KR100863068B1

KR100863068B1 - 바이러스 전달효과를 갖는 프로테오리포솜 및 이를 이용한유전자 전달체

Info

Publication number: KR100863068B1
Application number: KR1020070067708A
Authority: KR
Inventors: 조경현; 윤채옥; 박순현; 김재룡
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2007-07-05
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2008-10-13

Abstract

본 발명은 바이러스 전달효과를 갖는 프로테오리포솜 및 이를 이용한 유전자 전달체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 프로아포리포단백질 A-Ⅰ(proapolipoprotein A-I) 또는 이의 변이체를 포함하는 바이러스 전달용 프로테오리포솜과, 아데노바이러스를 프로테오리포솜(proteoliposome)과 상호작용을 통해, 용해도를 높이고, 바이러스의 안정성과 전달능을 향상시킴으로써 적은 양의 투여로도 높은 효율의 유전자 전달을 가능케 하여, 아데노바이러스 치료의 가장 큰 걸림돌인 면역 반응 유도와 독성 유발을 극복하고, 바이러스의 안정성이 개선되어 유전자 형질도입율이 낮은 종양세포 및 아데노바이러스 처리에 매우 민감한 독성을 보이는 세포의 치료에도 활용 가능한 유전자 전달체에 관한 것이다.

바이러스 전달, 프로테오리포솜, 유전자 전달체, 프로아포리포단백질 A-Ⅰ, 변이체

Description

바이러스 전달효과를 갖는 프로테오리포솜 및 이를 이용한 유전자 전달체{Enhanced virus or gene delivery using proteoliposome for therapeutics}

본 발명은 바이러스 전달효과를 갖는 프로테오리포솜에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 프로아포리포단백질 A-Ⅰ 또는 이의 변이체를 포함하는 바이러스 전달용 프로테오리포솜(proteoliposome)과, 세포의 치료에 활용 가능한 유전자 전달체에 관한 것이다.

종양살상효과를 가진 아데노바이러스의 개발 및 재조합 아데노바이러스를 이용한 단백질의 발현기술은 선행 특허와 논문이 많으나, 아데노바이러스를 프로테오리포솜 내에 포집하여 유전자 전달 혹은 종양세포 살상능을 향상한 선행 논문 혹은 특허는 아직 보고되지 않았다. 2006년에 아데노바이러스의 벡터를 키토산-바일 솔트(chitosan-bile salt) 극미립자(microparticle)에 포획(encapsulation)하였다는 보고 [Encapsulation of adenoviral vectors into chitosan-bile salt microparticles for mucosal vaccination. J. Biotechnol. 2006;126:152-162]는 있었지만, 이는 DNA 전달 벡터를 대상으로 한 것이므로 본 발명에서 제안하는 프로테 오리포솜-바이러스의 포집과는 분명한 차이가 있다.

현재까지의 리포솜 관련 기술은 저분자 물질을 포함하는 화장품, 의약품의 용도로 개발되었다. 특허 등록 제 501399호에 따르면 생약 추출물을 안정화한 나노리포솜을 포함하는 피부노화 방지용 화장료 조성물에 관해 개시하고 있거나 혹은 막입자 내에 저분자 화합물을 위치시켜 전달능을 향상시키는 방법으로 항암제인 탁솔(taxol)[Anticancer Research 2002; 22:2045-2050] 혹은 항진균제인 암포테리신 비(amphotericin B)를 고밀도지단백질 내에 포집시키는 방법[J. Lipid Res. 2006;47:260-267]으로 문헌상 발표되었으며, 본 발명에서 제안하고 있는 방법인 바이러스 입자를 프로테오리포솜 막간에 위치시키는 방법은 선행 특허나 논문에서 개시된 바 없다.

바이러스를 이용한 종양 살상 혹은 유전자 전달 치료제 개발의 최대 어려움은 유전자 치료물질들(plasmid DNA, 바이러스, siRNA 등)을 적절히 포장하여 목표세포나 조직에까지 선택적으로 전달하기가 어렵다는 점과 세포 내로의 흡수가 용이하지 않다는데 있다. 이를 극복하기 위해 전달체 개발에 많은 연구가 있어 왔으나, 목표 세포로의 정확한 전달능과 흡수 개선을 위한 새로운 전달체의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 기존의 치료용 바이러스 전달 혹은 유전자 기술이 바이 러스 입자 상태 그대로 정맥 혹은 피하 주사하여 전달효율이 낮을 뿐만 아니라, 과다 투여에 의한 독성 및 표적 장기 이외의 비특이적 전달에 따른 안정성에 문제가 있어 이를 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 프로아포리포단백질 A-I(Wildtype-proapoA-I) 혹은 그 변이체 단백질(V156K-proapoA-I)로 프로테오리포솜을 형성시켜 아데노바이러스 용해도와 안정성을 극대화시킴으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래의 유전자 치료제 전달 방법을 개선하여, 전달효율이 높은 인지질 프로테오리포솜 막 내에 바이러스를 포집하여 전달함으로써 치료효과를 최대화하는데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, wildtype-프로아포리포단백질 A-I(WT-proapoA-I) 혹은 그 변이체 단백질(V156K-proapoA-I)로 프로테오리포솜을 형성시켜 아데노바이러스 용해도와 안정성을 극대화시켰다.

즉, 본 발명은 인지질, 콜레스테롤과 단백질을 포함하여 이루어진 프로테오리포솜에 있어서, 상기 단백질이 프로아포리포단백질 A-Ⅰ[서열번호 1] 또는 이의 변이체인 프로테오리포솜(proteoliposome)을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프로테오리포솜에 바이러스가 포함된 유전자 전달체를 또 다른 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 프로테오리포솜은 적은 양의 투여로도 높은 효율의 유전자 전달을 가능케 하여, 아데노바이러스 치료의 가장 큰 걸림돌인 면역 반응 유도와 독성 유발을 극복하고, 바이러스의 안정성이 개선되어 유전자 형질도입율이 낮은 종양세포 및 아데노바이러스 처리에 매우 민감한 독성을 보이는 세포의 치료에 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 프로아포리포단백질 A-Ⅰ 또는 이의 변이체를 포함하는 바이러스 전달용 프로테오리포솜(proteoliposome)과, 아데노바이러스를 프로테오리포솜에 포집시켜 바이러스의 안정성과 전달능을 향상시킴으로써 적은 양의 투여로도 높은 효율의 유전자 전달을 가능케 하여, 아데노바이러스 치료의 가장 큰 걸림돌인 면역 반응 유도와 독성 유발을 극복하고, 바이러스의 안정성이 개선되어 유전자 형질도입율이 낮은 종양세포 및 아데노바이러스 처리에 매우 민감한 독성을 보이는 세포의 치료에 활용 가능한 유전자 전달체에 관한 것이다.

본 발명은 기존의 프로테오리포솜과는 달리 단백질로 프로아포리포단백질(proapolipoprotein) A-I[서열번호 1] 또는 이의 변이체를 사용함으로써 바이러스 또는 유전자의 안정성과 전달능을 월등히 향상시킨 점에서 그 의미가 있다. 상기 변이체는 프로아포리포단백질에서 아포리포단백질 A-Ⅰ의 156번 위치에 발린이 라이신으로 치환된 변이체[서열번호 6]가 바람직하다.

또한, 본 발명에서 프로테오리포솜 형성을 위한 인지질로는 레세틴( lecithin), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC) 중에서 선택된 1종 이상이 바람직하며, 본 발명에 따른 프로테오리포솜은 인지질, 콜레스테롤 및 단백질이, 단백질 1 mol당 인지질은 50 ~ 4000 mol, 콜레스테롤은 1 ~ 900 mol(인지질: 콜레스테롤: 단백질=4000 : 900 : 1 ~ 50 : 1 : 1의 분자비), 더욱 바람직하기로는 단백질 1 mol당 인지질은 100 ~ 2000 mol, 콜레스테롤은 5 ~ 100 mol로 혼합하여 형성시킨다. 만일 인지질이 상기 범위를 벗어나면 프로테오리포솜의 크기와 구조 형성이 약해지는 문제가 있고, 콜레스테롤이 상기 범위를 벗어나면 바이러스와의 친화도가 약해지는 문제가 있다.

이러한 조성으로 형성된 프로테오리포솜 입자들 사이에 바이러스 입자를 포집시킨다. 이때, 바이러스는 프로테오리포솜 입자 1 mL(1 mg of proapoA-I 함유)를 기준으로 1.0 x 10⁹ ~ 3.0 x 10¹¹ 바이러스 입자수(농도)를 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명에 따른 WT 혹은 V156K-proapoA-I를 포함하는 프로테오리포솜이 우수한 리포솜 구성 능력과 안정성 및 바이러스 전달 능력을 가지고 있다. 바람직하게는 V156K-proapoA-I를 포함하는 리포솜이 안정성이 가장 우수하며, 우수한 유전자 전달과 발현 능력을 가지고 있다.

따라서, 본 발명에서 개발된 바이러스 전달용 프로테오리포솜은 적은 양의 투여로도 높은 효율의 유전자 전달을 가능케 하여, 아데노바이러스 치료의 가장 큰 걸림돌인 면역 반응 유도와 독성 유발을 극복하고, 바이러스의 안정성이 개선되어 유전자 형질도입율이 낮은 종양세포 및 아데노바이러스 처리에 매우 민감한 독성을 보이는 세포의 치료에 활용될 수 있다.

이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며 아데노바이러스 이외에도 다양한 바이러스에 적용 가능하다.

실시예 1: proapo A-I의 유전자 서열

WT(Wildtype) apo A-I의 아미노 말단에 15개의 아미노산(Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln-서열을 포함)을 더 가지는 WT proapo A-I 유전자(서열번호 1)를 pET30[Novagen 사] 발현벡터에 클로닝하여 사람 apo A-I의 발현벡터(pET30a-proapoA-I)를 구축하였다[Cho and Jonas, 2000, J. Biol. Chem. 275: 26821-26827]. 상기 벡터로부터 생산되는 proapo A-I는 아미노 말단에 15개의 아미노산을 더 가지므로 전체 단백질 크기는 SDS-PAGE 상에서 대략 29 kDa에 해당한다.

실시예 2: proapo A-I 주형 DNA 클로닝

본 발명에서 제시하는 WT proapoA-I cDNA는 (His)6-tag을 아미노 말단에 가지며 벡터 pET30(Novagen, WI)에 클로닝되어 있다. 이때 벡터의 크기가 6.2 kb 정도로서, 변이체를 코딩하는 cDNA 생산을 위한 PCR에 주형으로 사용하기에 부적절하므로, Kpn I와 Hind III 제한효소를 처리하여 proapo A-I cDNA(795 bp) 삽입 물만을 잘라내어, pBlue ScriptII SK(+)[Stratagene 사]에 삽입하여 PCR에 사용할 주형 DNA를 클로닝하였다. 이렇게 제작된 벡터 pBlueScriptII SK-proapo A-I가 대장균 DH5@에 도입되어 형질전환된 대장균 DH5@/pBlueScriptII SK-proapo A-I를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2004년 6월 7일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC 10651BP를 부여받았다.

본 발명자들이 특허 등록 제560102호에도 상세히 설명되어 있듯이, 형질전환된 대장균 DH5@/pBlue ScriptII SK-proapo A-I[KCTC 10651BP]로부터 WT proapo A-I를 얻었다.

실시예 3 : proapo A-I 변이체 생산

본 발명자들이 특허 등록 제560102호에도 상세히 설명되어 있듯이, 형질전환된 대장균 BL21/pET30-V156K-proapo A-I[KCTC 10652BP]로부터 proapo A-I 변이체를 얻었다. 단백질의 발현 및 순수 분리도 본 발명자들의 선행논문과 선행 특허 (등록 제560102호)에 따라 실시하였고, 본 발명에 사용된 아포리포단백질들의 순도는 도1 의 전기영동(SDS-PAGE)에서와 같이 95% 이상을 보여주었다.

실시예 4: 바이러스의 분리와 정제

GFP(Green fluorescent protein) 발현 아데노바이러스는 293 세포주에서 증식시킨 뒤 한계 희석법(limiting dilution) 또는 플라크 분석 (plaque assay)을 실시하여 바이러스의 역가를 결정하고[Hitt, M. et al., Construction and propagation of human adenovirus vectors. Cell biology: a laboratory handbook. New York: Academic Press Inc, 479-490(1994)], 세슘클로라이드(CsCl) 농도구배로 농축하여 분리하였다.

실시예 5: 입자 내에 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜 합성

디미리스토일포스파티딜 콜린(dimyristoyl phosphatidyl choline, DMPC) 인지질을 단일 이중막 리포솜으로 합성하기 위해 콜레스테롤과 아포리포지단백질을 다음 표 1의 분자비로 혼합하여, Probe형 쏘니케이터(Sonics, model vcx130, Newtown, CT, USA)로 초음파 분해(sonication)를 10분 간격으로 3회 실시하여 단일 이중막(single unilamellar vesicle)으로 만들고, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고, 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시켜 프로테오리포솜의 합성을 유도하고, 반응 후, 아데노바이러스를 첨가하여 12 시간 동안 반응시키면서 프로테오리포솜과 아데노바이러스 입자가 상호작용하여 버퍼 등장액 내에서 침전을 일으키지 않고 용해되도록 하였다.

실시예 6: 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜 입자의 크기-전기영동

바이러스를 포함하는 프로테오리포솜의 형성이 끝난 후, 반응의 성공 여부와 리포솜 입자의 크기를 알기 위해 native 상태에서 전기영동(Pharmacia Phast Electrophoresis system, Uppsala, Sweden)을 실시하였다. 전기영동 후 밴드를 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 형성된 프로테오리포솜 대부분 170 Å의 크기를 가지는 것으로 나타났으나, V156K-프로테오리포솜은 running gel의 꼭대기 위치에서 밴드가 관찰되어 이보다 훨씬 큰 밴드가 형성되며, 직경 122 Å 이하의 밴드를 보이지 않았다. 그러나, Wildtype-apoA-I를 포함하는 프로테오리포솜은 122 Å 이하의 밴드도 보여, 입자크기의 구성이 V156K-프로테오리포솜의 경우 보다 더욱 다양(heterogeneous)함을 보여주었다[도 2]. 따라서, V156K-프로테오리포솜의 주된 크기는 직경 17 nm 정도이고, 이보다 10배 이상의 직경을 가진 입자도 존재한다.

실시예 7: 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜의 아포리포단백질 분자 수 측정

WT proapoA-I는 분자간 상호작용과 자가 결합(self-association) 경향이 우수하여 크로스링커(crosslinker)에 의하여 쉽게 교차 결합된다. Staros의 방법 (Biochemistry. 1982;21:3950-3955)에 따라, 각 프로테오리포솜에 11.4 Å의 길이를 갖는 크로스링커인 BS3(Bis-sulfosuccinimidyl suberate)와 반응시키고, 생성물을 8 ~ 25% SDS-PAGGE(Pharmacia Phast System)로 전개하여 이량체(dimer), 삼량체(trimer), 사량체(tetramer)의 자가 결합능을 비교하였다. 도 3과 같이, WT과 V156K 프로테오리포솜 모두 3량체와 4량체가 대부분 발견되었고, 이량체는 발견되지 않았다. 이 결과는 프로테오리포솜 입자 크기에 따라 입자 내에 아포리포단백질이 3분자, 혹은 4분자 존재함을 의미한다.

실시예 8: 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜의 혼탁도 감소 특성 규명

인지질 이중막과 단백질, 바이러스가 상호 작용하는 반응 초기의 2시간 동안 인지질과 콜레스테롤이 단백질과 상호작용하면서 프로테오리포솜이 형성되며, 이 과정에서 바이러스가 프로테오리포솜과 상호작용하면서 포집되는데, 인지질이중막의 형성과 바이러스의 포집이 원활히 일어나는지를 325 nm 빛에 대한 혼탁도의 감소로 관찰하였다. 선행 논문[Pownall, H. J., J. B. Massey, S. K. Kusserow, and A. M. Gotto, Jr. 1978.Kinetics of lipid-protein interactions: interaction of apolipoprotein A-I from human plasma high density lipoproteins with phosphatidylcholines. Biochemistry. 17: 1183-1188]에 의해 보고된 바와 같이, 프로테오리포솜이 형성되지 않으면, 혼탁도가 시간 경과에 따라 증가할 것이다. 따라서, 바이러스가 프로테오리포솜 내로 포집되지 않는다면 혼탁도가 감소하지 않고 시간 경과에 따라 증가할 것이다. 도 4에서 보는바와 같이, 바이러스와 DMPC만을 혼합하여 리포소옴을 만든 경우에는 흡광도(A325)가 전혀 감소하지 않고 오히려 증가하는 경향을 보인다. 이는 인지질과 바이러스만으로는 프로테오리포솜이 형성되지 않음을 보여주는 것이다. 그러나, 바이러스와 인지질, WT-proapoA-I 혹은 V156K-proapoA-I를 가지는 DMPC-프로테오리포솜은 초기 값에 비해 현저한 흡광도(A325)의 감소를 보여주어 프로테오리포솜의 형성과 바이러스의 포집이 원활히 진행되었음을 보여주었고, 특히 V156K-리포솜이 WT-리포솜에 비해 약 5% 더 낮은 흡광도를 보여 리포솜의 형성능력이 더욱 우수함을 시사하였다[도 4].

실시예 9: 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜의 반응 후 경과 자외선 흡수 특성 규명

프로테오리포솜이 형성되고 난 후 48 시간까지의 자외선 흡광 경향을 분석 한 결과, 48시간까지 단백질만의 흡광정도(280 nm)는 초기 값에 비해 변화를 보이지 않았으나. 지질과 단백질, 바이러스의 상호작용을 시사하는 325 nm에서의 흡광도는 반응 후 12시간까지는 유사하다가, 12시간 이후에는 두 리포솜 간에 차이를 보여, 다음 표 2와 같이 24시간 경과 후에는 53%, 48시간 이후에는 50%의 차이를 보여주었다. 이 결과는 리포솜 형성 12시간 이후의 안정성이 V156K를 포함하는 경우 WT에 비해 개선됨을 보여준다.

실시예 10: 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜의 Trp 형광활성 특성 규명

아포리포단백질 A-I는 4개의 Trp 잔기를 가지며, 그 중에서 108번 Trp이 형광 활성에 중요함은 이미 알려져 있다[Davidson, W. S., T. Hazlett, W. W. Mantulin, and A. Jonas. 1996. The role of apolipoprotein AI domains in lipid binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 13605-13610]. 지질이 없는 상태(lipid-free state)에서는 WT 아포리포단백질 A-I는 349 nm의 최대 형광활성(Wavelength maximum fluorescence)을 보이나, 지질과 결합한 상태(lipid-bound state)에서는 346 nm의 WMF를 보여, 아포리포단백질이 지질이 없는 상태에서 지질과 결합한 상태가 되면서 2 ~ 3 nm blue shift 된다는 기존의 결과와 잘 일치하였다.

V156K는 프로테오리포솜 상태에서 344 nm의 WMF를 보여 더욱 강한(대략 2 nm) blue shift 현상을 보여주었다. 이는 지질과 결합한 상태에서 V156K-proapoA-I가 더욱 우수한 프로테오리포솜 형성 능력을 보여줌을 시사하며, 실시예 6의 도 1의 인지질 결합능력의 향상 결과와 잘 일치한다.

실시예 11: 단백질 변성 유도제 첨가에 따른 아포리포단백질의 변성저항성 비교

실시예 10 에서 얻은 최대형광활성값은 변성이 일어나지 않은 native 상태의 결과이므로, 단백질 변성 유도 시약인 구아니딘 하이드로클로라이드(Gnd-HCL)을 최종농도가 0.5 M부터 6 M까지 되도록 첨가하여 72시간 동안 25 ℃에서 incubation 하고, 실시예 8에서 기술한 방법으로 각 프로테오리포솜의 최대형광활성을 측정하였다. 그 결과는 도 5에 표시한 바와 같이, 첨가되는 Gnd-HCL의 농도가 증가 될수록 단백질의 변성이 심해져 108번 Trp이 수용상으로 노출되어 WMF가 증가하게 되는데, 6 M Gnd-HCL이 첨가되었을 때 356 nm의 WMF를 보여주었다. 이는 Gnd-HCL이 첨가되지 않은 상태 보다 11 ~ 12 nm 증가된 값이다. 특이할만한 점은 V156K-프로테오리포솜은 최종 농도 0.5, 1.0, 2.0 M의 Gnd-HCL이 첨가될 때까지 WT-프로테오리포솜 보다 1 ~ 2 nm 정도의 낮은 WMF 보여 주었다. 이결과는 V156K의 108번 Trp이 WT의 경우보다 더욱 소수성 내부에 존재하며 단백질 변성의 진행과정에 대해 조금 더 저항성이 있음을 시사한다. 그러나, Gnd-HCL이 3.0 M 이상 첨가되었을 경우에는 두 프로테오리포솜 모두 유사한 WMF를 보여 주어, 3.0 M 이상에서는 단백질의 변성 진행이 유사함을 알 수 있었다[도 5].

실시예 12: 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜 입자의 전자현미경 관찰

형성된 프로테오리포솜과 바이러스 입자가 서로 상호 작용하는지를 알아보기 위해 전자현미경으로 관찰하였다. 프로테오리포솜 시료(단백질 농도= 1 mg/ml) 를 1% 인텅스텐산 나트륨(sodium phosphotungstate)으로 음성 염색(negative staining)하고, 5 ㎕의 시료를 Formvar carbon coated copper grid(300 mesh) 위에 떨어뜨리고, 건조하였고, 리포솜과 바이러스의 모양을 투과전자현미경(transmitted electron microscopy, Hitachi H-7600)을 사용하여 40,000배의 배율로 관찰하였다. 도 6과 도 7 에서 보는 바와 같이, 바이러스 입자가 프로테오리포솜들과 상호작용으로 디스크 형태의 막과 막 사이에 잘 위치하여 있어서, 수용액 상에 노출되지 않아 용해도가 증가함을 보여주고 있다. 이는 바이러스가 프로테오리포솜에 의해 수용액 내에서 안정적으로 상호작용하고 있음을 보여주는 증거가 된다.

실시예 13: 바이러스를 포함하는 프로테오리포솜의 유전자 전달 발현 효과 비교

실시예 5와 같은 방법으로 형성된 프로테오리포솜-바이러스를 24 웰 배양판(culture plate)에 건강하게 배양한 간세포주(Hepatocarcinoma Hep3B, MEM 배지, 5% FBS) 혹은 뇌신경세포주(U343 cell, DMEM 배지, 5% FBS)에 세포당 1000 virus particle을 각 세포군(5 x 10⁴ cell/1 mL medium) 처리하여 37 ℃에서 48시간동안 배양하고, FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석으로 GFP의 발현량을 측정하고, 형광현미경 관찰(Ex=488 nm, Em=535 nm)을 실시하였다.

도 8에서 보는 바와 같이, Hep3B 세포에 아데노바이러스 단독으로 처리한 경우(그래프의 #1)와 아데노바이러스와 DMPC를 혼합하여 처리한 경우(그래프의 #2) 각각 1843과 1985의 형광값을 보여 DMPC의 혼합으로 바이러스의 전달에 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 바이러스, DMPC, WT-apoA-I을 혼합하여 형성한 프로테오리포솜(그래프의 #3) 혹은 바이러스, DMPC, V156K-apoA-I을 혼합하여 형성한 프로테오리포솜(그래프의 #4)은 각각 2962와 3060의 형광 값을 보여, 아데노바이러스 단독 처리와 비교하였을 때 대략 37% 이상의 전달능 향상을 보여주었다. 아무것도 처리하지 않은 경우(그래프의 #C)와 DMPC만을 처리한 경우는 형광이 검출되지 않았다. 도 9에서와 같이, 형광현미경 촬영도 같은 양상을 보여 아데노바이러스 단독 처리(세포사진 1) 보다, WT-apoA-I 혹은 V156K-apoA-I 등의 프로테오리포솜의 형태로 처리하는 것이 더욱 선명한 GFP 발현을 관찰할 수 있었다.

뇌신경세포주(U343 cell)에 바이러스를 처리한 결과도 유사한 경향을 보여주었다. 도 10에서와 같이, 아무것도 처리하지 않은 세포(#C)와 DMPC만을 처리한 세포(#5)에서는 전혀 형광이 검출되지 않았고, 아데노바이러스만을 처리한 경우에는 2101, 아데노바이러스-DMPC 혼합물의 경우에는 2674를 보여 GFP 발현율이 21% 증가함을 보여주었다. 이에 비해, WT-apoA-I프로테오리포솜은 4235, V156K-프로테오리포솜은 4042의 형광값을 보여 아데노바이러스 단독 처리의 경우 보다 50% 이상 향상된 GFP 발현을 보여주었다. 도 11에서 보는 바와 같이, 형광현미경 관찰에서도 유사한 경향을 보여, 도 8과 도 9에서 제시한 형광검출 결과와 잘 일치하고 있다.

실시예 14: 프로테오리포솜의 바이러스 안정성 증대 효과

아데노바이러스는 열에 약한 단점을 가지고 있어, 실온에서 24시간 이상 보관할 경우 세포감염능력/유전자 전달능력이 심각하게 손실되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 바이러스의 안정성을 증대하는 것이 유전자 치료에서 중요하다. 본 발명에서 제안하는 프로테오리포솜에 의해서 아데노바이러스의 열에 대한 안정성이 개선되는지를 비교하기 위하여, 아데노바이러스를 포함하는 프로테오리포솜을 4℃, 25℃, 37℃에서 24시간동안 incubation한 후, 뇌신경세포주(U343 cell)에 처리하여(1000 virus/cell), 48시간 동안 37 ℃에서 incubation하였다. FACS 분석으로 GFP 유전자의 발현을 비교해본 결과, 도 12에서 제시하는 바와 같이, WT 이나 V156K이나 프로테오리포솜의 형태로 바이러스를 전달하는 것이 아데노바이러스 단독으로 혹은 아데노바이러스-DMPC의 형태로 전달하는 것이 유전자 발현율이 매우 증가함을 알 수 있었다. 아데노바이러스 단독으로 처리한 경우는 25 ℃와 37 ℃의 열처리로 인해 유전자 발현 능력이 절반이상 감소하였으나(#1, 혹은 #2), 프로테오리포솜의 형태로 처리한 경우는 같은 조건의 열처리에 의해서도 유전자 발현 능력이 감소하지 않았다. 이 결과는 열에 의한 바이러스의 감염능력 혹은 유전자 전달 능력의 약화가 프로테오리포솜 처리에 의해 개선, 증대될 수 있음을 보여준다.

도 1은 순수 분리된 프로아포리포단백질 A-I의 wildtype과 V156K 변이체를 전기영동하여 순도를 비교한 것이다.

도 2는 프로아포리포단백질을 이용하여 프로테오리포솜(proteoliposome)을 형성한 후 전기영동으로 입자의 크기를 비교한 것이다.

도 3은 Wildtype과 V156K의 프로테오리포솜 내에서 자가 결합된 proapoA-I의 분자 수를 비교한 것이다

도 4는 Wildtype과 V156K의 인지질과의 친화능력 및 프로테오리포솜 형성 능력을 비교한 것이다.

도 5는 Wildtype과 V156K이 프로테오리포솜 내에서 구아니딘 하이드로클로라이드(Gnd-HCl)에 대한 변성 저항성을 비교한 것이다.

도 6은 바이러스 입자를 포함하고 있는 DMPC-wildtype-proapoA-I 프로테오리포솜을 전자현미경 관찰로 나타낸 것이다.

도 7은 바이러스 입자를 포함하고 있는 DMPC-V156K-proapoA-I 프로테오리포솜을 전자현미경 관찰로 나타낸 것이다.

도 8은 프로테오리포솜-바이러스를 간암세포주(Hep3B 세포)에 처리한 후 GFP의 발현량을 FACS(fluorescence activated cell sorting)로 분석 비교한 것이다.

도 9는 프로테오리포솜-바이러스를 Hep3B 세포에 처리한 후 GFP의 발현량을 형광현미경으로 관찰한 것이다.

도 10은 프로테오리포솜-바이러스를 뇌신경세포주(U343 세포)에 처리한 후 GFP의 발현량을 FACS(fluorescence activated cell sorting)로 분석 비교한 것이다.

도 11은 프로테오리포솜-바이러스를 뇌신경세포주(U343 세포)에 처리한 후 GFP의 발현량을 형광현미경으로 관찰 비교한 것이다.

도 12는 프로테오리포솜 처리에 따른 바이러스의 온도에 대한 안정성 증대효과를 비교한 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yeungnam University <120> Enhanced virus or gene delivery using proteoliposome for therapeutics <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Met Ala His Phe Trp Gln Gln Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Asp 1 5 10 15 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp 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245 250 255 Thr Gln

Claims

인지질, 콜레스테롤과 단백질을 포함하여 이루어진 프로테오리포솜에 있어서, 상기 단백질이 프로아포리포단백질 A-Ⅰ[서열번호 1] 또는 프로아포리포단백질에서 아포리포단백질 A-Ⅰ의 156번 위치에 발린이 라이신으로 치환된 변이체[서열번호 6]인 것을 특징으로 하는 프로테오리포솜(proteoliposome).
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 인지질, 콜레스테롤과 단백질은 단백질 1 mol당 인지질은 50 ~ 4000 mol, 콜레스테롤은 1 ~ 900 mol로 혼합된 것을 특징으로 하는 프로테오리포솜.
청구항 1 또는 3의 프로테오리포솜에 바이러스가 존재하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
제 4 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.