KR100844189B1 - [ ]Spirulina platensis M20CJK3[KCTC11127BP] characterized by enhanced floatation of its cell - Google Patents

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김충재
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안치용
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Abstract

A Spirulina platensis M20CJK3 strain is provided to be adequate for mass-culturing due to increased floatation of its cell and morphological improvement by treating Spirulina platensis AG20590 with EMS(ethylmethane sulfonate). A Spirulina platensis M20CJK3 with enhanced floatation of its cell is deposited as a deposition no. KCTC11127BP and is characterized in that it has 60-99% of the cell floatation, a coil number of 5-7.5/trichome and a coil pitch of 1-55 micrometer(s).

Description

조체의 부상성이 향상된 스피루리나 플라텐시스 Ｍ２０ＣＪＫ３[ＫＣＴＣ １１１２７ＢＰ]{Spirulina platensis M20CJK3[KCTC11127BP] characterized by enhanced floatation of its cell}Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC11127BP] characterized by enhanced floatation of its cell}

도 1은 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis) AG20590[KCTC 11039BP]의 형태적 특징을 보여주는 현미경 사진이다(200배 배율).1 is a micrograph showing the morphological characteristics of Spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] (200 × magnification).

도 2는 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]과 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 cpcBA-IGS 유전자 염기서열을 비교한 그림이다(염기서열의 불일치 부분은 붉은색으로 나타냄).Figure 2 is a diagram comparing the cpcBA- IGS gene sequence of the spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] and the mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] (unmatched portions of the base sequence is shown in red).

도 3는 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]과 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 배양을 통한 부상성을 비교한 그래프이다.Figure 3 is a graph comparing the flotation through the culture of spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] and mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP].

도 4는 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP] 및 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]을 1시간 동안 정치한 후의 부상성을 나타낸 사진(A, 정치 직후의 조체; B, 1시간 경과 후의 조체)이다. Figure 4 is a photograph showing the injury after standing spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] and mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] for 1 hour (A, the body immediately after standing; B, after 1 hour elapsed) Body).

도 5는 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]과 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 배양을 통한 세포사의 코일 수의 변화 를 나타낸 그래프이다.Figure 5 is a graph showing the change in the number of coils of cell death through the culture of spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] and mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP].

도 6은 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]과 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 배양을 통한 세포사의 코일간 거리(pitch)를 비교한 그래프이다.FIG. 6 is a graph comparing the pitch between coils of cell death through culturing of spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] and the mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP].

도 7은 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]과 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 배양 6일째의 형태적 특징을 비교한 사진이다.Figure 7 is a photograph comparing the morphological characteristics of the spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] and the mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] on the 6th day of culture.

본 발명은 조체의 부상활성이 향상된 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 건강보조식품, 생리활성물질, 가축 및 애완동물의 사료 등으로 이용되고 있는 남세균(cyanobacteria) 스피루리나 플라텐시스(Spirulina) AG20590[KCTC 11039BP]에 돌연변이 유도물질인 EMS(ethylmethane sulfonate) 처리하여 조체의 부상활성이 증가되어 배양시 간편하고 경제적인 수확을 가능하게 하고 형태적으로는 코일이 촘촘하게 감긴 세포사(thrichome)의 형태를 갖는 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis) M20CJK3[KCTC 11127BP]에 관한 것이다.The present invention relates to spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] with improved floating activity of the present invention, and more specifically, cyanobacteria spirulina, which is used as dietary supplements, bioactive substances, livestock and pet foods. Treatment of Spirulina AG20590 [KCTC 11039BP] with mutant inducer (EMS) (ethylmethane sulfonate) increases the floating activity of the cells, allowing for convenient and economical harvesting in culture and morphologically wound coiled cells mutant strain Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] in the form of a thrichome.

스피루리나(Spirulina)는 사상형의 단세포성 남세균(cyanobacteria)으로 열 대, 아열대 지역의 bicarbonate가 풍부한 알칼리성의 환경에서 잘 증식하는 특징을 갖고 있다. 스피루리나는 풍부한 단백질 함량(60 ~ 70%), 비타민(vitamin B12, provitamin A), 필수아미노산, 미네랄, 필수지방산 함유 및 불포화 지방산인 GLA(gamma-linolenic acid)를 다량 함유하여 혈액순환 및 면역 강화제로 유용하여, 애완동물용 사료첨가제, 수산양식용 사료첨가제 및 건강보조식품으로 널리 이용되고 있다[Belay, A., 2004, The potential application of Spirulina (Arthrospira) as a nutritional and therapeutic supplement in health management]. Spirulina (Spirulina) has a characteristic that a well-grown in a rich bicarbonate alkaline environment of a tropical, sub-tropical regions in single cell St. cyanobacteria (cyanobacteria) of the type history. Spirulina contains abundant protein content (60-70%), vitamins (vitamin B12, provitamin A), essential amino acids, minerals, essential fatty acids and a large amount of unsaturated fatty acids, GLA (gamma-linolenic acid), for blood circulation and immune enhancing It is useful and widely used as pet food additive, aquaculture feed additive and health supplement food [Belay, A., 2004, The potential application of Spirulina ( Arthrospira ) as a nutritional and therapeutic supplement in health management].

스피루리나는 코일모양으로 감겨져 있는 형태로 긴 세포사를 형성하고, 코일 간의 길이는 10 ~ 70 ㎛로 다양한 것으로 알려져 있다. 스피루리나는 세포내에 기낭(air vesicle)를 갖고서 낮에는 수표면으로 부상하고 야간에는 침강하는 특징을 갖는다. 국내에서 분리된 스피루리나 AG20590[KCTC 11039BP]은 느슨한 코일모양으로 감겨져 있고(도 1), 부상활성은 매우 낮은 특징을 보이는 균주이다. 이러한 스피루리나는 부상성이 매우 낮아서 대량 배양시 효과적이고 경제적인 수확을 어렵게 한다. 현장의 대량 배양시 조체의 부상이 미미할 경우에는 수확을 위하여 많은 경제적 비용이 발생된다. 또한, 스피루리나의 코일이 촘촘하게 감겨진 균주는 코일이 느슨한 균주에 비하여 대량 배양시 유리한 특징을 갖는다. 코일이 촘촘한 경우에는 세포사(trichome)의 길이가 짧아서 고밀도 배양에서 조체 자체에 의한 빛의 저해 효과(self-shading effect)가 적어서 보다 높은 농도의 배양을 가능하게 한다. It is known that spirulina forms long cell death in the form of coils wound up, and the length between coils varies from 10 to 70 μm. Spirulina has air vesicles in the cell, which is characterized by rising to the water surface during the day and settling at night. Spirulina AG20590 [KCTC 11039BP] isolated in Korea is wound in a loose coil shape (FIG. 1), and has a very low floating activity. These spirulina have very low flotation, making effective and economical harvesting difficult for large scale cultures. In the case of small injuries during mass cultivation in the field, a large economic cost for harvesting is incurred. In addition, strains in which coils of spirulina are wound tightly have advantageous characteristics in mass cultivation compared to strains in which coils are loose. When the coil is dense, the length of the trichome is short, so that the high concentration of cultivation is possible due to the low self-shading effect due to the body itself in high density culture.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 스피루리나의 단점을 보완하기 위하여 연구 노력한 결과, 국내산 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis) AG20590[KCTC 11039BP]을 대상으로 돌연변이 유도물질인 EMS(ethylmethane sulfonate) 처리로 조체의 부상성의 증가, 형태적 개량 등을 통한 대량 배양에 적합한 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have made efforts to supplement the above-mentioned disadvantages of spirulina. As a result, the wounds of the granules were treated with EMS (ethylmethane sulfonate) which is a mutant inducer for domestic Spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP]. The present invention has been completed by developing spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] suitable for mass cultivation through increased sex, morphological improvement, and the like.

따라서, 본 발명은 조체의 부상성의 증가, 형태적 개량 등을 통한 대량 배양에 적합한 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]을 제공하는데 그 목적이 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP], which is suitable for mass cultivation through increased flotation, morphological improvement, and the like.

본 발명은 조체의 부상성의 증가, 형태적 개량 등을 통한 대량 배양에 적합한 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]을 특징으로 한다.The present invention is characterized by the mutant strain Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP], which is suitable for mass cultivation through the increase of the flocculation, morphological improvement and the like.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.

본 발명은 건강보조식품, 생리활성물질, 가축 및 애완동물의 사료 등으로 이용되고 있는 남세균(cyanobacteria) 스피루리나 플라텐시스(Spirulina) AG20590[KCTC 11039BP]에 돌연변이 유도물질인 EMS(ethylmethane sulfonate) 처리하여 조체의 부상활성이 증가되어 배양시 간편하고 경제적인 수확을 가능하게 하고 형태적으로는 코일이 촘촘하게 감긴 세포사(thrichome)의 형태를 갖는 돌연변이 균 주 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis) M20CJK3[KCTC 11127BP]에 관한 것이다.The present invention is treated with EMS (ethylmethane sulfonate), which is a mutant inducer, on cyanobacteria spirulina platensis ( Spirulina ) AG20590 [KCTC 11039BP], which is used for dietary supplements, bioactive substances, livestock and pet foods. Strirulina platensis mutant strain Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP], which has an increased floating activity to allow simple and economical harvesting during cultivation and has a form of closely wound coiled thrichome. It is about.

국내산 스피루리나(Spirulina) AG20590[KCTC 11039BP] 균주를 이용하여 돌연변이 유도물질인 EMS를 0.24%(v/v) 농도가 되도록 처리하여 고체 평판배지에 도말 후 증식한 콜로니(colony) 각각을 분리하여 액체배지에서 배양한 후, 조체의 부상활성과 형태적 특징을 조사하였다. Separating domestic Spirulina (Spirulina) AG20590 [KCTC 11039BP] the colonies (colony) growth mutation inducer of EMS using a strain 0.24% (v / v) is treated at a concentration then plated on a solid plate medium, respectively broth After cultivation at, the flotation activity and morphological characteristics of the body were investigated.

선별된 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3은 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]에 비하여 최소 3배 이상 향상된 조체의 부상성을 나타내었고, 세포사의 코일 수가 적고, 코일간의 거리는 배양이 진행되면서 짧아지는 경향을 보였다. The selected mutant strain spirulina platensis M20CJK3 exhibited at least three-fold improvement in cotyledonity compared to spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP], the number of coils in the cell death was small, and the distance between coils tended to shorten as the culture progressed. Showed.

본 발명에 따른 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3은 조체의 부상성(%)이 60 ~ 99%를 나타내고, 세포사의 코일 수가 5 ~ 7.5개이며, 코일간 거리(coil pitch)가 1 ~ 55 ㎛로, 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]에 비해 월등히 우수한 활성을 가졌다.The spirulina platensis M20CJK3 according to the present invention exhibits 60 to 99% of the flotation of the body, the number of coils of the cell yarn is 5 to 7.5, and the coil pitch is 1 to 55 μm. It had significantly better activity than Platensis AG20590 [KCTC 11039BP].

따라서 EMS 처리에 의해 유도된 본 균주를 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3으로 명명하였다. 또한, 상기 균주를 2007년 5월 4일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 11127BP로 부여받았다.Therefore, this strain induced by EMS treatment was named mutant strain Spirulina platensis M20CJK3. In addition, the strain was deposited with the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank on May 4, 2007, the accession number was given to KCTC 11127BP.

이러한 돌연변이 균주인 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 특징은 현장 대량 배양에서 높은 부상성에 의한 쉽고 경제적인 수확을 가능하게 하고, 적은 세포사의 코일 간의 거리가 조체 자체에 의한 빛 저해현상을 줄일 수 있 어 고밀도 배양을 가능하게 하여 높은 생산성을 나타낼 것이다. 또한, 스피루리나, 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP] 균주에 비해 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 높은 부상성, 촘촘하게 감긴 코일 및 짧은 세포사의 형태는 분자생물학 연구의 모델로 사용될 수 있다.This mutant strain, Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP], enables easy and economical harvesting due to high flotation in field cultivation, and the distance between coils of small cell death can reduce light inhibition by the body itself. This will result in high productivity by enabling high density cultivation. In addition, the morphology of spirulina, spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP], high flotation, tightly wound coils and short cell death of spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] can be used as a model for molecular biology research.

이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]의 돌연변이 유도를 위한 EMS 처리 및 생존율 조사Example 1 EMS Treatment and Survival Investigation for Mutation Induction of Spirulina Platensis AG20590 [KCTC 11039BP]

실험에 사용한 스피루리나 균주는 한국생명공학연구원에서 분양받은 AG20590[KCTC 11039BP]을 사용하였다. Spirulina strain used in the experiment was used AG20590 [KCTC 11039BP] distributed by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.

세포의 형태는 도 1에서와 같이 세포사는 느슨하게 꼬여진 형태였고 부상성은 정치배양한 결과 미미한 것으로 나타났다. 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP] 균주를 표 1과 같은 조성의 SOT 액체배지로 정지기까지 배양한 후 수확하였다. The cell morphology was loosely twisted as shown in FIG. 1, and the injury was found to be insignificant as a result of static culture. Spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] strain was harvested after incubation to the stationary phase with SOT liquid medium of the composition shown in Table 1.

스피루리나 플라텐시스 배양을 위해 사용되는 SOT 배지의 조성Composition of SOT Medium Used for Spirulina Platensis Culture 배지 성분Badge Ingredient 함량(g/ L)Content (g / L) NaHCO3 NaHCO 3 16.816.8 K2HPO4 K 2 HPO 4 0.50.5 NaNO3 NaNO 3 2.52.5 K2SO4 K 2 SO 4 1.01.0 NaClNaCl 1.01.0 MgSO4ㆍ7H2OMgSO 4 ㆍ 7H 2 O 0.20.2 CaCl2ㆍ2H2OCaCl 2 2H 2 O 0.040.04 FeSO4ㆍ7H2OFeSO 4 7 H 2 O 0.010.01 Na2EDTANa 2 EDTA 0.080.08 H3BO3 H 3 BO 3 2.862.86 MnSO4ㆍ7H2OMnSO 4 ㆍ 7H 2 O 2.52.5 ZnSO4ㆍ7H2OZnSO 4 ㆍ 7H 2 O 0.220.22 CuSO4ㆍ5H2OCuSO 4 ㆍ 5H 2 O 0.0790.079 Na2MoO4ㆍ2H2ONa 2 MoO 4 2H 2 O 0.0210.021

수확한 조체는 원심분리(10,000 rpm, 5분) 및 증류수를 이용한 수세를 3회 반복한 후, 증류수에 현탁하였다. 이를 얼음위에서 10초간 1회의 초음파 처리를 하여 긴 세포사를 짧게 자른 후, EMS를 0.24%(v/v) 농도가 되도록 첨가하고 이를 마이크로튜브(1.5-ml)에 1 ml씩 분취하였고 반복구는 3개로 하였다. 각각의 반복구는 20분간 35 ℃ 항온수조에서 항온처리하면서 돌연변이를 유도하였다. 대조구는 EMS 처리를 제외하고 실험구와 동일하게 처리하였다. 항온 처리 후에는 원심분리(10,000 rpm, 5분)하여 상등액을 제거하고 5% 소디움 티오설페이트 1 ml 첨가하여 돌연변이 반응을 종료시키고 원심분리(10,000 rpm, 5분)하여 상등액을 제거하였다. EMS 및 소디움 티오설페이트 성분을 제거하기 위하여 SOT 배지 1 ml을 첨가하여 원심분리(10,000 rpm, 5분)하는 과정을 3회 반복한 후 SOT 배지 1 ml로 현탁하고 30 ℃, 24시간 광조건으로 3일간 배양하였다. 배양한 후 각 구간에서 100 ㎕를 현미경으로 관찰하여 생존율을 조사하였다. 생존한 세포를 분리하기 위하여 SOT 배지성분을 첨가한 1.5% 한천 고체평판배지에 도말하여 콜로니를 형성하는 세포를 분리하여 SOT 배지로 시험관에서(10 ml) 배양하였다. The harvested crude was centrifuged (10,000 rpm, 5 minutes) and washed three times with distilled water, and then suspended in distilled water. This was sonicated once for 10 seconds on ice to cut long cell death, and then EMS was added to 0.24% (v / v) concentration. It was. Each repeat was incubated in a 35 ° C. water bath for 20 minutes to induce mutations. The control was treated the same as the experimental except for the EMS treatment. After incubation, the supernatant was removed by centrifugation (10,000 rpm, 5 minutes), 1 ml of 5% sodium thiosulfate was added to terminate the mutation reaction, and the supernatant was removed by centrifugation (10,000 rpm, 5 minutes). To remove the EMS and sodium thiosulfate components, repeat the process of centrifugation (10,000 rpm, 5 minutes) by adding 1 ml of SOT medium, and then suspended in 1 ml of SOT medium for 3 days at 30 ° C for 24 hours under light conditions. Incubated. After incubation, 100 μl of each section was observed under a microscope to check the survival rate. In order to isolate the surviving cells, the cells forming the colony were plated on 1.5% agar solid plate medium to which the SOT medium component was added, and then cultured in vitro (10 ml) with SOT medium.

돌연변이 처리 후 3일간 배양한 결과, 대조구는 평균 740 cells/ml, 실험구는 40 cells/ml가 생존하여 생존율은 5%로 나타났다.Incubation for 3 days after the mutation treatment resulted in an average survival rate of 740 cells / ml and 40 cells / ml in the experimental group, with a 5% survival rate.

실시예 2: 돌연변이 균주 M20CJK3 [KCTC 11127BP]의 특징Example 2: Characterization of Mutant Strain M20CJK3 [KCTC 11127BP]

생명공학연구원에서 분양받은 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC11039BP] 균주를 EMS 처리로 돌연변이 균주 M20CJK3을 유도한 것으로 본 돌연변이 균주는 스피루리나 프라텐시스에 속하면서 특정한 유전자 영역에서 변이가 일어난 균주이다. 스피루리나 프라텐시스 M20CJK3의 형태적 분류의 특성은 다음 표 2에 나타내었다. 또한, 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3을 분자생물학적인 동정법에 의하여 동정하였으며, 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다. 표 2와 표 3의 동정 결과에서 보여주는 바와 같이 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3은 스피루리나 플라텐시스 AG20590과는 형태적 특징에서 많은 차이를 보였다. 남세균의 특징적인 색소인 파이코시아닌과 관련된 유전자를 분석한 결과, wild type인 AG20590과 97.5%의 유사성을 보여 일부 차이를 보이는 것으로 나타났다(표 3, 도 2). The spirulina platensis AG20590 [KCTC11039BP] strain, which was distributed by the Biotechnology Research Institute, induced the mutant strain M20CJK3 by EMS treatment. The mutant strain belongs to spirulina pratensis and has a mutation in a specific gene region. The characteristics of the morphological classification of Spirulina pratensis M20CJK3 are shown in Table 2 below. In addition, spirulina platensis M20CJK3 was identified by molecular biological identification method, the results are shown in Table 3 below. As shown in the identification results of Table 2 and Table 3, the mutant strain spirulina platensis M20CJK3 showed a large difference in morphological characteristics from spirulina platensis AG20590. As a result of analyzing genes related to phycocyanin, a characteristic pigment of P. aeruginosa, 97.5% similarity with wild type AG20590 was shown to show some differences (Table 3, FIG. 2).

스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 형태적 특징Morphological features of spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] 특징Characteristic 스피루리나 프라텐시스 M20CJK3(mutant)Spirulina pratensis M20CJK3 (mutant) 스피루리나 프라텐시스 AG20590(wild type)Spirulina pratensis AG20590 (wild type) 세포사의 길이Cell length 100~300 ㎛100 ~ 300 ㎛ 678 ㎛678 μm 코일의 간격(pitch)Pitch of coil 0~55 ㎛0 to 55 μm 85~125 ㎛85 ~ 125 ㎛ 세포사의 말단형태Terminal form of cell death 느슨한 코일로 둥근 형태Round shape with loose coil 느슨한 코일로 둥근 형태Round shape with loose coil 가스 소포체Gas vesicles 다수 산재Multiple litter 부분 산재Partial scatter 세포의 치수비(길이: 너비)Dimension ratio of cells (length: width) 1:31: 3 1:31: 3 세포의 너비Width of cells 10 ㎛10 μm 8~9 ㎛8 ~ 9 ㎛

스피루리나 프라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 분자생물학적 동정 결과Molecular Biological Identification of Spirulina Pratensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] 유전자gene 비교 균주(승인번호)Comparative strain (approval number) 유사도Similarity cpcBA-IGS cpcBA -IGS Spirulina platensis CG590(EF380357) Spirulina platensis CG590 (EF380357) 97.5%(311/319)97.5% (311/319)

실시예 3: 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 부상성 및 형태적 특징 조사Example 3: Investigation of Flotation and Morphological Characteristics of Spirulina Platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP]

스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]을 대상으로 EMS 0.24% 농도로 20분간 처리하여 40개의 균주를 분리하였다. 이들 균주의 공통된 특징은 부상성이 높아서 정치된 배양상태에서도 모두 부상하였고 형태적으로는 촘촘하게 감긴 세포사를 형성하였다. 따라서, 이들 중 대표적인 1균주를 선정하여 실험구로 하였고 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC11039BP]을 대조구로 하여 부상성과 형태적인 특징을 비교하였다. 실험구로 사용된 균주는 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]으로 하였다. 시험관에서 배양된 AG20590[KCTC 11039BP]과 M20CJK3[KCTC 11127BP]을 삼각플라스크에 SOT 배지 150 ml을 채우고 10일간 배양한 것을 접종물로 하여 2 L 유리 용기에 SOT 배지 1.2 L을 채우고 접종하였다. 배양은 온도 30 ± 2 ℃, 조도 200 μmol photons/m2/s의 명 조건으로 하였고, 마그네틱 바를 이용하여 배양액을 회전시키면서 배양액의 원활한 순환을 위하여 2.5 L/min의 공기압으로 공기를 주입하였다. 배양기간 동안 2일 간격으로 조체의 부상성, 코일의 형태, 코일간의 거리(pitch), 세포사의 코일의 개수를 측정하였다. 조체의 부상성은 배양 중의 조체 6 ml을 채취하여 15-ml 플라스틱 용기에 넣고 1시간 동안 200 μmol photons/m2/s의 광 조건에서 정치한 후, 680 nm에서 측정한 초기의 흡광도 값과 1시간 경과 후의 흡광도 값을 비교하여 측정하였다. 1시간 경과 후의 흡광도 값은 상부로부터 4 ml을 제거한 후 남아 있는 조체를 섞은 후 조사하였다. 조체의 부상성은 다음 수학식 1로 계산하였다.Spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] was treated with EMS 0.24% concentration for 20 minutes to isolate 40 strains. The common characteristics of these strains were high incidence, which resulted in all of the injured cultures and form a tightly wound cell death. Therefore, one representative strain among them was selected as an experimental group, and the flocculation and morphological characteristics were compared using spirulina platensis AG20590 [KCTC11039BP] as a control. The strain used as the experiment was set to the mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP]. AG20590 [KCTC 11039BP] and M20CJK3 [KCTC 11127BP] cultured in vitro were filled with 150 ml of SOT medium in a Erlenmeyer flask and incubated for 10 days, and 1.2 L of SOT medium was inoculated in a 2 L glass container. Cultivation was carried out at a temperature of 30 ± 2 ℃, light conditions of 200 μmol photons / m 2 / s, and the air was injected at 2.5 L / min air pressure for smooth circulation of the culture medium while rotating the culture medium using a magnetic bar. Flotation, the shape of coils, the pitch between coils, and the number of coils of cell death were measured at 2 days intervals during the incubation period. Flotation of the granules was carried out in a 15-ml plastic container with 6 ml of the incubated medium in culture and allowed to stand for 1 hour at 200 μmol photons / m 2 / s light condition, then the initial absorbance value measured at 680 nm and 1 hour The absorbance values after elapsed were compared and measured. After 1 hour, the absorbance value was examined after removing 4 ml from the top and then mixing the remaining crude. Flotation of the body was calculated by the following equation.

Figure 112007043225344-pat00001
Figure 112007043225344-pat00001

코일의 형태는 현미경으로 관찰하였고 코일간의 거리는 현미경 200배 시야에서 50개 이상의 세포사를 관찰하여 평균값을 구하였다. 코일의 개수는 세포사 50개의 평균값으로 하였다.The shape of the coils was observed under a microscope, and the distance between coils was determined by observing 50 or more cell deaths in a 200-fold field of view. The number of coils was made into the average value of 50 cell deaths.

실험에 사용한 두 균주의 부상성은 도 3과 같이 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]은 - 9.3%에서 시작하여 배양 2일째에 82%로 급격히 증가하였고 이후에는 차차 감소하여 8일째에는 71%였다. 대조구인 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]의 경우에는 초기에는 -65%로 대부분 저층으로 침강하였고, 배양함에 따라 증가하여 배양 6일째에 -34%로 가장 높게 나타났 지만 전체적으로 부상보다는 침강하는 경향이 강하였다. 도 4는 배양 6일째의 두 균주간의 부상의 정도를 사진으로 보여주고 있다. 도 4의 A는 초기의 상태로 두 균주가 플라스틱 용기 내에서 전체적으로 분포하고 있으나 1시간 경과 후(도 4의 B)에는 돌연변이 균주인 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]은 75%가 부상했으나 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]은 여전히 전체적으로 분포하면서 낮은 부상성을 보여주고 있다. The floatability of the two strains used in the experiment increased mutant spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] from -9.3% to 82% on the second day of culture, and gradually decreased to 71% on the 8th day as shown in FIG. It was. The control group, Spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP], initially settled at -65% to the lower layer, and increased with incubation, which was the highest at -34% at 6 days of cultivation. Was strong. Figure 4 shows the degree of injury between the two strains on day 6 culture. In Figure 4A, the two strains are initially distributed in a plastic container, but after one hour (B in Figure 4), mutant strains of spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] were injured by 75% but spirulina. Platensis AG20590 [KCTC 11039BP] is still distributed throughout, showing low flotation.

세포사의 코일 수는 배양의 상태를 나타내어 증식상태가 양호할 때에는 대체로 많아지고 정지기에 들어가면서 적어지면서 세포사가 짧아지는 특징을 나타낸다. 본 실험에서는 도 5에서와 같이, 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]은 배양시간에 따라 차차 증가하여 4일째에 4.9개/세포사로 최고에 이른 후에 감소하는 경향이었고, 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]은 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP] 균주에 비해 적은 코일 수를 보이면서, 배양 4일째에 가장 많은 3.4개/세포사로 나타났고 그 이후에는 감소하였다. 배양 6일째에 두 균주 모두에서 코일의 수가 감소한 것은 긴 세포사가 짧게 끊어져서 짧아진 세포사가 늘어났기 때문이다. 배양 기간 동안 코일간 거리(pitch)는 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]은 초기의 87.0 ㎛에서 증가하여 배양 4일째에 127.6 ㎛로 최고에 이른 후 감소하는 경향을 보인 반면, 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]은 초기의 51.4 ㎛에서 감소하여 배양 6일째에는 5.5 ㎛로 줄면서 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]과는 상반된 양상을 보였다(도 6). 도 7은 배양 6일째의 두 균주의 형태를 사진으로 나타내고 있다. 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]은 코일의 형태가 느슨하면서 세포사는 길게 늘어진 반면, 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]은 코일의 형태는 매우 촘촘하게 감겨져 있고 세포사는 비교적 짧게 이어진 것으로 나타났다. 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 부상성과 코일의 형태가 기존의 균주인 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]과 확연한 차이를 보였다.The number of coils of cell death indicates the state of culture, and when the proliferative state is good, the number of coils increases and decreases as the cells enter the stationary phase. In this experiment, as shown in FIG. 5, spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] gradually increased with incubation time and decreased after peaking at 4.9 / cell death on day 4, and spirulina platensis M20CJK3 [KCTC]. 11127BP] showed less coil counts than Spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] strain, with the highest number of 3.4 cells per cell on day 4 and decreased thereafter. The decrease in the number of coils in both strains at day 6 was due to the short breaks of the long cell deaths resulting in increased shortened cell deaths. Spirulina platensis M20CJK3 tends to increase in spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] during the incubation period, increasing from the initial 87.0 μm to a peak at 127.6 μm on day 4, [KCTC 11127BP] decreased from the initial 51.4 μm and decreased to 5.5 μm on the 6th day of culture, and was in contrast to spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] (FIG. 6). Figure 7 shows the form of the two strains on the sixth day culture. Spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] was loosely coiled and elongated cell death, whereas spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] was coiled very tightly and cell death was relatively short. The mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] showed a marked difference in the flotation and coil morphology from the existing strain spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP].

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 돌연변이 균주인 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]은 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP]에 비하여 최소 3배 이상 향상된 부상성을 나타내었고, 세포사의 코일 수가 적고, 코일간의 거리는 배양이 진행되면서 짧아지는 경향을 보였다. 이러한 돌연변이 균주인 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 특징은 현장 대량 배양에서 높은 부상성에 의한 쉽고 경제적인 수확을 가능하게 하고, 적은 세포사의 코일 간의 거리가 조체 자체에 의한 빛 저해현상을 줄일 수 있어 고밀도 배양을 가능하게 하여 높은 생산성을 나타낼 것이다. 또한, 스피루리나 플라텐시스 AG20590[KCTC 11039BP] 균주에 비해 돌연변이 균주 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]의 높은 부상성, 촘촘하게 감긴 코일 및 짧은 세포사의 형태는 분자생물학 연구의 모델로 사용될 수 있다.As described above, the mutant strain spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] according to the present invention exhibited at least three times better injury than spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP], and the number of coils of cell death was increased. The distance between coils tended to get shorter as the culture progressed. This mutant strain, Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP], enables easy and economical harvesting due to high flotation in field cultivation, and the distance between coils of small cell death can reduce light inhibition by the body itself. It will enable high density cultivation and will show high productivity. In addition, the high floating, tightly wound coil and short cell death morphology of the mutant strain Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] compared to the spirulina platensis AG20590 [KCTC 11039BP] strain can be used as a model for molecular biology research.

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Claims (4)

조체의 부상활성이 향상된 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP].Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] with improved flotation activity. 제 1 항에 있어서, 60 ~ 99%의 조체의 부상성(%)을 갖는 것을 특징으로 하는 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]. 2. Spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] according to claim 1, which has a percent flotation of 60 to 99%. 제 1 항에 있어서, 5 ~ 7.5개/세포사의 코일 수를 갖는 것을 특징으로 하는 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]. 2. The spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] according to claim 1, having a coil number of 5 to 7.5 cells / cell death. 제 1 항에 있어서, 1 ~ 55 ㎛의 코일간 거리(coil pitch)를 갖는 스피루리나 플라텐시스 M20CJK3[KCTC 11127BP]. The spirulina platensis M20CJK3 [KCTC 11127BP] according to claim 1, having a coil pitch of 1 to 55 mu m.
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