KR100821217B1 - 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 및 이의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지용성이며 빛과 공기 중의 수분에 불안정한 레티놀의 안정성, 용해도 등이 개선된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자, 이의 제조방법 및 레티놀의 가용화방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 새로운 기능성 물질로 주목 받고 있는 레티놀을 산화 또는 변성 등이 없이 간단한 공정에 의해 본래 형태대로 안전하게 저분자량 수용성 키토산에 봉입시킬 수 있고, 표피층을 투과할 수 있는 물질의 제한성 및 흡수성의 문제를 나노기술을 이용하여 해결할 수 있으며, 레티놀을 담지하는 저분자량 수용성 키토산의 무독성 및 생분해성은 인체에 아무런 부작용이 없을 뿐만 아니라, 담지된 레티놀을 서서히 방출함으로써 레티놀의 효과를 높이는 데 유용하게 사용할 수 있다.

레티놀, 저분자량 수용성 키토산

Description

레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 및 이의 제조방법{Retinol encapsulated low molecular water-soluble chitosan nanoparticles and method for preparation thereof}

도 1은 (a) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기 분포, (b) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 투과전자현미경 사진이고,

도 2는 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 적외선 분광 스펙트럼을 나타내고,

도 3은 (a) D₂O하에서 저분자량 수용성 키토산, (b) DMSO하에서 레티놀, (c) D₂O하에서 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 및 (d) D₂O/DMSO 혼합용액(1:4, v/v)하에서 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타내고,

도 4는 (a) 레티놀, (b) 저분자량 수용성 키토산 및 레티놀의 물리적 혼합물, (c) 저분자량 수용성 키토산 및 (d) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자(실시예 1~4)의 X-선 회절(X-ray powder diffraction) 분석 결과를 나타내고,

도 5는 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 의한 레티놀의 용해도 측정 결과를 나타내고,

도 6은 실시예 1~4에서 제조된 (a) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 동결건조 전 입자 분포 변화 및 (b) 동결건조 후 증류수에 재분산한 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 입자 분포 변화를 측정한 결과를 나타내고,

도 7은 실시예 1~4에서 제조된 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 안정성 시험 결과를 나타내고,

도 8은 실시예 1~4에서 제조된 (a) 동결건조 전 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 및 (b) 동결건조 3일 후 증류수에 재분산시킨 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 촬영한 사진을 나타내고,

도 9의 (a)는 순수한 레티놀을 에탄올에 0.125 mg/㎖의 농도로 녹이고 이를 1/2씩 희석해 가면서 측정한 용액의 HPLC 분석 결과와 상기 각 농도에 대한 피크 면적을 나타내고, (b)는 실시예 1~4에서 제조된 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1 : 실시예 1에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자

2 : 실시예 2에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자

3 : 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자

4 : 실시예 4에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자

5 : 순수한 레티놀

6 : 레티놀이 봉입되지 않은 저분자량 수용성 키토산

7 : 순수한 레티놀과 순수한 저분자량 수용성 키토산의 물리적 혼합물

도 3의 1~20 : 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 키토산 나노입자에 대한 ¹H NMR 특성 피크

본 발명은 지용성이며 빛과 공기 중의 수분에 불안정한 레티놀의 안정성, 용해도 등이 개선된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자, 이의 제조방법 및 레티놀의 가용화방법에 관한 것이다.

키토산은 글루코오스아민(glucosamine)의 피라노스(pyranose) 단위체가 β-1,4 결합된 것으로서, 글루코오스아민 잔기가 5,000 개 이상 결합된 분자량이 100 만 이상이고 다가의 양이온을 가진 다당류(polysaccharide) 계열의 생체고분자물질로 게 껍질이나 새우와 같은 갑각류 및 오징어를 포함하는 수산계로부터 추출할 수 있으며, 그 분자 구조로 볼 때 다당류의 일종인 셀룰로오스와 유사한 구조로서, 생체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응이 일어나지 않기 때문에 의약 산업에 응용되고 있고, 최근 미국의 FDA에서 식품으로서 인증을 받은 후, 키토산은 21세기의 중요한 생물산업 및 생체의료용 물질로 응용되고 있다.

특히, 20,000 ∼ 100,000 이내의 특정 분자량의 범위를 가진 키토산은 강한 생리활성 기능을 띠고 있는 것으로 알려져 있기 때문에 건강 식품분야, 식ㆍ음료 분야, 화장품 분야, 보건위생 분야 및 의약품 분야에 대한 응용성을 기대할 수 있다.

그러나, 상술한 특징 및 장점을 갖는 키토산은 서로 이웃하는 분자가 강한 수소결합으로 견고하게 결합되어 물에 녹지 않는 불용성 물질로서, 종래 이러한 키토산을 녹이기 위하여 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산 및 염산, 질산 및 황산으로 구성되는 무기산을 사용함으로 생체에 응용하는 데 제한을 주고 있다는 문제점을 가지고 있었다. 본 발명자들은 이러한 문제를 해결할 수 있는 획기적인 수용성 키토산을 개발하고 이를 특허출원하여 등록받은 바 있다(대한민국 등록특허 제441270호). 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

상기 대한민국 등록특허 제441270호는 "1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼100,000 Da의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법"을 개시하고 있다.

한편, 레티놀은 전 세계적인 주목을 받고 있는 새로운 기능성 물질로서 그 실체는 순수 지용성 비타민 A이다. 이러한 레티놀은 그 활성형태인 레티노인산(retinoic acid)으로 변형되어 그 기능을 나타낸다. 이들의 주요 기능으로는 표피세포가 원래의 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 살펴보면, 레티놀은 피부세포에 존재하는 세포 핵 중의 DNA로 하여금 RNA를 발현시키게 함으로써 세포분화를 촉진하고 세포 사이에 존재하는 조직물인 콜라겐, 엘라스틴 등의 생합성을 촉진하여 주름 생성을 억제하고 피부탄력을 유지 및 증대시키는 효능을 가지고 있다. 또한, 레티놀은 세포의 증식을 억제하는 작용을 함으로써, 전신에 섭취될 경우에는 암의 증식을 예방하는 작용을 할 뿐만 아니라, 백혈병 치료제, 항염증제 등으로 사용되는 등 면역 기능의 수행에 있어서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

그러나, 지용성 비타민인 레티놀은 물에 대한 용해도가 매우 낮고, 빛, 열, 산소 등과 접촉되는 경우에는 쉽게 산화되거나 변형되어 변색, 변취, 역가가 떨어져 효과가 저하되는 불안정한 물질로서, 소량 사용에도 피부자극이 유발되는 문제점 등으로 인하여 이의 우수한 주름 생성 억제 기능 등에도 불구하고 화장료로서의 사용이 극히 제한되어 왔다. 따라서, 1차적으로 레티놀 자체를 안정화시킬 수 있는 기술이 선행되지 않는 한 레티놀의 제품화는 기대할 수 없는 실정이다.

종래, 이러한 레티놀의 불안정성, 불수용성 등의 문제를 개선하려는 연구가 많이 시도되었다. 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

미합중국 등록특허 제5,855,826호는 콜라겐 또는 콘드로이친황산나트륨과 같은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)으로 제조된 캡슐 내에 레티놀을 포접시켜 1차 안정화시키고, 겔란(gellan)검으로 상기 1차 안정화된 캡슐을 매트릭스화하여 2차 안정화시키는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법은 2중으로 안정화시켰으나, 겔란검에 의한 2차 안정화는 오픈 매트릭스 시스템으로 이루어져 있어 산소, 수분, 열에 아주 민감한 레티놀을 이들과의 접촉으로부터 효과적으로 차단하기 어렵기 때문에 여전히 레티놀의 안정화에 한계가 있다.

미합중국 등록특허 제3,906,108호는 유용성 항산화제인 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxyltoluene, BHT), DL-α-토코페롤 및 킬레이트제인 EDTA를 사용하여 레티노인산의 안정화를 시도한 수중유(O/W, oil in water)형의 유화제형에 대한 내용을 개시하고 있다. 또한, 미국특허 제4,247,547호는 유용성 항산화제인 토코페롤, 구연산을 사용하여 레티놀을 안정화시킨 수중유형의 유화제형에 대한 내용을 개시하고 있다.

미합중국 등록특허 제4,826,828호는 유용성 항산화제인 상기 BHT 및 BHA(butylated hydroxylanisole)를 사용하여, 레티놀, 레티닐아세테이트 또는 레티 닐 팔미테이트를 안정화시킨 유중수(W/O)형의 유화제형에 대한 내용을 개시하고 있다. 또한, 미합중국 등록특허 제4,720,353호는 레티놀을 항산화제인 상기 BHA, 아스코르빈산 및 토코페릴리놀레이트를 사용하여 안정화시킨 유중수형의 유화제형에 대한 내용을, 유럽등록특허 제0440,398 B1호는 레티노이드의 화학적 안정성을 향상시키기 위해 1종 이상의 수ㆍ유용성 항산화제 및 킬레이트제를 함유한 수중유형 유화조성물에 대한 내용을, 유럽공개특허공보 제1,568,106 A1호는 레티노이드를 안정화시키는 시스템으로 킬레이트제와 수ㆍ유용성 항산화제, 유화물의 유상과 수상에 동시에 존재하는 항산화제 및 유리염기형의 이미다졸을 함유하는 수중유형의 유화조성물에 대한 내용을 개시하고 있다.

이러한 수중유형 또는 유중수형의 유화제형 또는 유화조성물에 관한 종래 기술의 특징은 레티놀 및 이의 유도체를 안정화시키기 위해 유화형태에 따라 유ㆍ수용성 항산화제, 킬레이트의 종류를 변화시켜 이들의 안정화를 시도한 방법으로 요약될 수 있다. 그러나, 불안정한 레티놀을 빛, 열, 산소, 수분 등으로부터 완전하게 보호할 수 없기 때문에 장시간 레티놀을 효과적으로 안정화시키기에는 여전히 한계가 있다.

대한민국 공개특허공보 제2003-0021709호는 불안정한 유용성 물질인 레티놀을 비이온계면활성제, 콜레스테롤 및 콜레스테릴에스테르로 제조된 베시클(vesicle)에 1차 안정화시킨 후, 이를 다시 레시친과 세라마이드로 제조된 멀티 라멜라리포좀인 스핑고좀 내에 첨가한 다음, 마지막으로 라멜라 액정 유화베이스에 첨가함으로써 공기와 수분 등으로부터 산화되기 쉬운 레티놀을 3중으로 안정화시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 3중으로 안정화시키기까지의 다단계 공정으로 인해 시간과 비용면에서 불리하다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상술한 생체 고분자 물질인 저분자량 수용성 키토산을 이용하여 core-shell 형태의 나노입자를 제조하고, 그 내부에 레티놀을 봉입시킴으로써 레티놀의 불안정성을 개선하고 체내에서 효과적으로 전달될 수 있도록 용해도를 향상시킨 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제조하는 방법을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 레티놀의 안정성 및 수용성을 확보할 수 있는 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 레티놀을 가용화하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태는 저분자량 수용성 키토산이 레티놀 분자들을 둘러싸고 있는 구형의 core-shell 형태를 띠고 있다(도 1b 참조). 따라서, 이러한 구형의 core-shell 형태가 갖는 구조적 특성에 의해, 저분자량 수용성 키토산의 내부에 위치하게 되는 레티놀은 빛, 열, 공기 중의 수분 등과 접촉이 차단되고, 그 결과 레티놀의 안정성 확보가 가능하게 된다.

본 발명에 따른 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 하기 화학식 1과 같이 저분자량 수용성 키토산의 아민기와 레티놀의 하이드록시기가 수소결합에 의해 결합된 것으로 판단되나, 반드시 이 이론에 한정되지는 아니한다.

상기 식에서, n은 6 내지 310이다.

상기 저분자량 수용성 키토산은 500~100,000 Da의 분자량을 갖는 순수한 유리 아민기를 갖는 저분자량의 수용성 키토산이 바람직하고, 1,000~50,000 Da인 것이 더욱 바람직하다.

예를 들면, 불수용성인 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기로 처리하고, 이를 유기용매로 처리하여 상기 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산을 상기 염기 염의 형태로 제거한 키토산 올리고당을 회수하고, 간단한 처리 후 정제하여 얻어지는 수용성 키토산으로서, 본 발명자들의 대한민국 등록특허 제441,270호에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다.

상기 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 크기는 봉입되는 레티놀의 양에 의존한다. 따라서, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자가 적용되는 목적에 따라서, 상기 나노입자의 크기는 자유롭게 조절될 수 있다. 예를 들면, 피부 투과를 목적으로 하는 화장품의 원료로 사용되는 경우에는 피부 투과 효율을 최대화하기 위해, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 50 ~ 250 nm의 크기를 갖는 것이 바람직하고, 50 ~ 150 nm인 것이 더욱 바람직하며, 이는 봉입되는 레티놀의 양을 조절함으로써 확보될 수 있다.

또한, 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 수용성이므로, 용해도가 매우 작은 레티놀의 용해도를 증대시킬 수 있다. 나아가, 무독성, 생분해성 특징을 갖는 저분자량 수용성 키토산 나노입자로 둘러싸여 있기 때문에, 인체에 아무런 부작용이 없으며, 체내 복용 또는 피부에 흡수된 나노입자는 레티놀을 서서히 방출시키는 역할을 수행함으로써, 레티놀의 작용을 극대화하는 역할을 한다.

본 발명에 따른 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 레티놀의 산화 방지를 위해 토코페롤, BHT, BHA, 아스코르빈산 등과 같은 항산화제를 1 또는 2 이상 더 포함할 수 있다. 이러한 항산화제들은 레티놀과 함께 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 내부에 위치하게 된다.

본 발명은 또한, 저분자량 수용성 키토산 용액을 준비하는 단계; 레티놀 용액을 준비하는 단계; 상기 레티놀 용액을 상기 저분자량 수용성 키토산 용액과 혼합, 교반하는 단계; 및 상기 혼합 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 레티놀 용액을 준비하기 위해 사용되는 항산화제 용액을 준비하는 단계를 더 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명의 상기 저분자량 수용성 키토산 용액을 준비하는 단계는 적당량의 저분자량 수용성 키토산을 증류수에 용해시킴으로써 수행될 수 있다. 이때 사용되는 저분자량 수용성 키토산은 본 발명자들의 상기 등록특허 제4,412,705호에 기재되어 있는 방법에 의해 제조된 것을 사용할 수 있다. 상기 저분자량 수용성 키토산은 피부에 적절하게 투과되도록 하기 위해, 분자량이 500~100,000 Da이고, 1,000~ 50,000 Da으로 평균 분자량이 1,000~24,000 Da인 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 상기 항산화제 용액을 준비하는 단계는 레티놀의 산화안정성을 확보하기 위해 레티놀의 산화를 방지할 수 있는 항산화제를 적당한 용매에 용해시킴으로써 수행될 수 있다. 이때 사용되는 용매는 사용되는 항산화제를 용해시킬 수 있으며 인체에 무해한 용매이면 제한없이 사용될 수 있으나, 상기 항산화제 용액은 하기의 레티놀을 용해시킬 수 있어야 하므로 수성 용액은 사용할 수 없다. 상기 용매로는 예를 들어 DMSO(Dimethyl sufoxide), THF(Tetrahydrofuran), 에탄올 등을 사용하는 것이 바람직하며, 이 중 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 항산화제로는 토코페롤 외에 BHT, BHA, 아스코르빈산 등 레티놀의 산화를 방지할 수 있는 항산화제이면 제한없이 사용할 수 있다.

상기 항산화제 용액 내의 항산화제는 용해되는 레티놀 1 중량부에 대하여 0.3~4 중량부인 것이 바람직하다. 0.3 중량부 이하인 경우에는 레티놀을 안정화시키기에는 부족하고, 4 중량부 이상인 경우에는 초과되는 양에 의한 안정화 효과를 기대할 수 없으므로 시약의 낭비가 된다

본 발명의 상기 레티놀 용액을 준비하는 단계는 상기 제조된 항산화제 용액을 적당량의 레티놀에 적하하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 상기 레티놀 용액을 상기 제조된 저분자량 수용성 키토산 용액에 혼합, 교반하는 단계는 저분자량 수용성 키토산 용액을 교반시키면서 상기 레티놀 용액을 서서히 적하하는 방법으로 수행될 수 있다. 이때, 상기 저분자량 수용성 키토산 용액 및 레티놀 용액의 혼합은 저분자량 수용성 키토산 1 중량부에 대하여 레티놀 0.04 ~ 0.4 중량부로 이루어지는 것이 바람직하다.

교반은 상기 두 용액의 혼합에 의해 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자가 물리적인 힘에 의해 파괴되지 않도록 적당한 시간 동안 수행한다. 바람직하게는 25 ~ 35분 동안 수행한다.

본 발명의 상기 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 용액을 동결건조하는 단계는 통상적으로 사용되는 동결건조 방법 또는 동결건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 고체형태의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 나노입자를 얻을 수 있다.

본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 나노입자가 갖는 구형의 core- shell 형태는 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 ¹H NMR 또는 XRD 스펙트럼을 분석한 결과, 상기 스펙트럼에서는 저분자량 수용성 키토산의 피크만 관찰되는 것으로부터 알 수 있고, 이러한 구조적 특성에 의해 레티놀의 안정성이 확보될 수 있다(도 3 및 4 참조).

본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 지용성인 레티놀을 담지함으로써, 수환경에서도 그 용해도를 현저히 상승시킬 수 있다(도 5 참조).

본 발명에 의해 제조되는 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 나노입자는 동결건조 과정에 의해 그 크기가 감소한다(도 6 참조). 또한, 시간의 경과에 의한 레티놀의 불안정성 문제 및 분산 능력을 크게 향상시킬 수 있다(7 및 8 참조).

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 제조

분자량이 1,000~50,000 Da인 저분자량 수용성 키토산 50 mg을 증류수에 용해시켜 저분자량 수용성 키토산 용액을 준비하고, 산화방지제로서 토코페롤(시그마 제품) 및 BHT(시그마 제품) 10 mg을 에탄올 1 ml에 각각 용해시켜 항산화제 용액을 준비하였다. 이후, 상기 제조된 토코페롤 및 BHT 항산화제 용액을 레티놀(시그마 제품) 2 mg에 각각 0.2 ml를 적하하는 방법으로 용해시켜 레티놀을 용해시켰다. 상기 제조된 저분자량 수용성 키토산 용액을 교반시키면서 상기 제조된 레티놀 용액을 서서히 적하한 후, 30분 동안 더 교반시켜 레티놀이 저분자량 수용성 키토산 나노입자 내부에 봉입되도록 하였다. 교반이 끝난 후, 상기 반응용액을 동결건조기(77510-03, LABCONCO사, USA)에 24-48시간 동안 동결건조시킨 후, 고체형태의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 얻었다(47mg, 94%).

< 실시예 2~4> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 제조

*레티놀(시그마 제품)을 각각 5, 10, 20 mg으로 준비하여 레티놀 용액을 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 얻었다.

< 실험예 1> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태, 크기 및 표면 전압 측정

상기 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태, 크기 및 표면 전압을 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

먼저, 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태를 TEM(Transmission Electron Microscope; JEOL JEM-2000 FX-II)을 이용하여 관찰하 였다. 0.01%의 PTA(phosphotungstic acid)에 분산시킨 후 이 용액 한 방울을 탄소 필름이 코팅된 동 그리드(copper grid) 위에 떨어뜨리고 실온에서 건조하였다.

다음으로, 동결건조된 레티놀이 봉입된 키토산 나노입자를 1mg/ml의 농도로 증류수에 분산시킨 후, 광산란(Dynamic Light scattering)에 의한ELS-8000(Otsuka, Electronics사, Japan)를 이용하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다.

다음으로, 동결건조된 레티놀이 봉입된 키토산 나노입자를 1mg/ml의 농도로 증류수에 분산시킨 후, ELS-8000(Otsuka, Electronics사, Japan)을 이용하여 상기 나노입자의 표면 전압을 측정하였다.

상기 측정 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	LMWSC (mg)	레티놀 (mg)	입자 크기 (nm)			제타전위 (mV)
			강도 (intensity)	질량 (weight)	입자갯수 (number)
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4	50 50 50 50	2 5 10 20	100.6±30.3 135±42.4 174.2±46.6 254.5±67.2	79.6±21.5 106.2±28.9 143.8±35.7 208.6±53.3	67.8±14.7 90.6±19.4 124.2±26.1 179.0±38.1	51.90 55.92 67.32 74.86

표 1 및 도 1a 에 나타난 바와 같이, 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기는 평균 141.1 nm로 측정되었으며, 레티놀이 봉입된 양에 따라 50 ~250 nm의 값을 나타냄을 알 수 있다. 이로부터, 봉입되는 레티놀의 양을 조절하여 원하는 크기의 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

또한, 제타 전위는 (+) 50~75 mV 범위의 값을 갖는 것으로 나타났다. 나노입자 표면이 (+)값을 나타내는 것으로 보아, 상기 나노입자의 표면을 키토산이 둘러싸고 있음을 알 수 있다

또한, 도 1b의 TEM 사진 결과로부터, 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태는 구형의 형태를 갖는 것을 알 수 있다.

< 실험예 2> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 FT-IR 측정

실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 아민기 및 하이드록시기 간의 봉입 여부를 알아보기 위해 FT-IR 분광 분석기(Shimadzu사, FR-IR 8700)를 이용하여 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 3750 cm^-1 부근에서 유리 하이드록시기(OH) 피크가 레티놀의 봉입량이 증가함에 따라 함께 증가하는 것을 볼 수 있다. 이로부터, 저분자량 수용성 키토산의 아민기와 레티놀의 하이드록시기 간에 수소결합이 레티놀의 봉입량에 따라 증가함을 알 수 있다.

또한, 레티놀의 특성 피크인 1720 cm-1 부근의 피크도 레티놀의 봉입량이 증가함에 따라 함께 증가하는 것을 볼 수 있다. 이로부터, 레티놀이 저분자량 수용성 키토산 나노입자 내부로 봉입됨을 알 수 있다.

< 실험예 3> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 ¹ H NMR 측정

상기 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 ¹H NMR 스펙트럼을 얻기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

먼저, 친수성 물질인 저분자량 수용성 키토산을 0.5~1 mg/ml의 농도로D₂O에 용해하여 298 K에서 ¹H NMR 분석기(AVANCE 400(400MHz), Bruker사, Germany)로 스펙트럼을 측정하였다.

다음으로, 소수성 물질인 레티놀을 0.5~1 mg/ml의 농도로 유기용매인 DMSO에 용해하여 298 K에서 ¹H NMR 스펙트럼을 측정하였다.

다음으로, 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 0.5~1 mg/ml의 농도로 D₂O에 용해하여 298 K에서 ¹H NMR 스펙트럼을 측정하였다.

다음으로, 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 0.5~1 mg/ml의 농도로 D₂O : DMSO = 1:4 (v/v)로 혼합하여 298 K에서 ¹H NMR 스펙트럼을 측정하였다.

상기 측정 결과를 순서대로 도 3의 a~d에 나타내었다.

도 3a에 나타난 바와 같이, 친수성 물질인 저분자량 수용성 키토산은 D₂O에 용해된 결과, 5.0~3.0 ppm 사이에서 깨끗한 저분자량 수용성 키토산 피크를 나타냄을 확인하였다.

도 3b에 나타난 바와 같이, 소수성 물질인 레티놀은 유기용매인 DMSO에 용해된 결과, 2.0~1.0 ppm 사이에서 깨끗한 레티놀 피크를 나타냄을 확인하였다.

도 3c에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 D₂O에 녹여 측정한 NMR 스펙트럼에서는 도 1a에서 나타난 피크와 같은 저분자량 수용성 키토산 피크만 확인할 수 있었다. 이로부터, 저분자량 수용성 키토산이 레티놀을 Core-Shell 형태로 감싸 안고 있음을 알 수 있다.

도 3d에 나타난 바와 같이, 저분자량 수용성 키토산 피크와 레티놀 피크를 동시에 확인할 수 있었다. 변성되지 않는 레티놀(도 3b)과 똑같은 레티놀 피크를 확인함으로써, 레티놀이 저분자량 수용성 키토산에 봉입될 때 어떠한 변화도 생기지 않고 봉입되었음을 알 수 있다.

< 실험예 4> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 XRD 측정

순수한 레티놀, 저분자량 수용성 키토산, 레티놀과 저분자량 수용성 키토산의 10:50(v/v) 비율에 의한 물리적 혼합물 및 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 XRD 분석기(제작사 및 제원을 기재하여 주시기 바랍니다)를 이용하여 X-선 회절 스펙트럼을 얻고, 그 결과를 도 4의 a~d에 순서대로 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 레티놀은 강한 결정성을 보이는 반면(도 4a), 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자(도 4d)는 저분자량 수용성 키토산(도 4c)에 나타난 바와 같이 결정성을 나타내지 않았다. 이는 NMR결과를 뒷받침하는 결과로 레티놀이 저분자량 수용성 키토산에 봉입되었기 때문에 결정성이 나타나지 않았다. 이는 도 4b에 나타난 바와 같이, 레티놀과 저분자량 수용성 키토산 나노입자와의 단순한 물리적 혼합물인 경우에도 레티놀이 강한 결정성을 나타내는 것과 대조를 이룸을 알 수 있다.

< 실험예 5> 레티놀의 용해도 측정

불수용성인 레티놀이 본 발명에 의해 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 봉입되는 경우 용해도의 변화 여부를 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

키토산 용액을 10, 7, 3, 1, 0.7, 0.5, 0.1, 0.07, 0.03 및 0.01 ㎎/ml 농도로 준비하고 여기에 파우더 형태의 레티놀을 키토산 용액에 떨어뜨리고, shaking incubater에서 1일 및 3일 동안 흔들어 준 후, UV spectrophotometer(UV-1610, shimadzu사, Japan)를 이용하여 레티놀의 농도를 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 3일 경과 후의 레티놀의 용해도가 전체적으로 1일 경과 후의 레티놀의 용해도 측정값에 비하여 증가하였음을 알 수 있다. 또한, 레티놀의 용해도는 저분자량 수용성 키토산의 양이 증가함에 따라 함께 증가하여 최대 28 ㎍/ml까지 증가함을 알 수 있다. 이러한 용해도 값은 일반적으로 레티놀의 수용액 상태에서의 용해도가 0.06 ㎍/ml인 것과 비교할 때 무려 460 배 이상 증가한 값으로서, 본 발명에 의한 레티놀의 용해도 상승 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

< 실험예 5> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산의 안정성 시험

실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산의 안정성을 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

먼저, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 용액에 대하여 동결건조를 수행하기 전의 입자 크기와 동결건조 후의 고체 형태를 증류수에 재분산 한 후 입자크기를 ELS-8000을 이용하여 측정 비교하였다.

다음으로, 동결 건조 후 재분산시킨 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기를 1일, 1주, 1, 2, 3개월 간격으로 ELS-8000을 이용하여 측정함으로써 안정성 여부를 확인하였다.

다음으로, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 분산 능력을 레티놀 분말과 비교하기 위해, 동결건조 후 3일이 경과한 실시예 1~4의 나노입자와 레티놀 분말을 증류수에 재분산시켰다.

상기 실험 결과를 도 6~8에 순서대로 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 동결건조 전의 입자의 크기 및 분포는 최소 약 80 nm에서 최대 약 350 nm를 나타낸 반면, 동결 건조 후 재분산시킨 입자의 크기 및 분포는 최소 약 60 nm에서 최대 약 260 nm로 나타났다. 이로부터, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 동결건조과정에 의해 안정성이 향상되는 것을 알 수 있다.

도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기는 3개월이 경과한 후에도 입자의 크기 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 시간의 경과에 따른 레티놀의 불안정성을 개선할 수 있음을 알 수 있다.

도 8에 나타난 바와 같이, 소수성을 띤 레티놀 분말은 증류수에 거의 분산 되지 않으나, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 증류수에 현저하게 재분산되는 것으로 나타났다. 이로부터, 소수성을 띤 레티놀의 분산 능력 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 의해 크게 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 6> 레티놀의 봉입 효율 측정

실시예 1~4에서 제조된 레티놀의 봉입된 저분자량 수용성 키토산의 봉입 효율을 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

먼저, 순수한 레티놀의 검량하기 위해 레티놀을 에탄올에 0.125 mg/㎖의 농도로 녹이고 이를 1/2씩 희석해 가면서 HPLC(Spectra Physics사(미국) 제품, P4000) 분석을 수행하였다. 상기 HPLC는 이동상으로 95% 메탄올(메탄올:물=95:5(v/v))을 사용하였으며, 유속은 1.5 ㎖/분으로 조절하였다. HPLC 수행 온도는 25 ℃이었으며, UV 검출기 흡수파장은 325 nm에서 측정하였다.

다음으로, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 탄올을 첨가하여 상기 나노입자를 완전히 녹였다. 그 후, 상기 나노입자가 녹아있는 용액으로부터 각각 0.1 ㎖를 취하여 0.9 ㎖의 에탄올로 희석하고 상기 HPLC의 수행조건과 동일한 조건하에서 HPLC 분석을 수행하였다. 상기 분석 결과는 하기의 표 2 및 도 9에 나타내었다.

	키토산/레티놀 중량비(mg/mg)	약물 함량(%, w/w)	봉입 효율(%, w/w)
실시예 1	25	2.4	63
실시예 2	10	6.1	64.2
실시예 3	5	10.7	67.5
실시예 4	2.5	21	76.3

먼저, 도 9의 (a)에 나타낸 바와 같이, 최초 순수한 레티놀의 농도 0.125 mg/㎖를 1/2씩 희석해 가면서 측정된 용출시간은 4.3 분인 것을 알 수 있다. 도 9의 (a)의 그래프 내의 또 다른 그래프는 순수한 레티놀의 농도를 1/2씩 희석한 것을 나타내고 있다.

다음으로, 도 9의 (b)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1~4의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자가 레티놀의 용출시간인 4.3 분에서 저분자량 수용성 키토산 나노입자/레티놀의 중량비에 반비례하는 경향을 나타내면서 검출되는 것을 알 수 있다.

또한, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1~4의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 최저 63%에서 최고 77.3%의 봉입 효율로 레티놀 분자를 봉입하고 있음을 알 수 있다.

본 발명에 의하면, 새로운 기능성 물질로 주목 받고 있는 레티놀을 산화 또는 변성 등이 없이 간단한 공정에 의해 본래 형태대로 안전하게 저분자량 수용성 키토산에 봉입시킬 수 있다. 또한, 표피층을 투과할 수 있는 물질의 제한성 및 흡수성의 문제를 나노기술을 이용하여 해결하였으며, 레티놀을 담지하는 저분자량 수용성 키토산의 무독성 및 생분해성은 인체에 아무런 부작용이 없을 뿐만 아니라, 담지된 레티놀을 서서히 방출함으로써 레티놀의 효과를 높이는 데 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 분자량 1,000-50,000 Da의 수용성 유리아민 키토산을 물에 녹여 저분자량 수용성 유리아민 키토산 용액을 준비하는 단계;

   토코페롤, BHT(butylated hydroxyltoluene), BHA(butylated hydroxylanisole) 및 아스코르빈산 중에서 선택되는 1 또는 2 이상의 항산화제를 용해시켜 항산화제 용액을 제조하고, 상기 항산화제 용액을 레티놀에 적하시켜 레티놀 용액을 준비하는 단계;

   상기 저분자량 수용성 유리아민 키토산 용액을 교반시키면서 상기 레티놀 용액을 서서히 적하시켜 혼합, 교반하는 단계; 및

   상기 혼합 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 레티놀의 가용화방법.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서, 상기 항산화제 용액 내의 항산화제는 레티놀 1 중량부에 대하여 0.3~4 중량부인 것을 특징으로 하는 레티놀의 가용화방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 항산화제 용액은 용매로서 레티놀을 용해시킬 수 있는 DMSO, THF 및 에탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 레티놀의 가용화방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 레티놀의 가용화방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 제5항에 있어서, 상기 저분자량 수용성 유리아민 키토산 용액 및 레티놀 용액은 저분자량 수용성 유리아민 키토산 1 중량부에 대하여 레티놀 0.04~0.4 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 레티놀의 가용화방법.
14. 제5항에 있어서, 상기 교반은 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 유리아민 키토산 나노입자가 물리적인 힘에 의해 파괴되지 않도록 25~35분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 레티놀의 가용화방법.

Images