KR100882751B1 - 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통하여 선별한 키토산에 특이적으로 부착하는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 올리고 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 키토산에 특이적으로 부착하는 펩타이드는 생체적합성 키토산을 선택적으로 분리하거나 또는 키토산과 생체분자간의 연결물질(linker)로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드{Oligopeptide which binds specifically to chitosan}

도 1은 키토산에 특이적으로 부착하는 본 발명의 서열번호 1로 기재되는 올리고 펩타이드의 서열을 분석한 그래프이고,

도 2는 키토산에 특이적으로 부착하는 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 올리고 펩타이드의 서열을 분석한 그래프이다.

본 발명은 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통하여 선별한 키토산에 특이적으로 부착하는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 올리고 펩타이드에 관한 것이다.

인간을 비롯한 모든 다세포 생물은 다양한 기능과 형태를 지닌 조직 세포들 의 집합체라고 할 수 있다. 이러한 조직 세포들은 수많은 진화 과정을 거쳐 그들만의 고유한 기능이 원활히 발휘되는 독특한 형상의 신체 조직으로 발전하였다. 따라서, 이들은 매우 복잡한 구조 및 기능을 가지게 되어 외부의 자극이나 질병 등에 의한 손상으로부터 매우 취약한 문제점을 안고 있다.

인체는 질병이나 외상에 의한 손상을 면역반응에 의하여 정상상태로 복구하려 하며, 이는 신체의 기본 단위인 손상된 조직 세포를 정상 세포로 대체하려는 현상으로 볼 수 있다. 우리가 흔히 받는 약물이나 물리 치료법은 이러한 신체의 자동 복구 현상을 도와 주는 역할을 하는 것이며, 신체의 손상이 지나쳐 스스로 복구되지 못할 경우 외과 수술을 통해 손상된 조직을 제거하여 남아 있는 정상 조직에 더 이상의 손상이 발생하지 않도록 하기도 한다. 이러한 고전적인 외과 치료의 개념은 현대에 들어 손상 부위를 정상적인 조직이나 장기로 대체하거나 재생되도록 하는 시도가 이루어지면서 적극적으로 변모하고 있다. 이에 따라 의료공학기술이 급속히 발전하게 되었다. 그러나 또한 현대 기술 사회의 발전은 그 구성원인 인간에게 각종 사고와 질병을 동반하게 하였으며, 이의 치료에는 막대한 경비가 소요되고 발병의 빈도가 매우 높아 근래에 들어서는 사회전반적으로 심각한 문제로 대두되고 있다. 일례로 보건의료기술의 선진국인 미국에서는 매년 10만명 이상의 환자들이 간, 췌장, 피부, 뼈, 심장혈관의 질환과 손상으로 인하여 장기이식에 의한 치료를 필요로 하나 그 중 약 2만명 정도에 대해서만 장기 기증이 이루어지고 있으며, 대기자 조건을 갖춘 약 3만 6천명 중에서 최근 5년간 대기중에 사망한 환자의 수가 만여명에 이른다. 또한, 치료비, 간호비와 생활보조비 및 생산성에 대한 손실이 매년 4천억불에 달하는 것으로 집계되고 있다. 우리나라의 경우에도 매년 만여회의 장기이식수술이 이루어지고 있으나, 장기의 절대 부족 현상은 다른 나라와 다를 바 없이 심각한 공급 부족에 직면하고 있다.

이렇듯 손상된 신체의 일부를 대체할 기증 장기의 수요는 날로 증가하고 있으나, 개선의 여지가 없는 장기의 부족은 여전하여 장기의 암거래 등과 같은 사회적 문제를 야기하고 있다. 따라서, 인체를 이루는 체세포를 인공적으로 조작하거나 크게는 장기까지 인공적으로 처리하여 생명 기능을 가진 인공 조직을 개발할 필요가 대두되었다. 조직이나 장기의 이식은 자가 조직 이식(autograft) 외에 면역억제제의 발달 덕에 동종 이식(allograft)이 사용되고 있지만 제한 이식용 장기의 공급과 이식 후 면역반응에 의한 후유증을 완전히 방지하는 것은 요원한 것이 현실이다. 또한 이식용 장기로부터 후천성 면역결핍증(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)이나 감염 등과 같은 치명적인 질환의 감염 가능성도 간과할 수 없다. 그밖에 유전공학적으로 개량된 돼지 및 원숭이 등의 동물로부터 심장, 간, 폐, 신장 등의 장기를 얻는 방안이나 최근 급속히 발달하고 있는 체세포 복제와 간세포(幹細胞 ; stem cell) 배양 기술을 이용하여 환자의 손상된 신체 조직 세포를 체외에서 재생하는 방향이 모색되고 있으나 윤리적인 문제와 면역체계와의 적합성, 간세포로부터 유래한 조직 세포의 장기 형성 등의 문제가 과제로 남아 있다.

인공 조직의 세포외기질로 사용되는 생체재료는 크게 천연고분자와 합성 고분자 두 가지로 나누어진다. 천연고분자로는 콜라젠(collagen), 섬유결합소(fibronectin), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginic acid), 하이알우론산(hyaluronic acid) 등이 널리 이용되고 있으며, 합성 고분자로는 폴리-젓산(poly lactic acid), PGA(poly glycolic acid), PLGA와 그 유사 공중합체들과 폴리-카프로락톤(poly ε-caprolactone), 폴리-안하이드라이드(polyanhydrides) 및 폴리-오르토에스테르(polyorthoester) 등이 있다.

이러한 고분자 중 조직 공학 분야에서 널리 응용되는 생분해성 고분자는 생체 내에서 서서히 화학적 분해가 일어나면서 그 형태와 무게가 점차 소멸되는 고분자를 총칭하는 것으로서, 이를 사용하여 조직세포의 담체를 제작하여 세포와 함께 체내에 이식하게 되면, 세포가 신체 조직에 적응하여 조직을 형성하는 도중에 생분해성 고분자는 차차 분해되어 사라지므로 재수술을 통해 고분자를 제거하는 불편을 덜 수 있으며 이물질 삽입에 의한 만성적인 면역반응 또한 감소하는 효과를 기대할 수 있게 된다. 이 중, 천연 생분해성 고분자는 인위적으로 생분해속도를 조절하기 어려운 것에 비해서 유기합성을 통해 제조한 고분자는 그의 조성을 조절함에 의해서 생분해속도를 조절할 수 있는 장점이 있다.

생분해성 합성 고분자로 대표적인 키토산은 게나 새우등 갑각류 껍질의 주성 분을 이루고 있는 키틴을 알칼리 가수분해에 의해 가용화, 고분자 재료로서 이용될 수 있도록 한 것으로서, 1970년대 이전부터 자연에서 다량으로 얻을 수 있는 몇 안되는 고품질의 고분자로서 일련의 연구자들에 의해 꾸준히 연구되어 왔으며, 현재 일부는 생체 합성을 이용하여 인체내 인공피부 등 손상부위 대체용, 의약용 배지, 또는 지지체 등 의료용으로 이용되고 있고, 일부는 폐수처리제, 보습제 등 매우 다양한 용도로서 이용되고 있는데, 그 구성 성분이 고분자량임에 착안하여 최근들어 고분자 수지로의 이용에 많은 관심이 쏠리고 있는 물질이다.

이 재료의 성질은 매우 뛰어난 기계적 강도를 지니고, 생분해성과 생체 흡수성을 나타내면서, 인체에 대한 유해 작용을 유발하지 않아, 생체기간 대체용의 의료용 고분자로서 이용되기에 매우 적합한 특성을 지니고 있다. 더욱이 키틴으로부터 키토산에 이르는 결과가 발표되는 등, 탈아세틸화 정도를 조절해 줌으로써 용도에 적합한 분해성능을 부여해 주는 것이 가능하다. 뿐만 아니라, 기계적 강도 등, 이 재료 여타의 제반 성질은 탈아세틸화율과는 거의 무관하므로, 이를 이용하면 기계적 성질과 강도유지기간을 서로 독립적으로 용도에 따라 조정할 수 있다.

실제로 키토산을 이용하여 인체조직 대체 및 상처 치료용 제품을 제조하는 연구가 90년대 들어 매우 다양하게 진행되어, 일본에서는 이와 관련된 공개 및 공고 특허의 수만도 100여 건을 상회하고 있다. 이들 기술중 본 발명과 궁극적인 목적을 공유하는 대표적인 기술을 일부 살펴보면, 일본 특허공개 평성 1-181872 생체용이식재(生體用移植材): 키틴/키토산과 하이드록시 아파타이트(hydroy apatite)를 폴리비날알코올을 접합재로 이용하여 시트(sheet)상으로 제조후 폴리비닐알코올을 수세-제거, 일본 특허공개 평성 2-286155 인공치근(人工齒根): 하이드록시 아파타이트와 키틴/키토산의 혼합물을 소성하여 인공치근 제조, 일본 특허공고 소화 63-59706: 키토산 유도체 및 콜라겐의 복합재의 의료용 재료 및 그의 제조법, 키토산 유도체와 콜라겐의 혼합 스폰지로서 인공피부 및 창상 커버재 제조 등이 있다. 그러나, 상기와 같이 생체에 적합한 키토산에 특이적으로 결합하는 물질이 동정되지 않아 이러한 생체적합성 고분자를 이용하는데 어려움이 있었다.

이에, 본 발명자들은 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통해서 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 선별하였으며, 상기 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드가 생체적합성 키토산의 선택적인 분리 및 키토산과 생체분자간의 연결물질(linker)로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 올리고 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 군으로부터 선택되는 올리고 펩타이드이며, 키토산에 특이적으로 부착한다. 상기 올리고 펩타이드는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통하여 선별되며, 생체적합성 키토산의 선택적인 분리 및 키토산과 생체분자간의 연결물질로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 대장균에서 발현되는 펩타이드 라이브러리의 제조

본 발명자들은 키토산에 부착하는 무작위의 아미노산 부위를 스크리닝하기 위하여, 티오레독신(thioredoxin)의 활성 부위에 발현될 수 있는 융합 단백질 형태로 무작위의 아미노산 서열을 발현시켰다. 구체적으로, 무작위의 아미노산 서열을 티오레독신의 활성부위를 포함하는 pFLITRIX 벡터에 삽입시켜 티오레독신과 융합된 단백질이 세포표면에 노출될 수 있도록 하였다. 상기의 방법으로 발현되는 FLITRIX 펩타이드는 PL 프로모터에 의해 발현이 조절되고 박테리오파지(bacteriophage) cI 억제제(repressor)에 의해 발현이 억제된다. 상기 박테리오파지 유래의 cI 억제제는 단백질의 발현을 강력하게 억제하는 역할을 하며, PL 프로모터의 조절 하에 있는 FLITRIX 펩타이드의 발현을 억제하게 된다. 그러나, 배지에 트립토판이 첨가되면 트립토판-trp 억제제의 복합체가 형성되며, 트립토판-trp 억제제의 복합체는 trp 오퍼레이터(operator)에 결합하게 된다. trp 오퍼레이터에 결합하게 되면 cI 억제제의 발현이 억제되고 cI 억제제의 조절하에 있는 FLITRIX 펩타이드의 발현이 유도된다.

<실시예 2> 대장균에서 발현되는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝

본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 pFLITRIX 벡터를 대장균(E. coli)에 형질전환 시킨 후 암피실린이 첨가되어 있는 IMC 선택배지에서 배양하였다. 15시간동안 배양한 후 트립토판을 첨가하여 6시간동안 더 배양함으로써 FLITRIX 펩타이드의 발현을 유도하였다. 미리 키토산을 고정한 배양접시를 블록시킨 후, 상기에서 발현이 유도된 대장균 형질전환체를 부착시켰다. 상기의 과정을 반복적으로 시행하여 키토산에 특이적으로 부착하는 펩타이드 후보군을 선별하였다.

<실시예 3> 자동염기서열 분석기를 이용한 펩타이드의 서열 분석

본 발명자들은 자동염기서열분석기(ABI Prism 377, 퍼킨엘머사, 미국)를 이용하여 ABI PRISMTMDye 종결 순환 시퀀싱(terminator cycle sequencing) 방법으로 염기서열 분석은 실시하였다. 구체적으로, PCR 증폭산물을 QIAquick PCR 정제 키트(QIAGEN사, 미국)를 이용하여 PCR 산물만을 정제해내었다. 상기 PCR 정제산물을 GeneQuant(파마시아사, 미국)를 이용하여 정량하였다. 자동염기서열분석을 위한 PCR 반응은 다음과 같다. 8.0 ㎕의 종결 반응 혼합물(terminator ready reaction mix, 퍼킨엘머사, 미국), 10-30 ng/㎕ 농도의 정제한 PCR 산물 5 ㎕, 6.4 pmole의 PCR 프라이머 쌍 1 ㎕ 및 증류수 6 ㎕를 첨가하여 전체 반응액의 부피를 20 ㎕가 되도록 조정하였다. PCR 반응은 GeneAMP PCR system 9600(퍼킨엘머사, 미국)을 이용하여 96℃에서 핫 스타트(hot start) PCR을 시작하여 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분으로 25 사이클(cycle)을 시행한 후 4℃로 급냉시켰다. 각각의 PCR 증폭산물에 3 M의 나트륨 아세트산(sodium acetate, pH 5.2) 1 ㎕와 100% 에탄올 25 ㎕를 가한 후 얼음에 30분간 정치시켜 PCR 산물의 침전반응을 증가시켰으며, 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 PCR 침전물(pellet)을 수집하였다. 상층액을 제거한 후, 염을 제거하기 위하여 70% 에탄올로 세척한 후 공기중에서 건조시켰다. 탈이온화된 포름아마이드(deionized formamide)와 25 mM EDTA/ 50 ㎎/㎖ 블루 덱스트란(bule dextran)을 5 대 1의 비율로 혼합한 시퀀싱 로딩 버퍼(sequencing loading buffer) 6 ㎕을 이용하여 침전시킨 PCR 산물을 부유시켰다. 상기 부유물을 90℃에서 2분동안 방치하여 변성시킨 후 얼음에서 급냉시켰다. 자동염기서열분석용 겔을 제조하기 위하여 18 g의 요소(urea)를 25 ㎖의 증류수에 용해시키고 5.625 ㎖의 40% 아크릴아마이드를 첨가한 후, 0.5 g의 혼합된 비드 레진(mixed bed resin)을 첨가하여 15분간 잘 교반함으로써 탈이온화(deionization) 시켰다. 진공펌프를 이용하여 겔 용액을 0.2 μM 여과지로 거른 후 5분간 가스를 제거시켰다(degassing). 여기에 5 ㎖의 10×TBE를 첨가하고 최종부피가 50 ㎖가 되도록 증류수를 채운 후 4.5% 아크릴아마이드/6 M 요소(urea)/1×TBE 겔을 제조하였다. 자동 염기서열 분석기에 겔을 장치한 후 염기서열분석을 위하여 급냉시켰던 PCR 산물을 로딩하였다. 2×Run, 1,680 볼트로 7시간동안 전기영동을 실시한 후 ABI Prism Sequence Navigator와 ABI Prism Factura 등의 ABI Prism DNA 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.

상기의 방법으로 DNA 염기 서열을 결정함으로써, 본 발명자들은 키토산에 특이적으로 부착하는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 활성적인 항생 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하였다(도 1 및 도 2).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 키토산에 특이적으로 부착하는 펩타이드는 생체적합성 키토산의 선택적인 분리 및 키토산과 생체분자간의 연결물질로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> CHUNG, CHONG PYOUNG LEE, SEUNG JIN JANG, JUN-HYEOG <120> Oligopeptide which binds specifically to chitosan <130> 2p-05-09 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptide <400> 1 Leu Ala Ser Asp Thr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptide <400> 2 Leu Ala Ser Val Thr 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptide <400> 3 Leu Ala Ser Xaa Thr 1 5

Claims (4)

1. 서열번호 1 내지 3으로 기재되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 키토산에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제

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