KR100800437B1

KR100800437B1 - 옥사다이아졸 유래아 유도체, 이의 제조방법 및 이를유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100800437B1
Application number: KR1020060079562A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 한동초; 손광희; 신대섭; 이지민
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-08-22
Filing date: 2006-08-22
Publication date: 2008-02-01

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 옥사다이아졸 유래아 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 옥사다이아졸 유래아는 새로운 구조의 화합물이며, 세포주기 중 분열기(M)를 효과적으로 억제하여 세포의 분열을 막으며 이를 통하여 암세포의 성장을 저해함으로써 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

(상기 식에서, R은 명세서에 정의된 바와 같다.)

옥사다이아졸 유래아, 세포주기 조절, 암 예방 및 암 치료제

Description

옥사다이아졸 유래아 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물{Oxadiazole urea derivatives, preparation method and a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancers}

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 화합물 1의 대장암 세포(HCT116)의 세포주기 M기의 히스톤 H3 단백질의 인산화를 나타내는 그림이다.

본 발명은 옥사다이아졸 유래아(oxadiazole urea) 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

문명이 발달되어 갈수록 암의 발생률이 증가되고 있음에도 불구하고 암 환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40 여종의 강한 세포독성을 나타내는 항암물질 투여에 의한 화학요법 등에 의존하고 있다. 이러한 치료법들은 대개 초기 암 환자나 특정 암에만 처치가 국한되어 있어서 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.

암은 최대의 난치성 질환이며, 암 발생과 진행에 관련된 기전은 혈관, 면역, 류머티즘 등의 질환과 밀접한 관련이 있어서 그간 다양한 항암제 및 관련 연구가 진행되어왔다. 특정 분자 목표점에 작용하는 선택적 항암제는 보다 안전하고 효과적인 치료법을 제공할 뿐만 아니라 맞춤 의약 및 병행치료법(combination therapy)에 적용될 수 있어 더욱 주목받고 있다.

신체를 구성하고 있는 세포들의 분열증식과 분화는 생명현상을 유지하는 기본이다. 정상적인 기능을 발휘하기 위해 세포의 증식 및 성장은 정교한 세포 내 신호전달 체계에 의해서 조절되며, 이 일련의 과정은 세포가 외부로부터 받은 신호를 여러 단백질들(PLC, PKC, Shc, Grb2, Raf, MAPK, MEK 등)과 분자매개체들(GTP, cAMP 등)을 통해 핵 내의 세포시계로 전달시킴으로써 이루어진다. 이러한 일련의 과정 중에서 어느 한 부분에 이상이 발생하게 되면 자체적인 조절 기전에 의해서 균형을 유지하기도 하지만 많은 경우에는 질병으로 발전하게 되는 것이다. 특히, 세포 내 핵에 존재하는 세포주기는 세포들의 생명유지를 조절하는 중요한 과정 중의 하나이다.

세포주기는 일상적으로 우리가 사용하고 있는 시계가 초침, 분침, 시침으로 구분되듯이 4개의 독특한 단계로 나뉘어 진다. 즉, Gap1(G1), DNA 합성단계(S), Gap2(G2) 및 분열기(M)가 바로 그것이다. 한편, 세포가 높은 밀도로 존재하거나 낮은 농도의 성장인자의 환경에서 장기간 방치되면, 세포는 휴면기라고 불리는 성장 멈춤 상태(G0)로 접어든다. 이러한 일련의 핵 내 반응 사이클을 세포주기라 한다.

시계 내에는 전기적 또는 물리적 힘에 의해서 시계추가 진동하고 이에 따라서 초침, 분침, 시침이 순차적으로 움직임으로써 우리에게 정확한 시각을 알려 주게 된다. 이를 위해서는 시계추에 일정한 힘이 가해져야 하며 이를 조절하는 각종 부속품들이 시계를 구성하고 있다. 이와 마찬가지로 세포주기에도 체크 포인트(check point)라고 불리는 복잡한 네트워크가 있어서 세포시계가 정확히 G1-S-G2-M의 순서로 진행되도록 유도해 준다. 이런 체크 포인트 조절 메커니즘의 결핍은 유전물질의 불안정성을 증가시켜 조절되지 않은 세포 성장을 가져오며 때로는 암과 같은 무절제한 세포성장을 일으키기도 한다.

핵 외부로부터 성장인자의 신호전달과 영양상태가 양호하면 G1기의 세포 크기가 커지고, 세포주기로 진입하게끔 해준다. 세포주기 작동은 효모에서는 시작 시점(start point), 진핵세포에서는 제한점(restriction point)이라고 불리는 G1 체크포인트에서 이루어진다. 이 지점을 지난 후 특별한 제동이 없으면 세포는 자동적으로 4단계의 세포주기를 거쳐서 자신의 게놈을 복제하고 분열하게 된다. 진핵세포에서의 이들 단계를 자세히 살펴보면 다음과 같다. 체크 포인트가 존재하는 G1기는 새로운 세포를 만들기 위한 준비단계로서 이때에 성장인자와 충분한 영양이 공급되지 못하면 세포주기는 멈추게 되고 성장이 멈추는 상태인 G0 상태로 접어들게 된다. 그러나 충분한 영양이 공급되고 다양한 성장 인자들이 준비되면 S 단계 로 세포주기가 진행되게 된다. 이때에 세포의 핵에서는 게놈의 복제에 의하여 두 배수의 염색체가 만들어지고, 두 세포로 분열되기 위해 세포질 내의 여러 인자들도 복제된다. S기가 끝나면 세포는 제2의 체크 포인트로 알려진 G2 단계로 진입한다. 이 G2 기간에는 DNA 복제의 완성을 조절하며 분열기로의 진입이 준비된다. 그러므로 세포의 구성에 필요한 다양한 인자들이 이때에 생산된다. 두 세포로 분열되는데 필요한 인자들이 충분히 만들어진 후에 세포의 주기는 실질적 분열이 일어나는 분열기인 M기로 진행된다. M기는 시간적으로 가장 짧은 기간 동안 이루어지며, 매우 역동적으로 진행되는 단계이다. 복제된 게놈이 세포의 양극으로 분리되어 두 개의 딸세포가 만들어지는 단계이기 때문이다. 이런 일련의 과정은 한 세포가 성장하여 두 세포로 분열되기 위해서 모든 세포가 거치는 과정이므로 세포의 생명유지에 매우 중요한 과정이다. 그러므로 세포주기의 연구와 이들을 조절하는 물질의 개발은 세포 성장 기작의 연구 및 세포주기이상에서 발생하는 암의 예방, 치료제 개발에 필수적이라 할 수 있다( Science 1996 , 274, 1643-1677).

앞에서 언급한 것과 같이 진핵세포의 정상적인 세포주기 진행은 G1기에 존재하는 제한점에서 결정되어 지며, 이 제한점의 비정상적인 진행이 세포 노화나 암 등의 질병발생과 연결되어 진다. 제한점에서 중요한 역할을 하는 것이 사이클린 D(cycline D - D₁, D₂, D₃ 등) 단백질이다. 이들 단백질은 사이클린 의존형 키나제(cyclin dependent kinase; 이하 CDK) 4 또는 CDK 6에 결합하여 이들 효소의 활성을 조절한다. 그리고 사이클린 D와 CDK4는 세포주기의 제동장치인 Rb 단백질을 인산화시켜서 불활성화시키는 기능을 가지고 있다. 그러므로 사이클린 D와 CDK4의 활성 조절은 세포주기 전체를 조절하는데 있어서 매우 중요하다. 특히, 종양과 같은 난치성 질병들이 이들 유전자의 이상에 기인한다는 연구결과들이 발표되고 있어서 그 중요도가 증가되고 있다( Biotechnol . Prog . 1998 , 14, 807-833).

이에 본 발명자들은 세포주기를 조절할 수 있는 새로운 물질을 연구하던 중 새로운 구조의 옥사다이아졸 유래아 유도체가 세포주기 중에서 M기를 선택적으로 저해하는 것을 알아내고, 본 발명의 옥사다이아졸 유래아 유도체가 비정상적인 세포 성장에 의해 유발하는 각종 질병 특히, 암 예방 및 치료제로 개발될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규 옥사다이아졸 유래아 유도체, 이의 제조방 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 항암제의 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 옥사다이아졸 유래아 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 옥사다이아졸 유래아 유도체를 제공한다.

상기 식에서, R은 C₁~C₅의 알킬기 또는 C₁~C₅의 알킬 카보닐기이며, 바람직하게는 C₁~C₃의 알킬기 또는 C₁~C₃의 알킬 카보닐기인 것이며, 더욱 바람직하게는 메틸기 또는 아세틸기이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 새로운 구조의 옥사다이아졸 유래아 유도체의 바람직한 예는 하기와 같다:

1)1-(4-(4-메톡시페닐)-1,2,5-옥사다이아졸-3-일)-1,3-다이메틸-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)유래아; 및

2)1-(4-(4-아세톡시페닐)-1,2,5-옥사다이아졸-3-일)-1,3-다이메틸-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)유래아.

본 발명의 따른 상기 화학식 1로 표시되는 신규 옥사다이아졸 유래아 유도체 는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약제학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 카르복실산, 포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등을 사용할 수 있고, 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황산 등의 할로겐산 또는 인산 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 옥사다이아졸 유래아 유도체는 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화합물을 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 옥사다이아졸 유래아 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 옥사다이아졸 유래아 유도체의 제조방법은 하기 반응식 1로 표시되는 바와 같이, 출발물질인 치환된 벤즈알데하이드(benzaldehyde) 화합물(2)을 아미노하이드록사이드(NH₂OH) 및 N-클로로숙신이미드(NCS)와 반응시킨 후, 반응생성물을 시아노칼륨과 반응시켜 시아노 화합물(3)을 제조하는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 제조된 시아노 화합물(3)을 아미노하이드록사이드와 반응시킨 후, 반응생성물을 염기 용액 처리하여 옥사다이아졸 화합물(4)을 제조하는 단계(단계 2); 상기 단계 2에서 제조된 옥사다이아졸 화합물(4)을 4-트리플루오로메틸아닐린 및 트리포스겐과 반응시켜 옥사다이아졸 유래아 화합물(5)을 제조하는 단계(단계 3); 및 상기 단계 3에서 제조된 옥사다이아졸 유래아 화합물(5)을 알킬할라이드 또는 알킬카보닐할라이드와 반응시켜 화학식 1의 옥사다이아졸 유래아 유도체를 제조하는 단계(단계 4)를 포함하여 이루어진다.

<반응식 1>

상기 반응식에서, R은 메틸기 또는 아세틸기이다.

이하, 본 발명의 제조방법을 단계별로 설명한다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이, 먼저 화합물(2)의 출발물질을 메탄올 용매에서 아미노하이드록사이드 및 탄산수소나트륨과 반응시킨 후, 상기 반응의 생성물을 디메틸포름아미드(DMF) 용매에서 N-클로로숙신이미드와 반응시켜 화합물(6)의 옥심화합물을 얻는 단계를 거친 후, 상기 옥심화합물(6)을 에틸에테르 용매에 녹인 후 시아노칼륨과 반응시켜 화합물(3)을 얻는 단계이다.

<반응식 2>

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이, 단계 1에서 제조된 화합물(3)을 메탄올 용매에서 아미노하이드록사이드 및 탄산수소나트륨과 반응시켜, 시아노기의 탄소에 옥심기가 도입된 화합물(7)을 얻는 단계를 거친 후, 상기 화합물(7)을 과량의 염기가 용해되어있는 용액에 녹이고 가온, 환류시켜 옥사다이아졸 고리가 생성된 화합물(4)을 얻는 단계이다. 이때, 상기 염기 용매로는 2 N 농도의 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액 등을 사용할 수 있다.

<반응식 3>

다음으로, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 제조된 옥사다이아졸 화합물(4)을 THF 용매에 녹인 4-트리플루오로메틸 아닐린 및 트리포스겐과 반응시킨 후, 상기 반응생성물을 DMF 용매에 녹여 10% Pd/Charcoal과 반응시켜 옥사다이아졸 유래아 화합물(5)을 얻는다.

다음으로, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 제조된 옥사다이아졸 유래아 화합물(5)을 알킬할라이드 또는 알킬카보닐할라이드와 반응시켜 본 발명에 따른 옥사다이아졸 유래아 유도체(1)를 얻는 단계이다. 반응 용매로는 아세토나이트라일을 사용할 수 있으며, 상기 알킬할라이드로는 메틸아이오다이드 등을, 알킬카보닐할라이드로는 아세틸클로라이드 등을 사용할 수 있다. 알킬카보닐할라이드를 사용하는 경우에는 메틸아이오다이드를 더 첨가하여 본 발명의 화학식 1의 화합물을 얻을 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.

구체적으로 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 세포주기 중에서 세포의 분열기에 관련된 M기에서 세포를 멈추게 함으로써, 궁극적으로 세포의 성장을 억제할 수 있다. 이를 더욱 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

먼저, WST-1 검정을 수행한 결과, 24시간에서 55 μM, 48시간에서 20 μM의 50% 성장 억제 효과(GI₅₀)을 나타냄으로써, 대장암조직의 성장이 억제되는 것이 확인되었다.

또한, 상기 인간 대장암 세포주의 세포주기에 미치는 효과 실험에서, 본 발명의 화학식 1의 유도체를 상기 세포주에 50 μM 처리한 결과, 시간이 경과할수록 G2/M기의 세포가 급격히 증가하여, 처리 후, 12시간 경과 후에는 90% 이상의 세포가 G2/M기에 머무르고 있음이 확인되었다.

나아가, 세포주기 관련 단백질의 양을 분석한 실험에서, 본 발명의 화학식 1의 유도체를 일정 농도 이상으로 투여한 상기 인간 대장암 세포주에서 히스톤 단백질(H3)의 인산화가 급격히 증가됨이 확인되었다. 세포가 M기에 접어들면 H3 단백질이 오로라 B 키나아제(aurora B kinase)에 의하여 인산화되고, 인산화된 H3 단 백질은 M기 중에서 메타페이스까지 계속 유지된다. 따라서, 세포 단백질의 분석에서 인산화된 H3가 다량 존재하고 있다는 것은 세포들이 M기에 머무르고 있음을 의미한다. 결과적으로, 본 발명의 화학식 1의 유도체는 암세포를 세포주기 중 M기에 머무르게 하는 작용을 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 암세포를 세포주기 중 M기에 머무르게 함으로써, 암세포의 성장을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 방광암, 췌장암, 혈액암 등의 각종 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

제제화할 경우, 상기 화학식 1의 유도체 외에 약리학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 통한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에 스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 “투여”는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 “환자”는 본 발명의 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간과 원숭이, 개, 염소, 돼지, 또는 쥐 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 인간(치료, 억제 또는 예방)용일 뿐만 아니라 상업적으로 유용한 다른 동물들에게도 적용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 이들의 염을 포함하는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 암 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 종래의 상기 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에 있어서,“약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 체중 ㎏ 당 5 내지 50 mg, 바람직하게는 5 내지 20 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 1-(4-(4-메톡시페닐)-1,2,5-옥사다이아졸-3-일)-1,3-다이메틸-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)유래아의 제조

단계 1: (Z)-4-(벤질옥시)-N-하이드록시벤지미도일 시아나이드의 제조

250 ml 둥근 바닥 플라스크에 벤즈알데하이드(2) (8.1 g)를 넣고 메탄올 100 ml에 녹인다. 이 용액에 아미노하이드록사이드(3.5 g)와 5 g의 소다를 가하고 상온에서 2시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면 감압 농축하고, 에틸아세테이트로 추출하여 흰색 고체 화합물 9.1 g을 얻었다. 이 흰색 고체 화합물을 150 ml의 DMF에 녹이고 6.1 g의 N-클로로숙신이미드(NCS)를 가하여 12시간 교반하고 반응 혼합물에 물과 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 에틸아세테이트 층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 감압 제거하여 화합물(6)을 10.1 g을 얻었다. 화합물(6)을 에틸에테르 200 ml에 녹인 후 시아노칼륨을 가하여 목적화합물(3) (7.2 g, 85%)을 얻었다.

단계 2: 4-(4-(벤질옥시)페닐)-1,2,5-옥사다이아졸l-3-아민의 제조

6 g의 시아노 화합물(3)을 메탄올 300 ml에 녹이고 이 용액에 아미노하이드록사이드(5 g)와 소다(6 g)를 가하고 12시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면 감압 농축하고, 에틸아세테이트로 추출하여 5.1 g의 흰색 고체 화합물(7)을 얻었다. 얻어진 화합물(7) (5.1 g)을 2 N NaOH 용액 150 ml에 녹이고 12시간 동안 가온 환류시켰다. 반응이 완결된 후에는 상온으로 냉각, 여과한 후, 목적화합물(4) (3.2 g, 65%)을 얻었다.

단계 3: 1-(4-(4-하이드록시페닐)-1,2,5-옥사다이아졸-3-일)-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)유래아의 제조

1000 ml 둥근바닥 플라스크에 4-트리플루오로메틸 아닐닌(6.5 g)을 넣고 THF 500 ml를 가한 다음 0 ℃로 냉각시킨다. 이 반응 용액에 트리포스겐을 3.9 g을 가하고 5분 동안 교반하였다. 그리고 THF 100 ㎖에 녹인 화합물(4)을 상기 반응 용액에 천천히 적가한 후 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후에는 용매를 감압하여 제거하고 에틸아세테이트에 녹인 후 2 N HCl 용액과 소금물로 씻어 주었다. 에틸아세테이트 층은 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 감압하여 제거하였다. 반응 생성물을 50 ml DMF에 녹이고 10% Pd/Charcoal 5 g을 가하고 상온에서 12시간 교반하였다. 반응이 완료되면 에틸아세테이트와 물을 가하고 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 에틸아세테이트 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 감압 하에 농축하였다. 농축된 생성물은 실리카 컬럼 크로마토그래피(silica column chromatography)로 정제하였고 목적화합물(5) (3.2 g, 35%)을 얻었다. 하기 표 1에는 상기 목적 화합물의 성상을 나타내었다.

¹H-NMR (DMSO-d6): δ 7.61 (d, 4H, J = 8.4 Hz), 6.94 (d, 4H, J = 8.4 Hz).

외형	흰색 고체
분자식	C₁₆H₁₁F₃N₄O₃
분자량	364.28
융점(℃)	208
용해성	가용성	알코올, DMSO
	불용성	헥산

단계 4: 1-(4-(4-메톡시페닐)-1,2,5-옥사다이아졸-3-일)-1,3-다이메틸-3-(4-(트리플루오로메)페닐)유래아의 제조

100 ml 둥근바닥 플라스크에 화합물(5) (1.2 g)을 넣고 아세토나이트라일 50 ml을 가하여 녹인 후 탄산칼륨 1.5 g과 메틸아이오다이드 1 g을 가한다. 이 용액을 12시간 동안 가온 환류시킨다. 반응이 완결된 후에는 여과하여 탄산칼륨을 제거하고 에틸아세테이트와 물을 가하고 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 에틸아세테이트 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 감압 하에 농축하였다. 농축된 생성물은 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하였고 목적 화합물(1a) (0.8 g, 70%)을 얻었다. 하기 표 2에는 상기 목적 화합물의 성상을 나타내었다.

¹H-NMR (CDCl3): δ 7.52 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.37 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.03 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.86 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 3.88 (s, 3H), 3.40 (s, 3H), 2.83 (s, 3H).

외형	흰색 고체
분자식	C₁₉H₁₇F₃N₄O₃
분자량	406.56
융점(℃)	(오일)
용해성	가용성	알코올, DMSO
	불용성	헥산

<실시예 2> 1-(4-(4-아세톡시페닐)-1,2,5-옥사다이아졸-3-일)-1,3-다이메틸-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)유래아의 제조

단계 4에서 아세틸클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 목적화합물(1b)(0.5 g, 90%)을 얻었다. 하기 표 3에는 상기 목적 화합물의 성상을 나타내었다.

¹H-NMR (CDCl3): δ 7.72 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.52 (m, 4H), 7.27 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 3.48 (s, 3H), 3.23 (s, 3H), 2.33 (s, 3H).

외형	흰색 고체
분자식	C₂₀H₁₇F₃N₄O₄
분자량	434.78
융점(℃)	131
용해성	가용성	알코올, DMSO
	불용성	헥산

< 실험예 1> 암 세포주기 성장 억제

본 발명의 실시예 1의 트리메틸 옥사다이아졸 유래아에 의한 인간 암세포주 성장 억제 효과를 알아보기 위해 WST-1을 사용하여 하기의 실험을 수행하였다.

인간 암세포주들은 10% 소태아혈청(FBS)이 포함된 배지 조건에서 5% 이산화탄소가 유지되는 37 ℃ 항온기에서 배양하였고, 0.05% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포를 떼어내었다. 각각의 암세포들은 헤마토사이토미터(hematocytometer)로 개수를 측정하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 MDA-MB-231를 5,000개, HCT116, 및 SW620를 각각 7,000개의 세포를 투여하였다.

세포들은 10% FBS가 포함된 배지로 5% 이산화탄소를 포함한 37 ℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 화합물의 처리를 위하여 대조군(0.1 % DMSO)과 실시예 1의 트리메틸 옥사다이아졸 유래아를 농도별로 포함(DMSO에 녹인 화합물을 배지로 희석)한 배지로 교환하였다. 이후 24시간과 48시간 후에 각 웰에 WST-1(Roche사 제품) 발색시약을 10 ㎕씩을 첨가하고 2시간 동안 배양한 다음, ELISA 판독기(ELISA Reader, Bio-Rad사 제품)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

24시간 경과 후 MDA-MB-231과 SW620은 90 μM의 농도에서 50% 성장 억제 효과(GI₅₀)를 나타내었으며, HCT116은 55 μM로써 성장 억제가 가장 효과적이었다. 48시간 경과 후 MDA-MB-231은 변화없이 90 μM의 GI₅₀을 나타낸 반면, HCT116과 SW620은 각각 20 및 15 μM로 성장 저해 효과가 증가하였다.

< 실험예 2> 세포주기 분석

본 발명의 실시예 1의 화합물이 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위해, 인간 대장암 세포주인 HCT116을 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.

인간 대장암 세포인 HCT116은 10% FBS가 포함된 멕코이(Mccoy's) 배지에서 5% 이산화탄소가 유지되는 37 ℃ 항온기에서 배양하였고, 0.05% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포를 떼어내었다. 떼어낸 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer)로 개수를 측정한 후 90,000개의 세포를 포함하도록 10% FBS를 함유한 10 ml의 멕코이 배지로 현탁하였고, 100 mm 배양접시에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 12시간 배양 후, 각각의 배양 접시에 DMSO에 녹여진 합성한 트리메틸 옥사다이아졸 유래아를 최종 농도가 50 μM이 되도록 10 ㎕씩 첨가하였다. 트리메틸 옥사다이아졸 유래아를 처리한 세포는 0, 3, 6, 12, 24 및 48시간째에 분리하여 세포분석을 위해 사용하였다.

세포주기 분석을 위하여 배양된 세포는 배양 접시 바닥으로부터 떨어진 세포와 0.05% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 처리하여 배양 접시의 바닥으로부터 떼어낸 세포를 모두 원심분리(200g, 5분)하였다. 분리된 세포는 포스패이트 버퍼 살린(phosphate-buffered saline; PBS)으로 현탁하여 원심분리하는 과정을 거쳐 배지 성분을 제거하였다. 준비된 세포는 500 ㎕ PBS로 현탁하고, 4 ml의 70% 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 12시간 동안 방치하여 세포를 고정시켰다. 고정된 세포는 원심분리(200g, 5분)하여 에탄올을 제거한 후, PBS로 현탁하고 원심분리하는 과정을 두 번 반복함으로써 세포를 잔여 에탄올을 제거하였다. 원심분리하여 모여진 세포는 500 ㎕ PBS를 가하여 골고루 현탁한 후, 100 ㎍/ml RNase A와 50 ㎍/ml PI(propidium iodide)를 처리하여 37℃에서 30분간 배양하여 핵 내의 DNA만을 염색하였다.

염색된 세포는 FACS calibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 20,000개 세포의 세포 주기를 측정하였고, 벡톤-딕킨슨 모디피트(Becton-Dickinson Modifit) 세포 주기 분석 프로그램을 이용하여 세포주기의 G1, S, G2/M기에 있는 세포의 분포도를 계산하였다. 상기 대장암 세포(HCT116)의 세포주기 분석한 결과를 표 4에 도시하였다.

시간(hr)	세포의 분포도(%)
시간(hr)	G0/G1	S	G2/M
0	53.50	26.51	20.00
3	15.80	36.72	47.48
6	8.60	26.65	64.74
12	1.50	5.46	93.05
24	1.29	3.41	95.30
48	1.47	4.71	93.82

상기 표 4에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 따른 50 μM 트리메틸 옥사다이아졸 유래아 처리에 의하여 대장암 세포(HCT116)은 시간이 경과할수록 G2/M기의 세포가 급격히 증가하여, 처리 후 12시간 경과 후에는 90% 이상의 세포가 G2/M기에 머무르고 있음을 확인하였다.

< 실험예 3> 세포주기 관련 단백질 양 분석

본 발명의 실시예 1의 화합물에 의한 세포주기 관련 단백질의 양을 알아보기 위해 웨스턴 블롯팅을 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.

실험예 2에서와 같은 방법으로 대장암 세포 HCT116을 100 mm 배양 접시에서 배양하였다. 12시간 배양 후, 0.1% DMSO를 처리(음성 대조구)하고 DMSO에 녹여진 2 mM 노코다졸(nocodazole)을 최종농도가 2 μM이 되도록 10 ㎕를 첨가(양성 대조구)하였다. 농도별로 DMSO에 녹인 트리메틸 옥사다이아졸 유래아는 최종농도가 1, 2, 5, 10, 20 및 50 μM가 되도록 10 ㎕씩 각각의 배양 접시에 첨가하였다. 24시간 경과후 배양 접시 바닥으로부터 떨어진 세포와 0.05% 트립신-EDTA를 처리하여 떼어낸 세포를 원심분리(200g, 5분)하였다. 분리된 세포는 PBS 용액으로 현탁한 후 원심분리하여 잔여 배지 성분을 제거하였다. 분리한 세포에 500 ㎕의 막분해 용액(RIPA lysis buffer)을 첨가하여 세포 내 단백질들을 포함하는 용해물(lysate)를 얻었다. 각각의 대조구 및 처리구로부터 40 ㎍의 단백질을 포함하도록 용해물은 취하여 15% SDS-PAGE로 단백질들을 전기 영동하였다. 단백질의 크기에 따라 전개된 단백질들은 PVDF 막에 전이시킨 후, 인산화된 H3 단백질을 인지하는 일차 항체와 3시간 동안 반응시켰다. 막에 남아있는 잔여 항체를 제거하기 위하여 TBS-T 용액으로 막을 세 번 씻어낸 후, 다시 일차 항체를 인지하는 이차 항체를 2시간 동안 반응시켰다. TBS-T 용액으로 막을 세 번 씻어낸 후 이차 항체와 화학반응에 의하여 발광을 하는 POD 시약을 첨가한 후, X-ray 필름에 감광시켰다. 상기 결과를 도 1에 도시하였다.

도 1에서 보이는 바와 같이, 세포가 M기에 접어들면 H3 단백질이 오로라 B 키나아제(aurora B kinase)에 의하여 인산화된다. 인산화된 H3 단백질은 M기 중에서 메타페이스(metaphase)까지 계속 유지된다. 그러므로 세포 단백질을 분석하여 인산화된 H3 단백질이 다량 존재하고 있다는 것은 세포들이 M기에 머무르고 있음을 의미한다. 웨스턴 블롯팅으로 트리메틸 옥사다이아졸 유래아를 1, 2, 5, 10, 20 및 50 μM 처리한 HCT116 세포에서 인산화된 H3 단백질의 양을 분석하였을 때, 5 μM 이상의 농도에서 H3 단백질의 인산화가 급격히 증가하였음을 확인하였다.

< 실험예 4> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 다음과 같이 실시하였다. 군당 2 마리씩의 SD계 랫트에 상기 실시예 에서 얻어진 옥사다이아졸 유래아를 주사용 증류수에 현탁시켜 1 g/kg/㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강 장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 랫트에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 랫트은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

본 발명에 따르면, 화학식 1로 표시되는 옥사다이아졸 유래아 (oxadiazole urea) 유도체는 새로운 구조의 화합물이고, 세포주기 중 M기를 효과적으로 억제하여 세포의 분열을 막으며, 이로 인해 암세포 등의 비정상적인 세포성장을 저해하는 암 예방 및 치료제에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.

<화학식 1>

(상기 식에서, R은 C₁~C₅의 알킬기 또는 C₁~C₅의 알킬 카보닐기이다.)
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 R은 C₁~C₃의 알킬기 또는 C₁~C₃의 알킬 카보닐기인 것을 특징으로 하는 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제2항에 있어서, 상기 화학식 1의 R은 메틸기 또는 아세틸기인 것을 특징으 로 하는 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
하기 반응식에 나타난 바와 같이, 출발물질인 치환된 벤즈알데하이드 화합물(2)을 아미노하이드록사이드(NH₂OH) 및 N-클로로숙신이미드(NCS)와 반응시킨 후, 반응생성물을 시아노칼륨과 반응시켜 시아노 화합물(3)을 제조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조된 시아노 화합물(3)을 아미노하이드록사이드와 반응시킨 후, 반응생성물을 염기 용액 처리하여 옥사다이아졸 화합물(4)을 제조하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 제조된 옥사다이아졸 화합물(4)을 4-트리플루오로메틸아닐린 및 트리포스겐과 반응시켜 옥사다이아졸 유래아 화합물(5)을 제조하는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3에서 제조된 옥사다이아졸 유래아 화합물(5)을 알킬할라이드 또는 알킬카보닐할라이드와 반응시켜 화학식 1의 옥사다이아졸 유래아 유도체를 제조하는 단계(단계 4)

를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염의 제조방법.

(상기 반응식에서, R은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 옥사다이아졸 유래아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대장암 또는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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