 감압 하에 농축시켰다. 고체 잔류물을 에테르로 저작하고 흡입 여과로 수합하였다. THF (30 ml) 중 상기 물질 (1.81 g, 11.9 mmol) 의 현탁액을 1/2 시간 동안 실온에서 1 N NaOH (11.9 ml, 11.9 mmol) 로 처리하였다. THF 를 증류로 제거하고 수용액을 NaCl 로 포화시키고나서 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 황산 나트륨 상에서 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 아세트산 (0.68 ml, 11.9 mmol) 으로 처리하여 진공 오븐 내에서 건조한 후, c-(테트라히드로-피란-4-일)-메틸암모늄 아세테이트 (1.71 g) 를 제공하였다.

N-[4-에톡시-6-({4-옥소-2-[(테트라히드로-피란-4-일)메틸-아미노]-4H-티아졸-5-일리덴}메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드의 제조

아세토니트릴 (2 ml) 중 N-[4-에톡시-6-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드 (실시예 6a, 50 mg, 0.12 mmol) 의 현탁액을 45 분 동안 실온에서 디이소프로필에틸 아민 (0.20 ml, 1.2 mmol) 및 메틸 아이오다이드 (0.15 ml, 2.3 mmol) 와 반응시켰다. 혼합물을 농축하여 건조하고 잔류물을 아세토니트릴 (2 ml) 에서 현탁화하였다. 디이소프로필에틸 아민 (0.20 ml, 1.2 mmol) 및 c-(테트라히드로-피란-4-일)-메틸암모늄 아세테이트 (100 mg, 0.58 mmol) 를 실온에서 연속하여 첨가하고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 침전물을 흡입 여과로 수합하고, SiO₂ 상에 흡수하고 0 - 10 % 메탄올/에틸 아세테이트 구배로 실리카겔 컬럼 상에 정제하여 생성물 (29 mg, 56 %) 을 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 455 (MH⁺).

실시예 5

N-[6-(2- 시클로프로필아미노 -4-옥소-4H-티아졸-5- 일리덴메틸 )-4- 에톡시 -퀴놀린-2-일]- 아세트아미드:

2-시클로프로필아미노-티아졸-4-온의 제조

에탄올 (100 ml) 중 에틸 클로로아세테이트 (20 g, 0.16 mol) 및 칼륨 티오시아네이트 (12.7 g, 0.13 mol) 의 용액을 3 시간 동안 환류하였다. 용액을 여과하고 감압 하에 농축하여 18.7 g 의 티오시아나토-아세트산 에틸 에스테르 (97 %) 를 산출하였다. 시클로프로필암모늄 아세테이트 (0.50 g, 4.27 mmol) 및 티오시아나토-아세트산 에틸 에스테르 (0.62 g, 4.27 mmol) 의 혼합물을 3 시간 동안 90 ℃ 로 가열하고, 밤새 실온에서 방치하였다. 반응 혼합물을 6 N HCl 및 디클로로메탄 간에 분할하였다. 층을 분리하였다. 물 층을 6 N 암모늄 히드록사이드의 첨가로 염기로 만들고나서, 농축하여 건조하였다. 미정제물을 디클로로메탄으로 저작하고 용액을 여과로 고체로부터 분리하였다. 상기 용액을 황산 나트륨 상에서 건조하고 농축하여 건조하였다. 미정제물을 100 % 에틸 아세테이트로 실리카겔 컬럼 상에 정제하여 2-시클로프로필아미노-티아졸-4-온 (244 mg, 37 %) 을 산출하였다.

N-[6-(2-시클로프로필아미노-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴메틸)-4-에톡시-퀴놀린-2-일]-아세트아미드의 제조

아세트산 (2 ml) 중 N-(4-에톡시-6-포르밀-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (100 mg, 0.39 mmol) 의 용액을 90 분 동안 180 ℃ 에서 마이크로파 생성기에서 2-시클로프로필아미노-티아졸-4-온 (61 mg, 0.39 mmol) 및 아세트산 나트륨 (127 mg, 1.55 mmol) 으로 처리하였다. 침전물을 흡입 여과로 수합하고 물 및 에테르로 연속하여 세정하여 진공 오븐 내에서 건조한 후, 생성물 N-[6-(2-시클로프로필아미노-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴메틸)-4-에톡시-퀴놀린-2-일]-아세트아미드 (32 mg, 21 %) 를 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 397 (MH⁺).

실시예 6

N-(4- 에톡시 -6-{4-옥소-2[2-( 테트라히드로 -피란-4-일)- 에틸아미노 ]-4H-티아졸-5- 일리덴메틸 }-퀴놀린-2-일)- 아세트아미드:

N-[4-에톡시-6-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드의 제조

아세트산 (6 ml) 중 N-(4-에톡시-6-포르밀-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (400 mg, 1.55 mmol) 의 용액을 25 분 동안 160 ℃ 에서 마이크로파 생성기에서 로다닌 (320 mg, 0.29 mmol) 및 아세트산 나트륨 (530 mg, 6.5 mmol) 으로 처리하였다. 침전물을 흡입 여과로 수합하고, 아세트산, 물 및 에테르로 세정하고나서, 진공 오븐 내에서 건조하여 중간체 N-[4-에톡시-6-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드 (396 mg, 68 %) 를 갈색 고체로서 산출하였다.

N-(4-에톡시-6-{4-옥소-2[2-(테트라히드로-피란-4-일)-에틸아미노]-4H-티아졸-5-일리덴메틸}-퀴놀린-2-일)-아세트아미드의 제조

아세토니트릴 (1.5 ml) 중 N-[4-에톡시-6-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드 (실시예 6a, 50 mg, 0.11 mmol) 의 현탁액을 30 분 동안 실온에서 디이소프로필에틸 아민 (0.200 ml, 1.15 mmol) 및 메틸 아이오다이드 (0.15 ml, 2.3 mmol) 와 반응시켰다. 혼합물을 농축하여 건조하고 잔류물을 아세토니트릴 (1.5 ml) 에서 현탁화하였다. 디이소프로필에틸 아민 (0.20 ml, 1.15 mmol) 및 4-(2-아미노에틸)테트라히드로피란 (0.075 ml, 0.58 mmol) 을 실온에서 연속하여 첨가하고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 침전물을 흡입 여과로 수합하고, 아세토니트릴로 세정하였다. 그 다음 SiO₂ 상에 흡수하고 0 - 10 % 메탄올/에틸 아세테이트 구배로 실리카겔 컬럼 상에 정제하여 생성물 N-(4-에톡시-6-{4-옥소-2[2-(테트라히드로-피란-4-일)-에틸아미노]-4H-티아졸-5-일리덴메틸}-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (22 mg, 50 %) 을 담황색 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 469 (MH⁺).

실시예 7

N-(6-{2-아미노-4-옥소-4H-티아졸-5- 일리덴메틸 }-4- 에톡시 -퀴놀린-2-일)-아세트아미드:

아세토니트릴 (3 ml) 중 N-[4-에톡시-6-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드 (실시예 6a, 80 mg, 0.21 mmol) 의 현탁액을 30 분 동안 실온에서 디이소프로필에틸 아민 (0.40 ml, 2.2 mmol) 및 메틸 아이오다이드 (0.30 ml, 4.6 mmol) 와 반응시켰다. 혼합물을 농축하여 건조하고 잔류물을 DMF (0.5 ml) 에서 현탁화하였다. 메탄올 (7 N, 5 ml, 35 mmol) 중 암모니아의 용액을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 24 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축하여 건조하고 고체를 물로 저작하였다. 침전물을 흡입 여과로 수합하고, 연속하여 물 및 에테르로 세정하고나서, 공기를 건조하여 생성물을 (50 mg, 63 %) 을 연갈색 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 357 (MH⁺).

실시예 8

N-[6-(2- 시클로프로필메틸아미노 -4-옥소-4H-티아졸-5- 일리덴메틸 )-4- 에톡시 -퀴놀린-2-일]- 아세트아미드 :

2-시클로프로필메틸아미노-티아졸-4-온의 제조

시클로프로필메틸암모늄 아세테이트 (0.45 g, 3.44 mmol) 및 티오시아나토-아세트산 에틸 에스테르 (0.5 g, 3.44 mmol) 의 혼합물을 2 시간 동안 90 ℃ 에서 가열하였다. 반응 혼합물을 6 N HCl 및 디클로로메탄 간에 분할하였다. 층을 분리하였다. 물 층을 6 N 암모늄 히드록사이드의 첨가로 염기로 만들고나서, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 황산 나트륨 상에서 건조하고 감압 하에 농축하였다. 물 층을 또한 농축하여 건조하고 잔류물을 DMF 로 저작하였다. DMF 용액을 여과하고 농축하여 건조하였다. 잔류물을 조합하고 100 % 에틸 아세테이트로 실리카겔 컬럼 상에 정제하여 2-시클로프로필메틸아미노-티아졸-4-온 (275 mg, 47%) 을 산출하였다.

N-{6-[(2-시클로프로필메틸아미노-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴)메틸]-4-에톡시-퀴놀린-2-일}-아세트아미드의 제조

아세트산 (2 ml) 중 N-(4-에톡시-6-포르밀-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (100 mg, 0.39 mmol) 의 용액을 2 시간 동안 180 ℃ 에서 마이크로파 생성기에서 2-시클로프로필메틸아미노-티아졸-4-온 (66 mg, 0.39 mmol) 및 아세트산 나트륨 (127 mg, 1.55 mmol) 으로 처리하였다. 반응 혼합물을 1 N NaOH 및 에틸 아세테이트/디클로로메탄 (1:1) 간에 분할하였다. 유기층을 황산 나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 농축하여 건조하였다. 미정제물을 0 - 7 % 메탄올/에틸 아세테이트 구배로 실리카겔 컬럼 상에 정제하여 생성물 N-[6-(2-시클로프로필메틸아미노-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴메틸)-4-에톡시-퀴놀린-2-일]-아세트아미드 (10 mg, 7 %) 을 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 411 (MH⁺).

실시예 9

N-(6-{2-[([1,4] 디옥신 -2- 일메틸 )-아미노]-4-옥소-4H-티아졸-5- 일리덴메틸 }-4- 에톡시 -퀴놀린-2-일)- 아세트아미드

아세토니트릴 (1.5 ml) 중 N-[4-에톡시-6-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드 (실시예 6a, 50 mg, 0.12 mmol) 의 현탁액을 30 분 동안 실온에서 디이소프로필에틸 아민 (0.20 ml, 1.2 mmol) 및 메틸 아이오다이드 (0.15 ml, 2.3 mmol) 와 반응시켰다. 혼합물을 농축하여 건조하고 잔류물을 아세토니트릴 (1.5 ml) 에서 현탁화하였다. 디이소프로필에틸 아민 (0.20 ml, 1.2 mmol) 및 c-[1,4]디옥신-2-일-메틸 아민 (68 mg, 0.58 mmol) 을 연속하여 실온에서 첨가하고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 침전물을 흡입 여과로 수합하고, SiO₂ 상에 흡수하고 100 % 에틸 아세테이트로 실리카겔 컬럼 상에 정제하여 생성물 N-(6-{2-[([1,4]디옥신-2-일메틸)-아미노]-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴메틸}-4-에톡시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드 (34 mg, 63 %) 를 고체로서 산출하였다. LC-MS m/e 457 (MH⁺).

실시예 10

약리학적 분석

다수의 약리학적 분석에 의해 본 발명의 화합물의 약리학적 특성을 확인할 수 있었다. 이하의 예시된 약리학적 분석은 본 발명에 따른 화합물 및 그의 염을 이용하여 수행하였다. 본 발명의 화합물은 CDK1/시클린 B 활성을 5.0 μM 미만의 Ki 값으로 나타냈다. 이는 모든 상기 화합물이 CDK1/시클린 B 를 저해하는 데 활성이 있었음을 입증한다.

CDK1 활성의 저해를 결정하기 위해, FlashPlate^TM (NEN^TM-Life Science Products) 분석 또는 HTRF 분석을 수행하였다. 재조합 인간 CDK1/시클린 B 복합체를 이용하여, 상기 두 유형의 키나아제 분석을 수행하였다. 바큘로바이러스 벡터 내의 GST-시클린B (GST-cycB) 및 CDK1 cDNA 클론은 Baylor College of Medicine, Houston, TX 의 Dr. W. Harper 에 의해 제공되었다. High Five^TM 곤충 세포에서 단백질을 공동-발현 (co-express) 시키고, 앞서 기술한 바와 같이 글루타티온 Sepharose 수지 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 상에 상기 복합체를 정제하였다 (Harper, J. W. 등, Cell 1993, 75, 805 - 816). 6x-Histidine 표적화된 절단된 형태의 망막아세포종 (Rb) 단백질 (아미노산 386-928) 을 CDK1/시클린 B 분석용 기질로서 이용하였다 (발현 플라스미드는 Department of Molecular Virology, Roche Research Centre, Welwyn Garden City, United Kingdom 의 Dr. Veronica Sullivan 에 의해 제공되었음). Rb 단백질은 CDK1 에 의한 인산화를 위한 천연 기질이다 (문헌 [Herwig and Strauss Eur. J. Biochem. Vol. 246 (1997) pp. 581-601] 및 본원에 인용된 참조문헌 참고). 62Kd 단백질의 발현은 M15 E. coli 균주에서 IPTG 유도성 촉진제에 의해 제어되었다. 세포를 초음파 처리에 의해 용 해시키고, pH 8.0 에서, 1 mM 이미다졸로 예비처리된 Ni-킬레이트화 한천 컬럼에 용해물을 결합시켜 정제를 수행하였다. 이후, 수지를 점진적으로 감소되는 pH 완충제로 pH 6.0 까지 수회 세정하고, 500 mM 이미다졸로 용출하였다. 용출된 단백질은 20 mM HEPES pH 7.5, 30 % 글리세롤, 200 mM NaCl, 및 1 mM DTT 에 대해 투석되었다. 정제된 Rb 융합 단백질 스톡을 단백질 농도에 대해 정량하고, 나누고, -70 ℃ 에서 보관하였다.

FlashPlate 키나아제 분석을 위해, 96-웰 FlashPlates 를 10 μg/ml 의 Rb 단백질로, 웰 당 100 μl 를 이용하여 코팅하였다. 플레이트를 진탕기 상에서 3 시간 동안 실온에서 또는 밤새 4 ℃ 에서 항온배양하였다. 비특이적 인산화의 제어를 위해, 한줄의 웰을 100 μl/웰 코팅 완충액 (20 mM HEPES, 0.2 M NaCl) 으로 코팅하였다. 그 다음 플레이트를 세정 완충액 (포스페이트-완충 식염수 중 0.01 % Tween 20) 으로 2 회 세정하였다. 시험될 화합물 ("시험 화합물") 을 웰에 5x 최종 농도로 첨가하였다. 40 μl 반응 혼합물 (25 mM HEPES, 20 mM MgCl₂, 0.002% Tween 20, 2 mM DTT, 1 μM ATP, 4 nM 33P-ATP), 및 상기 백그라운드의 10 배 이상의 카운트 (count) 를 제공하기에 충분한 양의 효소를 즉시 첨가하여 반응을 개시하였다. 플레이트를 30 분 동안 진탕기 상에서 실온에서 항온배양하였다. 플레이트를 세정 완충액으로 4 회 세정하고, 밀봉하고, TopCount 신틸레이션 (scintillation) 카운터 (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) 로 카운트하였다. 하기 식에 따라 CDK 활성 저해의 측정치인, Rb 인산화의 저해 % 를 측정하였다:

(식 중 "시험 화합물" 은 시험 복제의 분 당 평균 카운트를 지칭하며, "비특이적" 은 CDK1/시클린B 등을 첨가하지 않았을 때의 분 당 평균 카운트를 지칭하며, "총" 은 화합물을 첨가하지 않았을 때의 분 당 평균 카운트를 지칭함). IC₅₀ 값은 기재된 시험 조건 하에서 방사성표지의 단백질-키나아제 유도 혼입을 50% 감소시키는 시험 화합물의 농도이다. 저해 상수 Ki 의 값은 하기 식으로 계산된다: Ki = IC₅₀/(1 + [S]/Km) (식 중 [S] 는 ATP 농도이고, Km 은 미카엘리스 상수임).

96-웰 폴리프로필렌 플레이트 (BD Biosciences, Bedford, MA) 에서 Homogeneous Time Resolved Fluorescence (HTRF) 키나아제 분석을 수행하였다. 먼저, 시험 화합물을 DMSO 에 용해시킨 다음, DMSO 농도가 15% 인 키나아제 분석 완충제 1 (25 mM HEPES, pH 7.0, 8 mM MgCl₂, 1.5 mM DTT, 및 162 μM ATP) 에 희석하였다. CDK1/시클린 B 효소를 키나아제 분석 완충제 2 (25 mM HEPES, pH 7.0, 8 mM MgCl₂, 0.003 % Tween 20, 0.045 % BSA, 1.5 mM DTT, 및 0.388 μM Rb 단백질) 에 희석하였다. 키나아제 반응을 개시하기 위해, 화합물 용액 20 μL 를 각각, 0.1 μg/mL 및 0.113 μM 에서의 CDK1/시클린 B 및 Rb 의 최종 농도를 갖는 CDK1/시클린 B 용액 40 μL 과 분석 플레이트에서 혼합하고, 30 분 동안 37 ℃ 에서 항 온배양하였다. 항-포스포-Rb (Ser 780) 항체 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 15 μL 를 항체의 1:7692 희석액과 함께 첨가하였다. 항온배양을 25 분 동안 37 ℃ 에서 지속하고 그 후, LANCE Eu-W1024 라벨의 항-래빗 IgG (1 nM, PerkinElmer, Wellesley, MA) 및 SureLight-Allophucocyanin 에 컨쥬게이션된 항-His 항체 (20 nM, PerkinElmer, Wellesley, MA) 를 웰에 첨가하였다. 항온배양을 추가로 40 분 동안 37 ℃ 에서 지속하였다. 항온 배양의 완료 시, 반응 혼합물 35 μL 를 미사용 384-웰 흑색 폴리스티렌 플레이트 (Corning Incorporated, Corning, NY) 로 옮기고 340 nm 의 여기 (excitation) 파장 및 665/615 nm 의 방출 파장에서 형광 플레이트 판독기로 판독하였다.

본 발명의 주제인 화합물에 적용되는, CDK1/시클린 B 활성을 나타내는 Ki 값은 약 0.001 μM 내지 약 5.000 μM 의 범위이다. 일부 실시예에 대한 특정 데이터는 하기와 같다:

실시예	Ki (μM)
1	0.023
3	0.030
5	0.085
7	0.097
9	3.241

Claims

하기 화학식 Ⅰ 의 화합물:

[식 중

R₁ 은 수소 또는 R₂-(X)_n- 이고;

X 는 C_1-6알킬렌, 히드록시-C_1-6알킬렌, 시클로-C_3-6알킬렌, 아릴 C_1-6알킬렌, 카르복시-C_1-6알킬렌, 아미도 C_1-6알킬렌, 모노- 또는 디- 할로-C_1-6알킬렌, 아미노-C_1-6알킬렌, 모노- 또는 디- C_1-6알킬 아미노-C_1-6알킬렌 또는 이미도-C_1-6알킬렌이고;

R₂ 는
이고:

(식 중
는 페닐 또는 나프틸 고리; 탄소 원자 3 내지 6 개를 함유하는 시클로알킬; 탄소 원자 3 내지 5 개 및 산소 원자 1 내지 2 개를 함유하는 4 내지 6 원 헤테로시클로알킬 고리; 또는 산소 원자 1 내지 2 개를 함유하는 5 또는 6 원 헤테로방향족 고리이고;

R₅, R₆ 및 R₇ 은 히드록시, C_1-6알킬-술폰, 히드록시-C_1-6알킬, 수소, C_1-6알킬, 할로겐, 퍼플루오로-C_1-6알킬, C_1-6알콕시, 아미노, 모노- 또는 디- C_1-6알킬 아미노로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택됨);

R₄ 는 수소 또는 -(O)_k(CH₂CH₂O)_y-R₁₀이고;

R₁₉ 는 수소이고;

R₂₀ 은 수소, C_1-6알킬 또는
이고;

R₁₀ 및 R₁₁ 은 C_1-6알킬이고;

n 및 k 는 0 내지 1 의 정수이고;

y 는 0 내지 3 의 정수임];

또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 Ⅰ-A 인 화합물:

[식 중 R₁' 은 수소이고;

R₄, R₁₉ 및 R₂₀ 은 제 1 항에서 정의된 바와 같음];

또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 화합물.
제 2 항에 있어서, R₁' 은 수소이고; R₄ 는 -(O)_k(CH₂CH₂O)_y-R₁₀ 이고; R₁₀, k 및 y 는 제 1 항에서 정의된 바와 같은 화합물.
제 3 항에 있어서, 상기 화합물은

N-(6-{2-아미노-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴메틸}-4-에톡시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드; 및

2-아미노-5-(2-아미노-4-에톡시-퀴놀린-6-일메틸렌)-티아졸-4-온인 화합물.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 Ⅰ-B 인 화합물:

[식 중

R₁" 은 R₂'-(X')_n- 이고;

n, R₄, R₁₉ 및 R₂₀ 은 제 1 항에서 정의된 바와 같고;

X' 은 C_1-6알킬렌, 히드록시-C_1-6알킬렌, 시클로-C_3-6알킬렌, 모노- 또는 디- 할로 C_1-6알킬렌이고;

R₂' 은

이고:

(식 중
는 페닐 또는 나프틸 고리; 탄소 원자 3 내지 6 개를 함유하는 시클로알킬 고리; 탄소 원자 3 내지 5 개 및 산소 원자 1 내지 2 개를 함유하는 4 내지 6 원 헤테로시클로알킬 고리; 산소 원자 1 내지 2 개를 함유하는 5 또는 6 원 헤테로방향족 고리이고;

R₅' 및 R₆' 은 히드록시, C_1-6알킬-술폰, 히드록시-C_1-6알킬, 수소, C_1-6알킬, 할로겐, 퍼플루오로-C_1-6알킬, C_1-6알콕시, 아미노, 및 모노- 또는 디- C_1-6알킬 아미노로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택됨)];

또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 화합물.
제 5 항에 있어서, X' 은 C_1-6알킬렌이고; R₂' 은 할로겐으로 선택적으로 치환된 페닐이고; R₄ 는 -O-CH₂-CH₃ 이고; n 은 1 인 화합물.
제 6 항에 있어서, 상기 화합물은 5-(2-아미노-4-에톡시-퀴놀린-6-일메틸렌)-2-[2-(3-플루오로-페닐)-에틸아미노]-티아졸-4-온인 화합물.
제 5 항에 있어서, X' 는 C_1-6알킬렌이고; R₂' 은 탄소 원자 3 내지 5 개 및 산소 원자 1 내지 2 개를 함유하는 헤테로고리형 고리이고; R₄ 는 -O-CH₂-CH₃ 이고; n 은 1 인 화합물.
제 8 항에 있어서, 상기 화합물은

N-(4-에톡시-6-{4-옥소-2[2-(테트라히드로-피란-4-일)-에틸아미노]-4H-티아졸-5-일리덴메틸}-퀴놀린-2-일)-아세트아미드;

N-[4-에톡시-6-({4-옥소-2-[(테트라히드로-피란-4-일)메틸-아미노]-4H-티아졸-5-일리덴}메틸)-퀴놀린-2-일]-아세트아미드; 및

N-(6-{2-[([1,4]디옥신-2-일메틸)-아미노]-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴메틸}-4-에톡시-퀴놀린-2-일)-아세트아미드인 화합물.
제 5 항에 있어서, X' 는 C_1-6알킬렌이고; R₂' 는 시클로프로필 (시클로프로필이 페닐로 치환 또는 비치환됨) 이고; R₄ 는 수소 또는 -O-CH₂-CH₃ 이고; n 은 0 또는 1 인 화합물.
제 10 항에 있어서 상기 화합물은

N-{6-[(2-시클로프로필메틸아미노-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴)메틸]-4-에톡시-퀴놀린-2-일}-아세트아미드;

N-[6-(2-시클로프로필아미노-4-옥소-4H-티아졸-5-일리덴메틸)-4-에톡시-퀴놀린-2-일]-아세트아미드; 및

5-[1-(2-아미노-퀴놀린-6-일)-메트-(Z)-일리덴]-2-((1R,2S)-2-페닐-시클로프로필아미노)-티아졸-4-온인 화합물.
하기를 포함하는, 제 1 항에 따른 화학식 Ⅰ 의 화합물의 제조방법.

a) 하기 화학식 Ⅱ 의 화합물:

,

을 하기 화학식 Ⅲ 의 화합물의 존재 하에 노베나겔 (Knoevenegel) 반응을 통해 반응시켜:

하기 화학식 Ⅳ 의 화합물을 수득하고:

,

b) 상기 화학식 Ⅳ 의 화합물의 티오기를 메틸화제의 존재 하에 추가로 반응시켜 하기 화학식 Ⅴ 의 화합물을 수득하고:

,

c) 상기 화학식 Ⅴ 의 화합물의 메틸티오기를 하기 화학식 Ⅵ 의 아민과 추가로 반응시켜 화학식 Ⅰ 의 화합물을 수득하고:

,

d) 상기 화학식 Ⅰ 의 화합물을 반응 혼합물로부터 분리하고, 원한다면 약학적으로 허용가능한 염으로 변화시킴 (여기서 R₁, R₄, R₁₉ 및 R₂₀ 은 제 1 항에서 주어진 의미를 가짐).
제 12 항에 있어서, 항목 b) 의 메틸화제는 아이오도메탄인 방법.
암의 치료를 위한 제 1 항에 따른 화학식 Ⅰ 의 화합물.
약학적으로 허용가능한 보조제와 함께 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화학식 Ⅰ 의 화합물을 포함하는 암의 치료를 위한 약학 조성물.
제 15 항에 있어서, 고형 종양의 치료를 위한 약학 조성물.
CDK1의 저해에 의한, 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 화학식 Ⅰ 의 화합물.
제 12 항에 따른 방법으로 제조된, 제 1 항에 따른 화학식 Ⅰ 의 화합물.
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