KR101692695B1 - Thraustochytriidae sp. mutant strain GA containing high content of polyunsaturated fatty acid and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA(KCTC12770BP), 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하고, 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오오일, 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하고, 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제 또는 바이오디젤 생산용 미생물 제제 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for producing a bio-oil by cultivating a strain of the genus Thraustochytriidae sp. GA (KCTC12770BP) containing a high content of a polyunsaturated fatty acid (PUFA) A method for producing a bio-oil containing a high content of polyunsaturated fatty acids and a method for producing bio-oil comprising the step of culturing the strain to produce a fatty acid and converting the bio-oil to biodiesel And a method for producing a microorganism preparation for fatty acid production comprising the step of culturing the microorganism preparation for producing fatty acid or biodiesel containing the microorganism preparation containing the microorganism as an active ingredient, to provide.
Description
본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA(KCTC12770BP), 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하고, 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오오일, 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하고, 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제 또는 바이오디젤 생산용 미생물 제제 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것이다.[0001] The present invention relates to a mutant strains GA and a mutant strains thereof, which contain a high amount of polyunsaturated fatty acids, and more particularly to a mutant strains of a mutant strains such as a mutant strain of TRAUSTOKITRI, which contains a high content of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) A method for producing a bio-oil containing a high content of polyunsaturated fatty acids, comprising the step of culturing said strain to produce and recovering bio-oil, and a method for producing said bio-oil, comprising the step of cultivating a strain of the genus Thraustochytriidae sp. GA (KCTC12770BP) Culturing the strain to produce a fatty acid, and converting the biodiesel to biodiesel; biodiesel produced by the method; a method for producing a fatty acid containing the strain as an active ingredient A microbial agent for producing a microbial agent or biodiesel, and a step of culturing the strain Relates to a method for producing a microbial preparation for fatty acid production.
해양 생태 먹이사슬의 최하위 계급을 차지하는 유기종속영양 원생생물인 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 DHA (docosahexaenoic acid)를 비롯한 다양한 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)을 고농도로 함유하는 트리아실글리세롤(Triacylglycerol)의 공급원으로 중요한 역할을 수행한다. 특히 다중불포화지방산 DHA는 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 치매 환자 뇌에서는 그 양이 현저하게 줄어드는 것으로 보고되었으며, 노안의 황반변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다. 사람을 비롯한 대부분의 고등 동물은 정상적인 생체기능에 필요한 다중불포화지방산을 자체적으로 원활하게 합성하지 못하기 때문에 다중불포화지방산을 필수 영양소로 반드시 섭취하여야 하며, 세계보건기구는 하루 1g 이상의 DHA 함유 다중불포화지방산을 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다.Thraustochytrid, an organic heterotrophic protozoa that occupies the lowest rank in the marine ecosystemic food chain, contains triacylglycerol, which contains a high concentration of various polyunsaturated fatty acids including DHA (docosahexaenoic acid) As a source of supply. Especially, DHA is a fatty acid essential for the brain, eye tissues and nervous system, and is known to play an important role in the development of visual and motor neurological ability, especially in infants. In addition, it has been reported that the amount of dementia is significantly reduced in the brain of demented patients, and various anti-aging functions such as inhibition of presbyopia and macular degeneration are newly discovered. Most high-end animals, including humans, must ingest polyunsaturated fatty acids as essential nutrients because they can not synthesize the polyunsaturated fatty acids required for normal biological functioning themselves, and the World Health Organization recommends that DHA-containing polyunsaturated fatty acids Is recommended to continue to eat.
전통적으로 DHA 다중불포화지방산의 공급원은 참치, 연어와 같은 해양 생태환경의 상위를 차지하는 심해성 어류들이다. 하지만, 해양환경의 오염이 심해지면서 심해성 어류의 체내에 수은을 비롯한 중금속, 환경호르몬, 방사성물질 등 오염물질 축적으로 인해 심해어류 섭취에 대한 위험이 커지고 있다. 따라서 DHA 다중불포화지방산 오일을 안전하고, 안정적으로 공급할 수 있는 새로운 수단으로 트라우스토키트리드 원생생물이 주목을 받고 있다. 고기능 DHA 다중불포화지방산의 높은 함량 뿐만 아니라 높은 지질 함량으로 인해 바이오디젤 생산을 위한 바이오오일 공급원료(feedstock)의 공급원으로서도 고유지성 트라우스토키트리드 원생생물은 산업적으로 중요한 가치를 지닌다.Traditionally, the sources of DHA polyunsaturated fatty acids are deep sea fish, which make up the top of marine ecosystems such as tuna and salmon. However, as the pollution of the marine environment becomes worse, the risk of ingestion of deep sea fish is increasing due to accumulation of pollutants such as mercury, heavy metals, environmental hormones and radioactive substances in the body of deep sea fishes. Therefore, TRAUSTOKITRID protozoa is attracting attention as a new means of safe and stable supply of DHA polyunsaturated fatty acid oil. Due to its high lipid content as well as the high content of high DHA polyunsaturated fatty acids, the inherent oyster trait toquitrid prototypes have industrial value as a source of biofuel feedstock for biodiesel production.
바이오디젤의 제조를 위한 바이오오일 원료의 주요한 공급원은 식물성 유지 혹은 미세조류 오일 등 광합성 오일이다. 유지성 식물 및 미세조류의 광합성 오일은 풍부한 태양광을 이용하고 이산화탄소를 재활용을 하는 매우 중요한 장점이 있지만, 시간, 공간, 계절, 기후 등 다양한 환경 요인에 의해 영향을 받는 단점이 있다. 일각에서는 광합성 오일을 원료로 하는 바이오디젤의 보급 확대가 식량 부족 및 원료작물의 대량 재배에 따른 새로운 환경문제를 야기할 수 있기 때문에 그 실효성 자체에 대한 의구심이 제기되고 있는 상황이다.The main source of bio-oil raw materials for the production of biodiesel is photosynthetic oil, such as vegetable oil or micro-algae oil. Photosynthetic oils of sustainable plants and microalgae have a very important advantage of using abundant sunlight and recycling carbon dioxide, but they are affected by various environmental factors such as time, space, season, and climate. Some have raised doubts about the effectiveness of biodiesel because it can cause new environmental problems due to the shortage of food and the mass cultivation of raw material crops.
최근 바이오오일의 대량 생산 방법으로 유기영양 미생물의 발효배양법이 주목을 받고 있다. 폐기물, 부산물 및 잉여 바이오매스 자원으로부터 생산된 미생물 발효오일은 광합성오일과 함께 바이오디젤의 원료로 활용될 것으로 기대된다. 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 등이 대표적인 유지성 미생물이며, 이들의 발효 공정 연구가 활발하게 진행 중이다.Recently, the fermentation culture method of organic nutrition microorganisms has attracted attention as a mass production method of bio oil. Microbial fermentation oils produced from waste, by-products and surplus biomass resources are expected to be used as raw materials for biodiesel along with photosynthetic oil. Chlorella protothecoides , Yarrowia lipolytica , Rhodosporidium < RTI ID = 0.0 > toruloides , Rhodotorula < RTI ID = 0.0 > glutinis , etc.) are representative retentive microorganisms, and their fermentation processes are actively researched.
한편, 한국등록특허 제1480051호에서는 '트라우스토키트리드 미세조류의 리보좀 단백질 코딩하는 유전자 변이체를 이용한 형질전환체 선별마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1147450호에서는 '신규 유지성 미세조류 ＫＲＳ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.Korean Patent No. 1480051 discloses a transformant selection marker using a mutant of a ribosomal protein coding for a Troutukitrid microalga. Korean Patent No. 1147450 discloses a novel microorganism strain KRS101 And a method for producing bio-oil using the same. However, as described in the present invention, there is no known fact that the mutant strains GA and their uses containing a high content of polyunsaturated fatty acids are used.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 우리나라 연안으로부터 분리한 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주를 대상으로 감마선 조사에 의한 돌연변이를 유발시켜 모균주보다 균체 증식 등 배양 특성이 개선된 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA를 분리할 수 있었다. 본 발명의 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA는 모균주보다 다중불포화지방산의 함량(PUFA), EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6) 함량이 다소 증가되었을 뿐만 아니라, 무엇보다도 모균주와는 달리 점액질(exopolysaccharide)이 분비되는 특성으로 인하여 단일 균주 형태로 증식되며, 이에 따라 모균주보다 제한시간 안에 다중불포화지방산을 많이 생산할 수 있는 장점을 가지는 큰 차이가 있으므로, 본 발명을 통해 균체 증식이 개선된 고기능의 다중불포화지방산을 많이 함유하는 고품질 균주를 제공할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention has been made in view of the above-mentioned needs. In the present invention, a mutant strain of Thraustochytriidae sp. D1c isolated from the Korean coast is induced by gamma irradiation, We could isolate GA mutant strains with improved culture characteristics. In addition, the content of polyunsaturated fatty acid (PUFA), EPA (eicosapentaenoic acid, 20: 5) and DHA (Docohexaenoic acid, 22: 6) was slightly increased in the TRA mutant strains GA of the present invention , And unlike the parent strain, it is proliferated in the form of a single strain due to the secretion of exopolysaccharide. Thus, there is a great difference in that it can produce a large amount of polyunsaturated fatty acids within a limited time than the parent strain, The present invention has been accomplished by confirming that the present invention can provide a high-quality strain containing a large amount of high-performance polyunsaturated fatty acids with improved cell proliferation.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA(KCTC12770BP)를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a Thraustochytriidae sp. Mutant strain GA (KCTC12770BP) containing a high content of polyunsaturated fatty acid (PUFA).
또한, 본 발명은 (a) 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일의 제조 방법을 제공한다.(A) culturing the strain to produce a bio-oil; And (b) recovering the bio-oil from the cultured cells. The present invention also provides a method for producing bio-oil containing a high content of polyunsaturated fatty acids.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일을 제공한다.The present invention also provides a bio-oil containing a high content of polyunsaturated fatty acids produced by the process.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제를 제공한다.The present invention also provides a microorganism preparation for fatty acid production comprising the strain as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a microorganism preparation for fatty acid production comprising culturing the strain.
또한, 본 발명은 (a) 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법을 제공한다.(A) culturing the strain to produce a fatty acid; And (b) converting the produced fatty acid into biodiesel.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤을 제공한다.The present invention also provides a biodiesel produced by the above method.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 생산용 미생물 제제를 제공한다.The present invention also provides a microorganism preparation for producing biodiesel comprising the strain as an active ingredient.
본 발명의 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA는 모균주보다 다중불포화지방산의 함량(PUFA), EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6) 함량이 증가되었고, 모균주와는 달리 점액질(exopolysaccharide)이 분비되는 특성으로 인하여 단일 균주 형태로 증식되며, 이에 따라 모균주보다 제한시간 안에 다중불포화지방산을 많이 생산할 수 있는 장점이 있다. The amount of polyunsaturated fatty acid (PUFA), EPA (eicosapentaenoic acid, 20: 5) and DHA (Docohexaenoic acid, 22: 6) content of the mutant strains of TRAUTOKITOR major mutant GA of the present invention was increased, , It is proliferated in the form of a single strain due to the secretion of exopolysaccharide. Thus, it is possible to produce a large amount of polyunsaturated fatty acid within a time limit than the parent strain.
따라서, 본 발명에 의한 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA 배양을 통해 DHA 및 EPA를 활용한 고부가가치 산업과 바이오디젤 산업을 연계함으로써, 일반적인 미생물 오일 혹은 광합성 오일과 달리 바이오디젤의 시장 경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.Therefore, unlike general microbial oil or photosynthetic oil, it is possible to provide market competitiveness of biodiesel by linking high value-added industry and biodiesel industry utilizing DHA and EPA through cultivation of TRA mutant strain GA according to the present invention It is expected to be possible.
도 1은 감마선 조사에 의한 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA에 대한 모균주인 트라우스토키트리대 속 d1c의 분류학적 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 감마선 조사에 의한 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA의 균체 증식을 모균주인 트라우스토키트리대 속 d1c과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 감마선 조사에 의한 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA의 균체를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 감마선 조사에 의한 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA의 점액질 생성 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다. d1c는 모균주인 트라우스토키트리대 속 d1c 균주.FIG. 1 shows a taxonomic diagram of the strain d1c of the genus Trautokitri, which is a parent strain for the mutant strain GA of the genus Thraustochytriida sp. By gamma irradiation.
Fig. 2 shows the result of comparing the growth of the mutant strain GA of the genus Thraustochytriida sp. GA by gamma irradiation to the strain d1c of the parent strain, Trautokyti.
FIG. 3 shows microscopic observation of the cells of the mutant strain GA of Thraustochytriidae sp. By gamma irradiation.
FIG. 4 shows the results of analysis of mucolytic production characteristics of a mutant strain GA of Thraustochytriidae sp. By gamma irradiation. d1c is a parent strain d1c strain belonging to the genus Trautokitri.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA(KCTC12770BP)를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a Thraustochytriidae sp. Mutant strain GA (KCTC12770BP) containing a high content of polyunsaturated fatty acid (PUFA).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 엑소폴리사카라이트(exopolysaccharides)라고 불리는 점액질을 세포 외로 분비할 수 있다. 상기 균주는 모균주와는 달리 점액질(exopolysaccharide)이 세포 외로 분비되는 특성으로 인하여 단일 균주 형태로 증식되며, 이에 따라 모균주보다 제한시간 안에 다중불포화지방산을 많이 생산할 수 있는 장점을 가지는 큰 차이가 있다.In a strain according to an embodiment of the present invention, the strain may secrete a mucus called exopolysaccharides outside the cell. Unlike parental strains, the above-mentioned strains are proliferated in the form of a single strain due to the secretion of exopolysaccharides into the cells, and thus there is a great difference in that they can produce a large amount of polyunsaturated fatty acids within a limited time than parent strains .
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 다중불포화지방산은 전체 지방산의 75% 이상을 차지할 수 있으며, 바람직하게는 80% 이상을 차지할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 80~85%를 차지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the strain according to an embodiment of the present invention, the polyunsaturated fatty acid may occupy 75% or more of the total fatty acids, preferably 80% or more, more preferably 80 to 85% , But is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)은 전체 지방산의 각각 8~15% 및 40~50%를 차지하는 것일 수 있고, 바람직하게는 각각 9~10% 및 40~45%를 차지하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Among the polyunsaturated fatty acids, EPA (eicosapentaenoic acid, 20: 5) and DHA (Docohexaenoic acid, 22: 6) in the strain according to an embodiment of the present invention contain 8 to 15% and 40 to 50% , Preferably 9 to 10% and 40 to 45%, respectively, but is not limited thereto.
본 발명에서는 우리나라 연안으로부터 분리한 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주를 대상으로 감마선 조사에 의한 돌연변이를 유발시켜 모균주보다 균체 증식 등 배양 특성이 개선된 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA를 분리한 것이다. 상기 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 GA는 한국생명공학연구원에 2015년 03월 10일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC12770BP).In the present invention, a mutant strain of Thraustochytriidae sp. D1c isolated from the Korean coast is induced by gamma-irradiation to produce a mutant strains of Trastutokitri mutant strain GA . The TRA mutant strain GA was deposited at the Korea Biotechnology Research Institute on Mar. 10, 2015 (Accession No. KCTC12770BP).
또한, 본 발명은 In addition,
(a) 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및(a) culturing the strain to produce a bio-oil; And
(b) 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 바이오오일의 제조 방법을 제공한다.(b) recovering the bio-oil from the cultured microorganism. The present invention also provides a method for producing a bio-oil containing a polyunsaturated fatty acid (PUFA).
본 발명에서 상기 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 의해 제한되지는 않는다.The method for culturing the strain in the present invention can be carried out according to a method commonly used in the art, and is not limited by a specific method.
또한, 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.In addition, any method known in the art can be used as a method for recovering the bio-oil from the cultured cells, and the method is not particularly limited.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 바이오오일을 제공한다.The present invention also provides bio oils containing a high content of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) prepared by the above process.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오오일에서, 상기 다중불포화지방산은 전체 지방산의 75% 이상을 차지할 수 있으며, 바람직하게는 80% 이상을 차지할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 80~85%를 차지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the bio-oil according to one embodiment of the present invention, the polyunsaturated fatty acid may occupy 75% or more of the total fatty acids, preferably 80% or more, more preferably 80 to 85% But is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오오일에서, 상기 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)은 전체 지방산의 각각 8~15% 및 40~50%를 차지하는 것일 수 있고, 바람직하게는 각각 9~10% 및 40~45%를 차지하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.EPO (eicosapentaenoic acid, 20: 5) and DHA (Docohexaenoic acid, 22: 6) among the polyunsaturated fatty acids in the bio-oil according to an embodiment of the present invention have 8 to 15% and 40 to 50% , Preferably not more than 9 to 10% and 40 to 45%, respectively.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제를 제공한다.The present invention also provides a microorganism preparation for fatty acid production comprising the strain as an active ingredient.
상기 미생물 제제는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 상기 균주를 이용하여 지방산을 생산할 수 있는 것이다. 상기 생산된 지방산은 다중불포화지방산 함량이 전체 지방산의 75% 이상을 차지하므로 상기 미생물 제제는 고품질 지방산을 생산하는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 지방산 생산용 미생물 제제는 용액, 분말 또는 현탁액으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The microorganism preparation may include a mutant strain of Thraustochytriidae sp. GA as an active ingredient, and the strain may be used to produce a fatty acid. Since the polyunsaturated fatty acid content of the produced fatty acid accounts for 75% or more of the total fatty acids, the microbial agent can be used for producing a high-quality fatty acid. The microorganism preparation for fatty acid production according to the present invention may be prepared as a solution, powder or suspension, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a microorganism preparation for fatty acid production comprising culturing the strain.
본 발명에서 상기 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 의해 제한되지는 않는다.The method for culturing the strain in the present invention can be carried out according to a method commonly used in the art, and is not limited by a specific method.
또한, 본 발명은In addition,
(a) 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하는 단계; 및(a) culturing the strain to produce a fatty acid; And
(b) 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법을 제공한다.and (b) converting the produced fatty acid into biodiesel.
본 발명에서 상기 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 의해 제한되지는 않는다.The method for culturing the strain in the present invention can be carried out according to a method commonly used in the art, and is not limited by a specific method.
또한, 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.The method of converting the produced fatty acid into biodiesel can be performed by any method known in the art and is not particularly limited to a specific method.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤을 제공한다.The present invention also provides a biodiesel produced by the above method.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 생산용 미생물 제제를 제공한다.The present invention also provides a microorganism preparation for producing biodiesel comprising the strain as an active ingredient.
상기 미생물 제제는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오디젤 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오디젤 생산용 미생물 제제는 용액, 분말 또는 현탁액으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
The microorganism preparation may include a mutant strain of Thraustochytriidae sp. GA as an active ingredient and may be effectively used for producing biodiesel. The microbial formulation for producing biodiesel according to the present invention may be prepared as a solution, powder or suspension, but is not limited thereto.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예Example 1. 감마선 조사 방법에 의한 1. By gamma irradiation 트라우스토키트리대Truce 속( genus( ThraustochytriidaeThraustochytriidae spsp .) 돌연변이 균주 .) Mutant strains GAGA 의 분리Separation of
서해 연안지역의 해수 시료를 50㎖ 팔콘 튜브를 이용하여 채취하고, 생리식염수 10㎖을 가하여 현탁한 후 적당히 희석하여 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 미세조류 분리용 B1 배지 (1 g/ℓ 효모 추출물, 1 g/ℓ 펩톤, 10 g/ℓ 아가를 300 ㎎/ℓ 페니실린 G와 500 ㎎/ℓ 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 첨가한 천연해수 1 ℓ에 녹임)에 도말하였다. 28℃에서 200rpm으로 2-4일간 배양하여 얻어진 콜로니들을 B1 배지에 재접종하여 순수분리한 후 현미경으로 관찰하여 트라우스토키트리드 균주의 전형적인 특징인 유주자(zoospore) 낭을 형성하는 콜로니를 분리하였다.The seawater samples from the West Sea coast were collected using a 50 ml Falcon tube, suspended in 10 ml of physiological saline, appropriately diluted, and cultured in a B1 medium for the isolation of microalgae (1 g / l yeast extract, 1 g / l of peptone and 10 g / l of agar were dissolved in 1 l of natural seawater to which 300 mg / l penicillin G and 500 mg / l streptomycin sulfate had been added. The colonies obtained by culturing at 28 rpm at 200 rpm for 2-4 days were re-inoculated into the B1 medium to be purely separated and then observed with a microscope to isolate colonies forming a zoospore cyst, which is a typical characteristic of the strain strain.
분리한 콜로니들을 50㎖ 기본배지 (탄소원 포도당 20 g/ℓ, 질소원 효모 추출물 10 g/ℓ, 인공해수염 5 g/ℓ, KH2PO4 9 g/ℓ) (250㎖ 플라스크)를 이용하여 28℃에서 120rpm으로 3일간 배양한 후, 균체를 회수하여 동결건조기에서 12시간 동안 건조하였다. 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 (methanolic sulfuric acid) 용액 6㎖에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산에스테르를 0.2㎖의 헥산으로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 d1c 균주는 균체에 축적된 지질은 다중불포화지방산의 함량이 매우 높은 것으로 관찰되었으며, DHA를 비롯한 다중불포화지방산(20:4, 20:5, 22:5, 22:6)의 함량은 전체 지방산의 80% 이상인 것으로 확인되었다.The separated colonies were cultured in a 50 ml basal medium (20 g / l of carbon source glucose, 10 g / l of nitrogen source yeast extract, 5 g / l of artificial sea salt, 9 g / l of KH 2 PO 4 ) After culturing at 120 rpm for 3 days, the cells were recovered and dried in a freeze dryer for 12 hours. The dried cells were resuspended in 6 ml of 5% methanolic sulfuric acid solution and reacted at 90 ° C for 1 hour. The resulting fatty acid ester was extracted with 0.2 ml of hexane and analyzed by gas chromatography. As a result, the lipid accumulated in the cells of the d1c strain of the present invention was found to have a very high content of polyunsaturated fatty acids, and the polyunsaturated fatty acids (20: 4, 20: 5, 22: 5, 22: 6) Was found to be more than 80% of total fatty acids.
분리한 콜로니의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 염기서열 상동성 분석 결과, 트라우스토키트리대 속 NIOS-4과 99.02%의 가장 높은 상동성을 보이는 것으로 나타났으며, 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주로 명명하였다.The 18S rRNA gene sequence was analyzed for the molecular identification of the isolated colonies. As a result of homology analysis, it showed the highest homology of 99.02% with T. thrutus Tyrosensis NIOS-4. It was named Thraustochytriidae sp. D1c strain.
상기 분리된 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주의 감마선 조사 변이 균주를 분리하고자 하였다. 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주를 50㎖ 플라스크에서 48시간 배양 후 균체를 회수하여 PBS 버퍼 10㎖에 현탁하여 감마선을 1~5 Kgy 선량으로 1시간 조사 후 50㎖ 기본 배지 (탄소원 포도당 30 g/ℓ, 질소원 효모 추출물 10 g/ℓ, 인공해수염 5 g/ℓ, KH2PO4 9g/ℓ) (250㎖ 플라스크)를 이용하여 28℃에서 120 rpm으로 2일간 배양한 후, 사멸률이 99%일 때 현탁한 균체를 적당히 희석하여 기본배지(탄소원 포도당 30 g/ℓ, 질소원 효모 추출물 10 g/ℓ, 인공해수염 5 g/ℓ, KH2PO4 9g/ℓ, 아가 20g/ℓ)에 도말하였다. 도말한 플레이트에서 자란 단일 콜로니들 중에서 특이하게 점액질 형태를 보이는 콜로니를 선별하여 플라스크 배양을 실시하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 선별된 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA는 모균주(d1c)에 비해 높은 균체 증식을 보이는 것으로 나타났다.
To isolate the isolated strain of Thraustochytriidae sp. D1c by gamma irradiation mutants. Thraustochytriidae sp.) D1c strain was cultured in a 50 ml flask for 48 hours. The cells were collected, suspended in 10 ml of PBS buffer, irradiated with gamma rays at a dose of 1 to 5 Kg for 1 hour, glucose 30 g / ℓ, a nitrogen source yeast extract, 10 g / ℓ, the artificial beard to 5 g / ℓ, KH 2 PO 4 9g / ℓ) 120 rpm at 28 ℃ using (250㎖ flask) 2 days after the culture, When the survival rate was 99%, the suspended cells were diluted appropriately and diluted with the basic medium (30 g / l of carbon source glucose, 10 g / l of nitrogen source yeast extract, 5 g / l of artificial sea salt, 9 g / l of KH 2 PO 4 , / L). Among the single colonies grown on the plated plates, colonies showing a specific mucosal form were selected and cultured in flasks. As shown in Fig. 2, the selected strain Thraustochytriidae sp. GA showed higher cell proliferation than the parent strain (d1c).
실시예Example 2. 2. 트라우스토키트리대Truce 속( genus( ThraustochytriidaeThraustochytriidae spsp .) 돌연변이 균주 .) Mutant strains GAGA 의 지방산 조성 분석Analysis of Fatty Acid Composition
원심분리법으로 회수한 균체를 PBS 버퍼(phosphate buffered saline, pH 7.2)로 3회 세척한 후 동결 건조기에서 12시간 건조하여 건조 균체 중량을 측정하고 5% 메탄올-황산 (methanolic sulfuric acid) 용액 6㎖에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산에스테르를 0.2㎖의 헥산으로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다.The cells recovered by centrifugation were washed three times with PBS buffer (phosphate buffered saline, pH 7.2), dried in a freeze dryer for 12 hours, and the weight of the dried cells was measured. The weight of the dried cells was measured in 6 ml of methanolic sulfuric acid solution After reacting at 90 ° C for 1 hour, the resulting fatty acid ester was extracted with 0.2 ml of hexane and analyzed by gas chromatography.
전체 오일 함량은 수정된 Bligh-Dyer법에 의하여 분석되었다. 건조 균체량 125 mg에 클로로포름 6.25㎖, 메탄올 12.5㎖, 50 mM K2HPO4 버퍼 (pH 7.4) 5㎖을 가하여 28℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 반응한 후 클로로포름 6.25㎖, K2HPO4 버퍼 6.25㎖을 첨가하여 30회 정도 섞어준 후 30분 동안 방치하여 수층과 오일이 함유된 유기용매층으로 분리되도록 하였다. 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 접시로 클로로포름 층을 조심스럽게 옮긴 후 90℃에서 30분 동안 건조한 후 오일의 무게를 측정하였다. 전체 오일 함량은 아래와 같이 산출하였다.The total oil content was analyzed by the modified Bligh-Dyer method. 6.25 ml of chloroform, 12.5 ml of methanol and 5 ml of 50 mM K 2 HPO 4 buffer (pH 7.4) were added to 125 mg of the dried cell mass and reacted at 28 ° C and 200 rpm for 1 hour. Then, 6.25 ml of chloroform and 6.25 ml of K 2 HPO 4 buffer And the mixture was allowed to stand for 30 minutes to separate into a water layer and an organic solvent layer containing oil. The chloroform layer was carefully transferred to an aluminum plate which had been previously weighed, and then dried at 90 ° C. for 30 minutes, and the weight of the oil was measured. The total oil content was calculated as follows.
총 오일함량 (%, 오일 g/건조균체량 100 g) = (WL-WD) × VC × 100/VP × WS Total oil content (%, oil g / dry cell weight 100 g) = (W L -W D ) × V C × 100 / V P × W S
WL: 알루미늄 접시의 무게, WD: 알루미늄 접시 + 지질의 무게, VC: 클로로포름의 총 부피, VP: 알루미늄 접시에 옮긴 클로로포름의 부피, WS: 사용한 균체의 무게 (건조중량)
W L : weight of aluminum plate, W D : weight of aluminum plate + lipid, V C : total volume of chloroform, V P : volume of chloroform transferred to aluminum plate, W S :
한편, 오일 중에 함유된 각 지방산의 함량은 기체크로마토그래피법으로 측정하였다. 적당량의 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 용액 6㎖에 현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응하여 지방산 에스테르를 생성한 다음 헥산 0.2㎖로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다. 표 1에서 보인 바와 같이 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA는 모균주(d1c)와 마찬가지로 높은 다중불포화지방산 함량을 보이는 것으로 확인되었다.On the other hand, the content of each fatty acid contained in the oil was measured by gas chromatography. An appropriate amount of the dried cells was suspended in 6 ml of a 5% methanol-sulfuric acid solution and reacted at 90 ° C for 1 hour to produce a fatty acid ester, which was then extracted with 0.2 ml of hexane and analyzed by gas chromatography. As shown in Table 1, the mutant strain GA of Thraustochytriidae sp. Showed high polyunsaturated fatty acid content as the parent strain (d1c).
실시예Example 3 : 3: 트라우스토키트리대Truce 속( genus( ThraustochytriidaeThraustochytriidae spsp .) 돌연변이 균주 GA의 배양 특성 분석.) Analysis of culture characteristics of mutant strain GA
배양액 중의 균체를 현미경으로 관찰한 결과, 도 3에 보인 바와 같이 모균주가 균체들 간에 군집을 형성하면서 증식하는데 반해 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 돌연변이 균주 GA는 군집을 형성하지 않고 단일 균체 형태로 증식을 하는 것으로 나타났다. 모균주와 돌연변이 균주 GA 배양액의 원심분리를 실시한 결과, 돌연변이 균주 GA의 경우 모균주와 달리 균체와 점액질이 확연하게 분리되는 특성을 보이는 것으로 나타났다. 돌연변이 균주 GA의 이러한 특성은 점액질 생성에 유리하게 작용할 것으로 사료된다.As a result of microscopic observation of the cells in the culture solution, the parent strains proliferate while forming clusters among the cells, whereas the mutant strains of Thraustochytriidae sp. GA do not form clusters, In the form of growth. As a result of centrifugation of mother strain and mutant strain GA culture, the mutant strain GA showed distinctive separation of cells and mucus, unlike the parent strain. This property of the mutant strain GA is believed to be beneficial to mucus production.
Claims (11)
(b) 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 전체 지방산의 80~85%를 차지하는 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하고, 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5)는 전체 지방산의 8~15%를 차지하는 바이오오일의 제조 방법.(a) culturing the strain of claim 1 or 4 to produce a bio-oil; And
(b) recovering the bio-oil from the cultured microbial cells, wherein the polyunsaturated fatty acid (PUFA) accounts for 80% to 85% of the total fatty acids, and eicosapentaenoic acid (EPA) : 5) comprises 8 ~ 15% of total fatty acids.
(b) 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법.(a) culturing the strain of claim 1 or 4 to produce a fatty acid; And
(b) converting the produced fatty acid into biodiesel.
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| Appl Microbiol Biotechnol, Vol.98, Issue.23, pp.9643-9652 (2014)* |
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