KR100880370B1 - 유효하고 선택적인 인간 ρ2χ3 수용체 길항제로서의스피노르핀계 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유효하고 선택적인 인간 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 펩타이드 AVVYPWT, 펩타이드 LAVYPWT, 펩타이드 LVAYPWT, 펩타이드 LVVAPWT 및 펩타이드 환형 LVVYPWT에서 선택된 유효하고 선택적인 인간 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 P2X3 수용체에서의 스피노르핀의 채널 차단 활성 및 단편 인식을 특성화하기 위해 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 발현된 재조합 인간 P2X3 수용체에서의 7개 알라닌 스캔된 스피노르핀 펩타이드 유도체, 절단된 펩타이드 아날로그, 환형 펩타이드 및 레트로-인버소 펩타이드의 전기생리학적 평가를 측정하여 신규한 스피노르핀 유도체를 개발한 것이다.
Figure 112007021555403-pat00001
P2X3 수용체 길항제, 스피노르핀계 유도체, 펩타이드, 채널 차단 활성

Description

유효하고 선택적인 인간 Ρ2Χ3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체 {Spinorphin derivatives as potent and selective human P2X3 receptor antagonist}
도 1은 P2X3 수용체 길항제의 구조 및 생물학적 활성을 나타낸 것이다.
도 2(A)는 스피노르핀에 의한 인간 P2X3 수용체-매개 전류의 저해를 나타낸 것이다. 대조군 및 3가지 농도의 스피노르핀의 존재시 2 μM ATP에 의해 유도된 대표적인 내부 전류를 나타낸다.
도 2(B)는 인간 P2X3 수용체에 대한 본 발명의 펩타이드 5 (■), 6 (●), 7 (▲), 13 (▼) 및 이소-PPADS, 4 (◆)의 농도-저해 곡선을 나타낸 것이다. ATP에 대한 연속선은 하기 방정식을 이용하여 데이터에 맞춰진다: I = Imax/(1 + IC50/L)nH), 'I'는 리간드 농도 ('L')에 대한 실제 전류이고, 'nH'는 Hill 계수이고 'Imax'는 최대 전류임. IC50 수치는 8.3 ± 2.2 pM (5); 14.3 ± 5.1 nM (6); 32.4 ± 8.7 nM (7); 82.4 ± 17.0 nM (13); 108.2 ± 11.4 nM (4). Hill 계수는 -0.38 ± 0.10 (5); -1.08 ± 0.13 (6); -1.27 ± 0.15 (7); -0.60 ± 0.05 (13); -0.92 ± 0.08 (4) 이었다. 각 수치는 4회 관찰의 평균 ± 표준편차이다. 기록은 2 μM ATP로 -90 mV의 보유 전위에서 수행되었다.
도 3은 스피노르핀 (펩타이드 5) 및 본 발명의 펩타이드 6의 증가 농도의 존재시 ATP에 대한 농도-반응 곡선을 나타낸 것이다. 데이터는 인간 P2X3 서브유니트를 발현하는 난모세포에 상응한다. ATP (μM)에 대한 EC50 수치 및 Hill 계수는: (A) 대조군 ■) : 1.66 ± 0.23, 0.84 ± 0.09, 100 nM 5 (●) 8.45 ± 2.00, 0.73 ± 0.11, 500 nM 5 (▲) 27.66 ± 1.89, 0.68 ± 0.03 및 1 μM 5 (▼) 54.31 ± 15.90, 0.57 ± 0.08. (B) 대조군 (■) 1.66 ± 0.23, 0.84 ± 0.09, 500 nM 6 (●) 9.76 ± 1.26, 0.66 ± 0.05 및 1 μM 6 (▲) 17.31 ± 4.16, 0.63 ± 0.07. 각 수치는 3∼7개 난모세포에 대한 평균 ± 표준편차이다.
본 발명은 유효하고 선택적인 인간 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 펩타이드 AVVYPWT, 펩타이드 LAVYPWT, 펩타이드 LVAYPWT, 펩타이드 LVVAPWT 및 펩타이드 환형 LVVYPWY에서 선택된 유효하고 선택적인 인간 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체에 관한 것이다.
P2 퓨린성 수용체계의 멤버인 P2X3 수용체는 내인성 리간드로서 세포외 ATP에 의해 활성화되는 리간드-관문 이온 채널이다. P2X3 수용체의 발현은 감각 구심성 뉴런의 말초 및 중추 처리에 매우 국한되어 있다. 따라서 세포외 ATP는 교감신경줄기신경절 및 뇌 내의 시냅스에서의 신경전달물질로서 보고되었다. 전통각성(pronociceptive) 효과에 기반한 ATP에 의한 P2X3 수용체의 활성화는 만성 염증 통각 및 신경 손상에 의한 신경병증성 통증에 관련한 통증 신호전달을 개시하는 것으로 알려져 있고, 이는 통증 조절을 위한 신규한 약물 타겟의 가능성을 지닌다.
많은 P2X3 수용체 길항제(도 1) 중 화합물 3(A317491)은 패치 클램프(path clamp) 분석시 99 nM의 IC50 수치로서 인간 P2X3 수용체에서 유효한 길항 활성을 나타내었고 일부 동물 모델에서 진통제 효과를 나타내었다. 그러나 화합물 3을 포함한 대부분의 알려진 길항제는 카르복실산 및 인산염과 같은 음이온 기능성기를 포함하고, 이는 일반적으로 잠재적인 약물 후보로서 이들 화합물의 생체이용율을 제 한한다.
스피노르핀(본 명세서 내의 펩타이드 5)은 7개의 아미노산 LVVYPWT로 구성된 내인성 펩타이드로서 소 척수에서 분리되었고, 엔케팔린(enkephalin)-분해 효소의 저해 효과에 대해 알려져 있고, 이는 뇌실내 투여로 꼬리 꼬집기 분석시 항진통 활성을 유발한다. 더욱이 스피노르핀이 브라디키닌(bradykinin)-유도 통각 반응의 저해제인 모르핀에 의해 차단되었던 작용제 유도 통각을 포함한 P2X 수용체 작용제인 2-MeS-ATP의 효과를 완전하게 저해함이 보고되었다. 이러한 이유로 P2X3 수용체의 첫 번째 유효한 펩타이드 길항제로서 본 발명에서 스피노르핀계 유도체의 구조-활성 관계 연구 및 항통각 효과를 측정코자 하였다.
본 발명에서 본 발명자들은 P2X3 수용체에서의 스피노르핀의 채널 차단 활성 및 단편 인식을 특성화하기 위해 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 발현된 재조합 인간 P2X3 수용체에서의 7개 알라닌 스캔된 스피노르핀 펩타이드 유도체, 절단된 펩타이드 아날로그, 환형 펩타이드 및 레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드의 전기생리학적 평가를 측정하여 특정 유도체를 선별함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 P2X3 수용체에서의 스피노르핀의 채널 차단 활성 및 단편 인식을 특성화하기 위해 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 발현된 재조합 인간 P2X3 수용체에서의 7개 알라닌 스캔된 스피노르핀 펩타이드 유도체, 절단된 펩타이드 아날로그, 환형 펩타이드 및 레트로-인버소 펩타이드의 전기생리학적 평가를 측정코자 한 것이다.
본 발명은 (a) 펩타이드 AVVYPWT (서열번호: 1), (b) 펩타이드 LAVYPWT (서열번호: 2), (c) 펩타이드 LVAYPWT (서열번호: 3), (d) 펩타이드 LVVAPWT (서열번호: 4) 및 (e) 펩타이드 환형 LVVYPWT (서열번호: 5)에서 선택된 인간 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 스피노르핀계 펩타이드를 활성성분으로 하고 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 P2X3 수용체 길항제 의약 조성물을 제공하는 것이다.
한편, 본 발명은 단계적 플루오렌(fluoren)-9-일-메톡시카르보닐(Fmoc) 고형상기 펩타이드 합성방법에 있어서, ⅰ) Fmoc 아미노산은 0.5 M N-메틸-2-피롤리 돈(NMP) 용액으로 보관하고, ⅱ) 커플링 시약은 NMP(0.5 M 용액) 내에 예비-용해시키고, ⅲ) Fmoc 탈보호는 NMP 내 20% 피페리딘으로 수행하고, ⅳ) 아미노산 측쇄의 수지로부터 펩타이드 분리는 TFA/H2O(95:5=v/v)로 수행하고, ⅴ) 펩타이드 생성물은 디에틸에테르로 침전시켜 원심분리에 의해 수집 동결건조시키는 단계로 구성된 상기 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
내인성 항통각성 펩타이드(LVVYPWT)인 스피노르핀은 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 발현된 재조합 인간 P2X3 수용체로의 2-전극 전압 클램프(two-electrode voltage clamp, TEVC) 분석시 8.3 pM의 IC50 수치를 지녀 인간 P2X3 수용체에서 유효한 길항 특성을 나타낸다.
다른 P2X 수용체 서브타입인 마우스 P2X1 및 인간 P2X7은 스피노르핀 및 그의 유도체에 의해 영향받지 않았으며, 스피노르핀의 알라닌 치환되거나 절단되거나 환형의 펩타이드 및 레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드를 포함한 일부 펩타이드 유도체는 구조-활성 관계를 평가하고 그 활성을 측정한다.
단일 알라닌 치환된 본 발명의 펩타이드 6 내지 펩타이드 9는 나노몰 범위의 IC50으로 인간 P2X3 수용체에서 길항 특성을 지속한 반면 트레오닌의 알라닌으로의 치환시킨 본 발명의 펩타이드 12는 길항 활성의 증강 효과를 유발함이 측정되었다. LVVYPWT 서열의 환형 형태인 펩타이드 13 역시 82.4 nM의 IC50 수치로 인간 P2X3 수용체에서 길항 효과를 나타낸다.
절단된 레트로-인버소 펩타이드 아날로그는 인간 P2X3 수용체에서 길항 활성의 완전한 소실을 나타내었다. 이들 결과는 P2X3 수용체에서의 스피노르핀 및 그의 유도체의 높은 유효성이 항통각 특성과 일치함을 나타내는 것이다.
스피노르핀(펩타이드 5) 및 다른 펩타이드 유도체는 Fmoc-보호 아미노산으로 충전된 Wang 수지 상에서 고형상 펩타이드 합성법으로 합성되었다. 여기서 HOBt 및 DCC는 Fmoc기의 탈보호(deprotection)후 수지 상에서 각 아미노산의 로딩 및 서브 커플링에 사용되었다.
수지로부터의 펩타이드의 분리는 TFA/H20(95:5 v/v)로 3시간 동안 수행되었다. 스피노르핀 합성의 대표적인 절차는 스킴 1에 기재되어 있다.
[스킴 1]
Figure 112007021555403-pat00002
이후 합성된 펩타이드는 2-전극 전압 클램핑(TEVC) 기술을 이용하여 제노푸스 난모세포에서 발현된 재조합 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에서의 ATP-유도 전류를 측정하기 위해 기능성 이온 채널 분석을 행하였다.
퓨린성 P1 및 P2 수용체가 제노푸스 난모세포의 난포 세포층 상에 존재하기 때문에 TEVC 실험은 탈난포화된(defolliculated) 난모세포에서 수행되었다. 2 μM ATP에 반응한 최고 전류의 재현가능 규모를 확인하기 위해 대조군 실험은 인간 P2X3 수용체 5회 반복되었고, 각 펩타이드의 길항 효과는 전류 차이에 기반하여 측정되었다. HEK293 세포에서 안정하게 발현된 인간 P2X7 수용체에서의 스피노르핀 유도체의 효과는 선택성 작용제로서 BzATP를 이용한 에티듐 축적 분석으로 측정되었다.
다양한 P2X 수용체 서브타입에서의 스피노르핀(펩타이드 5) 및 그의 유도체의 길항 활성은 표 1에 나타나 있다. P2X 수용체 길항제인 이소-PPADS(iso-pyridoxal-α5-phosphate-6-zaophenyl-2',5'-disulfonic acid)(펩타이드 4)는 양성 대조군으로 사용되었고, 이는 각각 마우스 P2X1, 인간 P2X3 수용체에서의 100 nM 내 및 인간 P2X7 수용체에서의 10 μM 내에서 64%, 48% 및 97% 저해를 나타내었다. 스피노르핀의 N-말단으로부터 첫 번째 내지 네 번째 아미노산의 단일 알라닌 치환을 지닌 스피노르핀(펩타이드 5) 및 그의 유도체는 인간 P2X3 수용체에서의 이소-PPADS와 비교시 더 높거나(펩타이드 5 및 6) 동일한(펩타이드 7∼9) 길항 효능을 나타내었다.
Figure 112007021555403-pat00003
a 이온 전류는 제노푸스 난모세포 내에서 발현된 재조합 P2X 수용체에서 2 μM ATP에 의해 유도되었고 10 μM 및 100 nM 화합물에 의한 이온 전류의 저해%는 각각 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에 대해 측정되었다(평균 ± 표준편차, n = 4). b 에티듐+의 축적은 HEK293 세포 내에서 발현된 인간 P2X7 수용체에서 6 μM BzATP에 의해 유도되었고 10 μM 화합물에 의한 축적의 저해%가 측정되었다(평균 ± 표준편차, n = 3). c 100 nM 화합물 4, 이소PPADS가 사용되었다. d 표준화 이온 전류는 2 μM ATP의 존재시 펩타이드 12에 의해 유도되었다. e 10 μM 화합물이 시험되었다.
서브타입 선택성의 측면에서 P2X3 수용체에서 길항 효과를 나타내는 펩타이드 아날로그는 모두 매우 선택적이고, 이는 P2X1,7 수용체에서 매우 약하거나 불활성을 나타낸다. 스피노르핀의 다섯 번째 및 여섯 번째 아미노산의 알라닌 치환(펩타이드 10 및 11)은 길항 활성을 유의적으로 감소시켰고, 100 nM에서 10∼20% 저해만을 나타내었다. 스피노르핀의 트레오닌의 알라닌으로의 치환(펩타이드 12)은 ATP 유도 전류의 2.5-배 증가를 유발하였고, 이는 P2X3 수용체에서 스피노르핀의 인간 ATP 효과의 강한 강화제로의 길항 특성의 극적 역전을 나타내었다.
따라서 스피노르핀 서열 내의 다섯 번째 내지 일곱 번째 아미노산이 길항제로서 인간 P2X3 수용체의 인식에 중요한 것으로 판단된다. 100 nM의 농도에서 펩타이드 5 및 6의 환형 형태인 펩타이드 13 및 14는 각각 인간 P2X3 수용체에서 ATP 유도 이온 전류에 대한 36% 및 11% 저해를 나타내는 매우 약한 길항작용을 지니는 것으로 나타났다. 역서열 및 전도된 키랄성(inverted chiralilty)을 지닌 이성체인 레트로-인버소 펩타이드(펩타이드 15)는 10 μM에서 불활성이었고, 이는 초기 아민 및 카르복실산 유니트와 같은 말단 기능이 적당히 배열될 필요가 있음을 나타낸다.
도 2(A)는 인간 P2X3 수용체를 발현하는 탈난포화 제노푸스 난모세포 내의 ATP-유도 이온 전류에 대한 스피노르핀(펩타이드 5)의 용량 의존적 저해를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이 펩타이드 아날로그의 길항 효과는 세척 후 완전하게 역전되었다. 더욱이 이소-PPADS(펩타이드 4), 스피노르핀(펩타이드 5), 알라닌 치환된 펩타이드 6, 7 및 스피노르핀의 환형 형태(펩타이드 13)의 전체 용량-반응 곡선이 도 2(B)에 나타나 있다. 도면에 나타난 바와 같이 스피노르핀이 8.3 pM의 IC50 수치 및 -0.38의 Hill 계수로서 ATP에 의해 유도된 내부 전류에 대한 가장 유효한 길항 효과를 나타내었고, 이는 음성 협동 길항작용을 지닌 결합 방식의 가능성을 나타낸다.
알라닌 치환된 펩타이드 6 및 7은 각각 14.3 nM 및 32.4 nM의 IC50 수치 및 -1.08 및 -1.27의 Hill 계수로서 감소된 길항 활성을 나타내었고, 이는 알라닌 치환에 의한 음성으로부터 양성 협동 길항작용으로의 변화된 결합 방식을 의미한다. 또한 스피노르핀 서열(LVVYPWT)의 환형 형태는 82.4 nM의 IC50 수치 및 -0.60의 Hill 계수로서 인간 P2X3 수용체에서 상당한 길항 효과를 지닌다.
인간 P2X3 수용체에서 길항 특성을 유지하는 스피노르핀(펩타이드 5)의 활성적 단편 검색시 많은 절단된 펩타이드 아날로그가 조사되었다. 그러나 본래 펩타이드로부터 특정 아미노산 서열의 제거는 표 1에 나타난 바와 같이 10 μM 농도에서 10∼30% 저해를 나타내어 길항 활성의 유의적 소실을 유발하였다. 더욱이 류신 결실된 펩타이드 22도 10 μM 농도에서 30% 저해만을 나타내어 스피노르핀보다 덜 활성적이었다. 따라서 데이터는 스피노르핀의 대부분의 아미노산 잔기가 인간 P2X3 수용체 서브타입에 대한 길항 활성을 부여하는데 중요함을 나타낸다.
펩타이드 5의 인간 P2X3 수용체와의 상호작용 메커니즘을 조사하기 위해 3가지 농도의 펩타이드 5의 존재시 ATP-유도 전류가 측정되었고, ATP에 대한 용량-반응 곡선이 비교되었다(도 3(A)). 각각의 최고 전류는 최대 ATP-유도 전류를 나타내는 농도인 200 μM ATP로의 처리로부터 수득된 전류 수치로 표준화되었고; 길항제 부재시(대조군) ATP의 용량-반응 곡선으로부터의 EC50 수치는 1.66 μM로 측정되었다.
펩타이드 5의 농도 증가는 ATP의 용량-반응 곡선을 우측으로 이동시켰고 동시 최대 전류를 감소시켰고, 이는 각각 펩타이드 5의 100 nM, 500 nM 및 1 μM에 대해 8.45 μM, 27.66 μM 및 54.31 μM의 EC50 수치를 유발하였다. 또한 각각의 용량-반응 곡선의 Hill 계수 수치 nH가 변화되었고(대조군, 펩타이드 5의 100 nM, 500 nM 및 1 μM에 대해 0.84, 0.73, 0.68 및 0.57), 이는 펩타이드 5의 길항작용 방식이 비경쟁적임을 나타낸다. 더욱이 두 번째 아미노산인 발린의 알라닌 치환된 펩타이드도 EC50 수치를 증가시키고 Hill 계수 수치를 감소시키는 것으로 나타나 인간 P2X3 수용체에서 비경쟁적 길항제인 것으로 판명되었다(도 3(B)).
결론적으로 본 발명자는 난모세포 또는 포유류 세포 시스템에서 발현되는 P2X1,3 및 7 수용체로 전기생리학적 평가에 의해 스피노르핀 유도체 시리즈의 유효한 길항작용 및 구조-활성 관계를 측정하였다. 길항작용의 방식이 비경쟁적인 것으로 판명되었으나 펩타이드 유도체는 마우스 P2X1 및 인간 P2X7 수용체와 비교시 인간 P2X3 수용체에 대해 큰 유효성 및 특이성을 나타내었다.
본 발명에서 합성된 펩타이드 길항제는 P2X 수용체의 구조 및 기능에 대한 연구에 유용할 것이고 길항작용에 대한 펩타이드 서열 상에 수집된 정보는 비-펩타이드 길항제의 또다른 발명에 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
합성, 재료 및 분석 방법
펩타이드 5∼22는 고형상 합성 방법에 의해 기술된 바와 같이 제조되었다. 화합물 4를 제조하기 위해 아조 커플링 반응에서 사용된 피리독살 5'-포스페이트 모노하이드레이트 및 아닐린 2,4-디술폰산은 Aldrich(St. Louis, MO) 및 TCI(Tokyo)에서 구입되었다. 나타내지 않는 한 사용된 모든 아미노산은 L-형상이다. Fmoc-보호된 아미노산은 Novabiochem(Darmstadt, Germany)에서 구입되었다. 모든 다른 시약 및 용매는 분석용이거나 펩타이드 합성 등급이고, Merck(Darmstadt, Germany), B&J Bioscience에서 구입되었다.
양자 핵 자기 공명 분광법은 JEOL JNM-LA 300WB 분광기 상에서 수행되었고 스펙트럼은 DMSO-d6 내에서 취해졌다. 언급되지 않는 한 화학적 쉬프트는 내부 테트라메틸실란으로부터 ppm 다운필드로 또는 DMSO(2.5 ppm)로부터 상대 ppm으로 표기된다. 데이터는 하기와 같이 나타났 있다: 화학적 쉬프트, 다중성(s, 단일체; d, 이중체; t, 삼중체; m, 다중체; b, 광범위; app., 명백), 커플링 상수 및 통합. 질량 측정법은 MALDI-TOF 및 FAB 기구 상에서 수행되었다. 고-해상 질량 스펙트럼(m/z)은 FAB 기구 상에서 기록되었다. [FAB 원천: JEOL FAB 원천 및 이온 건(Cs 이온 빔, 30 kV 가속]. 고-해상 질량 분석은 기초과학지원연구소 서울분소 분석 실험실에서 수행되었다.
순도 측정은 선형 기울기 용매 시스템 내에서 Shimadzu Shim-pack C18 분석 컬럼(250 mm × 4.6 mm, 5 ㎛, 100 Å)을 이용하여 Shimadzu SCL-10A VP HPLC 시스템 상에서 수행되었다. 하나의 용매 시스템(A)은 유속 = 1 mL/분으로 30분간의 H2O 내 0.1% TFA : CH3CN 내 0.1% TFA = 95 : 5 내지 35 : 65이었다. 또다른 시스템(B)은 유속 = 1 mL/분으로 30분간의 H2O 내 0.1% TFA : MeOH 내 0.1% TFA = 95 : 5 내지 35 : 65이었다. 최고점은 다이오드 배열 검출기를 이용한 UV 흡수에 의해 측정되었다.
인간 P2X3 수용체의 cRNA는 Dr. W. Stuhmer 및 Max-Plank Institute의 Dr. F. Soto에 의해 제공된 인간 P2X3 수용체의 cDNA의 역전사에 의해 수득되었다. 마우스 P2X1(클론 ID: 4189541) 및 인간 P2X7 수용체(클론 ID: 5286944)의 전체-길이 cDNA를 포함한 EST 클론은 구입되었고(Invitrogen, CA, USA) 그의 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.
(제조실시예 1) 펩타이드 합성
펩타이드는 단계적 플루오렌(fluoren)-9-일-메톡시카르보닐(Fmoc) 고형상 방법에 의해 합성되었다. Fmoc 아미노산은 0.5 M N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 용액으로 보관되었다. 커플링 시약은 NMP(0.5 M 용액) 내에 예비-용해되었고, 이는 2 M 용액으로서 활성제 EDCI, HOBt이다. 모든 실험은 단일 2시간 커플링 시간에서 10 등가의 아미노산 및 커플링 시약을 사용하였다. Fmoc 탈보호는 NMP 내 20% 피페리딘으로 수행되었다. 아미노산 측쇄의 수지로부터 펩타이드 분리는 TFA/H2O(95:5=v/v)으로 3시간 동안 수행되었다. 수지는 TFA로 세척되었고 여과물은 부분적으로 증발되었다. 천연 생성물은 디에틸에테르로 침전되었고 원심분리에 의해 수집되었고 H2O에 용해되어 동결건조되었다.
펩타이드 5(스피노르핀; LVVYPWT)
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.74 (s, 1H, Trp); 9.15 (s, 1H, Tyr); 8.46 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Tyr); 8.06 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Trp); 7.95 (m, 2H, Leu); 7.86 (d, J = 9.6 Hz, 1H, Thr); 7.79 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Val); 7.73 (d, J =8.4 Hz, 1H, Val); 7.55 (d, J =7.5 Hz, 1H, Trp); 7.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.13 (s, 1H, Trp); 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 7.02-7.09 (m, 1H, Trp); 6.95 (dd, J = 8.4, 7.5 Hz, 1H, Trp); 6.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.64 (m, 1H, Tyr); 4.55-4.61 (m, 1H, Trp); 4.28-4.36 (m, 1H, Leu); 4.21-4.27 (m, 2H, 2H of each Val); 4.10-4.19 (m, 2H, 각각 Thr의 1H); 3.84 (t, J = 6.9 Hz, 1H, Pro); 3.51-3.63 (m, 2H, Pro); 3.19-3.24 (m, 1H, Trp); 2.97-3.05 (m, 1H, Trp); 2.64-2.77 (tt, J = 10.2, 9.8 Hz, 2H, Tyr); 1.83-1.92 (m, 3H, 각각 Val의 2H + Pro의 1H); 1.72 (m, 2H, Pro); 1.56 (m, 1H, Leu); 1.46 (dd, J = 6.3, 6.9 Hz, 2H, Leu); 1.03 (d, J = 6.3 Hz, 3H, Thr); 0.78-0.89 (m, 12H, 각각 Val의 12H); 0.68-0.74 (d, J = 6.9 Hz, 6H, Leu). C45H65N8O10 : 877.4824 에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 877.4829 HPLC (tR, min) 시스템 A: 21.6, 시스템 B: 25.6 관찰됨.
(제조실시예 2) 펩타이드 6의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 6 (AVVYPWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.59 (s, 1H, Thr); 10.79 (s, 1H, Trp); 9.15 (s, 1H, Tyr); 8.36 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Tyr); 8.08 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Trp); 8.03 (m, 2H, Ala); 7.81 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Thr); 7.79 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Val); 7.76 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Val); 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.28 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.13 (s, 1H, Trp); 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Tyr); 7.02-7.04 (m, 1H, Trp); 6.95 (dd, J = 9.0, 8.1 Hz, 1H, Trp); 6.60 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Tyr); 4.87 (d, J = 4.5 Hz, 1H, Thr); 4.64 (m, 1H, Tyr); 4.55 (m, 1H, Trp); 4.28-4.31(m, 1H, Ala); 4.24-4.27 (m, 1H, Val); 4.22-4.24 (m, 1H, Val); 4.11-4.18 (m, 1H, Thr); 4.11-4.15 (m, 1H, Thr); 3.90 (m, 1H, Pro); 3.53 (m, 1H, Pro); 3.16-3.27 (m, 1H, Trp); 2.95-3.05 (m, 1H, Trp); 2.64-2.77 (tt, J = 10.2, 9.8 Hz, 2H, Tyr); 1.83-1.96 (m, 3H, 각각 Val의 2H + Pro의 1H); 1.67-1.75 (m, 2H, Pro); 1.03 (d, J = 6.9 Hz, 3H, Ala); 0.70-0.89 (m, 12H, 12H of each Val). C42H59N8O10 : 835.4354에 대해 경우HRMS (FAB) 계산됨. m/z 835.4351 HPLC (tR, min) 시스템 A: 19.8, 시스템 B: 21.7 관찰됨.
(제조실시예 3) 펩타이드 7의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 7 (LAVYPWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.60 (bs, 1H, Thr); 10.78 (s, 1H, Trp); 9.16 (s, 1H, Tyr); 8.61 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Tyr); 8.08 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 8.04 (m, 2H, Leu); 7.80 (m, 1H, Thr); 7.75 (m, 1H, Val); 7.74 (m, 1H, Val); 7.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Trp); 7.28 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.13 (s, 1H, Trp); 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 7.01 (m, 1H, Trp); 6.92 (dd, J = 8.4, 7.2 Hz, 1H, Trp); 6.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.90 (m, 1H, Thr); 4.64 (m, 1H, Tyr); 4.53 (m, 1H, Trp); 4.45 (m, 1H, Val); 4.30 (m, 1H, Leu); 4.21 (m, 1H, Ala); 4.14-4.17 (m, 1H, Thr); 4.12-4.14 (m, 1H, Thr); 3.75 (m, 1H, Pro); 3.55 (m, 1H, Pro); 3.16-3.21 (m, 1H, Trp); 2.97-3.05 (m, 1H, Trp); 2.60-2.80 (m, 2H, Tyr); 1.87-1.91 (m, 2H, Val의 1H + Pro의 1H); 1.67-1.79 (m, 2H, Pro); 1.55-1.65 (m, 1H, Leu); 1.45-1.55 (m, 2H, Leu); 1.20 (d, J = 6.9 Hz, 3H, Ala); 1.01 (d, J = 6.0 Hz, 3H, Tyr); 0.85 (dd, J = 7.2, 6.6 Hz, 6H, Val); 0.71 (t, J = 6.9 Hz, 6H, Leu). C43H61N8O10 : 849.4511에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 849.4511 HPLC (tR, min) 시스템 A:21.1 시스템 B: 24.0 관찰됨.
(제조실시예 4) 펩타이드 8의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 8 (LVAYPWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.80 (s, 1H, Trp); 9.15 (s, 1H, Tyr); 8.40 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Tyr); 8.05 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Trp); 8.00 (m, 2H, Leu); 7.85 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Thr); 7.70 (d, J = 9.2 Hz, 1H, Val); 7.55 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Trp); 7.28 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Trp); 7.15 (s, 1H, Trp); 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Tyr); 7.00-7.05 (m, 1H, Trp); 6.95 (dd, J = 8.7, 7.5 Hz, 1H, Trp); 6.60 (d, J = 8.7Hz, 2H, Tyr); 4.60-4.67 (m, 1H, Thr); 4.45-4.55 (m, 1H, Trp); 4.25-4.35 (m, 2H, Leu의 1H + Val의 1H); 4.17-4.25 (m, 2H, Ala의 1H + Thr의 1H); 4.07-4.15 (m, 1H, Thr); 3.65-3.85 (m, 1H, Pro); 3.45-3.55 (m, 1H, Pro); 3.13-3.25 (m, 1H, Trp); 2.98-3.05 (m, 1H, Trp); 2.60-2.85 (m, 2H, Tyr); 1.85-1.98 (m, 2H, Val의 1H + Pro의 1H); 1.70-1.80 (m, 2H, Pro); 1.55-1.65 (m, 1H, Leu); 1.45-1.52 (m, 2H, Leu); 1.10 (d, J = 6.9 Hz, 3H, Ala); 1.01 (d, J = 6.0 Hz, 3H, Thr); 0.81-0.95 (m, 12H, Val의 6H + Leu의 6H). C43H61N8O10 : 849.4511에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 849.4514 HPLC (tR, min) 시스템 A: 20.0 시스템 B: 22.5 관찰됨.
(제조실시예 5) 펩타이드 9의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 9 (LVVAPWT)를 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.80 (s, 1H, Trp); 8.43 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ala); 8.00 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Trp); 7.93 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Thr); 7.82 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Val); 7.66 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Val); 7.55 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.13 (s, 1H, Trp); 7.02 (dd, J = 6.9, 7.8 Hz, 1H, Trp); 6.93 (dd, J = 6.9, 7.8 Hz, 1H, Trp); 4.50-4.55 (m, 1H, Ala); 4.40-4.48 (m, 1H, Trp); 4.26-4.30 (m, 2H, 각각 Val의 2H); 4.12-4.15 (m, 2H, Leu의 1H + Thr의 1H); 4.05-4.10 (m, 1H, Thr); 3.72-3.80 (m, 1H, Pro); 3.16-3.23 (m, 1H, Trp); 2.97-3.05 (m, 1H, Trp); 1.85-2.00 (m, 3H, Pro의 1H + 각각 Val의 2H); 1.70-1.80 (m, 2H, Pro); 1.55-1.65 (m, 1H, Leu); 1.40-1.50 (m, 2H, Leu); 1.10 (d, J = 7.2 Hz, 3H, Ala); 1.00 (d, J = 6.0 Hz, 3H, Thr); 0.75-0.88 (m, 18H, Leu의 6H + 각각 Val의 12H). C39H61N8O9 : 785.4562에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 785.4579 HPLC (tR, min) 시스템 A: 32.4 시스템 B: 23.9 관찰됨.
(제조실시예 6) 펩타이드 10의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 10 (LVVYAWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.77 (s, 1H, Trp); 9.08 (s, 1H, Tyr); 8.40 (m, 1H, Ala); 8.07 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Tyr); 7.91-7.96 (app.m, 3H, 각각 Val의 2H + Trp의 1H); 7.68 (d, J = 6.9 Hz, 1H, Thr); 7.55 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.28 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.13 (s, 1H, Trp); 7.03 (dd, J = 6.9, 6.6 Hz, 1H, Trp); 6.98 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 6.90-7.00 (m, 1H, Tyr); 6.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.55-4.65 (m, 1H, Tyr); 4.39-4.50 (m, 1H, Trp); 4.20-4.30 (m, 2H, 각각 Val의 2H); 4.05-4.15 (m, 3H, Leu의 1H + Thr의 2H); 3.70-3.80 (m, 1H, Ala); 3.16-3.20 (m, 1H, Trp); 2.92-3.02 (m, 1H, Trp); 2.60-2.85 (m, 2H, Tyr); 1.80-1.95 (m, 2H, 각각 Val의 2H); 1.50-1.65 (m, 1H, Leu); 1.37-1.50 (m, 2H, Leu); 1.15 (d, J = 6.9 Hz, 3H, Ala); 0.97 (d, J = 6.3 Hz, 3H, Thr); 0.67-0.87 (m, 18H, 각각 Val의 12H + Leu의 6H). C43H63N8O10 : 851.4667에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 851.4653 HPLC (tR, min) 시스템 A: 21.2 시스템 B: 23.7 관찰됨.
(제조실시예 7) 펩타이드 11의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 11 (LVVYPAW)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.58 (s, 1H, Thr); 9.14 (s, 1H, Tyr); 8.47 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Tyr); 8.05-8.13 (app.m, 4H, Leu의 2H + Ala의 1H + Thr의 1H); 7.87 (d, J = 9.3 Hz, 1H, Val); 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Val); 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Tyr); 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Tyr); 4.87-4.97 (m, 1H, Thr); 4.53-4.64 (m, 1H, Tyr); 4.30-4.40 (m, 2H, 각각 Val의 2H); 4.22-4.30 (m, 1H, Leu); 4.10-4.21 (m, 3H, Thr의 2H + Ala의 1H); 3.82-3.90 (m, 1H, Pro); 3.55-3.65 (m, 1H, Pro); 2.62-2.75 (m, 2H, Tyr); 1.80-2.00 (m, 5H, 각각 Val의 2H + Pro의 3H); 1.55-1.65 (m, 1H, Leu); 1.45-1.55 (m, 2H, Leu); 1.23 (d, J = 7.2 Hz, 3H, Ala); 1.01 (d, J = 6.0 Hz, 3H, Thr); 0.70-0.90 (m, 18H, Leu의 6H + 각각 Val의 12H). C37H60N7O10 : 762.4402에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 762.4416 HPLC (tR, min) 시스템 A: 14.9 시스템 B: 17.6 관찰됨.
(제조실시예 8) 펩타이드 12의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 12 (LVVYPWA)를 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.80 (s, 1H, Trp); 9.15 (s, 1H, Tyr); 8.46 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Tyr); 8.00-8.20 (m, 4H, Leu의 2H + 각각 Val의 2H); 7.88 (d, J = 9.6 Hz, 1H, Thr); 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.27 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.11 (s, 1H, Trp); 7.03 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Tyr); 7.00-7.02 (m, 1H, Trp); 6.95 (m, 1H, Trp); 6.60 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Tyr); 4.50-4.60 (m, 2H, Trp의 1H + Tyr의 1H); 4.20-4.30 (m, 3H, Leu의 1H + Ala의 1H + Val의 1H); 4.12-4.18 (dd, J = 9.6, 8.4 Hz, 1H, Val); 3.80-3.90 (m, 1H, Pro); 3.52-3.62 (m, 1H, Pro); 3.12-3.22 (m, 1H, Trp); 2.97-3.05 (m, 1H, Trp); 2.60-2.82 (m, 2H, Tyr); 1.81-1.93 (m, 3H, Pro의 1H + 각각 Val의 2H); 1.65-1.75 (m, 3H, Val의 2H + 다른 Val의 1H); 1.53-1.61 (m, 1H, Leu); 1.45-1.52 (m, 2H, Leu); 1.27 (d, J = 7.2 Hz, 3H, Ala); 0.70-0.90 (m, 18H, Leu의 6H + 각각 Val의 12H). C44H63N8O9: 847.4718에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 847.4716 HPLC (tR, min) 시스템 A: 20.0 시스템 B: 25.2 관찰됨.
(제조실시예 9) 펩타이드 13의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 13 (환형 LVVYPWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.93 (s, 1H, Trp); 9.24 (s, 1H, Tyr); 8.91 (d, J = 4.5 Hz, 1H, Tyr); 8.15 (d, J = 9.3 Hz, 1H, Trp); 7.76 (d, J = 9.6 Hz, 1H, Thr); 7.52 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Val); 7.49 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Val); 7.32 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Trp); 7.25 (s, 1H, Trp); 7.07 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 6.90 (1H, Trp); 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 5.59 (s, 1H, Leu), 4.64 (m, 1H, Tyr); 4.55 (m, 1H, Trp); 4.22-4.41 (m, 4H, Leu의 1H + 각각 Val의 2H + Thr의 1H); 4.06 (m, 1H, Thr); 3.85 (m, 1H, Pro); 2.62-2.91 (m, 4H, Trp의 2H + Tyr의 2H); 2.10-2.20 (m, 2H, 각각 Val); 1.98-2.10 (m, 2H, Pro); 1.82 (m, 2H, Pro); 1.63 (m, 1H, Leu); 1.50 (m, 2H, Leu); 1.23 (d, J = 6.3 Hz, 3H, Thr); 0.78-1.02 (m, 각각 Val의 12H + Leu의 6H). C45H62N8O9: 859.0에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. m/z 859.3 HPLC (tR, min) 시스템 A: 26.3 시스템 B: 30.2 관찰됨.
(제조실시예 10) 펩타이드 14의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 14 (환형 AVVYPWT)를 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.95 (s, 1H, Trp); 9.25 (s, 1H, Tyr); 8.94 (d, J = 4.8 Hz, 1H, Tyr); 8.41 (bs, 1H, Thr); 8.14 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.78 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Val); 7.49 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Val); 7.29 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.13 (s, 1H, Trp); 7.06 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.02 (d, J = 4.2 Hz, 1H, Trp); 6.94 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 6.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 5.59 (s, 1H, Ala); 4,61 (m, 1H, Tyr); 4.50 (m, 1H, Trp); 4.20-4.38 (m, 3H, Ala의 1H + 각각 Val의 2H); 4.01 (m, 1H, Thr); 3.85 (m, 1H, Pro); 2.80 (m, 2H, Tyr); 2.01-2.21 (m, 2H, Pro); 1.50-1.59 (m, 2H, Pro); 1.31 (d. J = 7.2 Hz, 3H, Thr); 1.16 (d, J = 6.0 Hz, 3H, Ala); 0.78-1.02 (m, 12H, 각각 Val의 12H). C42H56N8O9: 816.9에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. m/z 817.7 HPLC (tR, min) 시스템 A: 22.2 시스템 B: 25.7 관찰됨.
(제조실시예 11) 펩타이드 15의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 15 (레트로인버소-펩타이드; (D)-TWPYVVL)를 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.88 (s, 1H, Trp); 9.11 (s, 1H, Tyr); 8.77 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Tyr); 8.13 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Trp); 7.87 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Leu); 7.82 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Val); 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Val); 7.58 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.27 (s, 1H, Trp); 7.04-7.12 (m, 1H, Trp); 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 6.90-7.00 (m, 1H, Trp); 6.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 5.40-5.52 (m, 1H, Thr); 4.72-4.80 (m, 1H, Tyr); 4.46-4.55 (m, 1H, Trp); 4.32-4.38 (m, 1H, Leu); 4.16-4.30 (m, 3H, Thr의 1H + 각각 Val의 2H); 3.76-3.84 (m, 1H, Pro); 3.48-3.50 (m, 2H, Pro); 3.08-3.17 (m, 1H, Trp); 2.91-3.00 (m, 1H, Trp); 2.82-3.00 (m, 1H, Tyr); 2.67-2.75 (m, 1H, Tyr); 1.88-2.00 (m, 3H, Pro의 1H + 각각 Val의 2H); 1.70-1.80 (m, 3H, Pro); 1.57-1.66 (m, 1H, Leu); 1.45-1.53 (m, 2H, Leu); 1.18 (d, J = 6.0 Hz, 3H, Thr); 0.74-0.90 (m, 18H, Leu의 6H + 각각 Val의 12H). C45H65N8O10 : 877.4824에 대해 HRMS (FAB) 계산됨. m/z 877.4805 HPLC (tR, min) 시스템 A: 23.1 시스템 B: 26.1 관찰됨
(제조실시예 12) 펩타이드 16의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 16 (VYP)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.51 (s, 1H, Pro); 9.23 (s, 1H, Tyr); 8.66 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Tyr); 7.98 (bs, 2H, Val); 7.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 6.67 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.62 (m, 1H, Tyr); 4.21 (d, J = 4.5 Hz, 1H, Pro); 3.72 (m, 1H, Val); 3.58 (m, 2H, Pro); 3.44 (m, 1H, Val); 2.73 (d, J = 5.7 Hz, 2H, Tyr); 2.09 (m, 3H, Pro의 1H + Val의 1H); 1.80-1.92 (m, 3H, Pro); 0.89 (m, 6H, Val). C19H27N3O5 : 377.4에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. m/z 377.7 HPLC (tR, min) 시스템 A: 11.9 관찰됨.
(제조실시예 13) 펩타이드 17의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 17 (VYPW)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.61 (s, 1H, Trp); 10.85 (s, 1H, Trp); 9.28 (s, 1H, Tyr); 8.66 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Tyr); 7.99 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Trp); 7.56 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Trp); 7.18 (s, 1H, Trp); 7.11 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 7.03 (m, 1H, Trp); 6.98 (m, 1H, Trp); 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.61 (m, 1H, Tyr); 4.52 (m, 2H, Val의 1H + Trp의 1H); 4.41 (m, 1H, Pro); 3.71 (m, 2H, Pro); 3.13 (m, 2H, Trp); 2.60-2.81 (m, 2H, Tyr); 2.07 (m, 2H, Pro); 1.78-1.82 (m, 3H, Val의 1H + Pro의 2H); 0.94 (dd, J = 6.6, 7.2 Hz, 6H, Val). C30H37N5O6 : 563.7에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. m/z 562.8 HPLC (tR, min) 시스템 A: 18.2 관찰됨.
(제조실시예 14) 펩타이드 18의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 18 (VYPWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 10.79 (s, 1H, Trp); 9.24 (s, 1H, Tyr); 8.64 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Tyr); 7.84 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Thr); 7.59 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Trp); 7.15 (s, 1H, Trp); 7.09 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 7.01 (t, J = 6.9 Hz, 1H, Trp); 6.92 (m, 1H, Trp); 6.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.68 (m, 1H, Tyr); 4.57 (m, 1H, Pro); 4.49 (m, 1H, Val); 4.33 (m, 1H, Trp); 4.24 (dd, J = 3.3 Hz, 1H, Thr); 4.13 (m, 1H, Thr); 3.51 (m, 2H, pro); 3.17 (d, J = 5.4 Hz, 2H, Trp); 3.05 (d, J = 7.8 Hz, 2H, Tyr); 2.08 (m, 1H, Val); 1.76-1.91 (m, 4H, Pro); 1.05 (d, J = 6.6 Hz, 3H, Thr); 0.83-1.02 (m, 6H, Val). C34H44N6O8 : 664.8에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. m/z 664.2 HPLC (tR, min) system A: 18.9 관찰됨.
(제조실시예 15) 펩타이드 19의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 19 (YPW)를 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.70 (s, 1H, Trp); 10.86 (s, 1H, Trp); 9.35 (s, 1H, Tyr); 8.18 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Trp); 8.01 (s, 2H, Tyr); 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Trp); 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.21 (s, 1H, Trp); 7.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 7.06 (dd, J = 6.9, 7.2 Hz, 1H, Trp); 6.95 (m, 1H, Trp); 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.70-4.53 (m, 2H, Tyr의 1H + Trp의 1H); 4.22 (m, 1H, Pro); 3.57-3.65 (m, 2H, Pro); 3.09 (m, 2H, Trp); 2.76-2.99 (m, 2H, Tyr); 2.06 (m, 1H, Pro); 1.73-1.85 (m, 3H, Pro의 2H + Pro의 1H). C25H28N4O5 : 464.5에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. m/z 464.7 HPLC (tR, min) 시스템 A: 18.8 관찰됨.
(제조실시예 16) 펩타이드 20의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 20 (YPWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.63 (s, 1H, Thr); 10.80 (s, 1H, Trp); 9.36 (s, 1H, Tyr); 8.26 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Trp); 8.01 (s, 2H, Tyr); 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Thr); 7.64 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Trp); 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.20 (s, 1H, Trp); 7.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 7.02 (dd, J = 7.2, 8.4 Hz, 1H, Trp); 6.90 (m, 1H, Trp); 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.92 (m, 1H, Pro); 4.70 (m, 1H, Tyr); 4.42 (m, 1H, Trp); 4.25 (m, 1H, Thr); 4.15 (m, 1H, Thr); 3.57 (m, 2H, Pro); 3.11-3.28 (m, 2H, Trp); 2.73-3.11 (m, 2H, Tyr); 2.01 (m, 1H, Pro); 1.64-1.80 (m, 3H, Pro의 2H + Pro의 1H); 1.02 (d, J = 6.3 Hz, 3H, Thr). C29H35N5O7 : 565.6에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. m/z 566.1 HPLC (tR, min) 시스템 A: 16.6 관찰됨.
(제조실시예 17) 펩타이드 21의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 21 (PWT)을 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ 10.84 (s, 1H, Trp); 8.73 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 8.09 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Trp); 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Thr); 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp); 7.20 (s, 1H, Trp); 7.07 (dd, J = 7.2, 8.7 Hz, 1H, Trp); 6.95 (dd, J = 7.2, 8.1 Hz, 1H, Trp); 5.02 (m, 1H, Pro); 4.79(m, 1H, Trp); 4.28 (dd, J = 3.0, 3.3 Hz, 1H, Thr); 4.19 (m, 1H, Thr); 4.07 (m, 1H, Pro); 3.16-3.24 (m, 2H, Trp); 2.98 (m, 1H, Pro); 2.27 (m, 1H, Pro); 1.81 (m, 2H, Pro); 1.07 (d, J = 6.3 Hz, 3H, Thr). C20H26N4O5 : 402.5에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. 40O2.9 HPLC (tR, min) 시스템 A: 13.4 관찰됨.
(제조실시예 18) 펩타이드 22의 합성
제조실시예 1과 동일한 방법으로 펩타이드 22 (VVYPWT)를 합성하였다. 합성된 펩타이드의 NMR, 원소 분석 및 원자량, HPLC 데이터는 다음과 같이 측정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 300 MHz)δ 12.57 (s, 1H, Thr); 10.78 (s, 1H, Trp); 9.13 (s, 1H, Tyr); 8.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Val); 8.18 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Tyr); 7.99 (s, 2H, Val); 7.83 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1h, Thr); 7.58 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Trp); 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Trp); 7.15 (s, 1H, Trp); 7.02-7.07 (m, 1H, Trp); 7.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); ;6.93 (dd, J = 7.8, 8.4 Hz, 1H, Trp); 6.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Tyr); 4.88 (m, 1H, Val); 4.65 (m, 1H, Tyr); 4.58 (m, 1H, Val); 4.32 (m, 1H, Pro); 4.25 (m, 1H, Trp); 4.20 (m, 1H, Thr); 4.11 (m, 1H, Thr); 3.53-3.67 (m, 2H, Pro); 3.17 (m, 2H, Trp); 3.02 (m, 1H, Pro); 2.61-2.82 (m, 2H, Tyr); 1.90-2.11 (m, 3H, 각각 Val의 2H + Pro의 1H); 1.74 (m, 3H, Pro의 1H + Pro의 2H); 1.06 (d, J = 6.3 Hz, 3H, Thr); 0.80-0.92 (m, 12H, 2개 Val). C39H53N7O9 : 763.9에 대해 MS (MALDI-TOF) 계산됨. 763.9 HPLC (tR, min) 시스템 A: 19.4 관찰됨.
(실시예 1) 재조합 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에서의 길항제 활성
제노푸스 난모세포는 앞서 기술된 바와 같이 채취되고 준비되었다. 탈난포화된 난모세포는 각각 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체 cRNA (40 nL, 1 ㎍/mL)과 함께 세포질적으로 주입되어 Barth 용액 내 18℃에서 24시간 동안 인큐베이트되었고 전기생리학적 실험에 사용되기 전까지 4℃에서 12일까지 보관되었다.
ATP-활성화 멤버 전류 (Vh` = -90 mV)는 2중-전극 전압-클램프 기술 (Axoclamp 2B amplifier)을 이용하여 cRNA-주입된 난모세포로부터 기록되었다. 전압 기록 (1∼2 ㏁ 팁(tip) 저항성) 및 전류-기록 미세전극 (5 ㏁ 팁 저항성)은 3.0 M KCl로 충진되었다. 난모세포는 전기생리학 챔버 내에 유지되었고 NaCl, 110 mM; KCl 2.5 mM; HEPES (N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[3-프로판술폰산]) 5 mM; BaCl3 1.8 mM을 함유하고 pH 7.5로 적정된 Ringer 용액으로 슈퍼퓨즈됨(superfused) (18℃에서 5 mL/분으로).
ATP는 60∼120초간 난모세포에 슈퍼퓨즈된 후 20분간 세척되었다. 저해 곡선에 있어서, 데이터는 pH 7.5에서 ATP에 의해 유도된 전류에 표준화되었다. 시험 물질은 ATP 노출전 20분간 첨가되었고; 모든 펩타이드는 그의 효과에 대한 가역성에 대해 시험되었다. ATP 반응을 50%까지 저해하는데 필요한 농도 (IC50)는 하기 식을 이용하여 구축된 Hill 플롯으로부터 계산되었다: log(I/Imax - I), I는 길항제 존재시 ATP에 의해 유도된 전류임. 데이터는 난모세포의 다른 뱃치의 데이터에 대해 평균 ± 표준편차 (n = 4)로 표기된다.
(실시예 2) 인간 P2X7 수용체에서의 에티듐+ 축적 분석
인간 P2X7-발현 HEK293 세포는 10% 우태아혈청으로 보충된 DMEM 내에서 5% CO2의 가습 대기 내 37℃에서 단층 배양으로 생장되었다. 세포는 트립신/EDTA 용액의 처리로 채취되었고 원심분리 (5분간 200 g)에 의해 수집되었다. 세포는 HEPES 10 mM, KCL 140 mM, 포도당 5 mM, EDTA 1 mM (pH 7.4)로 구성된 분석 완충액 내에 2.5 × 106 세포/mL로 재현탁된 후 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) (100 μM)이 첨가되었다. 세포 현탁액은 P2X7 수용체 작용제인 ATP 또는 BzATP를 포함한 96 웰 플레이트에 2 × 105 세포/웰로 첨가되었다. 플레이트는 37℃에서 120분간 인큐베이트되었고 에티듐+의 세포 축적은 Bio-Tek instrument FL600 형광 플레이트 판독기 (530 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방사 파장)로 형광도를 측정함으로서 측정되었다. PPADS, KN62와 같은 길항제 및 시험 펩타이드의 효과가 조사되는 경우 길항제는 예비-인큐베이션없이 작용제와 함께 처리되었다.
본 발명의 효과는 P2X3 수용체에서의 스피노르핀의 채널 차단 활성 및 단편 인식을 특성화하기 위해 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 발현된 재조합 인간 P2X3 수용체에서의 7개 알라닌 스캔된 스피노르핀 펩타이드 유도체, 절단된 펩타이드 아날로그, 환형 펩타이드 및 레트로-인버소 펩타이드의 전기생리학적 평가를 측정하여 신규한 스피노르핀 유도체를 개발한 것이다.
<110> Anygen Co., Ltd. <120> Spinorphin derivatives as potent and selective human P2X3 receptor antagonist <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 6 <400> 1 Ala Val Val Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 7 <400> 2 Leu Ala Val Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 8 <400> 3 Leu Val Ala Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 9 <400> 4 Leu Val Val Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 13 <400> 5 Leu Val Val Tyr Pro Trp Tyr 1 5

Claims (3)

  1. 펩타이드 AVVYPWT (서열번호: 1)로 구성된 인간 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체
  2. 삭제
  3. 단계적 플루오렌(fluoren)-9-일-메톡시카르보닐(Fmoc) 고형상 펩타이드 합성방법에 있어서, ⅰ) Fmoc 아미노산은 0.5 M N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 용액으로 보관하고, ⅱ) 커플링 시약은 NMP(0.5 M 용액) 내에 예비-용해시키고, ⅲ) Fmoc 탈보호는 NMP 내 20% 피페리딘으로 수행하고, ⅳ) 아미노산 측쇄의 수지로부터 펩타이드 분리는 TFA/H2O(95:5=v/v)로 수행하고, ⅴ) 펩타이드 생성물은 디에틸에테르로 침전시켜 원심분리에 의해 수집 동결건조시키는 단계로 구성된 제 1항의 P2X3 수용체 길항제로서의 스피노르핀계 유도체의 제조방법
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