KR100879419B1 - 염소화 에틸렌의 분해방법 - Google Patents
염소화 에틸렌의 분해방법Info
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Abstract
본 발명은, 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출에 이용할 수 있는 핵산으로서, 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 신규하고 또한 유용한 핵산, 이 핵산을 사용한 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법 및 염소화 에틸렌 또는 에탄의 분해방법을 제안하는 것을 과제로 한 것이며, 그 해결수단으로서, 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 18∼25 뉴클레오티드로 이루어진 핵산으로서, 서열번호 1∼15의 어느 하나의 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적(相補的)인 염기서열을 함유하는 핵산을 프라이머, 시료 중의 핵산을 주형(鑄型)으로 해서 PCR을 행하여, 합성된 DNA단편을 검출하는 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법, 및 이 방법에 의해 검출된 염소화 에틸렌 분해 세균을 오염토양이나 지하수에 도입해서 염소화 에틸렌 또는 에탄을 분해하는 분해방법을 특징으로 한 것이다.
Description
본 발명은 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 핵산, 이 핵산으로 이루어진 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지(標識)프로브, 이들 핵산 또는 표지 프로브를 사용한 염소화 에틸렌 분해세균의 검출방법, 및 염소화 에틸렌 또는 에탄의 분해방법에 관한 것이다.
염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수 등을 정화하는 방법으로서, 오염 토양 속에 원래 존재하는 염소화 에틸렌 분해 세균을 이용해서, 염소화 에틸렌을 혐기적으로 탈염소화하는 방법이 있다. 또 이들 세균을 오염 토양 또는 지하수에 첨가하는 방법도 알려져 있다. 염소화 에틸렌 분해 세균은, 이 세균이 보유하는 염소화 에틸렌 분해효소에 의해, 염소화 에틸렌뿐만 아니라 염소화 에탄도 분해할 수 있는 것도 알려져 있다. 그러나, 이와 같은 방법에 의해서는, 처리효과는 항상 양호하고, 즉 완전히 탈염소화가 행하여지는 보증은 없다고 하는 문제점이 있다.
이 때문에, 염소화 에틸렌 분해 세균을 이용해서 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수 등을 정화하는 경우, 탈염소화가 행하여지는지의 여부를 미리 판정하는 방법이 요망되고 있다.
본 발명의 과제는, 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출에 이용할 수 있는 핵산으로서, 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 신규하고 또한 유용한 핵산, 이 핵산으로 이루어진 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브, 이들 핵산 또는 표지 프로브를 사용한 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법, 및 염소화 에틸렌 또는 에탄의 분해방법을 제안하는 것이다.
본 발명은 다음의 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 핵산, 이 핵산으로 이루어진 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브, 이들 핵산 또는 표지 프로브를 사용한 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법, 및 염소화 에틸렌 또는 에탄의 분해방법이다.
(1) 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 18∼25 뉴클레오티드로 이루어진 핵산으로서, 서열번호 1∼15의 어느 하나의 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 핵산.
(2) 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 10∼50 뉴클레오티드로 이루어진 핵산으로서, 적어도 10개의 연속하는 염기서열이, 서열번호 1∼15의 어느 하나의 염기서열과 동일한 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열인 핵산.
(3) 염소화 에틸렌 분해 세균검출용인 상기 (1) 또는 (2) 기재의 핵산.
(4) 상기 (1)∼(3)의 어느 하나에 기재된 핵산을 방사성 원소, 효소, 형광물질, 항원, 항체 또는 화학물질에 의해 표지한 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브.
(5) 상기 (1)∼(3)의 어느 하나에 기재된 핵산을 프라이머, 시료속의 핵산을 주형으로 해서 PCR(polymerase chain reaction)을 행하여, 합성된 DNA단편을 검출하는 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법.
(6) 상기 (4) 기재의 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브와, 시료 중의 핵산(즉, 시료에 함유되는 핵산을 그대로 또는 시료로부터 핵산을 농축하도록 조제한 핵산)을 접촉시켜서 RNA 또는 DNA하이브리다이제이션을 행한 후, 표지를 지표로 해서 검출하는 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법.
(7) 지하수 또는 토양을 시료로 해서 상기 (5) 또는 (6) 기재의 에틸렌분해세균의 검출방법을 실시하고,
염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 지하수, 토양 또는 그들을 접종한 배양액을, 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수에 도입하는 염소화 에틸렌 또는 에탄의 분해방법.
염소화 에틸렌 분해 세균을 사용해서 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수 등을 정화하는 방법에 있어서 처리효과가 항상 양호하지 않은 이유를 검토한 결과, 탈염소화를 행하는 염소화 에틸렌 분해 세균이 처리현장에 생식(生息)하고 있는 경우에는 처리효과가 양호하고, 생식하고 있지 않는 경우에는 처리효과를 기대할 수 없는 것이 본 발명자들의 연구에 의해 명백해졌다. 따라서, 대상현장의 토양이나 지하수를 조사해서, 염소화 에틸렌 분해 세균이 생식하고 있는지의 여부를 확인하면, 처리를 양호하게 행할 수 있는지의 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 핵산을 이용함으로써 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출이 가능하고, 상기한 바와 같은 판정이 가능해진다
본 발명의 핵산은, 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 18∼25 뉴클레오티드로 이루어진 핵산으로서, 서열목록의 서열번호 1∼15의 어느 하나의 염기서열, 이들 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 핵산이다.
또 본 발명의 핵산은, 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하는 10∼50, 바람직하게는 15∼35 뉴클레오티드로 이루어진 핵산으로서, 적어도 10개의 연속하는 염기서열이 서열번호 1∼15의 어느 하나의 염기서열과 동일한 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열인 핵산이다. 예를 들면, 서열번호 1의 염기서열의 임의의 위치로부터 시작되는 연속한 10개이상의 염기서열과 동일한 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 핵산이고, 이 서열번호 1의 염기서열과 동일한 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열의 상류 및/또는 하류에는 염기가 결합되어 있어도 된다.
본 발명의 핵산, 즉 서열번호 1∼15의 염기서열, 이들 염기서열과 상보적인 염기서열, 및 적어도 10개의 연속하는 염기서열이 서열번호 1∼15의 어느 하나의 염기서열과 동일한 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열은, 공지의 방법에 의해 화학적으로 용이하게 합성할 수 있다.
본 발명의 핵산은 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rDNA의 염기서열을 결정한 후, 그들에 특이적인 부분을 이용해서 디자인하고 있으므로, 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈한다.
상기 염소화 에틸렌 분해 세균의 구체적인 것으로서는, 데할로코코이데스(Dehalococcoides)속의 세균 등을 들 수 있다.
염소화 에틸렌 분해 세균에 의해 분해(탈염소화)되는 염소화 에틸렌의 구체적인 것으로서는, 테트라클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌(TCE), cis-1,2-디클로로에틸렌, trans-1,2-디클로로에틸렌, 1,1-디클로로에틸렌, 비닐클로라이드 및 이들의 탈염소화 중간체 등을 들 수 있다. 또 염소화 에틸렌 분해 세균에 의해 분해(탈염소화)되는 염소화에탄의 구체적인 것으로서는, 1,2-디클로로에탄, 모노클로로에탄 등을 들 수 있다.
본 발명의 핵산은, 후술하는 바와 같이, 프라이머로서 사용해서 PCR을 행하거나, 또는 하이브리다이제이션을 행함으로써 염소화 에틸렌 분해 세균을 특이적으로 고정밀도로, 또한 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브는, 상기 본 발명의 핵산을 방사성 원소, 형광물질, 화학물질, 항원, 항체 또는 효소 등의 표지물질에 의해 표지한 프로브이다. 이와 같은 표지물질로서는 종래부터 사용되고 있는 표지물질을 사용할 수 있고, 구체적인 것으로서는 32P 등의 방사성 원소; FITC(Fluorescence isothiocyanate), 로다민 등의 형광물질; 디곡시게닌 등의 불완전 항원; 알칼리포스파타제, 퍼옥시다제 등의 효소; 비오틴 등의 생화학물질 등을 들 수 있다. 이들 표지물질은, 공지의 방법에 의해 핵산에 도입할 수 있다.
본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브는, 염소화 에틸렌 분해 세균의 유무를 검출하고자 하는 시료와 하이브리다이제이션을 실시하고, 그 후 표지물질을 지표로 해서 검출함으로써, 표지 프로브가 하이브리다이제이션한 염소화 에틸렌 분해 세균을 특이적으로 고정밀도로, 또한 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법은, 상기 본 발명의 핵산을 사용해서 염소화 에틸렌 분해 세균을 검출하는 방법이다. 즉, 상기 본 발명의 핵산을 프라이머로 하고, 염소화 에틸렌 분해 세균의 유무를 검출하고자 하는 시료로부터 조제한 핵산을 주형으로 해서 PCR을 행하여, 예상되는 크기의 DNA가 합성되면 시료속에 염소화 에틸렌 분해 세균이 존재했다고 판단할 수 있다.
PCR은 공지의 방법에 의해 행할 수 있고, 또 시판되고 있는 PCR용 키트를 사용해서 행할 수도 있다. PCR은 통상 상위 프라이머(Upper Primer) 및 하위 프라이머(Lower Primer)의 2종류의 프라이머를 사용하나, 어느 한쪽 또는 양쪽의 프라이머로서 본 발명의 핵산을 사용할 수 있다. 프라이머로서 종류가 다른 복수의 핵산을 사용해서 복수회 검출을 행함으로써, 검출정밀도를 보다 높게 할 수 있다.
또, 본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법은, 상기 본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브를 사용해서 염소화 에틸렌 분해 세균을 검출하는 방법이다. 즉, 상기 본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브를, 염소화 에틸렌 분해 세균의 유무를 검출하고자 하는 시료 중의 핵산에 접촉시켜서 RNA 또는 DNA하이브리다이제이션을 행한 후, 표지를 지표로 해서 염소화 에틸렌 분해 세균을 검출하는 방법이다. 하이브리다이제이션은 종래와 마찬가지의 방법에 의해 행할 수 있다.
하이브리다이제이션후의 검출은, 표지물질의 종류에 따라서 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 방사성 원소로 표지한 경우는 공지의 방법에 의해 방사능을 측정함으로써 검출할 수 있다. 또, 형광물질로 표지한 경우는 공지의 방법에 의해 광량을 측정함으로써 검출할 수 있다. 또한, 효소로 표지한 경우는 공지의 방법에 의해 효소활성을 측정함으로써 검출할 수 있다. 화학물질로 표지한 경우는, 그 화학물질을 분석함으로써 검출할 수 있다. 또, 항원 또는 항체로 표지한 경우는, 표지한 항원 또는 항체와 특이적으로 반응하는 항체 또는 항원을 사용해서 항원항체반응시키고, 반응생성물을 공지의 방법에 의해 측정함으로써 검출할 수 있다.
상기한 바와 같은 방법에 의해 염소화 에틸렌 분해 세균을 검출함으로써, 염소화 에틸렌 분해 세균을 이용해서 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수 등을 정화하는 경우에, 탈염소화가 양호하게 행하여지는지의 여부를 미리 판정할 수 있다. 또, 염소화 에틸렌 분해 세균을 검출할 수 없는 경우, 염소화 에틸렌 분해 세균을 첨가하는 등의 대책을 쓰는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 염소화 에틸렌 또는 에탄의 분해방법은, 지하수 또는 토양을 시료로 해서 상기 본 발명의 에틸렌분해세균의 검출방법을 실시하고, 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 지하수, 토양 또는 그들을 접종한 배양액(이하, 이들을 합쳐서 염소화 에틸렌 분해 세균검출물 등이라고 하는 경우가 있음)을, 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수(이하, 이들을 합쳐서 오염환경이라고 하는 경우가 있음)에 도입해서 염소화 에틸렌 또는 에탄을 분해하는 방법이다.
오염환경에 도입하는 염소화 에틸렌 분해 세균검출물 등은, 어느 장소에서 검출(채취)된 것이라도 된다. 예를 들면, 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염되어 있지 않은 장소에 있어서 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 지하수, 토양 또는 그들을 접종한 배양액을, 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수에 도입할 수도 있다. 또, 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 장소에 있어서 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 지하수, 토양 또는 그들을 접종한 배양액을, 동일구역내의 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 장소에 도입할 수도 있고, 동일구역이 아닌 다른 장소에 도입할 수도 있다.
염소화 에틸렌 분해 세균검출물을 오염환경에 도입하는 방법으로서는, 염소화 에틸렌 분해 세균검출물을 오염된 토양표면에 산포하는 방법, 주입관(주입웰)으로부터 토양 속에 주입하는 방법, 지하수원에 주입하는 방법 등을 들 수 있다. 도입 지점은 오염된 장소는 물론, 오염환경의 상류 등에 도입할 수 있다.
염소화 에틸렌 또는 에탄을 분해할 때, 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 지하수, 토양 또는 그들을 접종한 배양액을 오염환경에 도입하는 것만으로도 되는 경우도 있으나, 경우에 따라서는 물, 영양원 등을 또한 도입할 수도 있다. 또 1회의 도입에 의해 완전히 분해할 수 없는 경우에는, 도입을 반복할 수도 있다. 또한 염소화 에틸렌 분해 세균검출물에 응집제를 첨가해서 응집시키거나, 또는 담체에 담지시킨 후 도입할 수도 있다.
이와 같이 해서 염소화 에틸렌 또는 에탄을 분해함으로써, 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 오염환경을 정화할 수 있다.
(발명의 실시의 형태)
다음에 본 발명의 실시예에 대해서 설명한다.
실시예 1
에틸렌화(탈염소화)가 일어나고 있는 지점 A, B 및 C, 및 에틸렌화가 일어나고 있지 않는 지점 D, E 및 F의 합계 6개소로부터 지하수를 샘플링하고, 이 지하수 100㎖속에서 DNA를 하기와 같이 추출하였다.
(1) DNA의 추출
지하수 100㎖를 구멍직경 0.2㎛의 필터로 여과한 후, 이 필터를 2㎖용적의 튜브에 넣었다. 또 그 튜브에 지르코니아/실리카 비드(직경 0.1㎜) 1㎖ 및 추출 버퍼(100mM Tris-HCl[pH 8.0], 100mM 나트륨 EDTA[pH 8.0], 100mM 인산 나트륨[pH 8.0], 1.5M NaCl) 1㎖를 첨가하고, 세포 파쇄기인 비드 비터(Bead Beater)로 2분간 처리하였다. 다음에, 동결융해를 3회 반복한 후, 10㎕의 ProteinaseK(10㎎/㎖)를 첨가하고, 37℃에서 30분간 보온하였다. 이 액에, 250㎕의 10% SDS용액을 첨가하고, 65℃에서 2시간 보온한 후, 다시 상기의 비드 비터 처리를 행하였다. 그 후 8000×g으로 실온에서 10분간 원심분리하여, 상청액을 채취하였다. 상청액은 클로로포름에 의해 추출하고, 등량의 이소프로판올을 첨가한 후, 실온에서 60분간 정치, 8000×g으로 실온에서 20분간 원심분리하여, DNA를 침전시켰다. 침전물은 70% 에탄올로 세정하고, 건조시킨 후, 50㎕의 멸균증류수에 용해하였다.
이 추출DNA용액을 이용해서 하기와 같이 PCR반응을 행하여 염소화 에틸렌 분해 세균이 존재하는지의 여부를 조사하였다.
(2) PCR에 의한 16S rDNA의 증폭
상기 (1)에서 얻은 추출 DNA용액 1㎕를 템플레이트로 해서, 16S rDNA를 PCR에 의해 증폭하였다. PCR증폭의 반응액의 전용량은 100㎕로 하고, 2.5U의 Ex Taq DNA 폴리메라제(polymerase)(일본국, 타카라슈조 제품), 200μM의 dNTP를 사용하였다. 프라이머 쌍으로서는, 표 1에 표시한 바와 같이, KWI-De1∼KWI-De6의 어느 하나를 상위 프라이머로 하고, Bact1492(5'-ACGG C/T TACCTTGTTAGGACTT-3')를 하위 프라이머로 하는 6쌍의 프라이머쌍, 및 Bact0011(5'-GTTTGATCCTGGCTCAG-3')을 상위 프라이머로 하고, KWI-De7∼KWI-De15의 상보적인 염기서열의 어느 하나를 하위 프라이머로 하는 9쌍의 프라이머 쌍을 각각 20pmol 사용하였다. 그 외의 반응액 조성은 PCR 키트에 첨부된 매뉴얼에 따랐다. PCR반응은, 예열; 94℃, 2분간 계속, 제 1단계; 94℃, 20초, 제 2단계; 55℃, 30초, 제 3단계; 72℃, 2분을 30사이클 반복하고, Post extension; 72℃, 7분을 행하였다.
상기 PCR반응액 2㎕를 아가로스 전기영동에 걸고, 예상되는 크기의 DNA단편이 합성되면 염소화 에틸렌 분해 세균이 존재한다고 판단하였다. 결과를 표 1에 표시한다.
번호 | 상위 프라이머 | 하위 프라이머 | 합성DNA의길이(kb) | 지 점 | |||||
A | B | C | D | E | F | ||||
123456789101112131415 | KWI-De1KWI-De2KWI-De3KWI-De4KWI-De5KWI-De6Bact0011Bact0011Bact0011Bact0011Bact0011Bact0011Bact0011Bact0011Bact0011 | Bact1492Bact1492Bact1492Bact1492Bact1492Bact1492KWI-De7과 상보적인 염기서열KWI-De8과 상보적인 염기서열KWI-De9과 상보적인 염기서열KWI-De10과 상보적인 염기서열KWI-De11과 상보적인 염기서열KWI-De12과 상보적인 염기서열KWI-De13과 상보적인 염기서열KWI-De14과 상보적인 염기서열KWI-De15과 상보적인 염기서열 | 1.381.341.311.281.261.240.910.820.800.981.011.101.221.241.40 | ○○○○○○×○○○○○○○○ | ×○○○○○○○○×○○○○○ | ○○○×○○○○○○○○○×○ | ××××××××××××××× | ××××××××××××××× | ××××××××××××××× |
○: DNA의 합성이 관찰됨
×: DNA의 합성이 관찰되지 않음
표 1의 KWI-De1∼KWI-De15의 염기서열은 표 2에 표시하는 다음과 같다.
서열번호 | 염기서열(5'에서 3') | |
KWI-De1KWI-De2KWI-De3KWI-De4 *1KWI-De5KWI-De6KWI-De7KWI-De8KWI-De9KWI-De10KWI-De11KWI-De12KWI-De13KWI-De14KWI-De15 | 서열번호 1서열번호 2서열번호 3서열번호 4서열번호 5서열번호 6서열번호 7서열번호 8서열번호 9서열번호 10서열번호 11서열번호 12서열번호 13서열번호 14서열번호 15 | GTCTTAAGCAATTAAGATAGCGCGTAAGTAACCTACCTCTAAGTGCTTCGGGAAACTGAAGGTGGRCCGACATATGTTGGTTCACTAAAGCCGTAAGGCGCTTGGTGAGGGGCTTGCGTCCGGTGAGCGTAGGTGGTCTTTCCAGCAGGAGAAAACGGAATTGTATAGGGAGTATCGACCCTGTAGTAGTGAACTGAAAGGGGAACGACCTGTTAAGTCAGGAACTTGCACTGTTGCTAGTTAAATTTTCGTTGCAACAGTGCGAACTGGGCTAATCCCCAAAGCTGTCGTCGATGTGCCAACCGCAAGG |
*1 염기서열중 R은 A 또는 G이다.
표 1의 결과로부터, 에틸렌화가 관찰되고 있는 A, B, C지점에서는, 상기 PCR 및 전기영동에 의해 DNA합성이 관찰되지 않은 예외는 45회중 5회 관찰되었으나, 대부분 DNA합성이 관찰되었다. 한편, 에틸렌화가 전혀 관찰되지 않은 D, E, F지점에서는 DNA합성은 전혀 관찰되지 않았다. 이 결과로부터, 에틸렌화 반응이 일어나고 있는 지점에서는, 반드시 염소화 에틸렌 분해 세균이 존재하고, 이들의 모니터링이 가능한 것이 표시되었다.
실시예 2
(1) 라이트 사이클러(Light Cycler)에 의한 검출
실시예 1의 추출DNA용액에 대해서, 또 고정밀도의 PCR검출을 일본국, 롯슈·다이아구노스틱주식회사 제품의 라이트 사이클러를 사용해서 행하였다.
그때, 상위 프라이머로서는 KWI-De8을, 하위 프라이머로서는 KWI-De15에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 이용하였다. 또, 하이브리다이제이션프로브로서, KWI-De10의 3'말단을 FITC(Fluorescence isothiocyanate)로 표지한 것, 및 KWI-De11의 3'말단을 인산화하고, 5'말단을 FITC로 표지한 것을 사용하였다. PCR반응은 라이트 사이클러 DNA 마스터 하이브리다이제이션 프로브스 키트(Master Hybridization Probes kit)(상표)를 사용하고, 그 매뉴얼에 따라서 행하였다. 반응조건은 표 3∼표 6에 표시한 바와 같다.
사이클수=1 | ||||
세그먼트 | 표적온도(℃) | 유지시간(s) | 온도변화속도(℃/s) | 형광검출 |
1 | 95 | 120 | 20 | 없음 |
사이클수=50(세그먼트 1→2→3→다시 1로) | ||||
세그먼트 | 표적온도(℃) | 유지시간(s) | 온도변화속도(℃/s) | 형광검출 |
1 | 95 | 0 | 20 | 없음 |
2 | 54 | 15 | 20 | 1회 검출 |
3 | 72 | 30 | 2 | 없음 |
사이클수=1 | ||||
세그먼트 | 표적온도(℃) | 유지시간(s) | 온도변화속도(℃/s) | 형광검출 |
1 | 95 | 0 | 20 | 없음 |
2 | 44 | 10 | 20 | 없음 |
3 | 85 | 0 | 0.2 | 연속 검출 |
사이클수=1 | ||||
세그먼트 | 표적온도(℃) | 유지시간(s) | 온도변화속도(℃/s) | 형광검출 |
1 | 40 | 30 | 20 | 없음 |
결과는, 지점 A, B, C의 지하수에서는 목적의 DNA가 PCR합성되고, 염소화 에틸렌 분해 세균이 존재하는 것을 알 수 있었다. 그러나, 지점 D, E, F에서는 목적의 DNA는 합성되지 않고 염소화 에틸렌 분해 세균은 존재하지 않는다고 판단되었다. 이와 같이, 표 2에 표시된 프라이머는 하이브리다이제이션 프로브로서도 이용할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 3
cis-디클로로에틸렌(cis-DCE)에 의해 오염되어 있는 토양 100g과 지하수 50㎖를 150㎖ 용적의 바이알병에 넣고, 락트산을 100㎎/ℓ의 농도가 되도록 첨가한 후 부틸고무마개를 하고, 알루미캡으로 실링하였다. 바이알병은 동일한 것을 2개 준비하고, 한쪽의 바이알병에는 염소화 에틸렌 분해 세균유전자가 검출된 균현탁액을 식균하고, 염소화 에틸렌분해유전자가 최종농도로 105copies/㎖가 되게 하였다. 또 다른 쪽의 바이알병에는 어느 것도 식균하지 않고, 대조군으로 하였다. 이들 바이알병을 30℃에서 정치 배양하면서 정기적으로 샘플링을 행하여, 바이알병속의 에틸렌류의 농도를 측정하였다. 결과를 도 1 및 도 2에 표시한다.
염소화 에틸렌 분해 유전자가 검출된 균현탁액을 첨가한 경우(도 1), 염소화 에틸렌분해는 실험개시 약 20일에서 현저해지고, 염화비닐(VC)이 검출되기 시작했다. 그 후, VC도 분해되고, 약 135일에서 완전히 에틸렌으로 전환되었다. 한편 대조군의 경우(도 2), 시험기간 중 염화비닐 및 에틸렌은 전혀 검출되지 않았다.
상기 결과로부터, 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 액을 첨가하는 것은 염소화 에틸렌 분해반응을 촉진하는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
실시예 4
염소화 에틸렌에 의해 오염되어 있는 현장의 1m 떨어진 2점에 웰(A 및 B)을 설치하고, B지점으로부터 3ℓ/min으로 양수하여, 그 물을 A지점에 주입하였다. A지점에의 주입시에는, 락트산을 100㎎/L의 농도로 첨가하였다. 오염대수층(汚染帶水層)은 지면으로부터 3m 아래에 있고, 대수층 두께는 4m였다.
B지점에서 정기적으로 지하수를 샘플링하고, 에틸렌류의 농도를 측정하였다. 결과를 도 3에 표시한다. 가로축은 경과시간이고, 0점이 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 액(유전자 농도: 107copies/㎖) 50ℓ를 A지점으로부터 주입한 시점이다.
도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 주입 이전에는 디클로로에틸렌의 분해는 전혀 확인되지 않았지만, 주입후 20일째에 분해가 현저해지고, 약 170일 후에는 에틸렌화가 100%로 되었다.
상기 결과로부터, 염소화 에틸렌 오염 현장에 있어서도, 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 액을 첨가하는 것은 염소화 에틸렌 분해반응을 촉진하는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
본 발명의 핵산은 신규하고 또한 유용하다. 본 발명의 핵산은 특정한 염기서열을 가지며, 염소화 에틸렌 분해 세균의 16S rRNA 또는 rDNA에 우선적으로 하이브리다이즈하므로, 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출에 이용할 수 있다.
본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 핵산은 상기 핵산으로 이루어지므로, 이 핵산을 사용함으로써, 염소화 에틸렌 분해 세균을 특이적으로 고정밀도로, 또한 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균검출용 표지 프로브는 상기 핵산을 표지하고 있으므로, 이 표지를 지표로 해서 염소화 에틸렌 분해 세균을 특이적으로 고정밀도로, 또한 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 염소화 에틸렌 분해 세균의 검출방법은, 상기 핵산 또는 표지 프로브를 사용하고 있으므로, 염소화 에틸렌 분해 세균을 특이적으로 고정밀도로, 또한 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 염소화 에틸렌 또는 에탄의 분해방법은, 상기 검출방법에 의해 염소화 에틸렌 분해 세균이 검출된 지하수, 토양 또는 그들을 접종한 배양액을, 염소화 에틸렌 또는 에탄에 의해 오염된 토양 또는 지하수에 도입해서 염소화 에틸렌 또는 에탄을 분해하고 있으므로, 염소화 에틸렌 또는 에탄을 용이하게 효율좋게 분해해서 환경을 정화할 수 있다.
도 1은 실시예 3의 결과를 표시한 그래프.
도 2는 실시예 3의 컨트롤의 결과를 표시한 그래프.
도 3은 실시예 4의 결과를 표시한 그래프.
<110> KURITA WATER INDUSTRIES LTD.
<120> Process to biodegrade for chlorinated ethylene or ethane
<150> JP 2000-227580
<151> 2000-07-24
<150> JP 2001-66001
<151> 2001-03-09
<160> 17
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
gtcttaagca attaagatag 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
cgcgtaagta acctacctct aagt 24
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
gcttcgggaa actgaagg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
tggrccgaca tatgttggtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
cactaaagcc gtaaggcgct 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
tggtgagggg cttgcgtccg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
gtgagcgtag gtggtctttc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> Primer
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cagcaggaga aaacggaatt 20
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<213> Artificial Sequence
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gtatagggag tatcgaccc 19
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
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tgtagtagtg aactgaaagg ggaac 25
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<212> DNA
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<220>
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gacctgttaa gtcaggaact tgcac 25
<210> 12
<211> 19
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<220>
<223> Primer
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<220>
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gttgcaacag tgcgaactgg 20
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<220>
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gctaatcccc aaagctgtc 19
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<212> DNA
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<220>
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gtcgatgtgc caaccgcaag g 21
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<400> 16
acggytacct tgttaggact t 21
<210> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
gtttgatcct ggctcag 17
Claims (7)
- 지하수 또는 토양을 시료로 하고, 서열번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 내지 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 핵산으로부터 선택된 핵산을 프라이머로 하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 해서 PCR(polymerase chain reaction)을 행하여 합성된 DNA 단편으로부터, 상기 서열번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 내지 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 염기서열을 가진 핵산이 하이브리다이즈되는 16S rRNA 또는 rDNA를 가지고, 또한 염소화 에틸렌(염화 비닐을 제외함) 및 염화 비닐을 에틸렌으로까지 분해하는 염소화 에틸렌 분해세균이 시료 중에 존재하는지의 여부를 검출하고,상기 염소화 에틸렌 분해 세균의 존재가 검출된 지하수, 토양 또는 이들을 접종한 배양액을 염소화 에틸렌으로 오염된 토양 또는 지하수에 도입해서 염소화 에틸렌을 분해하는 것을 특징으로 하는 염소화 에틸렌의 분해방법.
- 지하수 또는 토양을 시료로 하고, 서열번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 내지 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 핵산으로부터 선택된 핵산을 프라이머로 하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 해서 PCR을 행하여 합성된 DNA 단편으로부터, 상기 서열번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 내지 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 가진 핵산이 하이브리다이즈되는 16S rRNA 또는 rDNA를 가지고, 또한 염소화 에틸렌(염화 비닐을 제외함) 및 염화 비닐을 에틸렌으로까지 분해하는 염소화 에틸렌 분해세균이 시료 중에 존재하는지의 여부를 검출하고,상기 염소화 에틸렌 분해 세균의 존재가 검출된 지하수, 토양 또는 이들을 접종한 배양액, 및 영양원을 염소화 에틸렌으로 오염된 토양 또는 지하수에 도입해서 염소화 에틸렌을 분해하는 것을 특징으로 하는 염소화 에틸렌의 분해방법.
- 지하수 또는 토양을 시료로 하고, 서열번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 내지 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 핵산으로부터 선택된 핵산을 프라이머로 하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 해서 PCR을 행하여 합성된 DNA 단편으로부터, 상기 서열번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 내지 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 가진 핵산이 하이브리다이즈되는 16S rRNA 또는 rDNA를 가지고, 또한 염소화 에틸렌(염화 비닐을 제외함) 및 염화 비닐을 에틸렌으로까지 분해하는 염소화 에틸렌 분해세균이 시료 중에 존재하는지의 여부를 검출하고,상기 염소화 에틸렌 분해 세균의 존재가 검출된 토양 또는 지하수에 영양원을 도입해서 염소화 에틸렌을 분해하는 것을 특징으로 하는 염소화 에틸렌의 분해방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 내지 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 염기서열 또는 이들 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 핵산을 방사성 원소, 효소, 형광물질, 항원, 항체 또는 화학물질로 표지화된 표지 프로브와, 시료 중의 핵산을 접촉시켜서 RNA 또는 DNA 하이브리다이제이션을 행한 후, 표지를 지표로 해서 검출하는 것을 특징으로 하는 염소화 에틸렌의 분해 방법.
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