KR100857914B1

KR100857914B1 - 바실러스 세레우스를 이용한 제초제 5-아미노레불린산의생산 방법

Info

Publication number: KR100857914B1
Application number: KR1020070032461A
Authority: KR
Inventors: 안경준; 장학연
Original assignee: 서원대학교산학협력단; 장학연
Priority date: 2007-02-26
Filing date: 2007-04-02
Publication date: 2008-09-10
Also published as: KR20080079158A

Abstract

본 발명은 배지에 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 접종하여 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법에 관한 것으로,

본 발명의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 이용하면 배양과정에서 광합성세균처럼 광선을 제공할 필요가 없고, 고가의 저해제인 레불린산(levulinic acid) 첨가하지 않아도 되며, 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)을 최대 4mM 까지 생산할 수 있을 만큼 경제적이다.

바실러스 세레우스, 제초제, 생분해성, 미생물, 친환경, 5-아미노레불린산

Description

바실러스 세레우스를 이용한 제초제 5-아미노레불린산의 생산 방법{Method for production of 5-aminolevulinic acid using Bacillus cereus}

도 1은 전 배양시간에 따른 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 결과를 나타내는 그래프이고,

도 2는 본 배양 시간에 따른 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 결과를 나타내는 그래프이고,

도 3은 첨가한 포도당의 농도별 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 결과를 나타내는 그래프이고,

도 4는 첨가한 산 종류별 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 결과를 나타내는 그래프이고,

도 5는 아세트산 첨가 시간에 따른 pH 변화와 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 결과를 나타내는 그래프이고,

도 6은 대량 배양 시간에 따른 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 결과를 나타내는 그래프이고,

도 7은 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 농도에 따른 표준곡선을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid; ALA)의 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 배양하여 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

농업생산성을 좌우하는 요인으로는 농업기반시설에 다수확 작물의 육종개량, 재배기술의 확립 및 비료, 농약의 개발, 응용 등 많은 요인들을 열거할 수 있다. 그 중에서도 작물보호의 측면에서 이용되는 농약류, 특히 제초제의 개발 및 이용은 농업의 현대화와 대규모 영농 및 에너지 절약형 재배방식 등이 도입됨에 따라 그 중요도가 더욱 높아지고 있다.

실제 잡초에 의한 각 작물의 평균 수확량 손실 정도를 보면 보통 20-30% 정도의 수량손실이 예측된다. 여기에 병충해의 손실까지를 포함한다면 30-45%의 수량감소까지도 예상되고 있는 실정이다. 이와 같은 이유로 제초제 개발을 위한 제초활성물질의 탐색에 많은 연구가 집중되고 있는데, 현재까지 제초활성물질로 보고된 화합물수는 총 571종류의 제초제가 개발되었고 그중 일부가 실용화되고 있다.

그러나, 이상 보고된 화합물들은 대부분이 유기화학합성물질로 잔류독성에 따른 자연환경의 오염과 인체에 대한 안전성 문제가 심각한 사회문제로 제기되고 있는데, 현재 사용되고 있는 제초제 중에서 옥신(auxin)계, 트리아진(triazine)계, 다이페닐 이써(diphenyl ether)계의 광민감성 제초제들은 제조 과정이 특히 복잡하며 농작물, 가축 및 인간에게 유해할 뿐 아니라 토양에 오래 잔류하여 환경오염을 일으킨다.

이에 환경적으로 안전한 생물공정으로서 미생물 배양을 통해 제초제 성분들을 생산하는 방법이 대안으로 부각되고 있다.

5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)은 광합성 세균이 광합성에 필요한 엽록소를 생산하는 과정에서 필요한 테트라피롤(tetrapyrrole)의 전구체이고, 세균을 비롯한 생물들은 이를 합성할 수 있다.

5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)은 생물체에 투여되었을 때 피롤(pyrrole)을 합성하게 되고, 이는 빛을 받아서 활성산소를 방출하므로 식물의 잎에 살포하면 세포막을 파괴하여 고사에 이르게 하는 제초 효과를 나타낼 수 있다.

그러나, 이상과 같은 효과를 나타내는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)을 광합성 세균을 이용하여 생산하기 위해서는 계속해서 2일에서 3일간 광선을 조사하여야 하며, 고가의 저해제인 레불린산(levulinic acid)를 투여하여야 하는 문제가 있고, 배양기간이 길어지게 되는 문제가 있으며, 오염이 빈번히 발생하는 문제 또한 발생한다.

이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하면서도 생분해성 제초제 성분으 로 가치가 있는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 배지에 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 접종하여 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성을 하기에서 상세히 설명하고자 한다.

본 발명의 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 배지에 접종한 후, 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는데, 이와 같은 배양에 의해 배지에는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)으로부터 생산된 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)이 축적된다.

한편, 본 발명의 배양은 바람직스럽게 전 배양을 거친 후, 본 배양을 수행하는 것이 바람직하다. 이는 발효에 의하여 대사산물을 생산하는 경우 사용되는 통상의 방법으로서, 전 배양을 거치게 되면 미생물이 본 배양과 동일한 환경에 대해 한 번 경험을 하게 되므로, 본 배양 시 휴지기(lag phase)를 단축시킬 수 있는 등의 효과가 발생한다.

따라서, 본 발명에서 상기 배양은 바람직하게 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 전 배양 배지에 접종하여 전 배양하는 단계(a); 단계(a)에서 전 배양 된 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 본 배양 배지에 접종하여 본 배양하는 단계(b)를 포함하는 방법에 의해 수행되는 것이 좋다.

한편, 본 발명에서 사용되는 균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 동정되는 것은 어느 것을 사용하여도 무방하나 바람직하게는 본 발명자들이 분리하여 기탁한 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)1-1 (KCTC 11067BP)를 사용하는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 있어 상기 전 배양 배지 또는 본 배양 배지는 바람직하게 트립톤(tryptone), 카사미노산(casamino acid) 및 이스트 익스트랙트(yeast extract)를 함유하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게 상기 배지는 트립톤(tryptone), 카사미노산(casamino acid) 및 이스트 익스트랙트(yeast extract)가 각각 1%(w/v), 1%(w/v) 및 1%(w/v)함유되는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 있어 상기 배양은 호기적으로 수행하는 것이 좋은데 호기적 방법에 의할 경우 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산량이 높았기 때문이다.

한편, 본 발명에 있어 상기 본 배양은 본 배양 배지에 포도당을 첨가하는 것이 좋은데 이와 같은 조건에서 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산량이 높다. 더욱 바람직하게 상기 포도당은 배지 중에 0.3%(w/v) 첨가된 것이 좋은데, 이와 같은 첨가량에서 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산량이 가장 높기 때문이다.

한편, 본 발명에 있어 배양 중 대수기 후기에 유기산을 배지에 첨가하는 것 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 대수기 후기 중 배지의 pH가 6.8 정도 일 때 유기산을 첨가하는 것이 좋다.

유기산을 첨가하는 경우 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)이 효율적으로 생산되며, 유기산 중에서 바람직하게는 아세트산이 좋다.

한편, 상기 아세트산은 그 첨가량이 5.4mM인 것이 좋으며, 이렇게 첨가한 경우가 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid) 생산에 대해 가장 효과적이기 때문이다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 1-1 균주의 분리

본 발명의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 청주 서원대학교 주변 토양에서 분리한 것으로, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 1-1 균주라 명명하고 2007년 1월 24일 자로 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11067BP를 부여받았다.

실시예 1: 제조예 1에서 획득한 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 1-1 (KCTC 11067 BP ) 균주를 이용한 5- 아미노레불린산 ( aminolevulinic acid ) 생산

본 발명의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 1-1는 호기적 조건에서 빠른 생장을 보이며 내생포자를 생산하였다. 1-1균주를 배양하기 위하여 TCY 배지(tryptone 1g, casamino acid 1g, yeast extract 1g, D.W. 100ml)에 접종하여 32^oC에서 호기적으로 배양하면서 생산되는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 양을 조사하였다

생산된 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)은 에르리히(Ehrlich)시약을 첨가하여 발색반응을 유발하고 분광광도계로 553nm 파장에서의 흡광도를 조사하여 농도를 확인하였다.

TCY배지에서의 전 배양 시간에 따른 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산을 측정한 결과, 18시간 동안 전 배양하여 본 배양에 접종한 경우 가장 많은 생산을 보였다(도 1).

한편, TCY배지에서의 본 배양 시간에 따른 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산을 측정한 결과, 역시 18시간 동안 본 배양한 경우 가장 우수하였다(도 2).

한편, 본 배양을 시작하면서 포도당을 농도별로 첨가하면서 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산을 조사한 결과 0.3%(w/v) 첨가한 배양에서 제일 많이 생산되었다(도 3).

한편, 균의 생장이 대수기 후기에 접어들었을 때 아세트산을 비롯한 여러 종류의 산을 5.4mM 농도로 첨가하였을 때, 유기산을 첨가한 경우가 대조군에 비해 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)가 효율적으로 생산되었으며, 아세트산이 가 장 효과적이었다(도 4).

한편, 발효시간에 따라 배지 중의 pH를 측정하고 각각의 시간 대에 아세트산을 첨가하여 이에 따른 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산을 비교하였는데, 그 결과 6시간째에 아세트산을 첨가하는 것이 가장 높은 생산량을 나타내었으며, 이때 배지의 pH는 6.8 수준이었다(도 5).

배지의 양을 2L로 늘려서 발효기에서 대량배양 하였을 때 가장 많은 량의 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)은 배양 개시 후 9시간 만에 생산되었으며 이는 소량배양 시보다 절반 정도의 시간이 소요된 결과이었다(도 6). 이것으로 보아 소량배양보다는 대량배양으로 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)을 생산하는 것이 유리함을 확인할 수 있었다.

배양을 통하여 생산된 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 양을 정량적으로 확인하기 위하여 표준곡선(도 7)을 작성하여 비교한 결과, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 1-1 균주가 생산한 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 농도는 약 4mM임을 알 수 있었다.

본 발명에서는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 TCY 배지에서 18시간 동안 전 배양하고, 새로운 TCY 배지에 본 배양하면서 배양 초기에 포도당을 0.3%(w/v) 첨가하고 대수기 후반에 아세트산을 5.4mM 가하여 18시간 동안 배양하였을 때, 가장 많은 량의 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)를 얻을 수 있었다.

이와 같이 본 발명은 천연의 제초제 성분인 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)를 호기성 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 이용하여 생산하게 함으로써 복잡한 화학공정이 아닌 단순한 미생물의 배양만으로 고가의 제초제 성분을 얻을 수 있는 장점을 발휘한다.

이 성분은 원래 자연 상태에서도 시토크롬과 엽록소의 생산을 위하여 유기호흡 생물과 광합성 생물들이 생산하는 천연화합물이므로 미생물들에 의하여 쉽게 분해되어 토양에 잔류오염을 남기지 않으며 그 자체로도 동식물에 해가 되는 성분이 아닌 특징이 있다.

따라서, 본 발명에 의하여 광합성세균을 이용한 무공해 천연 성분의 제초제 생산이 가능하며 이를 농업에 이용하게 되면 최근 그린라운드에 대비한 환경친화적인 농업 기술의 보편화에 한걸음 더 가까이 갈 수 있을 것으로 기대되며 앞으로 제초제를 비롯한 생물농약시장에서 국내 생물자원을 활용하는 기술이 응용될 수 있을 것이다.

Claims

배지에 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 접종하여 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제1항에 있어서,

상기 배양은,

바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 전 배양 배지에 접종하여 전 배양하는 단계(a); 및

단계(a)에서 전 배양 된 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 본 배양 배지에 접종하여 본 배양하는 단계(b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는,

바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 1-1 (KCTC 11067BP) 균주인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제2항에 있어서,

상기 전 배양 배지 또는 본 배양 배지는,

트립톤(tryptone), 카사미노산(casamino acid) 및 이스트 익스트랙트(yeast extract)를 함유하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 배양은,

호기적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제2항에 있어서,

상기 본 배양은,

본 배양 배지에 포도당을 첨가하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제2항에 있어서,

상기 본 배양은,

대수기 후기에 유기산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제7항에 있어서,

상기 유기산은,

아세트산인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법
제8항에 있어서,

상기 아세트산은,

5.4mM 첨가하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)의 생산 방법