KR102205564B1 - Pdrn이 캡슐화된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노필름 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노필름, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 제공되는 키토산 나노필름에 의해 세포 활성화 효과가 나타날 수 있다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 키토산 나노필름에 의해 조직 재생 효과가 나타날 수 있다.

Description

PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노필름 및 이의 제조 방법 {PDRN encapsulated chitosan nanoparticles included chitosan nanofilm and a method for preparing the same}
본 명세서에 의해 개시되는 내용은 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노필름, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용은 화장용 및 의료용으로 효율적인 제어 약물 전달 시스템을 개발하는 분야에 관한 것이다.
키토산 (Chitosan)은 키틴의 탈아세틸화를 통해서 제작될 수 있는 천연 생체 고분자 물질로, 폴리-베타-1,4-글루코사민(poly-β-1,4-glucosamine)이라는 명칭을 가지는 D-글루코사민과 N-아세틸글루코사민이 임의적으로 분포하는 양이온 선형 다당류이다.
키토산의 일 유도체인 키토산 하이드로클로라이드(Chitosan hydrochloride: 이하, CHC)는 강한 양이온성 키토산의 수용성 유도체이며 생체 적합성, 양전하, 접착 및 생물 분해성과 같은 약물 전달에 유리한 성질을 가지고 있다.
콜레스테롤 저하, 지방결합능력, 유당소화불량 억제작용, 발암억제효과, 항종양작용, 보습성 및 유화안정성 등 키토산의 다양한 생리적 효과를 의약품 및 화장품 산업에 적용하기 위한 많은 시도가 이루어지고 있다.
또한, 키토산을 이용하여 나노 입자(nanoparticle)가 제작될 수 있으며, 키토산 나노 입자(chitosan nanoparticle; 이하, CNP)에 히알루론산, 커큐민, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드 및 천연 항산화제와 같은 다양한 생물학적 활성 화합물이 캡슐화될 수 있다는 것이 이전의 연구에 의해 입증되었다 (Xu et al., 2017, Harris et al., 2011, Liang et al., 2016).
상기 키토산 나노 입자(CNP)는 생체 내 및 저장 중 효소 및 화학적 분해로부터 민감한 생체 활성 거대 분자를 보호 할 수 있을 뿐만 아니라 흡수성 상피 세포 (Takeuchi 등, 2001)를 통해 대 된 거대 분자의 전달을 촉진 할 수 있다.
한편 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide; 이하, PDRN)는 짧은 데옥시리보뉴클레오티드(short deoxyribonucleotide) 중합체 (50-2,000 염기의 DNA 절편)의 혼합물이다.
PDRN은 세포의 증식과 재생을 촉진하는 세포 성장 자극제로 알려져 있다(Koo and Yun 2016). PDRN은 인간의 태반 (Tonello et al., 1999), 송어 정자 또는 다른 연어 종 (Lee et al., 2018)에서 추출될 수 있다.
PDRN은 대부분 생체 내로 직접 처리(treatment)되고 있다. 생체 내로 직접 처리되는 PDRN은 짧은 반감기와 생체 내 존재하는 효소에 의해 빠른 시간 내에 제거(degradation)될 수 있으며, 이 경우, 생체 내에서 적절한 농도를 유지하기 위해 상처 부위에 PDRN이 여러 번 처리되어야 하는 번거로움이 있을 수 있다.
따라서, 생체 친화적인 물질을 이용한 생체 활성 물질의 고정화를 통해 생체 내에서 일정 시간 동안 생체 활성 물질을 보호하고, 생체 활성 물질의 방출 속도 제어가 가능할 수 있도록 하는 기술 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 출원에서는 생체 친화적 물질인 키토산을 이용하여 생체 활성 물질을 고정화 시켜, 생체 활성 물질의 보호 및 방출 속도 제어가 가능하도록 하는 키토산 나노필름을 제공하고자 한다.
본 출원에서는 생체 친화적 물질인 키토산을 이용하여 생체 활성 물질을 고정화 시켜, 생체 활성 물질의 보호 및 방출 속도 제어가 가능하도록 하는 키토산 나노필름의 제작 방법을 제공하고자 한다.
본 출원에서는 키토산에 고정화된 생체 활성 물질의 방출에 의한 상처 치유 및/또는 조직 재생용 키토산 나노필름을 제공하고자 한다.
본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자; 및 키토산으로 이루어지는 막(membrane);을 포함하는 키토산 나노필름으로서, 상기 키토산으로 이루어진 막의 표면에 상기 키토산 나노 입자가 하나 이상 포함되어있는 키토산 나노필름이 제공된다.
본 출원에 의해 개시되는 기술의 다른 양태에 따르면, i) PDRN 용액과 제1 키토산 용액을 1:1 부피비로 교반하는 것을 포함하는 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자를 제조하는 제1 단계 - 이 때, 상기 PDRN 용액은 PDRN이 펜타소듐 트리포스페이트(pentasodium triphosphate)에 용해된 것이며, 상기 제1 키토산 용액은 키토산이 물에 용해된 것임-; ii) 상기 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노 입자 용액(PDRN-CNP solution)을 제조하는 제2 단계 - 이 때, 상기 제2단계는 상기 제1 단계에서 제조된 상기 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자(PDRN-CNP)를 제2 키토산 용액에 첨가하고 교반하는 것을 포함 함- ; 및 iii) 상기 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노 입자 용액(PDRN-CNP solution)을 건조시키는 제3단계; 를 포함하는 키토산 나노필름 제조 방법이 제공된다.
본 출원에 의해 개시되는 기술의 또 다른 양태에 따르면, PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자; 및 키토산으로 이루어지는 막(membrane);을 포함하는 키토산 나노필름으로서, 상기 키토산으로 이루어진 막(membrane)의 표면에 상기 키토산 나노 입자가 하나 이상 포함되어있고,
상기 키토산 나노필름은 세포 증식 효과 및 세포 이동 효과 중 하나 이상을 나타내는, 조직 재생용 키토산 나노필름이 제공된다.
본 명세서에 의해 개시되는 기술에 따르면, 키토산에 고정화된 PDRN이 생체 내에서 안정하게 보호될 수 있는 키토산 나노필름이 제공될 수 있다. 나아가, 상기 고정화된 PDRN이 방출되는 속도가 조절되는 키토산 나노필름이 제공될 수 있다.
PDRN이 고정화된 키토산 나노필름 제조 시 용매 증발법(solvent evaporation method)을 이용하여 키토산 나노필름 생성속도를 단축시킬 수 있고, 공정설비 및 제조에 필요한 에너지가 감소되어 매우 경제적인 제조가 가능하다는 이점을 나타낼 수 있다.
본 출원에 의해 제공되는 키토산 나노필름은 생체 친화적인 물질로 생체 내에 적용되는 의약품, 및/또는 화장료 등으로 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 키토산 나노필름은 우수한 세포 증식 및 세포 이동 효과를 나타내는 바, 상처 치유용 의약품, 의료기기, 및/또는 화장료 등으로 유용하게 활용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 키토산 나노필름은 고정화된 생체 활성 물질의 방출 속도 제어가 가능한 효과를 나타내는 바, 의약품, 및/또는 화장료 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1의 (a)는 일 실험예에 따른 키토산(Chitosan) 용액, CNP 용액, 및 PDRN-CNP 용액을 나타낸다.
도 1의 (b)는 일 실험예에 따른 Chitosan-Film, CNP-Film, 및 PDRN-CNP-Film을 나타낸다.
도 2의 (a)는 일 실험예에 따른 CNP의 크기 분포를 나타낸다.
도 2의 (b)는 일 실험예에 따른 PDRN-CNP의 크기 분포를 나타낸다.
도 3의 (a)는 일 실험예에 따른 CNP의 제타 전위를 나타낸다.
도 3의 (b)는 일 실험예에 따른 PDRN-CNP의 제타 전위를 나타낸다.
도 4의 (a)는 일 실험예에 따른 CNP의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 4의 (b)는 일 실험예에 따른 PDRN-CNP의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 5 는 일 실험예에 따른 PDRN-CNP의 겔 지연 분석(gel-retaring analysis) 결과를 나타낸다. 1은 DNA 마커를, 2는 2μg의 PDRN을, 3은 2μg의 PDRN-CNP에 대한 겔 지연 분석(gel-retaring analysis) 결과를 나타낸다.
도 6은 키토산에 캡슐화된 PDRN의 안정성을 확인하기 위한 전기영동 결과를 나타낸다. 1은 DNA 마커, 2는 캡슐화 되지 않은 PDRN, 3은 캡슐화된 PDRN, 4는 캡슐화 되지 않은 PDRN+ DNAse I, 5는 캡슐화된 PDRN + Chitosanase, 6은 캡슐화된 PDRN+ DNAse I, 7은 캡슐화된 PDRN+ DNAse I+ Chitosanase에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 7은 일 실험예에 따른 FE-SEM에 의한 Chitosan-Film 의 표면 형태를 나타낸다.
도 8은 일 실험예에 따른 FE-SEM에 의한 CNP-Film 의 표면 형태를 나타낸다.
도 9는 일 실험예에 따른 FE-SEM에 의한 PDRN-CNP-Film 의 표면 형태를 나타낸다.
도 10 은 일 실험예에 따른 AFM에 의해 분석 된 Chitosan-Film 의 표면 구조를 나타낸다.
도 11 은 일 실험예에 따른 AFM에 의해 분석 된 CNP-Film 의 표면 구조를 나타낸다.
도 12 는 일 실험예에 따른 AFM에 의해 분석 된 PDRN-CNP-Film 의 표면 구조를 나타낸다.
도 13은 일 실험예에 따른 Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film 각각의 TG 및 DTG 곡선을 나타낸다.
도 14는 일 실험예에 따른 PDRN-CNP-Film으로부터 PDRN 방출 퍼센트(%)를 나타낸다.
도 15의 (a)는 일 실험예에 따른 Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film 으로 48시간 동안 처리된 인간 피부 섬유아세포를 나타낸다.
도 15의 (b)는 일 실험예에 따른 Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film 으로 48시간동안 처리된 인간 피부 섬유아세포를 세포 카운터(cell counter)로 측정한 세포 밀도(cell density)와 MTT 분석(MTT assay)에 의해 측정된 세포 생존력(cell viability) 그래프를 나타낸다.
도 16은 일 실험예에 따른 Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film 으로 36시간 동안 처리된 인간 피부 섬유아세포의 세포 이동 효과(cell migration effect)를 나타낸다. (a)는 CNP-Film이 처리된 섬유아세포의 세포 이동 효과를 나타내며, (b)는 Chitosan-Film이 처리된 섬유아세포의 세포 이동 효과를 나타내고, (c)는 PDRN-CNP-Film이 처리된 섬유아세포의 세포 이동 효과를 나타낸다.
용어의 정의
본 명세서에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
용어 "키토산"은 다당류로, 갑각류 껍질로부터 얻어지는 키틴의 -CH3CONH의 탈세틸화에 의하여 유도된 천연 고분자 물질이다. 즉, 키토산은 키틴의 단량체에 존재하는 아세틸기(acetyl group; -COCH3)가 아미노기(-NH3)로 치환된 형태이다. 한편, 게, 가재, 새우 등 갑각류의 껍질로부터 얻는 키틴은 셀룰로우스 다음으로 풍부한 천연고분자로 셀롤로오스 C-2위치의 OH가 CH3CONH로 치환된 구조이며 셀룰로오스와 매우 비슷한 구조를 가진 불용성 물질이다.
이러한 키토산은 천연고분자 중 유일한 양이온성을 갖는 물질로 알려져 있다. 키토산은 또한 풍부한 활성 아미노기와 히드록시기를 가지고 있으며 활성 아미노기의 수는 키틴의 탈아세틸화 정도에 따라 달라진다.
키토산은 생체 적합성이고, 비독성이며, 면역 유발성이 낮으며 효소에 의하여 쉽게 분해되는 것으로 알려져 있다. 또한, 키토산은 세포를 활성화에 따른 노화 억제, 면역력 강화, 질병 예방, 생체의 자연적인 치유 능력 활성화 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
용어 "PDRN"은 폴리디옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide)를 지칭하는 것으로, 짧은 디옥시리보뉴클레오타이드(short deoxyribonucleotide)의 혼합물(mixture)이다. 즉, DNA사슬을 일정 크기로 분획화하여 만든 저분자량 DNA 복합체(Low molecular weight DNA complex)이다.
PDRN은 인간의 태반, 송어 정자 또는 다른 연어 종에서 추출될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. PDRN의 체내 투여 시 항염증 효과, 세포 증식 효과, 조직 재생 효과가 나타날 수 있다.
용어 "단일 층(mono layer)"은 화합물을 소재로 하며 두 개의 상을 나누는 경계가 되는 단일 층으로 물질의 분리에 이용될 수 있다.
상기 단일 층(mono layer)에는 필름(film)이 포함될 수 있다.
삭제
용어 "필름(film)"은 화합물을 소재로 하는 얇은 막(membrane)을 의미 하는 것으로, 단일 층(mono layer) 의 한 종류일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "필름(film)"은 "막(membrane)"과 혼용될 수 있다.
용어 "고분자 필름(polymer film)"고분자 화합물을 소재로 하는 얇은 막을 의미 하는 것으로, 단일 층(mono layer) 의 한 종류일 수 있다.
필름(film) 은 균일한 다공성 필름(homogenous porous film) 또는 비공극성 필름(non-porous film)일 수 있다.
용어 "비공극성 필름(non-porous film)"은 일반적으로 0.001㎛ 이하의 공경을 갖는 필름을 의미할 수 있다. 0.001㎛ 이하의 공경은 막을 구성하고 있는 분자의 열 진동에 의해 생긴 입자의 틈일 수 있다.
용어 "균일한 다공성 필름(homogenous porous film)"은 공경의 크기가 균일한 필름을 의미할 수 있다.
용어 "섬유(fiber)"는 길이가 직경보다 월등히 큰 형태의 고체 물질로, 길고 가늘며 연하게 굽힐 수 있는 천연 또는 인조의 선상 물체를 의미한다. 용어 "섬유 복합체(fiber complex)" 는 다수의 섬유(fiber)가 모여서 만들어진 천을 의미할 수 있으며, 이는 단일 층(mono layer) 의 한 종류일 수 있다.
용어 "나노섬유(nanofiber)"는 직경이 수십에서 수백 나노미터에 불과한 섬유를 의미할 수 있다.
용어 "나노섬유 복합체(nanofiber complex)" 는 나노섬유(nanofiber)가 모여서 만들어진 천을 의미할 수 있으며, 이는 단일 층(mono layer) 의 한 종류일 수 있다. 나노섬유 복합체(nanofiber compolex)는 별도의 직조과정 없이 나노섬유(nanofiber)를 함께 모으기만 하면 서로 얽혀 천이 된다.
용어 "캡슐화(encapsulation)"는 특정 물질을 다른 물질로 둘러싸거나 코팅하는 기술을 의미한다.
특정 물질을 둘러싸는데 사용되는 물질 또는 코팅의 재료는 설탕, 단백질, 다당류, 합성고분자, 또는 지방 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 리포좀은 대표적인 나노캡슐(nano capsule)의 한 종류일 수 있다.
용어 "나노캡슐"은 나노 크기의 캡슐을 의미하며, 나노캡슐의 내부에 특정 물질이 포함되어 있을 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "나노 입자(nanoparticle)"는 "나노캡슐(nano capsule)"와 혼용될 수 있다.
캡슐화된 특정 물질은 외부 환경으로부터 안정하게 보호될 수 있으며, 특정 조건에서 방출될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "나노필름(nanofilm)"은 나노 입자(nanoparticle)가 포함된 필름을 의미 할 수 있다.
용어 '약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
이러한 용어들에 더하여, 필요한 경우 기타 용어들이 명세서 내의 다른 곳에서 정의된다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 업계 용어들은 업계에서 인식하는 의미를 가질 것이다.
이하, 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 상세히 설명한다.
1. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자를 포함하는 키토산 필름(Nucleotides-CP-Film)의 구성
본 명세서에 의해 제공되는 일 실시예에 따르면, "하나 이상의 뉴클레오타이드가 포함된 키토산 입자를 하나 이상 포함하는 키토산 필름" (이하, Nucleotides-CP-Film)이 제공될 수 있다.
상기 Nucleotides-CP-Film은 i) 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자 (Nucleotides encapsulated chitosan particle; 이하, Nucleotides-CP) 및 ii) 층(layer) (예를 들어, 막(membrane))을 구성 요소로 포함 할 수 있다.
상기 Nucleotides-CP-Film은 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자 (nucleotides-CP)가 상기 층(layer)의 표면에 균일하게 분포(homogenously distributed)되어 있는 형태일 수 있다.
즉, 본 명세서에서 개시하는 Nucleotides-CP-Film은 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP)를 포함하는 층상 구조물(layer structure)이다.
상기 층 (layer)은 단일 층(mono layer) 또는 복수 층(multilayer)로 형성될 수 있으나, 설명의 편의를 위해, 단일 층(mono layer) 형태로 이루어진 Nucleotides-CP-Film 을 중심으로 설명한다.
이하에서는, Nucleotides-CP-Film의 각 구성 요소(Nucleotides-CP 및 층)에 대하여 구체적인 설명을 개시한다.
1-1. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자 (Nucleotides-CP)
본 명세서에 의해 제공되는 일 실시예에 따르면, 하나 이상의 뉴클레오타이드(nucleotides)와 키토산 입자(chitosan particle; 이하, CP)의 복합체가 제공될 수 있다.
상기 키토산 입자(CP)는 키토산(chitosan)을 일 구성 요소로 포함할 수 있다.
상기 복합체의 형태는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nucleotides)가 상기 키토산 입자(CP)에 캡슐화 된 형태일 수 있다.
설명의 편의를 위해, 이하에서는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides encapsulated chitosan particle)를 nucleotides-CP로 칭한다. 또한, 설명의 편의를 위해 이하에서는 상기 '하나 이상의 뉴클레오타이드'를 '뉴클레오타이드'로 혼용하여 사용한다.
1-1-1. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 의 형태
본 명세서에서 제공되는 몇몇 실시예에 따른 상기 키토산 입자(CP) 및/또는 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 입체 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산 입자(CP) 및/또는 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 대칭 또는 비대칭의 구형 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하에서는, 상기 뉴클레오타이드가 키토산 입자(CP)에 캡슐화 되어있는 구체적인 형태에 대해 설명한다.
예를 들어, 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)는 키토산 입자(CP)의 내부에 존재하는 것일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)는 키토산 입자(CP)의 표면에 존재하는 것일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)는 키토산 입자(CP)의 내부 및 표면에 존재하는 것일 수 있다.
이하에서는, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 하나 이상의 뉴클레오타이드(nucleotides)와 키토산 입자(CP) 사이에서 일어날 수 있는 상호작용(interaction)에 대하여 설명한다.
예를 들어, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)와 키토산 입자(CP)의 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)에 의해 형성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 정전기적 상호작용은 양이온성(cationic)인 뉴클레오타이드(nucleotides)와 음이온성(anionic)인 키토산 입자(CP) 사이의 상호작용일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)와 키토산 입자(CP) 사이의 수소 결합(hydrogen bond)에 의해 형성된 것일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)와 상기 키토산 입자(CP) 사이의 공유 결합(covalent bond)에 의해 형성된 것일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)와 상기 키토산 입자(CP) 사이의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 형성된 것일 수 있다.
1-1-2. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP)의 성분
1-1-2-1. 키토산
이하에서는, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 구성요소로 포함될 수 있는 키토산(chitosan)에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 및/또는 키토산 입자(CP)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 염의 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산은 키토산 하이드로클로라이드(chitosan hydrochloride; 이하, CHC)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 및/또는 키토산 입자(CP)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 키토산 유도체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산 유도체는 키토산의 알킬화물, 아실화물, 아릴화물, 황산화물 또는 인산화물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 및/또는 키토산 입자(CP)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 물에 용해될 수 있다. 즉, 상기 키토산은 수용성(water soluble)일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 및/또는 키토산 입자(CP)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 유기산 수용액에 용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산은 포름산(formic acid), 젖산(lactic acid), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 초산(acetic acid)에 용해될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 및/또는 키토산 입자(CP)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 무기산 수용액에 용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산은 묽은 염산(diluted hydrochloric acid)에 용해될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 및/또는 키토산 입자(CP)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)의 분자량은 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산의 분자량[단위 g/mol]은 10000 내지 20000일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 키토산의 분자량[단위 g/mol]은 2000 내지 10000일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 키토산의 분자량은 2000이하일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP) 및/또는 키토산 입자(CP)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 키틴(chitin)이 탈아세틸화(deacetylation) 된 것 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 100% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 95% 내지 100% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 85% 내지 95% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 75% 내지 85% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 65% 내지 75% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 55% 내지 65% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 55% 이하 일 수 있다.
1-1-2-2. 하나 이상의 뉴클레오타이드(nucleotides)
이하에서는, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 구성요소로 포함될 수 있는 뉴클레오타이드(nucleotides)에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 예를 들어, 상기 RNA는 mRNA(messenger RNA), tRNA(transfer RNA), rRNA(ribosomal RNA), miRNA(micro RNA), snRNA(small nuclear RNA), snoRNA(small nucleolar RNA), aRNA(antisense RNA), 또는 siRNA(small intrfering RNA) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드(nucleotides)는 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide; 이하, PDRN) 일 수 있다.
상기 PDRN은 10 내지 3000개; 10 내지 2000개; 10 내지 1000개; 10 내지 500개; 10 내지 250개; 또는 10 내지 100개;의 염기 또는 염기쌍을 가지는 DNA 단편(DNA fragment) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 PDRN은 10 내지 3000개; 10 내지 2000개; 10 내지 1000개; 10 내지 500개; 10 내지 250개; 또는 10 내지 100개;의 염기 또는 염기쌍을 가지는 DNA 단편(DNA fragment)의 혼합물(mixture)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 상기 PDRN은 50 내지 2000개의 염기 또는 염기쌍(bases or basepair)을 가지는 DNA 단편(DNA fragment)의 혼합물(mixture)일 수 있다.
상기 PDRN은 인위적으로 합성된 것일 수 있고, 생물로부터 유래된 것일 수 있다. 즉, 상기 PDRN은 그 유래가 무관할 수 있다.
일 예에서, 상기 PDRN은 인간의 태반으로부터 유래한 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 PDRN은 어류의 정자, 정액 및/또는 정소로부터 유래한 것 일 수 있다. 이 경우, 상기 어류는 연어목 (Salmoniformes) 및/또는 연어과(Salmonidae) 일 수 있다. 예를 들어, 상기 어류는 연어속(Oncorhynchus) 또는 송어속(Salmo)일 수 있다.
1-1-3. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP)의 물리적 특징 및 화학적 특징
이하에서는, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 물리적 특징 및 화학적 특징에 대해 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따른 키토산 입자(CP) 및/또는 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 직경은 나노 크기(nano size) 또는 마이크로 크기(micro size)일 수 있다.
일 예로, 상기 키토산 입자(CP)의 직경은 나노 크기(nano size) 일 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산 입자(CP)의 직경은 100 nm 내지 500 nm 일 수 있다. 구체적으로, 상기 키토산 입자(CP)의 직경은 100 nm 내지 300 nm 일 수 있다. 구체적으로, 상기 키토산 입자(CP)의 직경은 300 nm 내지 500 nm 일 수 있다.
다른 예로, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 직경은 나노 크기(nano size) 일 수 있다.
예를 들어, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 직경은 100 내지 500nm 일 수 있다. 구체적으로, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 직경은 100nm 내지 250nm 일 수 있다. 구체적으로, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 직경은 250nm 내지 500nm 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 직경은 250nm 내지 350nm일 수 있다.
본 명세서의 구체적인 예에서, 상기 키토산 입자(CP)는 직경이 나노 크기(nano size)이다. 상기 나노 크기의 직경을 가지는 키토산 입자(CP)는 "키토산 나노 입자(CNP)"로 표현될 수 있다.
이러한 “키토산 나노 입자(CNP)”가 내부에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, "하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 나노 입자(nucleotides-CNP)" 또는 "뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 나노 입자(nucleotides-CNP)"로 표현될 수 있다.
한편, 뉴클레오타이드가 상기 키토산 입자(CP), 예를 들어, 키토산 나노 입자(CNP)에 포함되는 경우, 상기 뉴클레오타이드는 효소 또는 외부 환경으로부터 보호될 수 있다.
예를 들어, 상기 효소는 DNA 분해효소(DNase) 또는 RNA 분해효소(RNase) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
즉, 본 명세서에서 개시하고 있는 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 나노 입자(nucleotides-CNP)는 DNA 분해효소(DNase) 또는 RNA 분해효소(RNase)로부터 상기 뉴클레오타이드가 분해되는 것을 방지할 수 있는 형태의 물질이다.
또한, 본 명세서에 의해 제공되는 뉴클레오타이드는 상기 키토산 입자(CP)에 대하여 0.1 내지 10 % 질량 퍼센트(w/w)를 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 상기 키토산 입자(CP)에 대하여, 0.5 내지 5 % 질량 퍼센트(w/w)를 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 상기 키토산 입자(CP)에 대하여, 0.5 내지 2 % 질량 퍼센트(w/w)를 가질 수 있다.
1-1-4. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(Nucleotides-CP)의 제작 방법
이하에서는, 상기 키토산 입자 및/또는 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)의 제작 방법에 대해 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, 상기 키토산 입자 및/또는 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 이온성 겔화 방법(ionic gelation method), 또는 코아세르베이션 방법(coacervation method) 에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, 상기 키토산 입자 및/또는 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 용매 증발 방법, 순간 에멀션 및 용매 분산 방법에 의해 생산될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, 상기 키토산 입자 및/또는 상기 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자(nucleotides-CP)는 초임계 액체기술, 비-습성 템플레이트에서 입자복제, 자가조합 및 전기방사 방법에 의해 생산될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
1-2. 층상 구조(layer structure)
본 명세서에서 개시되는 층상 구조 (layer structure)는 단일 층(mono layer) 또는 복수 층(multilayer)로 형성될 수 있다. 상기 복수 층(multilayer)은 상기 단일 층(mono layer)이 적층 된 형태일 수 있다.
이하에서는 설명의 편의를 위해, 단일 층(mono layer) 형태를 중심으로 설명한다.
1-2-1. 단일 층(mono layer)의 형태
일 실시예로, 상기 단일 층(mono layer)은 막(membrane) 구조물이다. 구체적으로, 상기 단일 층(mono layer)은 키토산을 구성요소로 하는 막(membrane)일 수 있다.
상기 막(membrane)은 비공극성 막(non-porous membrane)일 수 있다.
상기 막(membrane)은 균일한 다공성 막(homogenous porous membrane)일 수 있다.
상기 막 구조물은 나노 섬유 복합체(nanofiber complex)와 비교하여, 상이한 성질 및 장점을 가질 수 있다.
상기 나노섬유 복합체(nanofiber complex)는 나노섬유(nanofiber)가 모여 만들어진 물질로, 공극(pore)이 존재하고, 그 공극(pore)의 크기는 균일하지 않다. 즉, 상기 나노섬유 복합체(nanofiber complex)는 무작위적으로(randomly) 생성된 공극(pore)을 포함하기 때문에 균일한 특성을 가지지 못하여 상기 나노섬유 복합체를 생성할 때 선택성(selectivity)이 낮아지는 문제가 있다.
그러나, 본 명세서에서 개시하고 있는 막(membrane) 구조물은 i) 공극(pore)이 존재하지 않거나, ii) 공극(pore)이 존재하더라도 크기가 작거나, iii) 공극(pore)이 존재하더라도 크기가 균일 할 수 있기 때문에, 균일한 특성을 가질 수 있어 선택성(selectivity)이 높다.
또한, 두께에 대하여, 상기 막(membrane) 구조물은 나노섬유 복합체(nanofiber complex) 보다 얇다.
나아가, 강도(strength)에 대하여, 상기 막(membrane) 구조물은 나노섬유 복합체(nanofiber complex) 보다 높다. 예를 들어, 상기 막(membrane) 구조물의 인장 강도(tensile strength)는 상기 나노섬유 복합체(nanofiber complex)의 인장 강도 보다 높을 수 있다.
1-2-2. 단일 층(mono layer)의 성분
이하에서는, 상기 단일 층(mono layer), 특히 막(membrane)의 일 구성요소인 키토산(chitosan)에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 막(membrane) 의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 염의 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산은 키토산 하이드로클로라이드(chitosan hydrochloride; 이하, CHC)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면 상기 막(membrane) 의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 키토산 유도체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산 유도체는 키토산의 알킬화물, 아실화물, 아릴화물, 황산화물 또는 인산화물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 막(membrane) 의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 물에 용해될 수 있다. 즉, 상기 키토산은 수용성(water soluble)일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 막(membrane) 의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 유기산 수용액에 용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산은 포름산(formic acid), 젖산(lactic acid), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 초산(acetic acid)에 용해될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 막(membrane) 의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 무기산 수용액에 용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산은 묽은 염산(diluted hydrochloric acid)에 용해될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 막(membrane) 의 일 구성요소인 키토산(chitosan)의 분자량은 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산의 분자량[단위 g/mol]은 10000 내지 20000일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 키토산의 분자량[단위 g/mol]은 2000 내지 10000일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 키토산의 분자량은 2000 이하일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따르면, 상기 막(membrane) 의 일 구성요소인 키토산(chitosan)은 키틴(chitin)이 탈아세틸화(deacetylation) 된 것 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 100% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 95% 내지 100% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 85% 내지 95% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 75% 내지 85% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 65% 내지 75% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 55% 내지 65% 일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산(chitosan)의 키틴으로부터의 탈아세탈화 정도(deacetylation degree; DD)는 55% 이하 일 수 있다.
본 명세서에서 개시하고 있는 Nucleotides-CP-Film의 일 구성요소인 막(membrane)은, 전술한 성질들 중 어느 하나 이상을 가지는 막(membrane) 구조의 단일 층(mono layer)이 2개 이상 적층된 복수 층(multilayer)의 층상 구조일 수 있다.
2. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자를 포함하는 키토산 필름 (Nucleotides-CP-Film) 의 물리적 특성 및 화학적 특성
이하에서는, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자(nucleotides-CP)를 포함하는 키토산 필름의 물리적 특징 및 화학적 특징에 대해 설명한다.
이하에서는 직경이 나노 사이즈인 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화 된 키토산 입자를 포함하는 키토산 필름은 Nucleotide-CNP-Film이라 표현한다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따른 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)의 두께는 마이크로 크기(micro size)일 수 있다.
예를 들어, 상기 두께는 30 μm 내지 60 μm일 수 있다. 구체적으로, 상기 두께는 50 μm 내지 60 μm일 수 있다.
본 명세서에서 개시하는 나노필름은 섬유 복합체(fiber complex)로 이루어진 층상 구조물의 두께 (통상 100 μm내지 120 μm) 보다 얇다.
상기 두께는 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)의 구성요소인 막(membrane)이 단일 층(monolayer)인지 복수 층(multilayer)인지 상관없이, 전체 나노필름의 두께를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 따른 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)의 인장 강도(tensile strength)는 Nucleotide-CP 및/또는 Nucleotide-CNP가 포함된 섬유 복합체(fiber complex)의 인장 강도 보다 높다.
예를 들어, 상기 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)의 인장 강도(tensile strength)는 70kgf/cm2 내지 90 gf/cm2 일 수 있다.
구체적으로, 상기 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)의 인장 강도(tensile strength)는 약 80kgf/cm2 내지 약 90 gf/cm2 일 수 있다.
나아가, 본 명세서에서 제공되는 일 실시예에 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)의 신장률(elongation at break)은 Nucleotide-CP 및/또는 Nucleotide-CNP가 포함된 섬유 복합체(fiber complex)의 신장률 보다 높다.
예를 들어, Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)m의 신장률(elongation at break)은 7 % 내지 8 % 일 수 있다.
한편, 본 명세서에 의해 제공되는 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)에는 뉴클레오타이드가 0.1 내지 10 % 질량 퍼센트(w/w)로 상기 Nucelotide-CP-Film에 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 상기 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)에 대하여, 0.5 내지 5 % 질량 퍼센트(w/w)로 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오타이드는 상기 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)에 대하여, 0.5 내지 2 % 질량 퍼센트(w/w)로 포함될 수 있다.
3. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자를 포함하는 키토산 필름 (Nucleotides-CP-Film) 의 제작 방법
이하에서는, 상기 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)의 제작 방법에 대해 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, 상기 Nucelotide-CP-Film (예를 들어, Nucleotide-CNP-Film)은 용매 증발법(solvent evaporation) 또는 용액 캐스팅 방법(solution casting method)에 의해 생산될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 Nucelotide-CP-Film을 제작하기 위한 방법은
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 나노 입자(Nucleotide-CP)를 제조하는 제 1 단계;
ii) 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 나노 입자(Nucleotide-CP)가 포함된 키토산 나노 입자 용액(Nucleotide-CP solution)을 제조하는 제 2 단계; 및
iii) 상기 키토산 나노 입자 용액(Nucleotide-CP solution)을 건조시키는 제 3 단계;를 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 i) Nucelotide-CP-Film 을 형성할 수 있는 용액을 Nucleotide-CNP solution 이라 표현한다.
상기 제 1 단계는 전술 한 바와 같이 온성겔 화 방법(ionic gelation method), 코아세르베이션 방법(coacervation method), 용매 증발법, 순간 에멀션 및 용매 분산 방법, 초임계 액체기술, 비-습성 템플레이트에서 입자복제, 자가조합 및/또는 전기방사 방법에 의해 생산될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 제 1 단계는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 포함된 용액과 제1 키토산 용액을 n:m의 부피비로 교반하는 과정을 포함할 수 있다 (n 및 m은 1이상의 자연수). 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 포함된 용액과 제1 키토산 용액은 1:1의 부피비로 교반될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제 1 단계는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 포함된 용액과 상기 제1 키토산 용액을 가열하는 과정을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 단계는 40 내지 50 ℃에서 가열하는 과정을 더 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 포함된 용액은 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 펜타소듐 트리포스페이트(pentasodium triphosphate; TPP)에 용해된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 하나 이상의 뉴클레오타이드는 PDRN일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 포함된 용액은 염의 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 포함된 용액은 나트륨 염(sodium salt) 형태일 수 있다.
상기 하나 이상의 뉴클레오타이드(nuccleotides)가 포함된 용액은 800μg/mL일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제1 키토산 용액은 키토산이 물에 용해된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 키토산은 키토산 하이드로 클로라이드(chitosan hydrochloride)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 키토산은 90%의 탈아세틸화도(deacetylation degree)를 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 제 2 단계는 상기 제 1 단계에서 생산된 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 포함된 키토산 입자(Nucleotide-CP)를 제2 키토산 용액에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제 2 단계는 상기 제 1 단계에서 생산된 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 포함된 키토산 입자(Nucleotide-CP)와 제2 키토산 용액을 교반하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제 2 키토산 용액은 키토산 하이드로클로라이드(chitosan hydrochloride)용액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제 2 키토산 용액에는 글리세롤(glycerol)이 더 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 글리세롤은 1%(w/w)일 수 있다.
상기 제 2 단계에서 제조된 상기 키토산 나노 입자 용액(Nucleotide-CP solution)에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드의 질량 퍼센트는 1%(w/w)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 제 3 단계는 상기 제 2 단계에서 제조된 상기 키토산 나노 입자 용액(Nucleotide-CP solution)을 페트리 접시(petri dish)에 붓는 과정을 포함할 수 있다.
상기 제 3 단계는 상기 제 2 단계에서 제조된 상기 키토산 나노 입자 용액을 건조시키는 과정을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산 나노 입자 용액은 30℃ 내지 70℃ 에서 건조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 키토산 나노 입자 용액은 40℃ 에서 건조될 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산 나노 입자 용액은 8시간 내지 12시간 동안 건조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 키토산 나노 입자 용액은 10 시간 동안 건조될 수 있다.
상기 제 3 단계는 상기 제 2 단계에서 제조된 상기 키토산 나노 입자 용액을 건조시키는 과정 후 낮은 온도에서 보관하는 과정을 더 포함할 수 있다.
상기 낮은 온도는 20℃ 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
4. 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 입자를 포함하는 키토산 필름(Nucleotides-CP-Film)의 효과 및 기능
이하에서는, 본 명세서에 의해 제공되는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화된 키토산 나노 입자(Nucleotide-CP)가 포함된 키토산 나노필름(Nucelotide-CP-Film)에 의한 몇몇 효과에 대해 설명한다.
하기 개시된 효과들은 키토산 나노 입자, 키토산 필름 및/또는 키토산 나노 입자에 캡슐화된 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의한 효과 일 수 있다.
4-1. 뉴클레오타이드의 보호 효과
본 명세서에 의해 제공되는 Nucleotide-CP-Film에 포함되어 있는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드는 외부 환경으로부터 보호될 수 있다.
상기 외부 환경은 상기 Nucleotides-CP-Film이 활용될 수 있는 환경을 포함할 수 있다.
상기 Nucleotides-CP-Film 이 세포 배양에 활용되는 경우, 상기 외부 환경은 배양될 세포, 상기 배양될 세포에서 방출되는 물질, 및 배양 배지가 될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 Nucleotides-CP-Film 이 생체 내서 이용되는 경우, 상기 외부 환경은 생체 내에 존재하는 단백질, DNA, RNA, 호르몬이 될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 상기 Nucleotides-CP-Film 에 포함되어 있는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드는 효소로부터 보호될 수 있다. 상기 효소는 DNA 분해 효소, 또는 RNA 분해 효소일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 DNA 분해 효소는 DNase1 일 수 있다.
4-2. 뉴클레오타이드의 방출 조절 효과
본 명세서에 의해 제공되는 Nucleotides-CP-Film 으로부터 상기 뉴클레오타이드가 방출될 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 중성 조건에서 방출될 수 있다. 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 약 pH 7 조건에서 방출될 수 있다.
이하에서는, 방출 퍼센트(방출 %)를 이용해 상기 뉴클레오타이드의 방출 속도를 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "방출 퍼센트(방출 %)"는 Nucleotides-CP-Film 에 포함되어있는 뉴클레오타이드의 양을 기준으로 방출된 뉴클레오타이드의 양을 나타낸다.
본 명세서에 의해 제공되는 Nucleotides-CP-Film 으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 방출 퍼센트는 15시간 동안 꾸준하게 증가할 수 있다.
본 명세서에 의해 제공되는 Nucleotides-CP-Film 으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 방출 퍼센트는 15시간 내지 24시간 동안 꾸준하게 유지될 수 있다.
본 명세서에 의해 제공되는 Nucleotides-CP-Film 으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 방출 퍼센트는 90% 까지 꾸준하게 증가될 수 있다.
본 명세서에 의해 제공되는 Nucleotides-CP-Film 으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 방출 퍼센트는 15시간 내지 24시간 동안 90%로 내지 100%로 유지될 수 있다.
4-3. 세포 증식 효과
본 명세서에 의해 제공되는 Nucleotides-CP-Film 에 의해 세포 활성화 효과가 나타날 수 있다.
상기 세포는 유기체의 기능적, 구조적 기본 단위로 동물 세포 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 세포는 줄기세포, 전구 세포 또는 완전히 분화된 세포일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 세포는 피부 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포는 진피 세포 또는 표피 세포일 수 있다.
상기 세포 활성화 효과는 세포 증식, 세포 분화, 및 세포 재생 효과 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이 외에도 당 업계에서 사용되는 일반적인 세포 활성의 의미가 포함될 수 있다.
용어 “세포 증식(cell proliferation)”이란, 세포가 분열되어 세포 수가 증가하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 세포의 증식은 단층으로의 증식 또는 다층으로의 증식을 모두 포함한다.
본 명세서에 의해 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, Nucleotides-CP-Film 에 의해 세포 증식 효과가 나타날 수 있다.
일 실시예로, Nucleotides-CP-Film 에 의해 세포 밀도(cell density) 증가 효과가 나타날 수 있다.
예를 들어, Nucleotides-CP-Film 이 존재하는 경우의 세포의 밀도는 Nucleotides-CP-Film 이 존재하지 않을 때의 세포 밀도보다 약 4배 내지 약 5배 높을 수 있다.
다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film 이 존재하는 경우의 세포의 밀도는 키토산 필름(chitosan-Film)이 존재하는 경우의 세포 밀도보다 약 3배 내지 약 4배 높을 수 있다.
또 다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film 이 존재하는 경우의 세포의 밀도는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화되지 않은 키토산 나노 입자를 포함하는 키토산 나노필름(CNP-Film)이 존재하는 경우의 세포 밀도보다 약 1.2배 내지 약 1.5배 높을 수 있다.
다른 실시예로, Nucleotides-CP-Film 에 의해 세포 생존률(cell viability) 증가 효과가 나타날 수 있다.
예를 들어, Nucleotides-CP-Film 이 존재하는 경우의 세포 생존률(%)은 상기 Nucleotides-CP-Film 이 존재하지 않을 때의 세포 생존률(%) 보다 약 1.5배 내지 약 2배 높을 수 있다.
다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film이 존재하는 경우의 세포의 밀도는 키토산 필름(chitosan-Film)이 존재하는 경우의 세포 밀도보다 약 1.3배 내지 약 1.5배 높을 수 있다.
또 다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film 이 존재하는 경우의 세포의 밀도는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화되지 않은 키토산 나노 입자를 포함하는 키토산 나노필름(CNP-Film)이 존재하는 경우의 세포 밀도보다 약 1.2배 내지 약 1.3배 높을 수 있다.
4-4. 세포 이동 효과
본 명세서에 의해 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, Nucleotides-CP-Film 에 의해 세포 이동(cell migration) 효과가 나타날 수 있다.
예를 들어, Nucleotides-CP-Film 이 존재하는 경우의 세포 이동 효과는 키토산 필름(chitosan-Film)이 존재하는 경우의 세포 이동 효과 보다 높을 수 있다.
다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film 이 존재하는 경우의 세포 이동 효과는 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 캡슐화되지 않은 키토산 나노 입자를 포함하는 키토산 나노필름(CNP-Film)이 존재하는 경우의 세포 이동 효과보다 높을 수 있다.
4-5. 재생 효과
본 명세서에 의해 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, Nucleotides-CP-Film에 의해 조직 재생(tissue regeneration) 효과가 나타날 수 있다. 상기 조직은 식물 또는 동물 조직일 수 있다. 예를 들어, 상기 동물 조직은 뼈 조직, 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직, 또는 상피 조직일 수 있다.
본 명세서에 의해 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, Nucleotides-CP-Film 에 의해 상처 치유(wound healing) 효과가 나타날 수 있다.
상기 조직 재생(tissue regeneration) 효과 또는 상처 치유(wound healing) 효과는 전술한 세포 활성화 효과 또는 세포 이동 효과에 의해 나타날 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 의해 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, Nucleotides-CP-Film에 의해 궤양 또는 염증 치료 효과가 나타날 수 있다.
상기 궤양은 소화성 궤양, 각막 궤양, 당뇨병성 궤양, 동맥경화성 궤양, 또는 구강점막 궤양일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
2-4. 피부 상태 개선 효과
본 명세서에 의해 제공되는 몇몇 실시예에 따르면, Nucleotides-CP-Film에 의해 피부 상태 개선 효과가 나타날 수 있다.
상기 피부 상태 개선 효과는 전술한 세포 활성화 효과 또는 세포 이동 효과에 의해 나타날 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, Nucleotides-CP-Film 에 의해 상처 치유(wound healing) 효과가 나타날 수 있다.
다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film 에 의해 조직 재생 효과가 나타날 수 있다.
또 다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film 에 의해 피부 미백 효과가 나타날 수 있다.
또 다른 예를 들어, Nucleotides-CP-Film 에 의해 피부 노화 억제 효과가 나타날 수 있다.
이하, 실험예를 통하여 본 명세서을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이하에는, 하나 이상의 뉴클레오타이드인 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자 및 상기 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노필름을 제작하는 방법이 개시되었다.
또한, 상기 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자 및 상기 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노필름의 물리적 및 화학적 특징을 확인하는 방법 및 결과가 개시되었다.
설명의 편의를 위해, i) PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자(이하, PDRN-CNP)를 포함하는 키토산 나노필름을 PDRN-CNP-Film(도 1의 (b-3) 참고)이라 하며, ii) 키토산 나노 입자가 포함되지 않은 키토산 필름을 Chitosan-Film (도 1의 (b-1) 참고) 이라 하고, iii) PDRN이 캡슐화 되지 않은 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노필름을 CNP-Film(도 1의 (b-2) 참고)이라 한다. 상기 Chitosan-Film 및 CNP-Film은 PDRN-CNP-Film 과 비교할 대조군으로 사용되었다. 상기 Chitosan-Film은 용매로서 물을 가지는 키토산으로부터 제작되었다.
또한, 이하에서는 i) 건조 후 PDRN-CNP-Film이 형성될 수 있는 용액을 PDRN-CNP solution (도 1의 (a-3) 참고)이라 부르며, ii) 건조 후 CNP-Film이 형성될 수 있는 용액을 CNP-solution(도 1의 (a-2) 참고)이라 부른다. 건조 후, Chitosan-Film이 형성될 수 있는 용액은 Chitosan-solution(도 1의 (a-1) 참고)이라 부른다.
[실험예 1] PDRN-CNP-Film 제작
1-1. PDRN이 캡슐화된 CNP 제작
이온성 겔화(ionic gelation)의 방법으로 1% 질량 퍼센트의 PDRN이 키토산 나노 입자(이하, CNP)에 캡슐화되었다.
캡슐화에 사용된 PDRN은 Zerone Bio(Chonan, Korea)에 의해 생산된 것으로, 송어의 정자로부터 분리된 genomic DNA를 사용해 제조되었다.
CNP를 만들기 위해 사용된 키토산의 원료로 수용성 키토산 하이드로 클로라이드 (KRAEBER & CO GMBH, Germany) 가 사용되었다.
수용성 키토산 하이드로 클로라이드는 이중 증류수(double distilled water)에 용해되었고, 90 % 탈아세틸화도(deacetyllation degree; DD) 및 100 mPas 점도를 갖는 4 mg / mL 의 수용성 키토산 하이드로 클로라이드 용액이 제조되었다. 1M NaOH의 첨가를 통해, 제조된 키토산 용액의 최종 pH가 4.6으로 조절되었다.
PDRN (length between 50-2000 bp)이 0.3 mg/mL의 펜타소듐 트리포스페이트 (TPP)에 용해되어 PDRN 용액이 제조되었다.
수용성 키토산 하이드로 클로라이드 용액과 PDRN 용액은 각각 0.45μm 필터를 통해 여과되었다.
PDRN의 캡슐화 과정은 Fan et al., 2012에 기술 된 변형된 이온성 겔화(modified ionic gelation)의 방법으로 수행 되었다.
최종 농도 800μg/mL (0.3 mg / mL TPP 내에서)인 나트륨 염(PDRN-Na) 형태의 PDRN 용액이 수용성 키토산 하이드로 클로라이드 용액에 30 ℃ 에서 1:1의 부피 비로 첨가되었고, 계속적인 기계를 이용한 교반 하에서 40 ℃에서 5 분 동안 가열되었다.
하기 표 1은 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자(PDRN-CNP)를 제작하기 위한 키토산, TPP, PDRN의 양을 개시한다.
또한, 하기 표 1은 대조군으로서 PDRN이 캡슐화 되지 않은 키토산 나노 입자(이하, CNP) 를 제작하기 위한 키토산, TPP, PDRN의 양을 개시한다. 즉, 대조군인 CNP는 상기 PDRN이 캡슐화된 CNP의 제작 방법에서 PDRN을 넣는 과정을 제외하고 동일한 방법을 사용하여 제조되었다.
Product Chitosan (mg/mL) VChit (mL) TPP (mg/mL) PDRN (mg/mL) VPDRN
(mL) 		Chit: TPP: PDRN
CNP 4 250 0.3 0 250 4:0.3:0

PDRN-CNP		 4 250 0.3 0.8 250 4:0.3:0.8
1-2. PDRN-CNP-Film 제작
PDRN-CNP-Film은 용매 증발법(solvent evaporation method)으로 제조되었다.
이 단계에서는 i) 전 단계에서 제작된 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자 및 ii) 키토산 하이드로클로라이드(chitosan hydrochloride)가 사용되었다.
우선, 20 mg/mL의 키토산 하이드로클로라이드 용액이 제조되었고, 1M의 NaOH를 사용하여 pH가 4.2로 조절되었다. 최종 생성물의 바람직한 가용성 수준(desired soluble level)을 수득 하기 위해, 상기 키토산 하이드로클로라이드 용액에 글리세롤 (1 % w/w)이 첨가되었다.
그 후, 전 단계에서 생성된 캡슐화된 PDRN(22mL)이 상기 키토산 하이드로클로라이드 용액에 첨가되었고, 20분 동안 교반되었다. 이를 통해 1% PDRN (w/w)이 포함된 PDRN-CNP solution(도 1의 (a-3) 참고) 이 생산되었다.
상기 방법에 의해 생성된 PDRN-CNP solution 은 직경 9cm의 페트리 접시(petri dish)에 부어졌고, 40 ℃의 건조 오븐에서 10 시간 동안 건조되었고, PDRN-CNP-Film (도 1의 (b-3) 참고)이 얻어졌다. 일정한 수분 함량과 안정성 유지를 위해, 전술한 방법에 의해 생산된 PDRN-CNP-Film은 10℃의 진공 데시케이터(desiccator)에서 보관되었다.
대조군인 CNP-Film은 PDRN-CNP-Film 제작 방법과 동일한 방법을 이용하되, PDRN이 캡슐화 된 CNP 대신, PDRN이 캡슐화 되지 않은 CNP가 키토산 하이드로클로라이드 용액에 첨가되는 방법으로 제작되었다.
또한, 대조군인 Chitosan-Film은 상기 PDRN-CNP-Film 의 제작 방법에서 캡슐화된 PDRN이 키토산 하이드로클로라이드 용액에 첨가되는 과정을 제외하고 동일한 방법을 사용하여 제조되었다.
[실험예 2] PDRN-CNP 물리화학적 특성 분석
본 발명자들은 필름 제조에 사용 된 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노 입자(이하, PDRN-CNP)의 물리 화학적 성질을 확인하였고, PDRN이 캡슐화 되지 않은 키토산 나노 입자 (이하, CNP)의 물리화학적 성질과 비교하였다.
2-1. CNP 입자 크기 측정
나노 입자의 크기는 동적 광 산란 (DLS) 기술을 기반으로 하는 Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK)를 사용하여 측정되었다.
그 결과, PDRN이 나노 입자에 캡슐화된 경우의 나노 입자는 PDRN이 캡슐화 되지 않은 나노 입자 보다 더 작은 크기 분포를 나타내는 것이 확인되었다(도 2 참고, (a): PDRN이 캡슐화 되지 않은 나노 입자의 크기 분포, (b): PDRN이 캡슐화 되지 않은 나노 입자 크기 분포).
하기 표 2는 CNP 및 PDRN-CNP의 입자 크기를 수치로 나타낸다.
Product Particle size (nm)
CNP 387.22±1.95
PDRN-CNP 301.58±1.62
2-2. Zeta potential 측정
제타 전위 (Zeta potential)는 표면 전하이며, 부유액에서 입자들 사이에 전기적 반발을 통해 입자 안정성에 상당한 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 제타 전위 값이 30 mV보다 높은 경우, 안정된 솔루션임을 나타낸다.
CNP 및 PDRN-CNP 용액의 제타 전위를 측정하기 위해 동적 광 산란 (DLS) 기술을 기반으로 하는 Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK)가 사용되었다.
그 결과, CNP 및 PDRN-CNP 용액 모두 +30 mV 이상의 제타 전위 값을 가지고 있고, CNP가 포함된 용액 및 PDRN-CNP가 포함된 용액 모두 매우 안정한 용액이라는 것이 확인되었다 (도 3 참고, (a): PDRN이 캡슐화 되지 않은 나노 입자의 제타 전위, (b): PDRN이 캡슐화 되지 않은 나노 입자의 제타 전위).
하기 표 3은 CNP 및 PDRN-CNP의 제타 전위를 수치로 나타낸다.
하기 표 3에 기재된 바와 같이, CNP의 현탁액 표면은 +42.07 mV 양전하를 가지고 있었고, PDRN-CNP의 현탁액 표면은 +36.07 mV 양전하를 가지고 있었다. 상기 양전하는 입자 주위의 키토산 분자에 존재하는 수소화된 아미노 그룹 (-NH3+)에 의해서 형성된 것으로 보인다.
구체적으로, PDRN-CNP의 제타 전위(+36.07 mV)는 CNP의 제타 전위(+ 42.07 mV) 보다 감소된 값을 보였으며, 이는 PDRN의 인산염에 의해 키토산 NH3+ 가 중화된 결과로 보인다. 즉, 상기 결과를 통해 PDRN이 성공적으로 키토산 나노 입자에 캡슐화 되었음이 확인되었다.
Product Zeta potential (mV)
CNP 42.07±1.37
PDRN-CNP 36.07±1.37
2-3. PDI 측정
크기 분포가 얼마나 퍼져있는지를 나타내는 PDI 값은 동적 광 산란 (DLS) 기술을 기반으로 하는 Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK)를 사용하여 측정되었다.
하기 표 4에 나타난 바와 같이, CNP의 PdI 값과 PDRN-CNP의 PdI 값은 큰 차이가 없었다.
Product Zeta potential (mV)
CNP 0.234±0.01
PDRN-CNP 0.212±0.01
2-4. 형태(morphology) 분석
CNP와 PDRN-CNP의 형태는 고성능 디지털 이미징 투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM) (JEOL 2100, Hitachi High-Technologies Corp., 일본)에 의해 확인되었다.
CNP의 현탁액 또는 캡슐화 된 PDRN의 현탁액은 400 메쉬(400 mesh) 크기의 탄소 피복 구리 격자(carbon-coated copper grid)상에 펼쳐졌고, 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색되었다.
각각의 염색된 샘플들은 실온에서 건조된 후, 100 kV의 가속 전압을 사용하여 TEM 분석되었다.
TEM 이미지 분석 결과, CNP와 PDRN-CNP는 모두 구형이고 부드럽고 거의 균질인(homogenous) 다분산(polydispersed)의 특성을 보였다 (도 4 참고, (a): CNP, (b): PDRN-CNP).
2-5. 캡슐화된 PDRN의 양 분석
키토산 -DNA 복합체 캡슐화 용량은 키토산의 분자량, 및 키토산의 탈카복실화 정도(degree of decarboxylation) 의해 영향을 받을 수 있다.
키토산의 탈카복실화 정도(degree of decarboxylation)에 의해 키토산의 전하 밀도 및 키토산의 양전하를 띠는 아미노기(NH3+)와 DNA의 인산염기(phosphate group)의 몰 비(N/P ratio)가 영향을 받을 수 있다.
CNP에 캡슐화 된 PDRN의 양은 CNP 준비 혼합물(CNP preparation mixture)에 첨가 된 PDRN의 총량(표 1 참고)과 이온 성 젤라틴 화 (ionic gelation) 후에 현탁액에 잔류하는 PDRN의 양의 차이를 측정함으로써 계산되었다.
CNP의 PDRN 캡슐화 효율은 94.75 ± 2.56 %였다.
PDRN이 캡슐화 된 CNP는 비 캡슐화 된 PDRN을 대조군으로하여 아가로오스 겔 (2 %) 전기 영동으로 분석 되었다.
CNP에 캡슐화 된 PDRN은 움직이지 않고 로딩 웰(loading well)에 남아있는 반면, 캡슐화 되지 않은 PDRN은 로딩 웰(loading well)로부터 이동된 것이 확인되었다 (도 5 참고, 1: DNA 마커, 2: PDRN 2 μg, 3: 캡슐화된 PDRN 2 μg).
[실험예 3] PDRN-CNP-Film 에서 PDRN의 보호 효과 확인
엔도뉴클레아제(endonuclease)로부터 키토산에 캡슐화된 PDRN의 안정성이 아가로스 (2%) 겔 전기 영동에 의해 확인되었다.
캡슐화 되지 않은 PDRN의 현탁액 또는 캡슐화 된 PDRN의 현탁액은 최종 농도 8 μg / mL의 7.5 유닛의 DNAse I (TaKaRa, Japan)로 37 ℃에서 15 분 동안 처리되었다.
90 ℃에서 1 분간 반응이 열로 불 활성화 된 후, 캡슐화된 PDRN에 65 ℃에서 30 분 동안 키토산 분해 효소(80μg/mL)가 처리되었다. PDRN의 무결성은 아가로스(2 %) 겔 전기 영동에 의해 분석되었다.
DNAse I의 처리에 의해 캡슐화되지 않은 PDRN은 사라진 것이 확인되었으며, 대조적으로 캡슐화된 PDRN은 DNAse I가 처리되더라도 사라지지 않은 것이 확인 되었다. 또한, 키토산 분해 효소(Chitosanase)에 의한 분해에 의해 캡슐화된 PDRN으로부터 PDRN이 방출되는 것이 확인되었다(도 6 참고, 1: DNA 마커, 2: 캡슐화 되지 않은 PDRN, 3: 캡슐화된 PDRN, 4: 캡슐화 되지 않은 PDRN+ DNAse I, 5: 캡슐화된 PDRN + Chitosanase, 6: 캡슐화된 PDRN+ DNAse I, 7: 캡슐화된 PDRN+ DNAse I+ Chitosanase).
상기 결과를 통해, 상기 PDRN이 키토산에 의해 캡슐화 되어 효소 또는 외부 환경으로부터 보호될 수 있다는 것이 확인되었다. 생리 조건에서는 상기 실험에서 사용된 분해 효소의 농도보다 현저하게 낮은 농도의 분해 효소가 존재하기 때문에, 생리 조건에서는 PDRN이 효소로부터 보다 더 잘 보호될 것으로 예상될 수 있다.
[실험예 4] PDRN-CNP-Film 물리-화학적 성질 분석
4-1. Thickness 측정
PDRN-CNP-Film의 두께는 필름 당 5 개의 다른 위치에서 디지털 마이크로 미터(Mitutoyo Corp., Japan)를 사용하여 측정되었다. PDRN-CNP-Film 두께의 평균값은 하기 표 5와 같다.
Type of Film Thickness(μm)
Chitosan-Film 41.24 ± 3.21
CNP-Film 54.82 ± 5.42
PDRN -CNP-Film 56.27 ± 6.22
대조군인 Chitosan-Film과 비교할 때, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film 의 두께는 보다 두꺼운 것이 확인되었다. 이러한 결과는, CNP- solution 및 PDRN-CNP solution 의 고형분의 함량이 높다는 것으로부터 기인한다.
4-2. Tensile strength 및 Elongation strength 측정
필름의 인장 강도 (tensile strength; TS) 및 파단 신도(elongation at break; EB)가 ASTM (1997)에 의해 측정 되었다.
필름의 인장 강도 (tensile strength; TS) 및 파단 신도(elongation at break; EB) 의 측정을 위해, 각 필름이 100 mm x 15mm의 직사각형 크기로 절단되었으며, 50 %의 상대 습도(RH)조건의 0.01 kN 로드 셀이 장착 된 인장 시험기(a tensile testing machine)(Instron Corp, MA)에서 시험 되었다.
PDRN-CN-Film의 견본(specimens)은 파단(breakage) 될 때까지 50mm의 초기 간격에서 10mm/분-1 의 속도로 늘려졌다.
기계적 분석을 진행하는 동안 상대습도는 60 %를 넘지 않았고, 온도는 27 ℃를 넘지 않았다.
TS는 최대 인장 응력(maximum tensile stress)을 Film 견본의 단면적으로 나누어 계산되었다. EB는 파단(breakage) 시 견본(specimens)의 길이를 초기 길이 (50mm)로 나누고 100을 곱하여 계산되었다.
Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film의 TS 및 EB는 표6에 나타난 바와 같다.
결과는 평균 ± 표준 편차 (n=3)로 표현되었으며, 기계적 분석을 통한 측정은 3번 수행되었다.
Type of Film TS (kgf/cm2) EB (%)
Chitosan-Film 46.13 ± 6.50 2.36 ± 0.83
Chitosan-Film 89.11 ± 12.13 7.21 ± 0.75
PDRN -CNP-Film 80.24 ± 14.65 7.04 ± 2.16
상기 결과에 의해, 필름 상에 CNP또는 PDRN-CNP의 융합에 의해, 필름의 저항성이 변형될 수 있다는 것이 예상된다. 높은 EB 값은 중합체 사슬 간의 응집력으로 인해 우수한 유연성, 신장성 및 인성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
4-3. 표면 형태 (Surface morphology) 분석
Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film의 표면 형태(surface morphology)가 FE-SEM(Field Emission Scanning Electron Microscopy)(SEISS, Germany)에 의해 관찰되었다.
각각의 Film(0.5 cm x 0.5 cm)은 양면 카본 테이프에 올려 졌고, 스퍼터 코터 (sputter coater)를 사용하여 2분 동안 백금으로 코팅되었다. 그 다음, 각각의 Film은 1 ~ 5 kV의 가속 전압에서 FE-SEM으로 관찰되었다.
FE-SEM에 의한 필름 표면 형태 관찰 결과는 도7 내지 도 9와 같다(도 7: Chitosan-Film , 도 8: CNP-Film , 도 9: PDRN-CNP-Film )
Chitosan-Film은 불규칙한 매끄러운 표면(irregular smooth surface)을 나타낸다 (도 7 참고).
한편, CNP-Film은 불규칙한 형상의 CNP (irregular shape CNPs)가 필름 표면에 균등하게 분포(evenly distributed )한다 (도 8 참고).
　 반면에, PDRN-CN-Film은 평균 15 nm 크기의 캡슐화 된 PDRN이 원형으로(circular shape) 필름 표면에 균일하게 분포(homogeneously distributed)되어있다 (도 9 참고).
또한, AFM (Atomic Force Microscopy)(Bruker Dimension Icon, Bruker Co., Germany)을 사용하여 PDRN-CNP-Film의 거칠기 값(roughness values)과 횡단면 프로필(cross-section profiles)을 통해 표면 형태가 더 분석되었다.
53±1 의 상대습도(RH)에서 72시간 동안 평형을 이룬 샘플은 AFM 이미징(AMF imaging)에 맞는 얇은 조각으로 잘렸고, 얇은 조각으로 잘린 각각의 샘플에 양면 테이프가 붙여졌다.
상기 샘플들은 25 N/m의 스프링 상수를 가진 예리한 캔틸레버(cantilever)를 사용하여 비접촉 모드(noncontact mode)에서 스캔되었고, 50μm x 50μm의 이미지가 얻어졌다. 각 샘플에 대한 결과 데이터는 3D 이미지로 변환되었다 (Fabra, Talens, & Chiralt, 2009). 모든 샘플은 3 배로 만들어졌고, Bruker Nanoscope 분석 소프트웨어(버전 1.40)를 사용하여 거칠기 값(roughness values)과 횡단면 프로파일(cross-section profiles)이 계산되었다.
도 10 은 AFM에 의해 분석 된 Chitosan-Film 의 표면 구조를 나타낸다.
도 11 은 AFM에 의해 분석 된 CNP-Film 의 표면 구조를 나타낸다.
도 12 는 AFM에 의해 분석 된 PDRN-CNP-Film 의 표면 구조를 나타낸다.
CNP와 PDRN-CNP가 융합된 필름의 Ra값 및 Rq 값은 하기 표 7에 개시된 바와 같다.
Type of Film Ra (nm) Rq (nm) CA(°)
Chitosan-Film 1.12 ± 0.21 2.56 ± 0.42 80.56 ± 3.84
CNP-Film 3.32 ± 0.85 4.07 ± 0.96 59.56 ± 2.24
PDRN -CNP-Film 3.65 ± 0.54 4.62 ± 0.82 58.42 ± 3.65
Ra는 평균 평면으로부터 측정 된 표면 높이 편차(Z)의 절대 값의 산술 평균 값이며, Rq는 평균 이미지 데이터로부터 취해진 높이 편차의 평균 제곱근 평균 값이다.
CNP 및 PDRN-CNP의 첨가에 의한 필름의 거칠기의 증가는 표면 CA(°)에 영향을 미칠 수 있다.
4-4. Thermal property analysis
열량 분석(Calorimetric analysis)은 동시 열 중량 분석기(a simultaneous thermal gravimetric analyzer) (Seiko Exstar 6200, Japan)를 사용하여 수행되었다.
Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film은 각각 5.10, 5.00 및 6.32mg의 샘플 중량이 측정되었다.
각 필름은 30 ℃에서 800 ℃까지 10 ℃/분의 가열 속도로 가열되었다. 150 mL/분의 질소 흐름 하에서, Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film의 열 중량(thermo gravimetric) 측정 (TG) 및 유도 열 중량(derivate thermo gravimetric) 측정 (DTG) 분석이 수행되었다.
도 13은 Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film 각각의 TG 및 DTG 곡선을 나타낸다.
TG 곡선(도 13의 (a) 참고) 에 따르면, Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film 모두 30 내지 100 ℃ 구간에서 첫 번째 작은 중량 손실(weight loss)이 나타났으며, 이는 수분 증발에 의한 것 일 수 있다. 또한, 150 내지 250℃ 구간에서 두 번째 중량 손실(weight loss)이 나타났으며, 이는 키토산의 열분해에 의한 것 일 수 있다. 나아가, 500 내지 700℃ 구간에서 세 번째 중량 손실(weight loss)이 나타났으며, 이는 부분적으로 분해 된 키토산과 탄화의 산화로 인해 발생하는 것일 수 있다. 각각의 중량 손실(weight loss) 단계에서 각 필름의 중량 손실률은 거의 동일했다.
DTG 곡선(도 13의 (b) 참고) 에 따르면, Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film의 첫 번째 분해 온도(decomposition temperatures)는 약 218 ℃로 서로 비슷하다. Chitosan-Film 과 CNP-Film의 두 번째 분해 온도(decomposition temperatures)는 각각 571℃ 및 587.6℃로 유사하나, PDRN-CNP-Film의 두 번째 분해 온도(decomposition temperatures)는 633.6 ℃ 로 차이가 존재한다.
[실험예 5] PDRN-CNP-Film 으로부터 PDRN의 컨트롤된 방출 동역학 (Controlled release kinetics of PDRN in PDRN-CN-Film)
PDRN-CNP-Film으로부터의 PDRN의 컨트롤된 방출을 확인하기 위해, 약물 방출 분석(drug release assay)이 수행되었다.
PDRN-CNP 필름 (160 mg)은 15 mL의 pH 7.2인 인산 완충액 (phosphate buffer) 에 담가졌다. 그 후, 25 ℃에서 진탕기(shaker) (New Brunswick Scientific Co. Inc., USA) 를 사용하여 60 rpm으로 PDRN-CNP 필름은 인산 완충액과 섞여졌다.
PBS 용액을 포함하는 PDRN-CNP-Film의 시료 100μL가 시간 간격(time intervals) (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 및 24 시간) 마다 얻어졌다.
얻어진 각각의 시료가 16,000rpm에서 10 분간 원심 분리되었다. 원심분리 후, 상등액이 수집되었고, 상기 상등액으로부터 PDRN 농도가 측정되었다.
PDRN의 농도는 나노 미세 부피 분광 광도계(Nano micro-volume spectrophotometer)(Genway, UK)를 이용해 측정되었다.
PDRN 방출 동역학 프로파일(profile)은 상이한 시간 간격에서 PDRN-CNP-Film으로부터 방출 된 PDRN에 기초하여 결정되었다. 모든 측정 값은 3 배로 수집되었고, 동일한 양의 CNP -Film이 blank 시료로 사용되었다.
PDRN-CNP-Film으로부터의 PDRN의 방출은 배양 초기 9 시간 동안 많은 양이 방출되었고, 빠르게 방출되었다. 배양 후, 15 시간이 경과할 때까지 PDRN-CNP-Film에 포함된 PDRN의 90% 이상이 지속적으로 방출되었다 (도 14 참고).
[실험예 6] PDRN-CNP-Film 에 의한 세포 증식 및 세포 이동 효과
세포 증식(cell proliferation) 및 세포 이동(cell migration) 효과를 확인하기 위해, 인간 유래의 피부 섬유아세포 (Dermal fibroblast, HDF) 가 American Type Culture Collection (Normal, Human, Adult (ATCC® PCS-201-012??)로부터 구매되었다. 상기 인간 유래의 피부 섬유아세포 (Dermal fibroblast, HDF)는 antibiotic-antimycotic (Gibco, USA), 및 2 % fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Fisher Scientific, USA)가 보충된 Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM) (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, USA)에서 배양되었다.
상기 인간 유래의 피부 섬유아세포는 5% CO2의 존재 하에 37 ℃에서 배양되었다.
6-1. PDRN-CNP-Film 에 의한 세포 증식 효과
HDF(1X105 세포)는 24 시간 동안 2 mL 배지가 있는 6개의 웰 플레이트(well plates)에서 성장되었다. 그 후, 상기 배지는 각각의 웰 플레이트로부터 제거되었다.
상기 HDF 세포는 10 mg의 Chitosan-Film, 10 mg의 CNP-Film 및10 mg의 PDRN-CNP-Film (키토산, CNP 및 PDRN-CNP)으로 처리 되었다. 음성 대조군으로 2% FBS 배지가 사용되었다.
24 시간 후, MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드((3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide), Sigma Aldrich, USA) 분석법을 사용하여 HDF 세포의 세포 성장 정도가 평가되었다.
각 웰 플레이트에 존재하는 세포는 30분 동안 20μL의 MTT 용액과 반응하였고 보라색 포르마잔(formazan) 생성물이 형성되었다. 이어서, 미토콘드리아 탈수소 효소(mitochondrial dehydrogenase)의 활성에 의해 생성된 포르마잔(formazan)은 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma Aldrich, USA)로 재현탁(re-suspended)되었다.
세포에 각 필름이 처리되고 48 시간이 지난 후, 세포 카운터(cell counter)를 이용해 세포 밀도(cell proliferation)가 측정되었다. 또한, 마이크로 플레이트 리더(microplate reader) (Bio-Rad, USA)를 이용해 570 nm에서 측정된 광학 밀도(optical density; OD)에 의해 세포 생존력(cell viability)이 평가되었다 (도 15의 (b) 참고).
상기 결과를 통해 PDRN-CN-Film이 48 시간 동안 처리되었을 때, 인간 유래의 피부 섬유아세포의 세포 증식 활성(cell proliferation activity)이 더 커지는 것이 확인되었다 (도 15 참고).
6-2. PDRN-CNP-Film 에 의한 세포 이동 효과
시험관 내(in vitro)에서 세포 이동 분석(cell migration assay)을 위해, Chitosan-Film, CNP-Film 및 PDRN-CNP-Film이 인간 유래의 피부 섬유아세포에 처리되었다.
36 시간이 경과된 후, 세포 이동 분석법(in vitro cell migration assay)로 세포 이동(cell migration) 효과가 확인되었다.
그 결과, PDRN-CNP-Film이 처리된 세포의 경우, CNP-Film이 처리된 세포의 경우 보다 빠르게 세포 이동이 활성화 된다는 것이 확인되었다 (도 16 참고, (a): CNP-Film, (b): Chitosan-Film, (c): PDRN-CNP-Film).
이들 실험예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로서, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

Claims (19)

  1. PDRN(polydeoxyribonucleotide)이 캡슐화된 키토산 나노 입자; 및
    키토산으로 이루어진 막; 을 포함하는 키토산 나노필름으로서,
    상기 막의 표면에 상기 PDRN이 캡슐화된 키토산 나노입자가 균등하게 분포되어 있고,
    상기 키토산 나노필름의 두께는 50μm 내지 60μm인 것을 특징으로 하는,
    키토산 나노필름.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 키토산 나노 입자의 키토산 및 상기 막의 키토산 중 하나 이상은 탈아세틸화도가 85% 내지 95%인 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 키토산 나노 입자의 키토산 및 상기 막의 키토산 중 하나 이상은 키토산 하이드로클로라이드인 키토산 나노필름.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 PDRN은 어류 정액 또는 정소 유래인 것인 키토산 나노필름.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 어류는 연어과의 어류인 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 PDRN의 크기는 50bp 내지 2000bp 인 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 키토산 나노 입자의 직경은 250nm 내지 350nm 인 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 PDRN은 상기 키토산 나노 입자에 대하여 0.5 내지 5 % 질량 퍼센트(w/w)인 키토산 나노필름.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 PDRN은 상기 키토산 나노 입자에 대하여 0.5 내지 2 % 질량 퍼센트(w/w)인 키토산 나노필름.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 막은 비공극성 또는 균일한 다공성인 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 키토산 나노필름은 수용성인 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 키토산 나노필름은 PDRN 방출능을 가지며,
    이 때, 상기 키토산 나노필름에 포함된 상기 PDRN 전체 질량의 90% 이상을 24간 이내에 방출하는 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 키토산 나노필름에 세포 배양 뒤 약 48시간 이후에 세포의 증식이 약 20배 증가되는 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름.
  14. i) PDRN 용액과 제1 키토산 용액을 1:1 부피비로 교반하는 것을 포함하는 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자를 제조하는 제1 단계 - 이 때, 상기 PDRN 용액은 PDRN이 펜타소듐 트리포스페이트에 용해된 것이며, 상기 제1 키토산 용액은 키토산이 물에 용해된 것임-;
    ii) 상기 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노 입자 용액을 제조하는 제2 단계 - 이 때, 상기 제2 단계는 상기 제1 단계에서 제조된 상기 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자를 제2 키토산 용액에 첨가하고 교반하는 것을 포함 함- ; 및
    iii) 상기 PDRN이 캡슐화 된 키토산 나노 입자가 포함된 키토산 나노 입자 용액을 입자용액을 디쉬 유사틀에 부어서 건조시키는 제3단계;
    를 포함하는 키토산 나노필름 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 PDRN 용액은 PDRN-Na 염의 형태인 키토산 나노필름 제조 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 제1 키토산 용액 또는 상기 제2 키토산 용액은 키토산 하이드로 클로라이드 용액인 키토산 나노필름 제조 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 제2 키토산 용액은 글리세롤을 더 포함하는 키토산 나노필름 제조방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 제3 단계는 30℃ 내지 70℃ 에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름 제조방법.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 제3 단계는 8시간 내지 12 시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 키토산 나노필름 제조방법.
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