KR100850880B1 - 미니 4-1ｂｂ 리간드 단백질 및 이를 함유하는 면역 질환치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포외 도메인(Extracellular domain, ECD)의 아미노산 말단을 제거하거나 또는 두 개의 아미노산을 변형시킴으로써 수용체 결합 활성능을 향상시킨 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

4-1BB, 4-1BB 리간드 단백질, 시그널 전달(Signal transduction), 면역 공동자극(Immune costimulation)

Description

미니 4-1ＢＢ 리간드 단백질 및 이를 함유하는 면역 질환 치료용 조성물{Mini 4-1BB ligand protein and composition for treating immune disorders containing the same}

도 1은 인간 4-1BB 리간드 결실 돌연변이체를 제작하기 위한 서열 및 프라이머를 보여준다.

도 2는 GST-4-1BB 리간드 결실 돌연변이체를 정제한 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 정밀 프로테아제(precision protease)를 이용하여 자유 h4-1BB 리간드 및 그 돌연변이 단백질을 생산한 결과를 보여주는 사진이다.

도 4는 쥬켓 8-1 세포에서 4-1BB 발현 및 4-1BB 리간드 단백질들의 결합 친화력을 보여주는 그래프이다.

도 5는 4-1BB와 4-1BB 리간드 단백질의 결합 친화력을 보여주는 그래프이다.

도 6은 h4-1BB에서 h4-1BB 리간드 결합 친화력을 보여준다.

도 7은 활성화된 일차 인간 CD8⁺ T-세포에서 4-1BB 발현과 서열번호 1의 4-1BB 리간드 단백질(h4-1BBL del4)의 결합 친화력을 보여준다.

도 8은 활성화된 일차 인간 CD4 T-세포에서 4-1BB 발현과 4-1BB 리간드 단백 질의 결합 친화력을 보여준다.

도 9는 일차 인간 T-세포 내에서 4-1BB 발현과 4-1BB 리간드 단백질의 결합 친화력을 보여준다.

도 10은 4-1BB 리간드 결합이 하류 시그널들을 유인함을 보여준다.

도 11은 4-1BB 리간드 단백질들의 기능 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 12는 인간 PBMC 유래의 CD4⁺ T-세포 내에서 4-1BB 리간드 단백질의 기능 분석을 보여주는 사진이다.

도 13은 인간 PBMC 유래의 CD8⁺ T-세포 내에서 4-1BB 리간드 단백질의 기능 분석을 보여주는 사진이다.

도 14는 일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포에서의 증식을 보여주는 그래프이다.

도 15는 일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포에서 IFN-γ의 증식을 보여주는 그래프이다.

도 16은 일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포에서 IL-2의 증식을 보여주는 그래프이다.

도 17은 일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포에서의 증식을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 세포외 도메인(Extracellular domain, ECD)의 아미노산 말단을 제거하거나 또는 두 개의 아미노산을 변형시킴으로써 수용체 결합 활성능을 향상시킨 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

클론으로 확장하기 위한 T-세포의 최적 활성은 적어도 두 개의 다른 생물학적 시그널들이 요구된다: 하나는 T-세포 항원 수용체(TCR)와 MHC 분자에 결합된 펩타이드의 상호작용에 의해 생성되며, 다른 시그널은 4-1BB/4-1BB 리간드와 같은 공동자극 분자들을 포함하는 공동자극 경로에 의해 생성된다. 4-1BB(CD137)는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 상과(superfamily)의 30kDa 당단백질이다[Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH (2005) The B7 family revisited. Annu Rev Immunol 23:515-548; 및 Watts TH (2005) The TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses. Annu Rev Immunol 23:23-68]. 4-1BB(CD137)는 활성화된 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포에서 발현되고, 휴면 단핵구(resting monocytes) 및 수상 돌기 세포에서 B-세포 및 자연 살해 세포(natural killer cells)를 활성화시킨다[Vinay DS, Kwon BS (2006) Immunotherapy targeting 4-1BB and its ligand. Int J. Hematol 83:23-28; Wong BR, Josien R, Lee SY, Sauter B, Li H-L, Steinman RM, Choi Y (1997) TRANCE (Tumor Necrosis Factor [TNF]-related activation-induced cytokine), a new TNF family member predominantly expressed in T cells, is a dendritic cell specific survival factor. J Exp Med 186:2075-2080; Williamson E, Bilsborough JM, Vinay JL (2002) Regulation of mucosal dendritic cell function by receptor activator of NF-κB (RANK)/RANK ligand interactions: impact on tolerance induction. J Immunoκl 169:3606-3612; 및 Kim N, Takami M, Rho J, Josien R, Choi Y (2002) A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. J Exp Med 195:201-209]. 이들의 천연 리간드인 4-1BB 리간드(4-1BBL)는 단핵구, 대식세포(macrophages), 수상 돌기 세포, B-세포 및 활성화된 T-세포에서 발현되는 TNF 상과(superfamily)의 II형 막횡단 당단백질(type II transmembrane glycoprotein)이다[Watts TH (2005) The TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses. Annu Rev Immunol 23:23-68; 및 Kwon BS, Weissman SM (1989) cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc Natl Acad Sci USA 86:1963-1967]. 4-1BB 사용 뮤린(engagement murine)과 인간의 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 발현을 증강시키고 CD28 트리거링(triggering)[Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH (2005) The B7 family revisited. Annu Rev Immunol 23:515-548; 및 Kwon BS, Kim CS, Prystowki MB, Lancki 1 DW, Sabath DE, Pan JL, Weissman SM (1987) Isolation and initial characterization of multiple species of T cell lymphocyte subset cDNA clones. Proc Natl Acad Sci USA 84:2896-2900]에 독립적이지만 협력작용에 의하여 사이토카인[인터류킨(IL)-2, IL-4, 인터페론(IFN)-γ 종양 괴사 인자(TNF-α)][Schwarz H, Tuckwell J, Lotz M (1993) A receptor induced by lymphocyte activation (ILA); a new member of the human nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor family. Gene 134:295-298; Kwon BS, Kim CS, Prystowki MB, Lancki 1 DW, Sabath DE, Pan JL, Weissman SM (1987) Isolation and initial characterization of multiple species of T cell lymphocyte subset cDNA clones. Proc Natl Acad Sci USA 84:2896-2900; 및 Pollok KE, Kim YJ, Zhou Z, Hurtado JC, Kim KK, Pickard RT, Kwon BS (1993) Inducible T cell antigen 4-1BB. Analysis of expression and function. J Immunol 150:771-781]을 분비하여 그들을 활성화한다. 4-1BB는 B-세포에 의한 T-세포 의존 항체 생산을 포함하고[Garni-Wagner BA, Lee ZH, Kim YJ, Wilde CE, Kang CY, Kwon BS (1996) 4-1BB is expressed on CD45 RAhi ROhi translational T cells in humans. Cell Immunol 169:91-98], T-세포의 생존을 촉진한다[Kwon BS, Kim CS, Prystowki MB, Lancki 1 DW, Sabath DE, Pan JL, Weissman SM (1987) Isolation and initial characterization of multiple species of T cell lymphocyte subset cDNA clones. Proc Natl Acad Sci USA 84:2896-2900; 및 Schwarz H, Valbracht J, Tuckwell J, von Kempis J, Lotz M (1995) ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages. Blood 85:1043-1052]. CD4⁺CD25⁺ 조절 T-세포들 은 말초 내성(peripheral tolerance)을 유지하는데 중요하다. 4-1BB는 이들 조절 T-세포들에서 구조적으로 발현되고[Takahashi C, Mittler RS, Vella AT (1999) 4-1BB is a bona-fide CD8 T cell survival signal. J Immunol 162:5037-5040], Choi 등은 이식 조직 대 숙주 모델(graft-versus-host model)에서 활성화된 CD4⁺CD25⁺ 조절 T-세포 기능이 4-1BB-의존적으로 억제됨을 보고하였다[Zhang H, Merchant MS, Chua KS, Khanna C, Helman LJ, Telford B, Ward Y, Summers, J, Toresky J, Thomas EK, June CH, Mackall CL (2003) Tumor expression of 4-1BB ligand sustains tumor lytic T cells. Cancer Biol Ther 2:579-586]. 따라서, 생체 내에서 4-1BB의 역할은 복합적으로 나타나고 실험 모델 연구에 따라서 변화한다.

4-1BB의 발현은 발병도(disease severity)와 서로 근접하게 연관된 다양한 임상경력들이 있는 몇몇 인간 환자들에서 검출되었다. 4-1BB는 캐스파아제(caspases)와 함께 갑상선 호르몬 자극에 의해 유도되었다[Yamada-Okabe T, Satoh H, Yamada-Okabe H (2003) Thyroid hormone induces the expression of 4-1BB and activation of caspases in thyroid hormone receptor dependent manner. Eur J Biochem 270:3064-3073]. 또한, 4-1BB 발현은 크론병(Crohn's disease)에서 검출되었다[Maerten T, Geboes K, De Hertogh G, Shen C, Cadot P, Bullens DM, Van Assche G, Penninckx F, Rutgeerts P, Cueppens JL (2004) Functional expression of 4-1BB (CD137) in the inflammatory tissue in Crohn's disease. Clin Immunol 112:239-246]. TNF 상과(superfamily)의 특정일원으로서, 4-1BB의 가 용성 형태가 류마티스 관절염을 앓는 사람의 혈청에서 발견되었고 순환하는 4-1BB의 레벨은 발병도가 증가하는 것에 따라 증가하였다[Jung HW, Choi SW, Choi JI, Kwon BS (2004) Serum concentrations of soluble 4-1BB and 4-1BB ligand correlated with the disease severity in rheumatoid arthritis. Exp Mol Med 36:13-22]. 4-1BB의 발현은 간암 및 종양 부위[Zhang H, Merchant MS, Chua KS, Khanna C, Helman LJ, Telford B, Ward Y, Summers, J, Toresky J, Thomas EK, June CH, Mackall CL (2003) Tumor expression of 4-1BB ligand sustains tumor lytic T cells. Cancer Biol Ther 2:579-586]뿐만 아니라 간의 비-종양 영역[Wan YL, Zheng SS, Zhao ZC, Li MW, Jia CK, Zhang H (2004) Expression of co7 stimulator 4-1BB molecule in hepatocellular carcinoma and adjacent non-tumor liver tissue, and its possible role in tumor immunity. World J Gastroenterol 10:195-1999]에서도 관찰되었다. 더욱이, 간이식 환자의 말초 혈액은 4-1BB를 함유하지 않을 뿐만 아니라 이들의 발현은 임상적 악화(clinical severity)와 관련이 있다고 보고되었다[Wan YL, Zheng SS, Jia CK, Liang TB, Huang DS, Wang WL, Li MW, Zhao ZC (2003) Expression of 4-1BB molecule on peripheral blood T cells in liver transplanted patients and its clinical implication. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2:38-43]. 더구나, 4-1BB는 4-1BB 리간드와 함께 만성 심부전증 환자 유래의 말초 혈액 샘플뿐만 아니라 인간 뉴런, 아스트로사이트(astrocytes) 및 미세아교세포(microglia)에서 검출되었다[Yndestad A, Damas JK, Ger Eiken H, Holm T, Hauh T, Simonsen S, Froland SS, Gullestad, Aukrust P (2002) Increased gene expression of tumor necrosis factor superfamily ligands in peripheral blood mononuclear cells during chronic heart failure. Cardiovasc Res 54:175-182]. 임 등은 소도 침윤 단핵 세포(islet infiltrating mononuclear cells) 및 뇌의 회백질(gray matter)에서 4-1BB-류 분자를 입증하였으나, 이러한 발현의 의미는 명확하지 않다[Lim HY, Kim KK, Zhou FC, Yoon JW, Hill 1 JM, Kwon BS (2002) 4-1BB-like molecule is expressed in islet-infiltrating mononuclear cells and in the gray matter of the brain. Cell Biol Int 26:271-278]. 지금까지 여러 가지 임상 질환에서 4-1BB에 대한 중요한 역할을 명확하게 내포하는 연구가 진행되었다.

구조적 분석은 공간적, 정전기적 및 친수성/소수성 잠재 결합의 조사 및 일부 또는 분리 단백질에서 인근의 잔기와 치환 잔기의 관계를 위하여 허용한다. 이 구조적 분석은 실제 클로닝 실험들을 위한 하나 또는 두 개의 임계 부위들을 선택하려고 하는 의도를 가지고 많은 잠재적 변화를 조사하기 위한 방법을 제공한다. 서열 상동관계의 커플링은 4-1BB 리간드를 위한 여러 가지 잠재적 단백질-단백질 상호작용을 나타내는 구조 모델로 분석한다. 중첩 결손 돌연변이생성(nested deletion mutagenesis) 연구에 기초하는 지식은 4-1BB 리간드의 C-말단 도메인이 4-1BB에 결합하기 위하여 중요함을 보여주었다.

4-1 BB 시그널링 -매개 항-자가면역 질환: 호전적인 항-4-1BB 단클론 항체 치료는 암 및 자가면역질환을 치료하는데 제안되어 왔으며, 자가면역 질환의 발생에서 전례없는 증가가 보고되었다. 4-1BBL도 호전적인 항-4-1BB 단클론 항체가 흉내를 내는 원래의 리간드이므로 상기 항체가 보이는 치료효과를 동일하게 보일 것으 로 사료된다. 건강 케어에서 자가면역 질환의 역학 및 중요성에 대한 최근의 리뷰에서 인구의 약 20%가 적어도 한 가지 이상의 자가면역 질환을 앓고 있다고 제시하였다[Cervara R (2001) The epidemiology and significance of autoimmune diseases in health care. Scand J Clin Lab Invest 61:27-35]. 자기반응성(Autoreactive) T 세포(chiefly CD4⁺ T cells)는 염증성 사이토카인, 자가항체들을 제조하는 헬프(help) B 세포 및 활성 대식세포를 생산하고 일괄적으로 자가면역 조건의 중요도(severity)의 주요 영속체(main perpetuators)가 된다. 그 중에서도, 단클론 항체 또는 그 결실에 의한 자기반응성 T 세포 기능을 바꾸려는 프로토콜은 일반적으로 이용할 수 있는 치료 양상의 하나이다.

그러나, 일부는 작용 메커니즘이 기본적인 항-4-1BB 단클론항체 치료에 있어서 두드러진다. 다른 사람들은 이러한 손실이 없다고 보고하는데 반해[Foell J, Strahotin S, O' Neil SP, McClausland MM, Suwyn C, Haber M, Chander PN, Bapat AS, Yan XJ, Chiorazzi N, Hoffmann MK, Mittler RS (2003) CD137 costimulatory T cell receptor engagement reverses acute disease in lupus-prone NZB x NZB F1 mice. J Clin Invest 111:1505-1518] 대다수가 Th1-4-1BB 및 면역 조절형(Immune Modulation-type) 사이토카인, 특히 IFN-γ의 증강이 자기반응성 CD4⁺ T 세포의 결실을 초래하는 항-4-1BB 단클론항체 치료에 결정적이라는데 동의한다[Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, Chen J, Koka R, Chen L, Fu YX (2003) Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 8:1405-1413]. 또한 항-4-1BB 치료는 자가항체 생산을 억제하기 위하여 전반적으로 체액의 면역을 둔화하는 B 세포 수 및 기능에 강하게 영향을 준다. 무엇이 B 세포에서 항-4-1BB 단클론항체-매개 기능 상실을 유발하는지 아직 명확하지 않지만, B 세포가 Ag 자극이 결여된 상황에서 조차도 단독으로 항-4-1BB 단클론항체 치료 중단에 영향을 받기 쉽다는 사실을 알 수 있다[Sun Y, Blink SE, Chen JH, Fu YX (2205) Regulation of follicular dendritic cell networks by activated T cells: the role of CD137 signaling. J Immunol 175:884-890].

Sun 등은 낭창-성향이 있는 쥐의 항-4-1BB 단클론항체 처리에서 B 세포 기능의 상실이 생체 내에서 IFN-γ가 중성화된(neutralized) 후에 현저하게 회복됨을 증명하였다[Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, Chen J, Koka R, Chen L, Fu YX (2003) Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 8:1405-1413]. 전신의 항-4-1BB 단클론항체 치료를 Sytwu 등은 이용하지 않았지만, 췌장 베타 세포에서 막결합 작용제의 단일쇄를 과발현하는 항-4-1BB Fv 형질전환 NOD 마우스(non-obese diabetic mice)를 사용하여 이들의 새끼들(littermates) 보다 심한 당뇨를 보였다[Sytwu HK, Lin WD, Roffler SR, Hung JT, Sung HS, Wang CH, Cheng TL, Tsou SC, His, SC, Shen KL (2003) Anti-4-1BB-based immunotherapy for autoimmune diabetes: lessons from a transgenic non-obese diabetic (NOD) model. J Autoimmun 21:247-254]. 비록 4-1BB 시그널링에 의한 당뇨 진행의 이러한 악화에 대한 근거가 명확하지는 않지만 작용제적 단클론항체에 의한 4-1BB의 생체내 결찰이 상기 연구에서 보여지는 생리적인 교차-결합의 차이로 나타난다고 제시한다.

본 발명자들은 자가면역 류마티스성 관절염의 RA 모델을 사용하여 항-4-1BB 단클론항체-매개 보호 효과의 근거에 관하여 포괄적인 설명을 제공하였다. Seo 등은 류마티스성 관절염의 항-4-1BB 단클론항체-매개 개량(amelioration)에 관하여 흥미로운 관찰을 하였다[Seo SK, Choi JH, Kim YH, Kang WJ, Park HY, Suh JH, Choi BK, Vinay DS, Kwon BS (2004) 4-1BB-mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 10:1088-1094]. 이들은 항-4-1BB 단클론항체 치료의 결과로 자기반응성 CD4⁺ T 세포가 IFN-γ 및 IDO 의존법(dependent manner)에서 제거되는 것을 증명하였다. 비론 많은 세포 유형들이 항-4-1BB 단클론항체-매개 4-1BB 및 면역 조절-면역 보호에서 표적되지만, 수지상세포 및 CD11c⁺CD8⁺ T 세포들은 그들의 입증된 조절 기능을 위해 선발된다[Seo SK, Choi JH, Kim YH, Kang WJ, Park HY, Suh JH, Choi BK, Vinay DS, Kwon BS (2004) 4-1BB-mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 10:1088-1094; 및 Kwon B, Lee HW, Kwon BS (2002) New insights into the role of 4-1BB in immune responses: beyond CD8⁺ T cells. Trens Immunol 23:378-380]. 항-4-1BB 단클론항체 치료가 대식세포 및 수지상 세포(dendritic cells, DC)에서 IDO를 상향조절하고, 이러한 IDO⁺CD11b⁺ 대식세포 또는 IDO⁺CD11c⁺ 수지상세포를 자기반응성 CD4⁺ T 세포들은 자기반응성 CD4⁺ T 세포들을 제거한다고 생각하였다[Seo SK, Choi JH, Kim YH, Kang WJ, Park HY, Suh JH, Choi BK, Vinay DS, Kwon BS (2004) 4-1BB-mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 10:1088-1094]. 또한 이들은 항-4-1BB 단클론항체 처리가 다른 CD11c 분자 사이에서 공동발현하는 CD8⁺ T 세포 유형을 확대한다는 발달가능성이 있는 소견을 제시하였다. 이 CD11c⁺CD8⁺ 세포들은 CD3, 퍼포린(perforin)을 발현하는 능력 및 CD4, CD40, MHC II, CD11b, B220, CD205 및 33D1[Seo SK, Choi JH, Kim YH, Kang WJ, Park HY, Suh JH, Choi BK, Vinay DS, Kwon BS (2004) 4-1BB-mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 10:1088-1094]을 발현하지 못하는 능력에 기초하여 CD8⁺ T 세포의 작은 부분(subset)이 된다고 믿어지며, 주로 그들의 비-T 세포 기원(origin)으로 인해 표현되는 조절(regulatory) 수지상세포(DCs)와 별개이다[Homann D, Jahreis A, Wolfe T, Hughes A, Coon B, van Stipdonk MJB, Prilliman KR, Schoenbeger SP, von Herrath MG (2002) CD40L blockade prevents autoimmune diabetes by induction of bitypic NK/DC regulatory cells. Immunity 16:403-415; Chan CW, Crafton E, Fan, H-N, Flook J, Yoshimura, K, Skarica M, Brockstedt D, Dubensky TW, Stins, M, Lanier LL, Pardoll DM, Housseau F (2006) Interferon producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat Med 12:207-213; 및 Taieb J, Chaput N, Menard C, Apetoh, L, Ullrich E, Bonmort M, Pequignot M, Casares N, Terme M, Flament C, Opolon P, Lecluse Y, Metivier D, Tomasello E, Vivier E, Ghiringhelli F, Martin F, Klatzmann D 1, Poynard T, Tursz T, Raposo G, Yagita H, Ryffel B, Kroemer, Zitvgel L (2006) A novel dendritic cell subset in tumor immunosurveillance. Nat Med 12: 214-219]. 이 CD11c⁺CD8⁺ T 세포들은 제한된 유사분열(mitotic) 활성을 보이고, 정상적인 이동성을 가지는 IFN-γ를 발현하며, 잠재적 면역억제제(immunosuppressors)이고 4-1BB 시그널링에 배타적이다[Seo SK, Choi JH, Kim YH, Kang WJ, Park HY, Suh JH, Choi BK, Vinay DS, Kwon BS (2004) 4-1BB-mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 10:1088-1094]. CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 관절염 민감성(arthritis susceptible) DBA/1 쥐로의 선택적 전달은 관절염의 진행을 현저히 늦추었다. 그러나, 동일 Ag 존재하에 시험관내에서 재배양할 경우, 쥐 유래의 분별 증류하지 않은 비장림프구(unfractionated splenocytes)를 Ag 및 항-4-1BB 단클론항체로 미리 처리하는 경우, 세포 증식은 배양액 내 수지상세포의 존재에도 불구하고 생체 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 빠른 사멸로 인하여 그다지 과도하게 영향을 받지 않았다(Vinay et al., manuscript in preparation). 이는 항-4-1BB 시그널링의 시험관내 및 생체 내 효과 사이의 명확한 구분을 증명한 것이다. 이 자료는 IFN-γ 수지상세포 및 CD11c⁺CD8⁺ 조절 T 세포가 모두 모델 테스트에서 항-4-1BB 단클론항체-매개 면역치료에서 결정적인 역할을 하고 있음을 제시한다. 또한 천연 리간드 h4-1BB 리간드가 암 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료법과 동등하거나 그 이상의 치료법임을 보여준다.

4-1 BB 시그널링 -매개 항-바이러스 면역: 4-1BB 시그널링의 역할은 항-4-1BB 단클론항체 치료가 항-바이러스 면역을 증강하는 매우 효과적인 수단 중 하나라고 몇몇 연구자들에 의해 평가되었고 애매하게 제의되었다[Bertram EM, Dawicki W, Watts TH (2004) Role of T cell costimulation in anti5 viral immunity. Sem Immunol (2004) 16:185-196]. 대부분의 경우에서 바이러스에 대한 보호는 CD8⁺ T 세포에 의존하고, CD8⁺ T 세포의 강한 활성화제인 4-1BB가 바이러스 제거에 유익한 감각작용을 한다. 사실 Halstead 등은 생체 내에서 4-1BB 자극이 마우스에서 인플루엔자 A형 바이러스 감염에 대한 일차 CD8⁺ T 세포 반응을 증가시킴을 보였다[Halstead ES, Mueller YM, Altman JD, Katsikis PD (2002) In vivo stimulation of CD137 broadens primary antiviral CD8⁺ T cell responses. Nat Immunol 168:5483-5490].

유사하게, Bertram 등은 시작 단계가 아닌 초기 동안에 작용제적 항-4-1BB 단클론항체로 인플루엔자 바이러스 감염 주를 치료하는 것은 이들 마우스가 불완전한 이차 CD8⁺ T 세포 반응을 보일 때 CD28-/- 마우스에서 불완전한 이차 CD8⁺ T 세포 반응을 회복시키는 효과가 있었다[Bertram EM, Dawicki W, Sedgmen B, Bramson JL, Lynch DH, Watts TH (2004) A switch in costimulation from a CD28 to 4-1BB during primary versus secondary CD8 T cell response to influenza virus in vivo. J Immunol 15:981-988]. 또 한편으로는 정상적인 일차 CD8⁺ T 세포 반응을 보 이는 4-1BB-/- 마우스는 4-1BB 시그널링이 후기 항-바이러스 면역 반응에 결정적임을 제시하는 이차 반응을 지속하지 않는다. Maus 등은 생체 밖의 공동배양 시스템에서 바이러스 특이적 인간 CD8⁺ T 세포의 장기 증식(long-term proliferation) 및 생존이 4-1BB 시그널링의 존재하에 완성된다는 것을 명확하게 증명하였다[Maus MV, Thomas AK, Leonard DGB, Allman D, Addya K, Schlienger K, Riley JL, June CH (2002) Expansion of polyclonal and antigen-specific cytotoxic T lymphocytes by artificial APCs expressing ligands for the T-cell receptor, CD28 and 4-1BB. Nat Biotech 20:143-148]. 이러한 발견은 TCR/CD28 시그널에 의해 초기 활성화되는 CD8⁺ T 세포가 반응시 4-1BB 공동자극(co-stimulation)을 요구함을 제시한다. 이러한 접근은 생체 밖의 바이러스- 또는 종양-특이적 CD8⁺ T 세포를 성장시키기 위한 귀중한 발판이 된다.

최근 보고서에서 Arribillaga 등은 C형 간염바이러스(hepatitis C virus)를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스로 마우스를 면역한 후 항-4-1BB 단클론항체를 투여하면 세포독성 가능성이 증가함을 밝혔다[Arribillaga L, Sarobe P, Arina A, Gorraiz M, Borras-Cuesta F, Ruiz J, Prieto J, Chen L, Melero I, Lasarte JJ (2005) Enhancement of CD4 and CD8 immunity by anti-CD137 (4-1BB) monoclonal antibodies during hepatitis C vaccination with recombinant adenovirus. Vaccine 23:3493-3499]. 자가면역 류마티스성 관절염 모델[Seo SK, Choi JH, Kim YH, Kang WJ, Park HY, Suh JH, Choi BK, Vinay DS, Kwon BS (2004) 4-1BB- mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 10:1088-1094]에서 보여지는 바와 같이, 항-4-1BB 단클론항체 치료는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포[Kim YH, Seo SK, Choi BK, Kang WJ, Kim CH, Lee SK, Kwon BS (2006) 4-1BB costimulation enhances HSV-1-specific CD8⁺ T cell responses by the induction of CD11c⁺CD8⁺ T cells. Cell Immunol in press 56. Melero I, Shuford WW, Newby SA, Aruffo A, Ledbetter 1 JA, Hellstrom KE, Mittler RS, Chen L (1997) Monoclonal antibodies against 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3:682-685]의 거대신장(massive expansion)을 포함하는 메커니즘에 의해 1형 단순포진 바이러스(herpes simplex virus type 1)의 일차 및 재감염에 모두 효과적으로 나타났다. 또한 이 연구는 HSV-1로 다시 자극될 때 HSV-1 및/또는 래트 IgG 또는 항-4-1BB 단클론항체에 초기 노출한 50일 이후에 래트 IgG가 아니라 미리 항-4-1BB 단클론항체로 치료된 마우스에서만 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 상승된 재발생을 보임이 관찰됨으로써 입증된 바와 같이 CD11c⁺CD8⁺ T 세포들이 메모리(memory) CD8⁺ T 세포 풀(pool)[Arribillaga L, Sarobe P, Arina A, Gorraiz M, Borras-Cuesta F, Ruiz J, Prieto J, Chen L, Melero I, Lasarte JJ (2005) Enhancement of CD4 and CD8 immunity by anti-CD137 (4-1BB) monoclonal antibodies during hepatitis C vaccination with recombinant adenovirus. Vaccine 23:3493-3499]에서 유지되었다. 공통적으로, 이들 결과들은 추측컨대 바이러스 감염의 일차 및 이차 단계에서 면역성을 올림으로써 바이러스 감염의 치료에서 항-4-1BB 단클론항체 치료의 중요성을 분명하게 강조하였다.

4-1 BB 시그널링 -매개 항-종양 면역성: 종양 인자 또는 이들의 소거 억제는 임상의학자에게 여전히 위압적인 일로 남아 있다. 일반적으로 치료 양상들(Treatment modalities)은 면역 활성이 정상적에서 벗어나는 비면역원성 또는 저면역원성 종양들을 처리하는 경우에 보다 어렵게 된다.

지금까지 연구된 다양한 동물모델에서 4-1BB 시그널링은 종양 모델에서 가장 많이 연구되었다. Chen과 동료들은 종양생성 마우스의 항-4-1BB 단클론항체 치료가 생성된 종양의 소거에서도 효과적임을 최초로 증명하였다[Melero I, Shuford WW, Newby SA, Aruffo A, Ledbetter 1 JA, Hellstrom KE, Mittler RS, Chen L (1997) Monoclonal antibodies against 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3:682-685]. Tirapu 등은 수지상세포(semiallogeneic dendritic cells)와 함께 작용제적 항-4-1BB 단클론항체를 투여하는 것은 저면역원성 MC38 결장 종양을 생성할 뿐만 아니라 자발적으로 잠재적 항-종양 면역 반응과 결합함을 보여 주었다[Tirapu, I, Arina A, Mazzolini G, Duarte M, Alfaro C, Feiji E, Qian C, Chen L, Prieto J, Melero I (2004) Improving efficacy of interleukin-12-transfected dendritic cells injected into murine colon cancer with anti-CD137 monoclonal antibodies and alloantigens. Int J Cancer 110:51-60].

유사하게, 항-4-1BB 및 IL-12로 처리한 저면역원성 B16-F10 흑색종 생성 마 우스는 종양-특이적 T 세포의 기능이 증가하였고 피하로 주입된 종양의 성장이 지연되었으며 종양 생성 마우스의 생존이 50% 까지 증가하였다[Xu DP, Sauter BV, Huang TG, Meseck M, Woo SL, Chen SH (2005) The systemic administration of Ig-4-1BB ligand in combination with IL-12 gene transfer eradicates hepatic colon carcinoma. Gen Ther12:1526-1533]. 상기 연구에서 폐 전이 모델(pulmonary metastatic model)을 사용하여 항-4-1BB 단클론항체/IL-12-결합 보호 활성이 제거된 CD4⁺ T가 아닌 NK 또는 CD8⁺가 생체 내에서 감소함을 보고한 바 있다. 수지상세포-기초 백신(Tumor-lysate pulsed dendritic cell-based vaccination)은 최근 몇 년간 상당한 주목을 받았다[Schuler G, Steinman RM (1997) Dendritic cells as adjuvants for immune12 mediated resistance to tumors. J Exp Med 186:1183-1187; 및 Pilon-Thomas SA, Verhaegen ME, Mule JJ (2005) Dendritic cell-based therapeutics for breast cancer. Breast Dis 20:65-71]. Ito 등은 항-4-1BB 단클론항체로 처리될 때 폐 및 피하에서 종양을 생성하는 마우스는 종양 성장이 두드러지게 퇴보되고 마우스의 생존이 현저히 증가함을 증명하였다[Ito F, Li Q, Shreiner AB, Okuyama R, Jure-Kunkel MN, Tietz-Tennenbaum S, Chang AE (2004) Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the anti tumor efficacy of dendritic cell-based vaccines. Cancer Res 64:8411-8419]. 유사한 조사에서 항-4-1BB 단클론항체 및 DC 백신의 항-종양 활성이 온전한(intact) CD8⁺ T 세포에 더 의존하고, 항-4-1BB 단클론항체-보호 효과에서 CD8⁺ T 세포의 중요성을 나타내는 CD4⁺ T 세포 또는 NK 세포에서 보다 적은 범위가 되는 것이 드러났다. 게다가, 항-4-1BB와 간의 MCA26 결장 암종을 가지는 마우스의 치료에서 생존이 증가하지는 않았으나 종양 성장이 현저히 감소(50%)하였다[Xu DP, Sauter BV, Huang TG, Meseck M, Woo SL, Chen SH (2005) The systemic administration of Ig-4-1BB ligand in combination with IL-12 gene transfer eradicates hepatic colon carcinoma. Gen Ther12:1526-1533].

최근 연구에서, Ju 등은 B16F10 흑색종 세포가 주입된 4-1BB+/+ 마우스가 4-1BB-/- 마우스보다 오래 생존하였다[Ju SA, Lee SC, Kwon TH, Heo SK, Park SM, Paek HN, Suh JH, Cho HR, Kwon B, Kwon BS, Kim BS (2005) Immunity to melanoma mediated by 4-1BB is associated with enhanced activity of tumor-infiltrating lymphocytes. Immunol Cell Biol 83:344-351]. 그러나, CD8⁺ T 세포- 및 IFN-γ-의존 방법으로 항-4-1BB를 처리하는 경우 4-1BB+/+ 마우스의 생존이 현저하다고 보고되었다(pronounced).

항-4-1BB 단클론항체 치료의 부작용 중 하나는 B 세포 기능 상실로 인한 것으로 보여진다[Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, Chen J, Koka R, Chen L, Fu YX (2003) Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 8:1405-1413]. 체액 면역성의 항-4-1BB 단클론항체-매개 상실이 자가항체 생산의 억제가 어려운 분리 동물 모델(discrete animal models)에서 유익하게 나타나더라도(예를 들면, 류마티스성 관절염 및 전신 홍반성 낭창[1 39-41]), 체액 면역성의 결손은 다른 모델, 특히 손상되지 않은 B 세포 기능이 바이러스 반응을 중화하는데 필요한 바이러스 모델에서 해로울 것이다. 항-4-1BB 단클론항체 치료와 결합하는 부작용의 일부를 피하기 위하여, Ye 등은 항-4-1BB 단일쇄 Fv를 발현하는 형질감염된 종양 세포가 주입된 마우스에서 흥미로운 전략을 세웠다[Ye Z, Hellstrom I, Hayden-Ledbetter M, Dahlin A, Ledbetter 1 JA, Hellstrom KE (2002) Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med 8:343-348]. 이 "설계된 종양 세포(engineered tumor cells)"는 감소된 부작용으로 강한 항-종양 면역 반응에 영향을 주었다. 그러나, 이러한 치료는 Sytwu 등이 췌장 베타 세포에서 항-4-1BB 단일쇄 Fv를 발현하도록 제조된 NOD 마우스에서 당뇨병의 발생이 증가되는 것을 관찰함으로써 일부 한계를 가지고 있음을 알게 되었다[Sytwu HK, Lin WD, Roffler SR, Hung JT, Sung HS, Wang CH, Cheng TL, Tsou SC, His, SC, Shen KL (2003) Anti-4-1BB-based immunotherapy for autoimmune diabetes: lessons from a transgenic non-obese diabetic (NOD) model. J Autoimmun 21:247-254]. 분명히 잘 조정될 필요가 있지만, 상기 연구들은 암 및 자가면역 질환을 치료하는 항-4-1BB 단클론항체 치료 형태에서 흥미로운 전략을 제공한다. 예를 들면, Sabel 등은 생체 내에서 항-인간 4-1BB 단클론항체를 종양 및 말초 혈액 림프구와 함께 SCID 마우스에 공동-주입하여 투여하면 림프구-매개 종양이 억제되지 않고 점진적으로 성장함을 증명하였다[Sabel MS, Conway TF, Chen FA, Bankert RB (2000) Monoclonal antibodies directed against the T-cell activation molecule CD137 (interleukin-A or 4- 1BB) block human lymphocyte-mediated suppression of tumor xenografts in severe combined immunodeficient mice. J Immunother 23:362-368]. 상기 실험에서 보호 제공의 실패는 항체-의존 세포질 독성에 의하여 선택적으로 전달된 말초 혈액 림프구를 죽이는 NK 세포의 활성으로 인하여 초래된다고 의심된다. NK 세포들이 항-asialo GM1-특이적 항체들에 의한 치료로 제거되는 경우, 항-인간 4-1BB 단클론항체 효과가 관찰된다. 부수적으로, 항-인간 4-1BB 단클론항체를 일원(one-way) 혼합된 림프구 반응에 첨가하여 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 증식을 지속하였다. 종양의 치료에서 항-4-1BB 항체의 생체 내 및 시험관 내에서의 역할을 비교하는 것은 항-4-1BB 단클론항체 치료의 이중 특성을 강조하는 가장 좋은 예이다.

다른 4-1 BB 시그널링 -매개 생체내 효과들: 생체 내에서 4-1BB 결찰이 B 세포 기능을 억제한다. Mittler 등은 항-4-1BB의 투여가 T-의존 항원들에 대한 체액 활성의 상실을 야기한다는 중요한 의견을 처음으로 제시하였다. 최근 조사에서 항-4-1BB 단클론항체를 투여한 마우스에서 체액 활성의 상실은 이들 마우스에서 면역성 결여(anergic) CD4⁺ T 세포와 서로 연관이 있음이 드러났다[Mittler RS, Bailey TS, Klussman K, Trailsmith MD, Hoffmann MK (1999) Anti-4-1BB monoclonal antibodies abrogate T-cell-dependent humoral immune responses in vivo through the induction of helper T cell anergy. J Exp Med 190:1535-1540]. 또 한편으로, Sun 등은 낭창증의 마우스(lupus-prone mice)에서 B 세포의 수 및 기능 상실은 CD4⁺ T 세포의 상실과 결합되었고 항-IFN-γ 단클론항체 처리로 중화되는 IFN-γ의 상향 조절이 결핍을 현저하게 회복하였다고 제안하였다[Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, Chen J, Koka R, Chen L, Fu YX (2003) Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 8:1405-1413].

최근, Sun 등은 항-4-1BB 단클론항체-매개 치료가 소포의 수지상세포(FDC)를 특이적으로 제거하여 배아 중심 생성(germinal center formation) 및 항체 생산을 유도하는 등의 이어지는 결과들을 방해한다고 제안하였다[Sun Y, Blink SE, Chen JH, Fu YX (2205) Regulation of follicular dendritic cell networks by activated T cells: the role of CD137 signaling. J Immunol 175:884-890]. 이들은 또한 항-4-1BB 단클론항체가 이해하기 힘든 현상으로 항원 자극의 부재에서도 B 세포 기능을 상실시킴을 관찰하였다[Foell J, Strahotin S, O' Neil SP, McClausland MM, Suwyn C, Haber M, Chander PN, Bapat AS, Yan XJ, Chiorazzi N, Hoffmann MK, Mittler RS (2003) CD137 costimulatory T cell receptor engagement reverses acute disease in lupus-prone NZB x NZB F1 mice. J Clin Invest 111:1505-1518]. 마우스의 B 세포 기능에서 항-4-1BB 단클론항체-매개 효과는 비인간 영장류 관련 실험들에서 실현됨을 입증하였다. Hong 등은 인간화된 항-4-1BB 단클론항체 치료가 비인간 영장류에서 T-의존 항원(난단백(ovalbumin))에 대한 체액 반응을 억제함을 증명하였다[Hong HJ, Lee JW, Park SS, Kang YJ, Chang SY, Kim KM, Kim JO, Murthy KK, Payne JS, Yoon SK, Park MJ, Kim IC, Kim JG, Kang CY (2000) A humanized anti-4-1BB monoclonal antibody suppresses antigen-induced humoral immune response in nonhuman primates. J Immunother 23:613-621]. 일괄 하여, 이 실험들은 항-4-1BB 단클론항체에 의한 B 세포의 기능 상실이 일부 질병 모델에서 보여지는 보호 면역을 유도하는 결과의 필수불가결한 구성임을 제시한다. 그러나 B 세포 기능 상실을 유도하는 분자 결과의 정확한 특성은 완전히 이해되지 않고 미지의 흥미진진한 분야로 남는다.

CD11c⁺CD8⁺ T 세포가 항-4-1BB의 이중 역할에 책임이 있다. 본 발명에서는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 거대 확장이 콜라겐-유도 관절염 모델[Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, Chen J, Koka R, Chen L, Fu YX (2003) Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 8:1405-1413] 뿐만 아니라 실험적 자가면역 포도막염, 흑색종(manuscript in preparation), 단순포진 바이러스 1형(herpes simplex virus type 1) 및 소수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus)와 같은 바이러스 감염 모델에서 항-4-1BB를 항원과 함께 투여할 때 발생되는 것을 발견하였다. 바이러스 감염 모델 및 종양 모델에서 CD11c⁺CD8⁺ T 세포는 매우 세포독성이 강하고 대다수의 바이러스 항원 특이적 CD8⁺ T 세포를 포함한다[Kim YH, Seo SK, Choi BK, Kang WJ, Kim CH, Lee SK, Kwon BS (2006) 4-1BB costimulation enhances HSV-1-specific CD8⁺ T cell responses by the induction of CD11c⁺CD8⁺ T cells. Cell Immunol in press]. 따라서, 본 발명자들은 항-4-1BB 증강 기능 및 억제 기능에 대한 겉으로 상반되는 이중 역할이 이 신규 CD11c⁺CD8⁺ T 세포 집단에 의해 중재됨을 제안하였다. 즉, CD11c⁺CD8⁺ T 세포들은 암 및 바이러스 감염에서 일차 킬러 세포가 되고 이들 세포에 의해 생산된 IFN-γ 수지상세포에서 IDO를 유도한 다음 유도된 IDO는 자가면역 질환 모델에서 항원-특이적 CD4⁺ T 세포의 억제자가 된다. 이에 대한 예외는 항-4-1BB와 함께 스타필로코커스 장독소 A(Staphylococcal enterotoxin A)와 같은 초항원(super-antigens)과 투여되는 경우뿐이다. 이 초항원이 항-4-1BB와 공동투여되는 경우 CD11c⁺CD8⁺ T 세포를 생산하였다 하더라도 결과적으로 CD4⁺ T 세포를 억제하지 못하지만 CD8⁺ T 세포수의 증가로 인해 그들의 수가 전체적으로 얼마간 증가한다.

또한 항-4-1BB 단클론항체에 의한 트립토판 결실을 초래한다. 인돌아민 2,3-옥시게나아제(Indoleamine 2,3-doxygenase, IDO)는 강력한 면역조절 효소이다. IDO의 발현은 생체 내 및 시험관내 T 세포 증식을 억제하는 대식세포 및 수지상세포를 차례로 특정할 수 있는 IFN-γ와 함께 상향 조절된다. IDO는 T 세포 증식을 진행하는데 필요한 필수 아미노산인 트립토판을 감소시킨다[Grohmann U, Fallarino F, Puccetti P (2003) Tolerance, DCs and tryptophan: much ado about IDO. Trends Immunol 24:242-249; 및 Mellor A, Munn DH (2004) IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nat Rev Immunol 4:762-774.]. Seo 등은 항-4-1BB 단클론항체 치료가 차례로 대식세포와 수지상세포에서 상향 조절하 는 IFN-γ를 증가시킴을 관찰하였고 IDO⁺ 대식세포와 수지상세포 사이에 상호작용 및 T 세포와 짝을 이루어 T 세포 활성을 억제 또는 제거함을 가정하였다. IDO-매개 면역 억제를 조절하는 항-4-1BB 단클론항체는 1-메틸 트립토판과 처리하는 경우 실제로 제거할 수 있었다[Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, Chen J, Koka R, Chen L, Fu YX (2003) Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 8:1405-1413]. 항-4-1BB에 의한 실험적 자가면역 포도막염 증후군 및 종양 생성 마우스에 대한 보호는 자기반응성 CD4⁺ T 세포 기능을 억제하는 증가된 IFN-γ 및 IDO 발현에 의한 트립토판 고갈을 차례로 포함한다. 항-4-1BB 단클론항체 결합 보호 효과의 이 새로운 개념들은 다양한 바이러스 임상 질환의 치료를 위한 부가적 방법을 열어주고 4-1BB 시그널링의 별개의 역할을 설명한다.

4-1BB는 공동자극 및 T 세포 생존에 관여하는 중요한 T 세포 분자이다. 4-1BB 시그널링의 시험관내 및 생체 내 사이에서의 구분이 명백하다. 시험관 내에서의 시그널링은 현저하게 CD8⁺ T 세포의 활성을 유도하고 보다 적은 양으로 CD4⁺ T 세포를 유도한다. 생체 내에서 4-1BB 시그널링은 생체 내에서 작용제적 항-4-1BB 단클론항체의 투여가 CD8⁺ T 세포의 거대 확장을 야기하고, CD4⁺ T 세포수와 기능을 억제/제거하며 B 세포 기능을 방해하며 IDO와 IFN-γ를 상향조절하고 단일 CD11c⁺CD8⁺ T 세포를 확장하여 일반적으로 공동자극 분자의 특징이 나타나는 중에 실제로 복합적이고 유일하다. 이들 CD11c⁺CD8⁺ T 세포들은 강력한 항-암 및 항-바이러스 작동체이다; 게다가 IFN-γ의 생산에 의하여 DC에서 IDO를 유도한다. 항-4-1BB 단클론항체 치료의 상기 언급된 모든 특징들은 다양한 임상 질환에 대한 보호를 성취하는 범위에서 중요한 역할을 한다.

그러나, 치료제로서 항-4-1BB 단클론항체의 사용을 생각할 때 가장 주의할 필요가 있다. CD4⁺ T 세포 기능의 억제 효과가 주어지는 것은, 이러한 치료가 온전한 CD4⁺ T 세포 기능이 보호 과정에서 주요 역할을 하는 모델에서 사용하는 경우 바람직하지 않다는 것을 제시한다. 게다가, 체액 면역의 항-4-1BB 단클론항체-매개 상실은 자가면역 과정에서는 유익할 수 있지만, 바이러스 모델과 컨쥬케이션에서 보는 경우, 항체 생산이 바이러스 감염을 중화하는데 매우 필요하다는 사실을 고려하여 특히 눈에 보이게 양자택일적이 된다. Ye 등[Ju SA, Lee SC, Kwon TH, Heo SK, Park SM, Paek HN, Suh JH, Cho HR, Kwon B, Kwon BS, Kim BS (2005) Immunity to melanoma mediated by 4-1BB is associated with enhanced activity of tumor-infiltrating lymphocytes. Immunol Cell Biol 83:344-351]에 의해 제시된 항-4-1BB 단일쇄 Fv를 사용하는 선택적 접근이 종양 모델에서 작용하는 것으로 보이기는 하나, Sytwu 등[Sytwu HK, Lin WD, Roffler SR, Hung JT, Sung HS, Wang CH, Cheng TL, Tsou SC, His, SC, Shen KL (2003) Anti-4-1BB-based immunotherapy for autoimmune diabetes: lessons from a transgenic non-obese diabetic (NOD) model. J Autoimmun 21:247-254]에 의해 입증된 결과는 췌장 베타 세포에서 항-4- 1BB 단일-fv를 발현하도록 형질감염된 NOD 마우스에서 당뇨병 발생이 증가되므로 이를 반박하는 것으로 보인다. 많은 특성 조사는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 특성을 이해하는데 직결되어 있다. CD11c⁺CD8⁺ T 세포가 어떻게 질병의 진행을 바꾸는지에 의하여, 그들의 부작용, 생체 내에서의 수명 및 시그널링 요구가 완전히 이해될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 항-4-1BB 단클론항체에 의한 4-1BB의 생체 내 결찰은 암, 바이러스 감염 및 자가면역 질환과 같이 다양한 임상적 이상의 진행을 거스르는 강력한 치료 방법을 제공한다.

이에 본 발명자들은 기존 온길이(full length) h4-1BB 리간드 서열에서 PCR 클로닝법을 이용하여 단백질의 생성 수율과 구조분석용 크리스탈이 잘 만들어지는 클론을 조사한 결과, 다른 동물의 서열에는 존재하지 않고 인간에만 존재하여 결합(binding) 등의 활성을 저해하는 C-말단(AGLPSPRSE) 부분을 제거한 클론 및 여기에서 두 개의 아미노산(P81L/T121S)이 변형된 유도체 클론이 온길이(full length) h4-1BB 리간드 보다 효과적임을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 온전한 4-1BB에 대한 4-1BB 리간드의 능력을 최적화하는 미니 h4-1BB 리간드를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역질환 치료용 조성물을 제공 하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 구조 기반 연속 결실(Structure-based serial deletion)-PCR 방법으로 세포외 도메인(Extracellular domain, 이하 'ECD'라 한다)의 아미노산 말단이 추가 제거된 서열번호 1 및 2의 미니 h4-1BB 리간드를 제공한다. 즉, 본 발명에서는 도 1에 도시된 온길이 h4-1BB 리간드의 F2 내지 R1 부위를 포함하는 서열번호 1의 미니 h4-1BB 리간드 및 F1 내지 R1 부위를 포함하는 서열번호 2의 미니 h4-1BB 리간드를 제공한다.

또한 본 발명에서는 두 개의 아미노산이 변형된 서열번호 3 및 4의 P81L/T121S 유도체 클론을 제공한다. 즉, 본 발명에서는 도 1에 도시된 온길이 h4-1BB 리간드의 F2 내지 R1 부위를 포함하고 두 개의 아미노산이 변형된(P81L/T121S) 서열번호 3의 미니 h4-1BB 리간드 및 F1 내지 R1 부위를 포함하고 두 개의 아미노산이 변형된(P81L/T121S) 서열번호 4의 미니 h4-1BB 리간드를 제공한다.

또 본 발명에서는 상기 서열번호 1 내지 4의 미니 h4-1BB 리간드 또는 그 유도체 클론을 포함하는 암 및 자가면역 질환 진단용 조성물을 제공한다.

4-1BB 리간드의 세포외 도메인(extracellular domain(ECD))에 기능을 부여하기 위하여, 본 발명자들은 4-1BB에 결합하는 능력이 조사된 에피토프-테그된 4-1BB 리간드를 발현하고 정제하였으며, 이것의 생물학적 시그널을 변환(transducer)하였다.

본 발명에 의한 서열번호 1 및 2의 미니 h4-1BB 리간드와 두 개의 아미노산이 변형된 서열번호 3 및 4의 P81L/T121S 유도체 클론은 수용체 결합 활성이 기존의 온길이 h4-1BB 리간드 보다 20-25배 높다.

4-1BB 리간드(CD137L)에서 C-말단 결실은 그 인지(cognitive) 수용체 4-1BB에 대한 4-1BB 리간드의 결합을 증강시킨다.

4-1BB/4-1BB 리간드는 활성화된 면역세포들에서 주로 발현되는 TNF 수용체/리간드 상과(superfamily)의 일종이다. 4-1BB/4-1BB 리간드는 면역반응에서 중요한 공동자극 분자로 알려져 있다. 본 발명자들은 인간 4-1BB에 결합하는 기능적 미니 인간 4-1BB 리간드를 생성하였다. 지식 기반 돌연변이반응(Knowledge-based mutagenesis)을 이용하는 결실 돌연변이체의 시리즈들은 그들의 기능적 양상을 얻기 위해 제작되고 사용되었다. C-말단 결실이 그들의 인지 수용체 4-1BB에 대한 4-1BB 리간드의 결합을 증강시키는 것을 확인하였다. 또한 그들의 활성을 잃지 않는 최소 크기의 분자를 제작하였다. 제작된 분자는 4-1BB에 대한 결합 활성이 20-25배 증가하였고, 효과적으로 기능적 상호작용을 나타내는 하류 시그널 전달 캐스캐이드를 유인하였다. 4-1BB 리간드 결합은 CD4 T 및 CD8 T-세포 활성을 보이고 T-세포 증식을 증강시켰다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 4의 미니 4-1BB 리간드 또는 그 유도체 클론을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역질환 치료용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명에서는 서열번호 1 내지 4의 미니 4-1BB 리간드 또는 그 유도체 클론을 유효성분으로 함유하여 체외에서 면역세포를 활성화 및 증폭하여 이용되는 면역질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 서열번호 1 내지 4의 미니 h4-1BB 리간드 또는 그 유도체 클론은 기존의 4-1BB에 대한 작용제적 단클론 항체 효과를 대신할 수 있는 천연 리간드의 효율적인 미니 형태(mini form)와 변형체로서 기존의 4-1BB 리간드와 비슷하거나 향상된 기능을 보이는 분자이므로 4-1BB 시그널링이 관여한다고 알려진 모든 적응증에 적용이 가능하다.

예를 들면, 암(미국특허공보 제6,303,121호 및 제6,887,673호, 및 한국 특허출원 제2005-43854호 및 제2006-0222030호), 류마티스성 관절염(미국특허공보 제6,569,997호 및 한국 공개특허공보 제2005-116981호), 전신 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)(미국특허공보 제6,569,997호 및 일본공개특허공보 제2005-536511호), 천식 및 아토피성 피부염과 같은 IgE-매개 질병(미국특허공개공보 제2003-223989호), HIV(미국특허공보 제6,303,121호, 제6,569,997호 및 제6,905,685호), 바이러스성 인플루엔자(미국특허공보 제6,905,685호), 당뇨(미국특허공보 제6,362,325호 및 제6,569,997호, 및 일본공개특허공보 제2005-536511호), 장기이식 거부반응(미국특허공보 제6,569,997호) 및 심장 관련 질환(미국특허공개공보 제2004-136992호)을 치료하기 위한 조성물로 사용이 가능하다.

또한 본 발명에 따른 치료용 조성물의 제형에는 특별히 한정되지 않으나, 경구투여용으로 구강용 또는 주사약제가 가능하며, 식품 첨가물로도 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분 말의 형태가 되어 경구용 제형, 피하주사, 정맥주사, 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수 있다.

경구용 제형의 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태로 제제화되며, 이는 단위 투여량 형태 및 다용량 용기에 담아서 완성품을 제조할 수 있다.

경구용 제형 중, 정제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘, 인산나트륨 등의 불활성 희석제; 옥수수, 녹말, 알긴산 등의 입자화제; 붕해제; 녹말, 젤라틴, 아카시아 등의 결합제; 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산, 탈크 등의 윤활제와 같이, 정제의 제조에 사용 가능한 부형제와 섞여진 상태로 제조될 수 있다. 정제는 코팅되지 않은 상태로 사용하거나, 위장관내의 흡수와 정제의 분해를 저해하기 위해 코팅하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트와 글리세릴디스테아레이트 등의 시간 저해 물질을 적용해도 좋다. 경질캅셀은 본 발명의 화합물을 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 등의 불활성 고체 희석제에 섞은 것이고, 연질캅셀은 물이나 혼합이 가능한 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), PEGs(polyethylene glycol), 에탄올 등의 용매와 땅콩기름, 액상 파라핀, 올리브 오일 등의 기름 용매에 활성성분을 섞은 것이다.

수용성 현탁제는 수용성 현탁제 제조에 적당한 부형제와 활성 성분을 함께 혼합한 것으로, 부형제로는, 예를 들면, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰 로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스검(gum tragacanth), 아카시아검(gum acacia) 등의 현탁화제; 폴리옥시에틸렌스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같이 긴 지방산에 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 폴리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들; 습윤제; 또는 분산화제 등이 있다. 수용성 현탁제는 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유한다.

유성 현탁제는 올리브유, 세사미유(sesami oil) 등의 식물성 오일 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일에 활성 성분을 현탁시킨 것으로, 예를 들어 비즈왁스, 경화 파라핀, 세틸 알코올 등의 농후제(thickening agent)를 함유한다. 또한, 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유하는데, 이러한 조성은 비타민 C 같은 항산화제를 가하여 보존할 수 있다.

분산성의 파우더와 입자는 분산화제, 습윤제, 현탁화제, 보존제 등을 넣어 함께 혼합한 상태로 활성 성분을 가지고 있다. 적절한 분산화제, 습윤제나 현탁화제는 앞서 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 부가적인 부형제는, 예를 들어, 감미료, 향신료, 착색제 등이 있다.

유중수형 유화액은 올리브유 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두레시틴(soy bean lecithin) 등의 자연산 인지질, 소르비탄모노올레이트와 같은 무수헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리 옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로하여 활성성분을 유화시킨 것 등이 있다.

시럽과 일릭서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨, 슈크로스 등의 감미료와 함께 활성성분을 혼합하여 제조될 수 있다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용가능한 희석제나 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 식염수 용액이 있다. 또한, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 이런 목적으로 섞는 무자극, 비휘발성 오일(bland fixed oil)은 합성 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 사용한다. 또한, 올레인산과 같은 지방산을 주사제 마련에 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여할 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

본 발명에서 사용하는 마그네틱 비즈(Magnetic beads)는 DYNAL에서 구입하였고, Ni-NTA 플레이트는 Qiagen(Valencia, CA)에서 구입하였다. 또한 본 발명에서 사용하는 특이 단클론항체들은 Croft M (2003) Costimulation of T cells by OX-40, 4-1BB, and CD27. Cytokine Growth factor Rev 14:265-273에 기재되어 있으며, 단클론항체들은 항체 용액 ml당 1mg에 대하여 1.46의 소광계수(extinction coefficient)를 이용하여 정제하고 정량하였다.

h4-1BB 리간드, DNA 구조체, 부위특이적 돌연변이 및 서열화의 이차원적 모델링에서 이차 구조를 분석하는데 nnPredict(www.cmpharm.ucsf.edu/∼nomi/nnpredict.html) 및 jppred (http://www.compbio.dundee.ac.uk/∼www-jpred/submit.html)를 사용하였다.

PCR(Polymerase chain reactions)은 시판되는 프라이머 세트(Primer3, Whitehead Institute)로 부위특이적 돌연변이하는데 이용되었다. 모든 돌연변이체들은 오토메이션화된 PCR 서열화를 통하여 서열화되고 확인되었다(IRC, Sequencing Core Facility).

[실시예 1] 미니 h4-1BB 리간드 및 그 유도체 클론 선별을 위한 h4-1BB 리간드 돌연변이 단백질 제조

<h4-1BB 리간드의 돌연변이 제작>

도 1은 h4-1BB 리간드의 아미노산 서열 및 돌연변이 반응을 위해 제작한 프라이머를 나타낸다. 프라이머의 각 조합은 결실 돌연변이 시리즈에 나타내었다. 즉, 온길이 h4-1BB 리간드의 F1 내지 전체 말단 부위를 포함하는 FL; F1 내지 R1 부위를 포함하는 D0(서열번호 2); F1 내지 R2 부위를 포함하는 D1; F1 내지 R3 부위를 포함하는 D2; F1 내지 R4 부위를 포함하는 D3; F2 내지 R1 부위를 포함하는 D4(서열번호 1); F3 내지 R1 부위를 포함하는 D5; F4 내지 R1 부위를 포함하는 D6; F5 내지 R1 부위를 포함하는 D7; 및 F5 내지 R4 부위를 포함하는 D8;의 돌연변이를 각각 제조하였으며, 각 표적 유전자의 특이적인 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다(서열번호 5 내지 22). P81L/ T121S 점 돌연변이(point mutation)는 PCR 반응 중 무작위적 돌연변이(random mutation)로 생성되었으며, 염기서열 확인 후 효과적 단백질 생성이 확인되어 분석에 포함시켰다.

D0. t4-1BBL	Forward (Bam HI, 27mer)	5'-CGCGGATCCGGCATGTTTGCGCAGCTG-3' (서열번호 5)
	Reverse (Xho I, 30mer)	5'-GCGCTCGAGTTATGGGATTTCGGGGGTCAC-3' (서열번호 6)
D1. h4-1BBL dCt-1	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF1	5'-CGCGGATCCGCTCGCGCCTCGCCCGGC-3' (서열번호 7)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR2	5'-CCGCTCGAGGAGTCCCAAGACTGTGGC-3' (서열번호 8)
D2. h4-1BBL dCt-2	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF1	5'-CGCGGATCCGCTCGCGCCTCGCCCGGC-3' (서열번호 9)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR3	5'-CCGCTCGAGGCCCTGGGTAAGCTGCCA-3' (서열번호 10)
D3. h4-1BBL dCt-3	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF1	5'-CGCGGATCCGCTCGCGCCTCGCCCGGC-3' (서열번호 11)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR4	5'-CCGCTCGAGGTGAAGATGGACGCCCAG-3' (서열번호 12)
D4. h4-1BBL dNt-1	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF2	5'-CGCGGATCCAGCCCGAGACTCCGCGAG-3' (서열번호 13)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR1	5'-CCGCTCGAGTGGGATTTCGGGGGTCAC-3' (서열번호 14)
D5. h4-1BBL dNt-2	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF3	5'-CGCGGATCCGCCGGCCTCTTGGACCTG-3' (서열번호 15)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR1	5'-CCGCTCGAGTGGGATTTCGGGGGTCAC-3' (서열번호 16)
D6. h4-1BBL dNt-3	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF4	5'-CGCGGATCCGATGGGCCCCTGAGCTGG-3' (서열번호 17)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR1	5'-CCGCTCGAGTGGGATTTCGGGGGTCAC-3' (서열번호 18)
D7. h4-1BBL dNt-4	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF5	5'-CGCGGATCCACGGGGGGCCTGAGCTAC-3' (서열번호 19)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR1	5'-CCGCTCGAGTGGGATTTCGGGGGTCAC-3' (서열번호 20)
D8. h4-1BBL dNCt	Forward (Bam HI, 27mer): H4LF5	5'-CGCGGATCCACGGGGGGCCTGAGCTAC-3' (서열번호 21)
	Reverse (Xho I, 27mer): H4LR4	5'-CCGCTCGAGGTGAAGATGGACGCCCAG-3' (서열번호 22)

PCR 조건은 다음과 같다: D1, D3 및 D8번은 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 51℃에서 30초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 30초간 확장(extention)하는 사이클을 30회 반복하고, D2, D4, D5, D6 및 D7번은 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 53℃에서 30초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 30초간 변성(extention)하는 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. PCR 산물은 1.2% 아가로스 젤에서 확인하였다.

여기서 얻은 산물을　pGEM T-easy 플라스미드에 삽입하여 X-gal과 IPTG가 들어있는 플레이트에 첫 번째로 클로닝하였다. 그 후 제한효소 BamH I과 Xho I로 절단하여 pGEX6P-1 플라스미드에 삽입하여　염기서열을 확인한 후에 다음 단계에 사용하였다.

<h4-1BB 리간드 및 그 돌연변이 단백질 발현을 위한 초기배양>

50ug/ml 암피실린(Ampicillin)을 첨가한 20ml LB배지(Luria Bertani broth)에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음 4000×g에서 5분 동안 원심분리해서 상층액을 제거하고 동일량의 새로운 LB+50ug/ml 암피실린(Ampicillin)을 넣어준 후 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 잘 섞어주었다.

섞인 배양액을 새로운 LB 배지에 h4-1BB 리간드 혹은 돌연변이 pGEX6P-1 플라스미드를 형질전환(transformation)한 오리가미 대장균(Origami E. coli)을 1/100 볼륨으로 접종한 다음, OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 37℃에서 배양하고, 배양액을 20℃ 물에 담군 후 10분 후에 최종농도 0.5mM IPTG를 첨가하여 20℃에서 2시간 배양하였다.

<h4-1BB 리간드 발현을 위한 본 배양>

TP(Tryptone Phosphate) 배지: 2% 박토-트립톤(bacto-tryptone), 0.2% Na₂HPO₄, 0.1% KH₂PO₄, 0.8% NaCl, 1.5% 효모 추출물 및 0.2% 글루코오스.

20ml TP+50ug/ml 암피실린(Ampicillin) 배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후 4000xg에서 5분 동안 원심분리해서 상층액을 제거하고 동일량의 새로운 TP+50ug/ml 암피실린을 넣어준 다음 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 잘 섞어주었다.

섞인 배양액을 새로운 TP 배지에 1/100 볼륨으로 접종한 다음, OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 37℃에서 배양하고, 배양액을 20℃ 물에 담군 후 10분 후에 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가하여 20℃에서 2시간 배양하였다.

수득 후 건조 전 중량(wet weight)의 0.5∼1 부피(volume)의 1xPBS를 첨가하고 볼텍싱(vortexing)해서 액체질소에 급냉시켜 -80℃에 보관하였다.

<세포 용해(cell lysis)>

상기 샘플들을 얼음 속에서 서서히 녹인 후 배양액 부피(culture volume) 400ml:음파파쇄 부피(Snication volume) 20ml 의 비율로 1×PBS를 넣고 볼텍싱(vortexing)해서 섞어준 다음 1mM PMSF, 0.5mM DTT 및 200ug/ml 리소자임(Lysozyme)을 첨가하고 얼음 속에서 1∼1.5시간 항온배양하였다.

<음파파쇄(Sonication)>

Duty cycle: 30%, Output: 2.5, Time: 5min × 2times의 조건으로 음파파쇄(Branson) 한 다음 A8.24로터(Kontron)에 15,000rpm의 속도로 30분간 원심분리 하였다. 50ml 원뿔형 튜브(conical tube)에 상층액을 옮기고 6000g에서 5분간 원심분리를 하고, 얼음으로 감싸진 브레이커(beaker)로 옮겼다.

<친화성 크로마토그래피>

글루타치온 세파로오스 4B(Glutathione Sepharose 4B, amerham pharmacia biotech AB) 레진을 5ml 크로마토그래피 칼럼(Novagen)에 패킹(packing)한 다음 10ml의 1×PBS로 평형화(equilibration)시킨 다음 1×PBS에서 투석한 전체 단백질 추출물을 결합시키고, 10ml의 1×PBS로 10번 통과시켜 세척한 후 1ml의 글루타치온 용리 완충액(Glutathione Elution buffer: 30mM 글루타치온, 100mM 트리스-HCl, pH 8.0 및 120mM NaCl)을 첨가하고, 30분 동안 항온배양한 다음 용리하였다(1∼5). 정밀 프로테아제(Precision protease)를 처리하여(1.0ug/ml 효소:기질 1:50, 상온에서 1hr) GST를 자른 후에, 글루타치온 세파로오스를 통과하여 정제된 h4-1BB 리간드 및 돌연변이 단백질을 얻었다.

도 2는 h4-1BB 리간드의 세포외 도메인(extracellular domain) 및 그 돌연변이체가 오리가미 대장균(Origami E. coli) 균주에서 GST-융합 형태로 성공적으로 발현되었음을 보여준다. 가용성 분획들을 박테리아 용균액(lysate)으로부터 수집하고 글루타치온-세파로오스(glutathioin-Sepharose)로 정제하였다. 순도는 85-90%이었다. 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 부분(Glutathione-S-Transferase moiety)은 정확한 프로테아제에 의해 절단되었고(도 3) 글루타치온-세파로오스에 의해 제거되었다.

[시험예 1] h4-1BB 리간드 및 그 돌연변이 단백질(D0∼D8)의 친화력 결정

쥬켓 8-1(stably transfected 4-1BB, patent 등록됨, 권병세)을 이용해서 h4-1BB 리간드 및 그 돌연변이 단백질(D0∼D8)의 친화력을 알아보았다.

쥬켓 8-1(안정된 4-1BB 발현 T 세포주)로부터 4-1BB의 발현을 측정하기 위하여, 쥬켓 8-1 세포를 Fc 수용체를 차단하기 위하여 AB 혈청에서 예비-항온배양한 다음 PE-항-4-1BB 또는 -동형상(isotype)-대조군 항체로 염색하였으며, 그 결과를 도 4A에 나타내었다.

4-1BB와 그 리간드인 4-1BB 리간드 사이의 결합 친화력을 평가하기 위하여, 쥬켓 8-1 세포를 상온에서 40분간 4-1BB 단백질 0.5㎍/ml과 함께 항온배양한 후 세포를 세척하고 Fc 수용체를 차단하기 위하여 AB 혈청에서 항온배양한 다음 PE-항-4-1BB 또는 -동형상(isotype)-대조군 항체로 염색하였으며, 그 결과를 도 4B에 나타내었다. 모든 샘플들은 FACScan으로 분석하였다.

4-1BB 발현 및 4-1BB 리간드 단백질의 결합 친화력은 쥬켓(jurkat) 8-1 세포에서 정량하였다(도 4). 4-1BB는 세포의 94% 이상에서 안정하게 발현되었다(도 4A). 4-1BB 리간드(Del 0, 서열번호 2)은 C-말단이 제거된 경우 발현된 4-1BB와 효과적으로 결합한 반면 동형상(isotype) 대조군은 배경 시그널(background signal)만을 보였다.

먼저, 쥬켓(jurkat) 8-1(2x10⁵/250ul RPMI with 10% FBS)을 분주한 다음, h4-1BB 리간드(h4-1BBL ECD) 및 서열번호 1 및 2 의 단백질(D4, h4-1BBL Del0)을 0.005, 0.02, 0.1 및 0.5ug/ml의 농도로 처리한 후 상온에서 40분 동안 항온배양하였다. 상기 배양액에 h4-1BBL-PE 항체를 처리한 다음 20분간 항온배양한 후 FACS 완충액 이용해서 세척하였다. FACS 분석을 통하여 4-1BB 리간드의 결합(binding)을 정량분석하였다.

<웨스턴 블랏 분석>

쥬켓 8-1(transfected 4-1BB)을 이용해서 h4-1BB 리간드 단백질을 이용한 샘플링을 하기 방법으로 실시하였다.

1. 쥬켓 8-1(1×10⁶/1ml RPMI with 10% FBS)을 분주한 다음, 0.5ug/ml 신규 h4-1BB 리간드 처리하였다.

2. NT, 5, 30, 60, 90 및 120분동안 항온배양하였다.

3. 얼음-냉각(ice-cold) PBS를 이용해서 세척하였다(1800rpm, 5min).

4. 젠틀 용해 완충액(gentle lysis buffer)을 45ul로 용해하여 얼음 상에서 30분간 항온배양하였다.

5. 14000rpm에서 20분간 원심분리하였다.

6. 20ug 단백질을 이용해서 웨스턴블랏을 수행하였다.

7. 12% SDS-PAGE 겔(85 volts)을 이용하여 전기영동하였다.

8. 85 volts 에서 1시간 30분간 전이하였다.

9. 5% 탈지 우유(skim milk)에서 1시간동안 차단하였다.

10. 저온시스템(cold room)에서 하룻밤 동안 Lck, 인산화된(phosphorylated) Lck, Bcl-2(1:1000 2.5% skim milk) 및 IkB-a(1:1000 2.5% skim milk).

도 5의 결과를 보면, 온길이 4-1BB(h4-1BBL ECD) 및 그 돌연변이 단백질(D4, h4-1BBL Del0)의 결합 친화력이 농도에 의존하여 증가하였고, 본 발명에 의한 서열번호 1 및 2 의 돌연변이 단백질(D4, h4-1BBL Del0)의 결합 친화력이 온길이 4-1BB(h4-1BBL FL ECD) 보다 많게는 20-25배 정도 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 따라서, 결실 돌연변이 시리즈를 기초로 한 이해는 이차 구조 위상 예측(secondary structure topology prediction)을 기초로 생성되었다. 결합 친화력을 도 6에서 비교하였다.

상기 결합은 C-말단 베타-시트 구조가 제거될 때 증가하였다(D0 및 D4). C-말단의 더 많은 결실은 전체 결합 친화력을 상실시켰다(D1, D2, 및 D3). 상기 결과는 C-말단의 LFRVTPEIP 펩타이드 영역이 결합에 결정적인 부분임을 가리킨다. N-말단의 18개 아미노산은 결합 친화력의 어떠한 상실도 없이 제거될 수 있었다(D4). 또한 15개 이상의 아미노산(SPRLREGPELSPDDP)의 결실은 전체 결합 친화력의 상실을 초래하였고(D5), 이는 상기 SPRLREGPELSPDDP 영역이 N-말단 기부 영역에서 결합 부위임을 가리킨다. 본 발명에 의한 미니 h-4-1BB 리간드를 제안한 결과, 온전한 결합 친화력을 보였다.

[시험예 2] CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서의 결합 친화력 확인

활성화된 일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 4-1BB의 발현 및 4-1BB 리간드 단백질의 결합 친화력을 알아보기 위하여 하기 시험을 수행하였다.

<공초점 현미경을 이용한 국부면역법(Immunolocalization)>

정제된 인간 PBMC는 RPMI-10%에서 48시간 동안 둔 다음 시험관 내에서 항-CD3(OKT-3) 0.1㎍/ml로 다시 24시간 동안 자극하였다. 자극 세포들을 24시간 항온배양한 후 수득하였다.

(A) 활성화된 인간 CD8⁺ T 세포로부터 4-1BB의 발현을 측정하기 위하여, 상기 자극 세포들은 Fc 수용체들을 차단하는 AB 혈청에서 예비-항온 배양된 FITC-항-CD8 및 PE-항-4-1BB 단클론항체로 염색하였다.

(B) 4-1BB와 그 리간드인 4-1BB 리간드 사이의 결합 친화력을 평가하기 위하여, 자극 세포들과 항-CD3 단클론항체를 4-1BB 리간드 단백질 0.5 ㎍/ml과 함께 상온에서 40분간 항온배양하였다. 그런 다음 세포를 세척하고 차단한 다음 FITC-항-CD8(또는 FITC-항-CD4) 및 PE-항-4-1BB 리간드 단클론항체 또는 동형상-대조군 항체(isotype-control Ab)로 염색하였다. 세척 후 염색된 세포를 폴리리신(polylysine)이 코팅된 슬라이드에 부착하였다. 상기 슬라이드를 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope)에 올려놓고 가시화하였다.

<4-1BB 리간드 단백질의 기능 분석>

인간 PBMC는 밀도차 원심분리 방법(Ficoll-hypaque density gradient centrifugation)에 의해 말초 혈액으로부터 분리하였다. 정제된 인간 PBMC를 RPMI-10%에 48시간 동안 둔 다음 시험관 내에서 다시 24시간 동안 항체로 자극하였다. 항-CD3(OKT-3, 0.01㎍/ml), 래트 IgG (0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). 항체로 자극한 다음 24-72시간에서 촬영하였다.

<일차인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 증식>

인간 PBMC를 밀도차 원심분리 방법에 의하여 말초 혈액으로부터 분리하였고, CD4⁺ T 또는 CD8⁺ T 세포는 MACS 마그네틱 시스템을 이용하여 분리하였다. 정제된 인간 T 세포를 RPMI-10%에 48시간 동안 둔 다음 시험관 내에서 다시 96시간 동안 항체로 자극하였다. 항-CD3(OKT-3, 0.05㎍/ml), 래트 IgG(0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). [³H]-티미딘(thymidine) 결합을 평가하기 위하여, 배양한 세포를 마지막 12시간동안 [³H]-티미딘(1μCi/공)으로 고동치고(pulsed), 유리섬유막 매트(glass fiber filter mats)에서 수확한 다음 액체섬광계수(liquid scintillation counting)로 [³H]-티미딘 결합을 분석하였다.

상기 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다. FACS는 인간 일차 CD8⁺ T 세포(도 7) 및 CD4⁺ T 세포(도 8)뿐만 아니라 쥬켓 8-1 제작 세포주의 사용으로 확인되는 결합 활성을 보이는 결과를 정량할 수 있다.

h4-1BB 리간드의 결합 표면은 국부면역법(immunolocalization) 및 공초점 현미경으로 검출되었다(도 9). h4-1BB 리간드 결합은 사실 Lck 및 아마도 LAT, CD3 서브유닛을 인산화하는 하류 신호를 자극하였다(도 9). 이 결과는 h4-1BB 리간드가 기능적으로 효과적인 결합을 받을 만 함을 시사한다.

[시험예 3] 시그널링 유도 확인

4-1BB 리간드의 부착이 증가하는 것을 확인한 후, 이 부착의 결과 실제 효과를 위한 시그널링이 전달됨을 확인하였다.

세포는 지속적으로 4-1BB를 발현하고 있는 T 세포 주인 쥬켓 8-1을 사용하였다.

쥬켓 8-1은 10% FBS가 들어있는 RPMI의 배지에서 키우다가 실험 하루 전에 0.5% 가사 상태(serum starvation)로 배양하였다. 이 세포에 새로 제작한 돌연변이 h4-1BBLdNt-1을 시간 별로 처리하여 원심분리로 모은 후, 1×dPBS로 한번 세척한 다음, 용균 완충액(10mM NaCl, 50mM 트리스-HCl(pH7.4), 0.5% NP-40, 5mM NaF, 0.1mM Na₃VO₄, 1mM 벤즈아미드(Benzamide), 5mM EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail))을 이용하여 단백질을 분리하였다.

각 샘플 당 일정한 농도의 단백질을 6×샘플 완충액으로 희석시킨 후 5분간 끓여서 변성시켰다. 12% SDS-PAGE 젤을 이용하여 분리한 다음 니트로셀룰로오스막(Millipore, Bedford, MA)으로 전달하였다. 블로킹(blocking)과 일차 항체(phospho-tyrosine, 4G10, upstate), 이차 항체-HRP(mouse IgG HRP, santa cruz)를 사용하였다. ECL(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, England)에 의해서 발색을 확인하였다.

항 4-1BB 단클론 항체 4B4로 자극되었을 때, LCK 등의 시그널링 분자의 인산화를 통해 NFkB의 활성화가 일어남이 알려져 있다. 도 10에서와 같이 h4-1BBL Del 4로 자극하였을 때에도 자극하지 않은 대조구(NT)와 비교하여, 자극 후 15-45분에 걸쳐 LCK의 티로신 잔기에 인산화가 일어남을 보여 주었고, 자극 후 45분에 대조구(NT), 4B4와 동일 젤상에서 비교하였을 때에도 4B4와 비슷한 정도로 LCK 인산화 시그널링을 야기할 수 있음을 볼 수 있었으며 LAT, CD3 부착단백질의 인산화 시그널링에도 영향을 주어 다음 생체 활성화가 이러한 생화학적 시그널링의 활성화로부터 시작됨을 알 수 있었다. 동량의 단백질이 실험에 사용된 것을 LCK 항체를 이용하여 확인할 수 있었다. 결과적으로 h4-1BBL은 부착이 될 뿐 아니라, 부착을 통한 실제 생화학적 효과를 보임을 확인할 수 있었다.

[시험예 4] 4-1BB 리간드 기능 분석

인간 PBMC는 밀도차 원심분리 방법에 의하여 말초 혈액으로부터 분리하였다. 정제된 인간 PBMC를 48시간 동안 RPMI-10%에 둔 다음 다시 시험관 내에서 24시간 동안 항체로 자극하였다. 항-CD3(OKT-3, 0.05㎍/ml), 래트 IgG (0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). 항체로 자극하고 24시간이 지난 후 사진을 도 11에 나타내었다.

인간 PBMC는 밀도차 원심분리 방법에 의하여 말초 혈액으로부터 분리하였고 CD4⁺ T 또는 CD8⁺ T 세포는 MACS 마그네틱 시스템을 사용하여 정제하였다. 정제된 인간 T 세포는 48시간 동안 RPMI-10%에 둔 다음 다시 시험관 내에서 72시간 동안 항체로 자극하였다. 항-CD3(OKT-3, 0.05㎍/ml), 래트 IgG(0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). 항체로 자극하고 72시간이 지난 후 사진을 도 12 및 도 13에 나타내었다.

또한 본 발명에 의한 서열번호 3의 미니 4-1BB 리간드 단백질 활성 결합은 자극 후에 인간 PBMC(도 11), CD4⁺ T 세포(도 12) 및 CD8⁺ T 세포(도 13)의 덩어리 생성으로 인하여 확인되었다.

<일차인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 증식>

인간 PBMC를 밀도차 원심분리 방법에 의하여 말초 혈액으로부터 분리하였고, CD4⁺ T 또는 CD8⁺ T 세포는 MACS 마그네틱 시스템을 이용하여 분리하였다. 정제된 인간 T 세포를 RPMI-10%에 48시간 동안 둔 다음 시험관 내에서 다시 96시간 동안 항체로 자극하였다. 항-CD3(OKT-3, 0.05㎍/ml), 래트 IgG(0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). [³H]-티미딘(thymidine) 결합을 평가하기 위하여, 배양한 세포를 마지막 12시간동안 [³H]-티미딘(1μCi/공)으로 고동치고(pulsed), 유리섬유막 매트(glass fiber filter mats)에서 수확한 다음 액체섬광계수(liquid scintillation counting)로 [³H]-티미딘 결합을 분석하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14의 결과에서, 본 발명에 의한 서열번호 1의 4-1BB 리간드는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 세포증식을 촉진하였으며 CD8+ T 세포의 경우 기존 항체 자극보다도 약 15% 더 촉진하는 것을 확인하였다.

[시험예 5]

<일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 IFN-γ 생산>

인간 PBMC는 밀도차 원심분리 방법에 의하여 말초 혈액으로부터 분리하였고 CD4⁺ T 또는 CD8⁺ T 세포는 MACS 마그네틱 시스템을 사용하여 정제하였다. 정제된 인간 T 세포는 48시간 동안 RPMI-10%에 둔 다음 다시 시험관 내에서 72시간 동안 항체로 자극하였다. 항-CD3(OKT-3, 0.05㎍/ml), 래트 IgG(0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). IFN-γ 단백질은 ELISA에 의해 CD4⁺ T (A) 및 CD8⁺ T (B) 세포의 배양 상층액에서 측정하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15의 결과, 본 발명에 의한 서열번호 3의 미니 4-1BB 리간드 단백질은 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 IFN-γ 생성을 촉진하였다.

<일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 IL-2 생산>

인간 PBMC는 밀도차 원심분리 방법에 의해 말초 혈액에서 분리하였고, CD4⁺ T 또는 CD8⁺ T 세포는 MACS 마그네틱 시스템을 사용하여 정제하였다. 정제된 인간 T 세포는 RPMI-10% 에서 48시간 동안 둔 다음 시험관 내에서 다시 72시간 동안 상기와 같이 항체로 자극하였다. 항-CD3(OKT-3, 0.05㎍/ml), 래트 IgG(0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). IL-2 단백질은 CD4⁺ T (A) 및 CD8⁺ T (B) 세포의 배양 상층액에서 ELISA에 의해 결정하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16의 결과, 본 발명에 의한 서열번호 3의 미니 4-1BB 리간드 단백질은 CD4 세포에서 4B4 작용제적(agonistic) 단클론항체 치료제와 동일한 자극 효능을 보였다.

<일차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포에서 증식>

인간 PBMC는 밀도차 원심분리 방법에 의해 말초 혈액에서 분리하였고, CD4⁺ T 또는 CD8⁺ T 세포는 MACS 마그네틱 시스템을 사용하여 정제하였다. 정제된 인간 T 세포는 RPMI-10% 에서 48시간 동안 둔 다음 시험관 내에서 다시 72시간동안 상기와 같이 항체로 자극하였다. 항-CD3(CD4 T 세포 자극을 위한 OKT-3, 0.1㎍/ml 및 CD8 T 세포 자극을 위한 OKT-3, 0.2㎍/ml), 래트 IgG(0.5㎍/ml), 항-4-1BB(4B4, 0.5㎍/ml), 항-CD28(9.3, 0.5㎍/ml) 및/또는 4-1BB 리간드 단백질(0.5㎍/ml). [³H]-티미딘 결합을 위하여, 배양된 세포에 마지막 12시간 동안 [³H]-티미딘(1μCi/well)으로 처리하고 유리 섬유 여과 매트에서 수득한 다음 액체 섬광 계측(liquid scintillation counting)에 의하여 [³H]-티미딘 결합을 분석하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17의 결과에서, 본 발명에 의한 서열번호 3의 h4-1BB 리간드 D4(P81L/T121S) 돌연변이 단백질은 유사하거나 높은 활성의 T 세포 증식을 보였다.

상기 결과들로부터 본 발명에 의한 서열번호 1 내지 4의 미니 h4-1BB 리간드 단백질 및 그 유도체들이 4-1BB 시그널링을 표적하는 치료적 단클론항체의 효과적이고 개선된 대체물임을 확인할 수 있었다.

h4-1BB 리간드는 4-1BB에 대한 작용제적 단클론항체와 비교하여 동등하거나 보다 나은 시그널을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 상기 결과로부터 본 발명에 의한 h4-1BB 리간드가 알려진 4-1BB 시그널링-매개 효과에 의하여 관련 질병의 치료를 위하여 적용할 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 서열번호 1 내지 4의 인간 4-1BB 리간드 단백질은 인간 4-1BB와 효율적인 생화학적 결합 활성을 가지고, 이로 인한 시그널링(signaling) 결과, 생물학적 활성증가(activation) 및 CD4⁺ T-세포와 CD8⁺ T-세포의 효과적인 증폭 및 인터페론 감마 등 활성물질의 증폭을 초래하여 면역질환 치료에 유용할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 인간 4-1BB에 결합하는 서열번호 1 및 2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 가지는 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질.
2. 제 1항에 의한 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus, SLE), 천식, 아토피성 피부염, HIV, 바이러스성 인플루엔자, 당뇨, 장기이식 거부반응 및 심장 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질병을 치료하기 위한 치료용 조성물.
3. 제 1항에 의한 미니 인간 4-1BB 리간드 단백질을 유효성분으로 함유하여 체외에서 면역세포를 활성화 및 증폭하여 이용되는 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus, SLE), 천식, 아토피성 피부염, HIV, 바이러스성 인플루엔자, 당뇨, 장기이식 거부반응 및 심장 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질병을 치료하기 위한 치료용 조성물.

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