KR100857043B1 - Specific primer for detection of Soybean mosaic virus - Google Patents

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Abstract

본 발명은 콩모자이크바이러스(Soybean mosaic virus, SMV)와 종 특이적으로 반응하는 저항성 연관 핵산단편에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물체의 콩모자이크바이러스 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 서열을 가지는 핵산, 상기 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머 및 이들을 이용하여 콩모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다. The present invention relates to a species of resistance-associated nucleic acid fragments that specifically react with soybean mosaic virus (SMV), and more particularly, a nucleic acid having a sequence having a high degree of association with a soybean mosaic virus-resistant trait of a plant, Provided is a primer comprising some nucleotide sequences of the nucleic acid and a method for detecting soybean mosaic virus resistant plants using them.

본 발명에 따른 분자 표지는 콩모자이크바이러스를 식물체에 직접 접종하지 않고서도 신속하고 정확하게 콩모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출할 수 있으며, 나아가 콩모자이크바이러스 저항성 식물체의 유전형을 결정할 수 있는 장점이 있으며, 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높다. 지금까지 알려진 콩모자이크바이러스의 모든 계통에 대한 검출이 가능하고, 또한 다른 관련 바이러스와의 비특이적 반응이 없어 훨씬 정밀하게 콩모자이크바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다.Molecular label according to the present invention can detect soybean virus virus resistant plants quickly and accurately without directly inoculating soybean mosaic virus, and furthermore, there is an advantage that can determine the genotype of soybean mosaic virus resistant plant, antiserum The detection limit is 1,000 times higher than the diagnostic method used. It is possible to detect all strains of soybean mosaic virus known to date, and also have no non-specific reaction with other related viruses, so that the infection of soybean mosaic virus can be diagnosed more precisely.

콩모자이크바이러스, 저항성, 분자표지 Soybean Mosaic Virus, Resistant, Molecular Labeling

Description

콩모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머{Specific primer for detection of Soybean mosaic virus}Specific primer for detection of Soybean mosaic virus

도 1은 콩모자이크바이러스 프라이머의 위치도1 is a location diagram of soybean mosaic virus primer

도 2는 프라이머 조합에 따른 콩모자이크바이러스와의 RT-PCR 사진 (Lane 1: 조합 1, Lane 2: 조합 2, Lane 3: 조합 3, Lane 4: 조합 4, Lane 5: 조합5, Lane 6: 조합 6, Lane 7: 조합 7, Lane 8: 조합 8, Lane 9: 조합 9, Lane 10: 조합 10, Lane 11: 조합 11) Figure 2 is a RT-PCR picture with soybean mosaic virus according to the primer combination (Lane 1: combination 1, Lane 2: combination 2, Lane 3: combination 3, Lane 4: combination 4, Lane 5: combination 5, Lane 6: Union 6, Lane 7: Union 7, Lane 8: Union 8, Lane 9: Union 9, Lane 10: Union 10, Lane 11: Union 11)

본 발명은 콩모자이크바이러스(Soybean mosaic virus, SMV)와 종 특이적으로 반응하는 저항성 연관 핵산단편에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물체의 콩모자이크바이러스 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 서열을 가지는 핵산, 상기 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머 및 이들을 이용하여 콩모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a species of resistance-associated nucleic acid fragments that specifically react with soybean mosaic virus (SMV), and more particularly, a nucleic acid having a sequence having a high degree of association with a soybean mosaic virus-resistant trait of a plant, Provided is a primer comprising some nucleotide sequences of the nucleic acid and a method for detecting soybean mosaic virus resistant plants using them.

콩모자이크바이러스는 단일가닥의 RNA로 이루어진 핵산을 가지고 있으며, 전체 게놈 사이즈는 10.4Kb에 달하고(Genomic nucleic acid isolated by Hill and Benner;1978,1980), Eggenberger, A. L.에 의해 콩모자이크바이러스의 전체 게놈 구성 단백질의 위치를 확인할 수 있었다(Stark, D.M. and Beachy, R. N.; J. Gen. Virol. 70, 1853-1860, 1989). 본 발명에 선발된 프라이머 조합은 바이러스 감염에 기주 특이적으로 관여하는 단백질인 P1 protein(132-1055bp)과 HC-Pro protein(1056-2426), 외피단백질인 Coat protein(8535-9329)의 위치에서 탐색되어졌다. Protease를 생성하는 P1과 HC-Pro protein은 진딧물을 매개로 전염되는 바이러스 감염에 특이적 공여자(Helper) 역할을 수행한다. 또한 Coat protein은 바이러스의 외피를 형성하는 단백질로 모든 바이러스가 일괄적으로 가지고 있는 부분이다.Soybean virus has a nucleic acid consisting of single-stranded RNA, the total genome size reaches 10.4 Kb (Genomic nucleic acid isolated by Hill and Benner; 1978, 1980), and the whole genome composition of soybean mosaic virus by Eggenberger, AL. The location of the protein could be confirmed (Stark, DM and Beachy, RN; J. Gen. Virol. 70, 1853-1860, 1989). Primer combination selected from the present invention is located at the position of coat protein (8535-9329), P1 protein (132-1055bp) and HC-Pro protein (1056-2426), envelope protein that is specifically involved in the viral infection host Searched. Protease-producing P1 and HC-Pro proteins play a role as a specific donor in aphid-borne viral infections. Coat protein is also a protein that forms the envelope of a virus and is a part of every virus.

한편, 병 저항성 품종을 육종하기 위해서는 병 저항성 인자를 갖는 다른 품종으로부터 계속적인 역교배를 통하여 그 인자를 도입하여야 하며, 도입 단계마다 저항성 시험을 거쳐 선발하여야 하는데, 이러한 선발 단계에서 상기 병 저항성 인자와 밀접하게 연관되어 있는 분자 표지(molecular marker)를 이용한다면 매우 편리할 것이다. 예를 들면, 대한민국 특허출원 제2002-75493호에서는 오이모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 핵산단편의 특정 조합으로 구성되는 프라이머를 이용하여 오이모자이크바이러스의 감염여부를 진단하는 방법을 제공하고, 대한민국 특허출원 제2002-75495호에서는 수박모자이크바이러스2와 종 특이적으로 반응하는 핵산단편의 특정 조합으로 구성되는 프라이머를 이용하여 수박모자이크바이러스2의 감염여부를 진단하는 방법을 제공하고, 대한민국 특허출원 제2004-86321호에서는 식물 바이러스 중에서도 기주 범위가 가장 넓은 식물병원 바이러스로 알려진 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus) 그룹에 속하는 CMV(cucumber mosaic virus)의 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 CMV 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다.On the other hand, in order to breed disease-resistant varieties, the factors must be introduced through continuous backcrossing from other varieties having disease resistance factors, and must be selected through resistance testing at each introduction stage. It would be very convenient to use closely related molecular markers. For example, Korean Patent Application No. 2002-75493 provides a method for diagnosing the infection of a cucumber mosaic virus using a primer composed of a specific combination of a cucumber mosaic virus and a species of nucleic acid that reacts species-specific. Patent application No. 2002-75495 provides a method for diagnosing the infection of watermelon mosaic virus 2 using a primer consisting of a specific combination of the watermelon mosaic virus 2 and the species-specific nucleic acid fragments, and the Republic of Korea Patent Application In 2004-86321, a CMV resistant plant was selected using a primer containing a nucleotide sequence of a nucleic acid of a cucumber mosaic virus (CMV) belonging to the Cucumovirus group, which is known as the broadest host plant virus. It provides a method for detecting.

일반적으로 콩모자이크바이러스의 계통 간에는 상당한 변이가 존재한다. 현재까지 콩모자이크바이러스에 대한 진단 방법은 혈청학적 진단 방법만이 개시되어 있을 뿐이다. 하지만 동 방법으로는 계통간 변이가 존재하는 경우 검출능의 한계로 인해 검출에 실패할 가능성이 상당히 높은 실정이나 아직 이렇다 할 대안은 제시되고 있지 못하다. 콩모자이크바이러스는 1900년대에 국내 보급된 콩과작물에 발생하여 매년 수득율의 90%를 좌우하는 심각한 피해를 야기할 수 있다. 이 병의 실질적인 방제를 위해서는 건전한 종자와 재배관리가 필수적이며, 콩모자이크바이러스 병 발생시 조속한 방제대책을 강구해야 더 큰 피해를 막을 수 있다. 이를 위해서는 정밀하고 신속한 콩모자이크바이러스의 진단이 절실히 필요하다. In general, there are significant variations between strains of soybean virus. To date, only serological diagnostic methods for soybean virus have been disclosed. However, this method is highly likely to fail detection due to the limitation of detectability when there is interline variation, but there is no alternative yet. Soybean mosaic virus can occur in soybean crops in Korea in the 1900's, and can cause severe damage, which accounts for 90% of annual yields. Healthy seed and cultivation management is essential for the actual control of the disease, and prompt measures should be taken to prevent further damage in case of soybean virus virus outbreak. For this, precise and rapid diagnosis of soybean virus is urgently needed.

본 발명은 이를 해결하기 위하여 지금까지 알려진 콩모자이크바이러스(Soybean mosaic virus, SMV)의 모든 계통에 작용하는 특이 프라이머(Primer)를 개발하고자 하였다.In order to solve this problem, the present invention was to develop a specific primer (Primer) that acts on all strains of soybean mosaic virus (SMV) known to date.

본 발명자들은 계통간 변이에도 불구하고, 모든 콩모자이크바이러스 종에 걸쳐 광범위한 검출 스펙트럼을 가지는 핵산단편 내지는 프라이머를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors have completed the present invention by preparing nucleic acid fragments or primers having a broad spectrum of detection across all soybean virus species, despite interline variation.

따라서, 본 발명의 목적은 콩모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1~12로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 프라이머를 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is from any one of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 12, the complementary nucleotide sequence thereof, or a variant based on these nucleotide sequences, which reacts species-specifically with soybean mosaic virus. To provide the primer of choice.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~12로 표시되는 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is a variant based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 12 or its complementary nucleotide sequence, partial deletion of the nucleotide sequence, addition of excess base or nucleotide sequence, or base or portion in the nucleotide sequence It is to provide a primer characterized in that the substitution of the sequence to another base sequence, or a combination thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a primer which is characterized by a sequence in which a label that binds to a molecule of the nucleic acid fragment and / or a site capable of binding to a solid phase carrier is introduced.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~12로 표시되는 염기서열 또는 프라이머를 포함하는 콩모자이크바이러스 저항성 식물체 검출용 키트를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a kit for detecting soybean mosaic virus resistant plant comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 1 to 12 or a primer.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~12로 표시되는 염기서열 또는 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 콩모자이크바이러스 저항성 식물체의 검출 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for detecting soybean mosaic virus resistant plant, which comprises analyzing genomic DNA of a plant in the presence of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1-12.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~12로 표시되는 선택된 핵산단편 및 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 콩모자이크바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to detect the soybean mosaic virus from the product obtained by the polymerase chain reaction by using the selected nucleic acid fragments and combinations represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 as a primer, and adding the primer to the unknown virus genome. To provide a way.

본 발명은 콩모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1~12로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 프라이머를 포함한다.The present invention provides a primer selected from any one of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 12, a complementary nucleotide sequence thereof, or a modification sequence based on these nucleotide sequences, which reacts species-specificly with soybean mosaic virus. Include.

본 발명은 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 포함한다.In the present invention, a mutant based on a nucleotide sequence or a complementary nucleotide sequence thereof is partially deleted from an nucleotide sequence, addition of an excess base or nucleotide sequence, or substitution of a base or subsequence in a nucleotide sequence with another nucleotide sequence, or a nucleotide sequence thereof. Primers characterized by complex sequences.

본 발명은 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 포함한다.The present invention includes a primer characterized in that the label is bound to the molecule of the nucleic acid fragment and / or the sequence is a site capable of binding to the solid phase carrier.

본 발명은 염기서열 또는 프라이머를 포함하는 콩모자이크바이러스 저항성 식물체 검출용 키트를 포함한다.The present invention includes a kit for detecting soybean mosaic virus resistant plant comprising a nucleotide sequence or a primer.

본 발명은 염기서열 또는 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 콩모자이크바이러스 저항성 식물체의 검출 방법을 포함한다.The present invention includes a method for detecting soybean mosaic virus resistant plants comprising analyzing genomic DNA of plants in the presence of nucleotide sequences or primers.

본 발명은 선택된 핵산단편 및 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 콩모자이크바이러스를 검출하는 방법을 포함한다.The present invention includes a method for detecting soybean mosaic virus from a product obtained by a polymerase chain reaction by using a selected nucleic acid fragment and combination as a primer and adding the primer to an unknown virus genome.

변형서열의 경우 실질적으로 콩모자이크바이러스의 게놈과 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미한다.In the case of a modified sequence, it means a sequence in which some bases are deleted, inserted, added, and substituted within a range that substantially maintains hybridization ability with the genome of soybean virus.

프로브 또는 프라이머로 사용되는 경우 변형된 염기의 수는 혼성화능을 실질적으로 유지하는 한 특별한 한정을 요하지는 아니하나, 통상 변이의 결과 얻어진 핵산단편의 총 염기 개수가 10∼50개 정도가 바람직하다.When used as a probe or primer, the number of modified bases does not require any particular limitation as long as it substantially maintains the hybridization ability. However, the total number of bases of the nucleic acid fragments obtained as a result of the variation is preferably about 10 to 50.

핵산단편이 프라이머로 사용되는 경우 변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 중합효소연쇄반응의 단계 중 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3'말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되어야 할 것이다.If the nucleic acid fragment is used as a primer, the position of the mutation is not particularly limited as long as it does not interfere with the hybridization, but preferably, the 3 'terminal portion that affects the elongation step of the polymerase chain reaction is excluded or Only minimal variations should be allowed.

본 발명의 핵산단편의 서열과는 상이하지만 상기와 같이 핵산단편에서 변형서열, 표식물, 고체상 담체등을 사용하는 보다 구체적인 예가 대한민국 등록특허 제0454434호에 개시되어 있다.Although different from the sequence of the nucleic acid fragment of the present invention, a more specific example of using a modified sequence, a label, a solid carrier, etc. in the nucleic acid fragment as described above is disclosed in Korean Patent No. 0454434.

콩모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머를 설계하기 위하여 지금까지 알려진 모든 콩모자이크바이러스의 전체 게놈 유전정보를 분석하였다. 분석 염기 서열은 이동단백질(Movement protein)과 외피단백질(Capsid or Coat protein)을 포함하는 전체 영역을 대상으로 하였다(도1). 프라이머는 콩모자이크바이러스 모든 분리주가 공통적으로 가지고 있는 서열 중에서 프라이머로서의 조건을 충족하는 부분과 기주 종 특이적으로 반응하는 저항성 연관 핵산단편에 관한 것에 일치하도록 탐색하여 설계하였다. 설계한 프라이머들은 콩모자이크바이러스와의 RT-PCR을 통하여 진단에 효과적인 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다(도2). In order to design specific primers for diagnosing soybean mosaic virus, the whole genome genetic information of all known soybean mosaic virus was analyzed. Assay base sequence was used for the entire region including the movement protein and the coat protein (Capsid or Coat protein) (Fig. 1). The primers were designed to match the resistance-associated nucleic acid fragments that reacted specifically with host species and the part satisfying the conditions as primers among the sequences common to all isolates of soybean mosaic virus. The designed primers finally selected the primer combination effective for diagnosis through RT-PCR with soybean virus (FIG. 2).

본 발명에 따라 제공되는 바이러스의 분리 및 유지, 프라이머 설계, 프라이머 선발, RT-PCR에 의한 바이러스 진단을 아래에서 실시 예에 의해 설명하였다.Isolation and maintenance of the virus provided according to the present invention, primer design, primer selection, virus diagnosis by RT-PCR was described by the examples below.

이하 본 발명이 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, these examples are only presented to understand the content of the present invention, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to these embodiments.

<실시예 1> 프라이머의 설계Example 1 Design of Primer

(1) 콩모자이크바이러스 분리주들의 유전정보 분석(1) Analysis of genetic information of soybean mosaic virus isolates

콩모자이크바이러스의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위하여 지금까지 알려진 콩모자이크바이러스 분리주들의 유전정보를 미국 NCBI 온라인 사이트를 이용한 모든 유전자 은행의 정보로 대체하여 이를 분석하였다.In order to develop diagnostic primers that can be used for all strains of soybean virus, the genetic information of soybean virus isolates so far known was replaced with the information of all gene banks using the NCBI online site.

(2) 공통 염기서열 및 기주 특이적 염기서열 탐색(2) search for common and host specific sequences

콩모자이크바이러스의 전체 게놈 분석 데이터를 분리주마다 수집하여 이를 정렬하고, 공통적인 염기서열의 부분적 위치를 확인하였다. NCBI에 등재되어 있는 Genbank accession no. AY216010, AY294045, AY294044, AJ312439, AJ310200, AB100443, AB100442, D00507, S42280, AY216987에서 감염매개단백질(P1 protein, HC-Pro protein)과 외피단백질을 포함하는 영역을 대상으로 기주 특이적 염기서열 분석을 하였다. 이 영역에서 모든 콩모자이크바이러스 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 표 1과 같은 프라이머를 합성하였다.The entire genome analysis data of soybean mosaic virus was collected every isolate and sorted, and the partial positions of common sequences were identified. Genbank accession no. Listed on the NCBI. Host-specific sequencing was performed on the areas containing P1 protein, HC-Pro protein and envelope proteins in AY216010, AY294045, AY294044, AJ312439, AJ310200, AB100443, AB100442, D00507, S42280, and AY216987. . In this region, primers as shown in Table 1 were synthesized by searching for sequences satisfying the conditions as primers among the nucleotide sequences common to all soybean virus strains.

(3) 합성한 프라이머 개요(3) Synthesized Primer Outline

표 1에서 보면 종류는 정방향(forward)과 역방향(reverse) 프라이머로 분리하였으며, 탐색된 영역의 위치를 같이 나타내었다. 상세 합성한 프라이머 위치는 도 1에 나타내었다.In Table 1, the types were divided into forward and reverse primers, and the locations of the searched regions were also shown. Detailed synthesized primer positions are shown in FIG. 1.

종류Kinds 프라이머primer 염기서열(5→3)Sequence (5 → 3) 크기size 영역(protein)Protein forwardforward 서열1SEQ ID NO: 1 CCG TGG TTG GAA AAA GGT GTTCCG TGG TTG GAA AAA GGT GTT 2121 HC-ProHC-Pro forwardforward 서열2SEQ ID NO: 2 GGA GAA TCA TGA ATG CAC CAT TGGA GAA TCA TGA ATG CAC CAT T 2222 HC-ProHC-Pro forwardforward 서열3SEQ ID NO: 3 TCC AGT TAA GAA ACT ATC ATG TAATCC AGT TAA GAA ACT ATC ATG TAA 2424 HC-ProHC-Pro reversereverse 서열4SEQ ID NO: 4 TCT TCC ACC ACT GTG TCA TTGTCT TCC ACC ACT GTG TCA TTG 2121 HC-ProHC-Pro reversereverse 서열5SEQ ID NO: 5 GAA TGC CTG CCA CGC TCT TCGAA TGC CTG CCA CGC TCT TC 2020 HC-ProHC-Pro forwardforward 서열6SEQ ID NO: 6 ATG ATT GGA AGC ATG GCG ATT TATG ATT GGA AGC ATG GCG ATT T 2222 P1P1 forwardforward 서열7SEQ ID NO: 7 ACC AAC TCC AAA GAA GAC TAA AACC AAC TCC AAA GAA GAC TAA A 2222 P1P1 reversereverse 서열8SEQ ID NO: 8 TTT AGT CTT CTT TGG AGT TGG TTTT AGT CTT CTT TGG AGT TGG T 2222 P1P1 reversereverse 서열9SEQ ID NO: 9 YCC ATA AGT TAT ATC ATC CGC AYCC ATA AGT TAT ATC ATC CGC A 2222 P1P1 forwardforward 서열10SEQ ID NO: 10 CTC GAG CAA CAA GAA CAC AGTCTC GAG CAA CAA GAA CAC AGT 2121 CoatCoat forwardforward 서열11SEQ ID NO: 11 TGG GTG ATG ATG GAT GGA GATGG GTG ATG ATG GAT GGA GA 2020 CoatCoat reversereverse 서열12SEQ ID NO: 12 TAA CTC CCG AGA GAG CTG CATAA CTC CCG AGA GAG CTG CA 2020 CoatCoat

<콩모자이크바이러스 종 특이적으로 설계한 프라이머><Specific primer designed specifically for soybean virus virus>

<실시예 2> 프라이머 선발Example 2 Primer Selection

합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머를 한 쌍으로 11가지로 조합하였다. 우리나라 전역에 분포하고 있는 야생콩에서 분리한 콩모자이크바이러스 분리주는 자연상태에서 SMV에 흔히 감염되어 있다. 이 콩모자이크바이러스 분리주의 총 RNA와의 RT-PCR을 통하여 콩모자이크바이러스 진단에 효과적인 조합을 선발하였다. 선발된 프라이머 조합과 RT-PCR 산물의 크기는 표 2와 같다.In consideration of the size of the RT-PCR product, the synthesized primers were composed of 11 types of forward and reverse primers in pairs. Soybean mosaic virus isolates from wild soybeans distributed throughout Korea are frequently infected with SMV in nature. An effective combination for diagnosing soybean mosaic virus was selected through RT-PCR with total RNA of this soybean mosaic virus isolate. The size of the selected primer combinations and RT-PCR products is shown in Table 2.

조합번호Combination number 포워드 프라이머 (forward primer)Forward primer 리버스프라이머 (reverse primer)Reverse primer 반응 생성물사이즈 (product size (bp))   Product size (bp) 1One 서열 1SEQ ID NO: 1 서열 4SEQ ID NO: 4 473473 22 서열 1SEQ ID NO: 1 서열 5SEQ ID NO: 5 619619 33 서열 2SEQ ID NO: 2 서열 4SEQ ID NO: 4 431431 44 서열 2SEQ ID NO: 2 서열 5SEQ ID NO: 5 577577 55 서열 3SEQ ID NO: 3 서열 4SEQ ID NO: 4 353353 66 서열 3SEQ ID NO: 3 서열 5SEQ ID NO: 5 499499 77 서열 6SEQ ID NO: 6 서열 8SEQ ID NO: 8 481481 88 서열 6SEQ ID NO: 6 서열 9SEQ ID NO: 9 761761 99 서열 7SEQ ID NO: 7 서열 9SEQ ID NO: 9 314314 1010 서열 10SEQ ID NO: 10 서열 12SEQ ID NO: 12 438438 1111 서열 11SEQ ID NO: 11 서열 12SEQ ID NO: 12 289289

<콩모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합>Combination primer for diagnosing soybean virus

1. 본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 다음과 같다(1) 총 RNA 분리1. Total RNA isolation method and RT-PCR conditions used for the present invention are as follows (1) Total RNA isolation

총 RNA는 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다.Total RNA was isolated using the Trizol solution (Tri-reagent; TR118, MRC co.) Extraction method.

1) 감염식물체 100mg을 유발에 담아 액체질소를 넣어 유봉을 이용하여 잘게 마쇄1) Put 100mg of infected plant in the induction and put liquid nitrogen to finely crush it using pestle.

2) 마쇄된 식물체 조직을 온도를 떨어뜨린 용기에 담고 트리졸 용액 1ml를 넣고 볼텍싱(vortexing)으로 고루 섞음2) Put the ground plant tissue in a container with a temperature drop and add 1 ml of trizol solution and mix by vortexing.

3) 200ul 클로로포름(Chloroform) 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리 3) Add 200ul chloroform and mix, allow to stand at room temperature for 15 minutes, and then centrifuge for 5 minutes at 13,000rpm at 4 ℃.

4) RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 위 3)방법으로 맑은 수층을 수득4) Collect the water layer containing RNA to obtain a clear water layer by the above 3) method

5) 수득한 수층의 80%정도 부피의 이소프로파놀(Isopropanol)을 혼합하여 실온에서 20분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리5) Isopropanol of about 80% of the volume of the aqueous layer was mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C.

6) 침전물의 이소프로파놀(Isopropanol) 액을 건조시켜 2ml의 70% 에탄올을 넣어 침전물을 흔들어 세척6) Dry the isopropanol solution of the precipitate, add 2 ml of 70% ethanol, and shake the precipitate to wash it.

7) 70% 에탄올에 부양되어있는 침전물을 4℃에서 13000rpm으로 15분 동안 원심분리7) Centrifuge for 15 min at 13000rpm at 4 ℃

8) 침전물의 70% 에탄올 액을 건조시켜 100ul 증류수로 녹여서 냉동보관8) Dry the 70% ethanol solution of the precipitate and dissolve it in 100ul distilled water for freezing.

(2) 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)(2) reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR은 아래의 조건으로 실시하였다.RT-PCR was performed under the following conditions.

1) 30ug 총 RNA에 역방향 프라이머(reverse primer)를 총 RNA량의 1/10ug을 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 ice에서 30분 정치 1) Put 1 / 10ug of the reverse RNA into 30ug total RNA and add distilled water to make 12µl of the reaction solution.

2) 역전사는 위 반응액에 5배 역전사완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl2, 150 mM KCl, 5 mM dithiothreithol, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응2) Reverse transcription was performed by 5 times reverse transcription buffer (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl 2 , 150 mM KCl, 5 mM dithiothreithol, pH 8.5) 4 μl, 10 mM dNTP 2 μl, RNA degrading enzyme inhibitor (RNase). inhibitor) Add 2 μl and distilled water to make 20 μl of reaction solution.

3) MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2유니트(unit)을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각3) Add 2 units of MuLV reverse transcriptase, perform reverse transcription reaction at 42 ℃ for 1 hour, treat at 70 ℃ for 10 minutes, and then cool with ice.

4) PCR은 역전사반응으로 합성해놓은 cDNA를 ½희석한 후 주형으로 1㎕사용4) PCR uses 1µl of template after ½ dilution of cDNA synthesized by reverse transcription.

5) 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 정방향(forward) 프라이머 5pmole, 역방향(reverse) 프라이머 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소(polymerase) 1유니트(unit)를 넣고 증류수로 첨가하여 20㎕ 반응액으로 수행5) 2 μl of 10-fold PCR buffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl 2 , 500 mM KCl, pH 8.3), 5 μm forward primer, 5 μm reverse primer, 0.4 μl 10 mM dNTPs, EF Taq polymerization Add 1 unit of polymerase and add distilled water to perform 20µl reaction solution.

6) PCR 조건은 94 ℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94 ℃에서 30초, 결합(Annealing) 58 ℃에서 30초, 합성(Extension)은 72 ℃에서 30초를 35회 실시6) PCR conditions were denatured for 1 minute at 94 ℃, Denature 30 seconds at 94 ℃, 30 seconds at 58 ℃ curing, (Extension) 30 seconds at 72 ℃ 30 times

7) PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석7) PCR products were analyzed on 1% agarose gel

상기한 바와 같이, 본 발명은 콩모자이크바이러스 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 유전자 염기서열을 갖는 분자 표지를 제공함으로써, 콩모자이크바이러스를 식물체에 직접 접종하지 않고서도 신속하고 정확하게 콩모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출할 수 있으며, 나아가 콩모자이크바이러스 저항성 식물체의 유전형을 결정할 수 있는 장점이 있으며, 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높으며, 지금까지 알려진 콩모자이크바이러스의 모든 계통에 대한 검출이 가능하다. 또한 다른 관련 바이러스와의 비특이적 반응이 없어 훨씬 정밀하게 콩모자이크바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다.As described above, the present invention provides a molecular label having a gene sequence having a very high degree of association with soybean mosaic virus resistant trait, thereby quickly and accurately soybean soybean virus resistant plant without inoculating soybean mosaic virus directly to the plant. It can be detected, and furthermore, it has the advantage of determining the genotype of soybean mosaic virus resistant plant, the detection limit is more than 1,000 times higher than the diagnostic method using antiserum, and it is possible to detect all strains of soybean mosaic virus known to date. . In addition, there is no nonspecific reaction with other related viruses, so it can be diagnosed more accurately soybean virus infection.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Specific primer for detection of Soybean mosaic virus <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 1 ccgtggttgg aaaaaggtgt t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 2 ggagaatcat gaatgcacca tt 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 3 tccagttaag aaactatcat gtaa 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 4 tcttccacca ctgtgtcatt g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 5 gaatgcctgc cacgctcttc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 6 atgattggaa gcatggcgat tt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 7 accaactcca aagaagacta aa 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 8 tttagtcttc tttggagttg gt 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 9 yccataagtt atatcatccg ca 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 10 ctcgagcaac aagaacacag t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 11 tgggtgatga tggatggaga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 12 taactcccga gagagctgca 20 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Specific primer for detection of Soybean mosaic virus <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 1 ccgtggttgg aaaaaggtgt t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 2 ggagaatcat gaatgcacca tt 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 3 tccagttaag aaactatcat gtaa 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 4 tcttccacca ctgtgtcatt g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 5 gaatgcctgc cacgctcttc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 6 atgattggaa gcatggcgat tt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 7 accaactcca aagaagacta aa 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 8 tttagtcttc tttggagttg gt 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 9 yccataagtt atatcatccg ca 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 10 ctcgagcaac aagaacacag t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 11 tgggtgatga tggatggaga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Soybean mosaic virus <400> 12 taactcccga gagagctgca 20

Claims (6)

콩모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1~12로 표시되는 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로부터 조합에 의해 선택되는 프라이머 세트로서, 상기 조합은 서열번호 1 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 1 및 5의 프라이머 세트, 서열번호 2 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 2 및 5의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 5의 프라이머 세트, 서열번호 6 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 6 및 9의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 9의 프라이머 세트, 서열번호 10 및 12의 프라이머 세트, 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머 세트.A primer set selected by a combination from a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 or a complementary nucleotide sequence thereof which reacts specifically with soybean virus, and the combination is a primer set of SEQ ID NOs: 1 and 4, SEQ ID NO: Primer sets 1 and 5, primer sets SEQ ID NOs: 2 and 4, primer sets SEQ ID NOs: 2 and 5, primer sets SEQ ID NOs: 3 and 4, primer sets SEQ ID NOs: 3 and 5, primers SEQ ID NOs: 6 and 8 A primer set selected from the group consisting of a set, a primer set of SEQ ID NOs: 6 and 9, a primer set of SEQ ID NOs: 7 and 9, a primer set of SEQ ID NOs: 10 and 12, and a primer set of SEQ ID NOs: 11 and 12. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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