KR100782023B1 - Flavonoid fractions comprising neohesperidin from citrus grandis, that having physiological activity - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생리활성을 가지는 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a flavonoid fraction composition comprising neohesperidine derived from the sugar citron having physiological activity.
본 발명의 생리활성을 가지는 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물은 네오헤스페리딘이 전체 분획조성물의 60 ~ 70 %, 나린진이 20 ~ 35 %를 차지하는 것으로 구성된다.Flavonoid fraction composition comprising the sugar-derived neohesperidine derived from the physiological activity of the present invention is composed of neohesperidin is 60 to 70% of the total fraction composition, naringin 20 to 35%.
본 발명에 의해 생리활성이 뛰어난 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물이 제공된다. According to the present invention there is provided a flavonoid fraction composition comprising neohesperidine derived from the sugar citron excellent in physiological activity.
당유자, 플라보노이드, 네오헤스페리딘, 나린진, 항산화, 항염 Sugar-free, flavonoids, neohesperidin, naringin, antioxidant, anti-inflammatory
Description
도 1은 LPS 자극된 RAW 264.7 세포에서 세포독성과 산화질소 생성억제활성을 나타내는 그래프1 is a graph showing cytotoxicity and nitric oxide production inhibitory activity in LPS-stimulated RAW 264.7 cells
A : 실시예 1의 당유자 분획조성물 B : 비교예 1의 감귤추출물A: sugar-oil fraction composition of Example 1 B: citrus extract of Comparative Example 1
본 발명은 생리활성을 가지는 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a flavonoid fraction composition comprising neohesperidine derived from the sugar citron having physiological activity.
종래에 알려진 감귤류에서 유래된 플라보노이드는 나린진, 나린제닌, 헤스페리딘 또는 헤스페레틴 등으로 이루어진다.Flavonoids derived from citrus fruits known in the art consist of naringin, naringenin, hesperidin or hesperetin and the like.
감귤류 유래 플라보노이드는 항산화 및 항암활성이 있으며, 그 중 나린진은 간질환에 효과가 좋고,혈소판 응집억제, 혈압강하, 지질대사개선 등의 효과가 있다 고 알려져 있다.Citrus-derived flavonoids have antioxidant and anticancer activities, among which naringin is known to be effective for liver disease, platelet aggregation inhibition, blood pressure lowering, and lipid metabolism improvement.
한국공개특허공보 특1999-0079683(감귤류의 과피 분말 또는 과피 추출물을 포함하는 기능성 건강식품)에는, 감귤류의 과피를 건조하고 이 건조과피에 에탄올을 넣고 가열하여 추출. 여과하여 얻은 추출물이 항산화, 혈압강하, 혈중 콜레스테롤 강하, 항암작용, 간기능 개선 등의 효과가 있고, 이 추출물을 각종 식품에 첨가하여 기능성 건강식품을 제공한다는 것에 대해 공개되어 있다.In Korean Laid-Open Patent Publication No. 1999-0079683 (a functional health food comprising a citrus rind powder or rind extract), the tangerine rind is dried, and ethanol is added to the dried rind and heated. The extract obtained by filtration has the effect of antioxidation, lowering blood pressure, lowering blood cholesterol, anticancer action, and improving liver function, and it is disclosed that the extract is added to various foods to provide a functional health food.
한국등록특허공보 10-0537492(항균활성을 갖는 신규한 천연 조성물)에는, 탱자 완숙과의 과피를 제외한 열매 부분을 착즙한 것으로, 탱자유래의 천연화합물을 유효성분으로 하는 항균활성을 갖는 천연조성물에 관한 것이 공개되어 있다.Korean Patent Publication No. 10-0537492 (a novel natural composition having antibacterial activity) extracts the fruit part of the fruit except the skin of the ripened tanza, and has a natural composition having antimicrobial activity as a natural ingredient derived from the tanza. Is open to the public.
한국공개특허공보 특2003-0038009(감귤박에서 연속공정에 의한 플라보노이드와 펙틴의 추출 및 정제방법)에는, 감귤박에 메탄올을 넣고 가열하여 플라보노이드를 추출하고, 그 잔사를 분말화하고 여기에 염산과 물을 투입하여 추출하고, 동결건조시켜 펙틴을 추출하는 것으로 구성된 연속공정에 의한 플라보노이드와 펙틴의 추출 및 정제방법에 관한 것이 공개되어 있다.In Korean Patent Laid-Open Publication No. 2003-0038009 (a method of extracting and purifying flavonoids and pectins by a continuous process from citrus fruits), methanol is added to citrus fruits and heated to extract flavonoids, and the residue is powdered and hydrochloric acid and Disclosed is a method for extracting and purifying flavonoids and pectins by a continuous process comprising extraction by adding water, lyophilization and extracting pectin.
그러나, 종래의 방법으로 감귤류에서 플라보노이드를 추출하면 추출된 플라보노이드 양이 극히 적고, 생리활성도 다소 떨어지며, 네오헤스페리딘을 다량 추출하기도 어려웠다.However, when the flavonoids are extracted from citrus fruits by the conventional method, the amount of the extracted flavonoids is extremely small, the physiological activity is slightly reduced, and it is difficult to extract a large amount of neohesperidin.
한국식품과학회지 "제주재래종 감귤류 미숙과의 neohesperidin, naringin 및 hesperidin 함량"(류미라 외, Vol. 34, No.1, pp. 132-135(2002) 에는, 제주 재래종 감귤류 9 종 즉, 당유자, 지각, 편귤, 감자, 동정귤, 병귤, 빈귤, 사두감, 진귤 에서 각 숙기별로 시료를 분석한 결과, 당유자와 지각은 네오헤스페리딘과 나린진의 함량이 높고, 빈귤과 동정귤은 헤스페리딘의 함량이 높다는 내용이 공개되어 있다.The Korean Society of Food Science and Technology "Neohesperidin, naringin and hesperidin Contents of Jeju Native Citrus Fruits Immature" (Ryu Mira et al., Vol. 34, No.1, pp. 132-135 (2002)) show that 9 kinds of Jeju citrus fruits, As a result of analyzing the samples by each ripening season, crust, cinnamon, potato, virgin tangerine, bottle tangerine, bilberry, tangerine, and tangerine, sugar and crust have high content of neohesperidin and naringin, and This high content is open to the public.
그러나, 상기와 같은 내용은 각 감귤류의 플라보노이드의 함량을 단순히 분석한 것으로서, 감귤류의 플라보노이드 함량이 다소 적으며, 또한 실질적으로 다양하게 활용하기 위해서 감귤류에서 분획물을 다량 제조하기는 어려웠다.However, the above contents are simply analyzed the content of each citrus flavonoid, the citrus flavonoid content is somewhat less, and it was difficult to prepare a large amount of fractions in citrus fruits to utilize a variety.
한편, 당유자(Citrus grandis)는 제주도에서 자생되는 약용과일로써, 유자보다 열매가 약 10 배 정도 크고, 나린진 등의 플라보노이드가 풍부해 기침과 감기에 좋다고 알려진 과실이다.On the other hand, Citrus grandis is a medicinal fruit native to Jeju Island, which is about 10 times larger in fruit than citron and rich in flavonoids such as naringin, which is known to be good for coughing and colds.
종래에 감귤류 유래 플라보노이드 중 당유자와 지각에서 네오헤스페리딘의 함량이 높다는 사실이 알려져 있으나, 실제로 해당 과실에서 분획물을 다량 분획하기가 어려웠으며, 종래의 방법과 같이 일반적인 추출물로 제조하면 생리활성도 높지 않는 문제점이 있었다.It is known that the content of neohesperidin is high in the sugar crust and the crust of citrus-derived flavonoids, but it is difficult to fractionate a large amount of fractions from the fruit, and when prepared as a general extract as in the conventional method, the biological activity is not high. There was this.
따라서, 당유자에서 플라보노이드를 다량 분획하여 종래의 감귤류보다 경제성이 높고, 생리활성 또한 높아 보다 폭넓게 활용할 수 있는 연구가 더욱 필요한 실정이다.Therefore, a large amount of flavonoids from sugar-sugars is more economical than conventional citrus fruits, and the biophysical activity is also high.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 당유자로부터 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.In order to solve the above problems, an object of the present invention is to provide a method for producing a flavonoid fraction composition comprising neohesperidine from sugar.
또한, 항산화, 항염활성이 뛰어난 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.In addition, an object of the present invention is to provide a flavonoid fraction composition containing neohesperidine derived from sugar yuja with excellent antioxidant and anti-inflammatory activity.
본 발명은 생리활성을 가지는 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a flavonoid fraction composition comprising neohesperidine derived from the sugar citron having physiological activity.
본 발명의 생리활성을 가지는 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물은, 당유자 미숙과를 분쇄하는 제1공정, 이 분쇄물에 80 % 메탄올 수용액을 상기 분쇄물 1 ㎏ 당 1.5 ℓ를 가한 다음, 1 시간 동안 80 ~ 90 ℃로 중탕하여 1차 추출하는 제2공정, 1차 추출액을 감압여과하여 여과액을 얻는 제3공정, 이 여과액에 상기 제2공정과 제3공정을 반복하여 2차 추출액을 제조하는 제4공정, 상기의 2차 추출액을 감압농축하는 제5공정, 이 농축물에 농축물의 중량대비 25 배의 증류수를 넣고 녹인 후 여과한 여과액을 초미세여과 키트를 이용하여 여과하는 제6공정, 이 여과액을 MPLC 컬럼에 XAD-16 레진을 충진하여 30 % 에탄올 용액으로 용출시켜 플라보노이드 분획조성물을 얻는 제7공정으로 구성된다.The flavonoid fraction composition comprising the neohesperidine derived from the sugar citron having the physiological activity of the present invention is the first step of grinding the sugar citrus fruit immature fruit, to which 1.5 liters of 80% aqueous methanol solution is added per 1 kg of the ground product. Next, the second step of the primary extraction by hot water at 80 ~ 90 ℃ for 1 hour, the third step of obtaining the filtrate by filtration of the primary extract under reduced pressure, and repeating the second step and the third step to the filtrate The fourth step of preparing the secondary extract, the fifth step of condensing the secondary extract under reduced pressure, 25 times distilled water to the concentrate is dissolved in the concentrate, and the filtrate filtered using the ultrafiltration kit And a filtrate. The filtrate is filled with XAD-16 resin in an MPLC column, eluted with a 30% ethanol solution to obtain a flavonoid fraction composition.
당유자(Citrus grandis)는 제주도에서 자생되는 약용과일로써, 유자보다 열매가 약 10 배 정도 크고, 나린진 등의 플라보노이드가 풍부해 기침과 감기에 좋다고 알려진 과실이다.Citrus grandis is a medicinal fruit that grows on Jeju Island. Fruit is about 10 times larger than citron and rich in flavonoids such as naringin, which is known to be good for coughing and colds.
종래에 감귤류 유래 플라보노이드 중 당유자와 지각에서 네오헤스페리딘의 함량이 높다는 사실이 알려져 있으나, 실제로 해당 과실에서 분획물을 다량 분획하기가 어려웠으며, 종래의 방법과 같이 일반적인 추출물로 제조하면 생리활성도 높지 않는 문제점이 있었다.It is known that the content of neohesperidin is high in the sugar crust and the crust of citrus-derived flavonoids, but it is difficult to fractionate a large amount of fractions from the fruit, and when prepared as a general extract as in the conventional method, the biological activity is not high. There was this.
본 발명의 발명자들은 상기의 문제를 해결하기 위해 당유자를 이용하여 네오헤스페리딘이 다량 함유된 분획물을 다량 분획하고, 생리활성 또한 뛰어난 플라보노이드 분획조성물을 제조하기 위해 많은 시행착오를 겪으며 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, the inventors of the present invention have undergone many trials and errors to prepare a flavonoid fraction composition having a large fraction of neohesperidine-containing fractions and a physiologically active flavonoid fraction composition. .
본 발명의 당유자 유래 네오헤스페리딘이 포함된 플라보노이드 분획조성물은 당유자 미숙과를 분쇄하고, 이 분쇄물에 80 % 메탄올 수용액을 상기 분쇄물 1 ㎏ 당 1.5 ℓ를 가한 다음, 1 시간 동안 80 ~ 90 ℃로 중탕하여 1차 추출하고, 이 1차 추출액을 감압여과하여 여과액을 얻은 후, 이 여과액에 상기 과정을 반복하여 2차 추출액을 제조하고, 이 2차 추출액을 감압농축하되 감압농축시 암갈색 시럽 상태로 변할때 30 % 에탄올을 가하여 노란색 침전이 생기게 하고, 이를 원심분리하여 침전물을 제거한 후 완전히 농축하여 농축물을 제조한 다음, 이 농축물에 농축물의 중량대비 25 배의 증류수를 넣고 녹인 후 여과한 여과액을 초미세여과 키트를 이용하여 여과하고, 이 여과액을 MPLC 컬럼에 XAD-16 레진을 충진하여 30 % 에탄올 용액으로 용출시켜 플라보노이드 분획조성물을 얻는다.Flavonoid fraction composition containing the sugar-derived neohesperidine-derived sugar of the present invention is pulverized, the sugar-dried immature fruit fruit, 80 L aqueous solution of 1.5% per kg of the pulverized powder is added, 80-90 for 1 hour After primary extraction with a water bath at 50 ° C., the primary extract was filtered under reduced pressure to obtain a filtrate, and the filtrate was repeated to prepare a secondary extract, and the secondary extract was concentrated under reduced pressure. 30% ethanol is added to give a yellow precipitate when it turns into dark brown syrup. The precipitate is removed by centrifugation, and the concentrate is completely concentrated to make a concentrate. Then, 25 times of distilled water is added to the concentrate and dissolved. The filtrate was filtered using an ultrafiltration kit, and the filtrate was filled with XAD-16 resin in an MPLC column and eluted with a 30% ethanol solution. To obtain a composition.
상기 방법에 의해 제조된 본 발명의 당유자 유래 플라보노이드 분획물은 당유자 전체 중량대비 9 ~ 16 %를 얻을 수 있으며, 그 전체분획물 중 네오헤스페리딘은 60 ~ 70 %, 나린진은 20 ~ 35 %를 차지했다.The sugar-derived flavonoid fraction of the present invention prepared by the above method was able to obtain 9-16% of the total weight of sugar-oil, and neohesperidine was 60-70% and naringin 20-35% of the total fraction. .
상기와 같이 분획했을때 가장 분획조성물의 양이 많았으며, 네오헤스페리딘의 양을 다량 분획할 수 있었다.When fractionated as described above, the amount of the most fraction composition was large, and the amount of neohesperidin could be largely fractionated.
본 발명의 플라보노이드 분획조성물 중 대부분을 차지하는 네오헤스페리딘 (Neohesperidin)은 감귤류 중 당유자, 지각, 편귤에 함유되어 있는 플라보노이드 중 하나이다.Neohesperidin, which occupies most of the flavonoid fraction composition of the present invention, is one of the flavonoids contained in sugar citron, crust, and citrus fruits of citrus fruits.
네오헤스페리딘을 수소 환원반응시키거나, 감귤류의 나린진으로부터 화학반응을 통해 네오헤스페리딘을 만들고 다시 수소 환원반응을 시켜 네오헤스피리딘 디히드로칼콘을 제조할 수 있다.Neohesperidine may be reduced by hydrogen reduction, or neohesperidine may be prepared by chemical reaction from citrus naringin, followed by hydrogen reduction to produce neohespyridine dihydrochalcone.
이 네오헤스피리딘 디히드로칼콘은 1960년대 초 미국 농림부에서 처음으로 보고한 것으로 동일한 농도에서 설탕의 1,500 ~ 1,800 배의 감미도를 나타내므로, 식품에 저칼로리를 부여하는데 주로 사용되고, 쥬스, 음료, 주류, 제과, 소스류, 향신료, 치약, 구강청정제 등 폭넓게 활용할 수 있어 각광받고 있는 물질이다.This neohespyridine dehydrochalcone was first reported by the US Department of Agriculture in the early 1960s and has a sweetness of 1,500 to 1,800 times the sugar at the same concentration, and is therefore used primarily to give foods a low calorie, juice, beverage, liquor, and confectionery. It is widely used because it can be widely used for sauces, spices, toothpaste, and mouthwashes.
이러한 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 네오헤스페리딘으로 제조하기 때문에 네오헤스페리딘을 효율적으로 다량 분획하는 것은 산업상 이용가치가 매우 높은 것이라 할 수 있다.Since neohesperidine dihydrochalcone is prepared from neohesperidine, efficient fractionation of neohesperidine can be said to be of high industrial value.
또한, 네오헤스페리딘 자체도 생리활성이 뛰어날 것으로 추정되어 본 발명의 생리활성 실험을 수행하여, 그 생리활성을 입증하였다.In addition, neohesperidine itself was estimated to be excellent in physiological activity, and the physiological activity experiment of the present invention was performed to prove its physiological activity.
나린진(Naringin)은 감귤류에 다량 함유되어 있다고 널리 알려져 있는 물질로서 항산화작용, 항동맥경화작용, 항암작용을 하는 플라보노이드 중 하나이다.Naringin is one of the citrus fruits that is widely known as an antioxidant, anti-arteriosclerosis, and anti-cancer flavonoids.
나린진 또한 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 화학적 변환이 가능하다.Naringin can also be chemically converted to neohesperidine dihydrochalcone.
본 발명은 상기와 같은 특징을 갖고 있는 네오헤스페리딘과 나린진이 다량 함유되어 있는 플라보노이드 분획조성물을 당유자로부터 제조하여 쥬스, 음료, 주류, 제과, 소스류, 향신료, 치약, 구강청정제, 화장품 등에 다양하게 활용할 수 있다.The present invention prepares flavonoid fraction composition containing a large amount of neohesperidin and naringin having the above characteristics from sugar-dried milk, juices, beverages, alcoholic beverages, confectionery, sauces, spices, toothpaste, mouthwashes, cosmetics, etc. Can be.
또한, 본 발명의 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물은 헤스페리딘과 나린진을 주요 물질로 함유하고 있는 감귤추출물 보다 DPPH 자유유리기 소거활성, 수퍼옥사이드 자유기 소거활성, 크산틴 산화효소 억제활성이 높아 항산화활성이 뛰어난 것으로 확인하였으며, 항염활성 또한 뛰어난 것으로 확인하였다.In addition, the flavonoid fraction composition containing the sugar-derived neohesperidine derived from the present invention has a DPPH free free radical scavenging activity, a superoxide free radical scavenging activity, and a xanthine oxidase inhibitory activity than citrus extracts containing hesperidin and naringin as main substances. High anti-oxidant activity was confirmed, and anti-inflammatory activity was also found to be excellent.
따라서, 본 발명의 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물을 활성성분으로 포함하는 조성물을 제조하여 각종 질병의 예방 및 치료에 다양하게 이용할 수 있다.Therefore, by preparing a composition comprising a flavonoid fraction composition comprising the sugar-derived neohesperidine of the present invention as an active ingredient it can be used in various ways for the prevention and treatment of various diseases.
이하, 본 발명의 생리활성이 뛰어난 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물의 제조공정에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the manufacturing process of the flavonoid fractional composition containing the neohesperidine derived from the sugar citron excellent in physiological activity of the present invention will be described in detail.
<생리활성이 뛰어난 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물의 제조공정><Manufacturing Process of Flavonoid Fraction Composition Containing Neohesperidin Derived from Sugar Citrus Fruit with High Bioactivity>
1. 제1공정 : 분쇄1. The first step: grinding
당유자 미숙과를 시중에서 구입하여 준비한 다음, 습식 분쇄기를 이용하여 분쇄한다.Sugary immature fruit is purchased commercially and prepared, and then ground using a wet mill.
2. 제2공정 : 1차 추출2. Second Process: First Extraction
상기의 분쇄물에 80 % 메탄올 수용액을 상기 분쇄물 1 ㎏ 당 1.5 ℓ를 가한 다음, 1 시간 동안 80 ~ 90 ℃로 중탕하여 1차 추출한다.1.5 L per 1 kg of the pulverized product was added to the pulverized product, and then extracted by primary water at 80-90 ° C. for 1 hour.
3. 제3공정 : 여과3. Third Process: Filtration
상기의 1차 추출액을 감압여과하여 여과액을 얻는다.The primary extract is filtered under reduced pressure to obtain a filtrate.
4. 제4공정 : 2차 추출4. 4th process: 2nd extraction
상기의 여과액에 80 % 메탄올 수용액을 상기 1차 추출액 제조시 첨가한 메탄올 수용액과 같은양으로 가한 다음, 1 시간 동안 80 ~ 90 ℃로 중탕하여 2차 추출액을 제조한다.80% methanol solution was added to the filtrate in the same amount as the methanol solution added during the preparation of the primary extract, followed by agitation at 80-90 ° C. for 1 hour to prepare a secondary extract.
5. 제5공정 : 감압농축5. The fifth step: vacuum concentration
상기의 2차 추출액을 감압농축한다. The secondary extract is concentrated under reduced pressure.
상기의 감압농축시 농축액이 암갈색 시럽 상태로 변할 때 30 % 에탄올을 가하여 노란색 침전이 생기게 하고, 더 이상 침전물이 생기지 않을 때까지 에탄올을 가하고, 원심분리하여 침전물을 제거한 다음 완전히 농축한다.When the concentrate is reduced to dark brown syrup, the concentrate is reduced to 30% ethanol to give a yellow precipitate, ethanol is added until no precipitate is formed, and the precipitate is removed by centrifugation and then concentrated.
6. 제6공정 : 여과6. Sixth Step: Filtration
상기의 농축물에 농축물의 중량대비 25 배의 증류수를 넣고 녹인 후 여과하고, 이 여과액을 초미세여과 키트(ultrafiltration, cut off 10K Da, 3K Da)를 이용하여 초미세여과액을 제조한다.Distilled water of 25 times the weight of the concentrate in the concentrate was dissolved and filtered, and the filtrate was prepared using ultrafiltration kit (ultrafiltration, cut off 10K Da, 3K Da).
7. 제7공정 : 분획조성물 제조7. Step 7: Preparation of fraction composition
상기의 초미세여과액을 MPLC 컬럼에 XAD-16 레진을 충진하여 30 % 에탄올 용액으로 용출시켜 본 발명의 플라보노이드 분획조성물을 제조한다.The ultrafiltrate was filled with XAD-16 resin in an MPLC column and eluted with a 30% ethanol solution to prepare a flavonoid fraction composition of the present invention.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
<실시예 1> 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물의 제조Example 1 Preparation of Flavonoid Fraction Composition Containing Sugar-Derived Neohesperidin
제주도에서 2005년 6월에 채취한 당유자(Citrus grandis) 미숙과를 준비하였다.A crude fruit (Citrus grandis) was collected from June 2005 in Jeju Island.
준비한 당유자를 세척한 다음 습식 분쇄기에 넣고 분쇄하였다.The sugar-sugars which were prepared were washed and then put in a wet grinder and ground.
이 분쇄물 1 ㎏에 80 % 메탄올 1.5 ℓ를 가한 다음, 1 시간 동안 90 ℃로 중탕하여 1차 추출액을 제조하였다.1.5 L of 80% methanol was added to 1 kg of the pulverized product, followed by agitation at 90 ° C. for 1 hour to prepare a primary extract.
이 1차 추출액을 감압여과하여 여과액을 얻고, 이 여과액에 80 % 메탄올을 1.5 ℓ를 가한 다음, 1 시간 동안 90 ℃로 중탕하여 2차 추출액을 제조하였다.The primary extract was filtered under reduced pressure to obtain a filtrate. 1.5 liter of 80% methanol was added to the filtrate, followed by agitation at 90 ° C. for 1 hour to prepare a secondary extract.
상기의 2차 추출액을 감압농축하였다.The secondary extract was concentrated under reduced pressure.
감압농축시 농축액이 암갈색 시럽 상태로 변할 때 30 % 에탄올을 가하여 노란색 침전물이 생기게 하고, 침전물이 더 이상 생기지 않을 때 원심분리하여 노란색 침전물을 제거한 다음, 완전히 농축하여 농축물을 제조하였다.30% ethanol was added to produce a yellow precipitate when the concentrate changed to a dark brown syrup state under reduced pressure, and when the precipitate was no longer formed, the yellow precipitate was removed by centrifugation, and then concentrated completely to prepare a concentrate.
이 농축물에 농축물의 중량대비 25 배의 증류수를 넣고 녹인 후 여과하고, 이 여과액을 초미세여과 키트(ultrafiltration, cut off 10K Da, 3K Da)를 이용하여 다시 여과하였다. Distilled water 25 times the weight of the concentrate was dissolved in the concentrate, and the filtrate was filtered, and the filtrate was filtered again using an ultrafiltration kit (ultrafiltration, cut off 10K Da, 3K Da).
이 초미세여과액을 MPLC 컬럼에 XAD-16 레진을 충진하여 30 % 에탄올 용액으로 용출시켜 플라보노이드 분획물을 제조하였다.The ultrafiltrate was filled with XAD-16 resin in an MPLC column and eluted with 30% ethanol solution to prepare a flavonoid fraction.
이때, 본 발명의 당유자 유래 플라보노이드 분획물의 중량은 150 g이었다.At this time, the weight of the sugar-derived flavonoid fraction of the present invention was 150 g.
<비교예 1> 감귤 추출물의 제조Comparative Example 1 Preparation of Citrus Fruit Extract
제주도에서 2005년 6월에 채취한 온주감귤 미숙과를 준비하였다.We have prepared Wenzhou tangerines, which were collected in June 2005 from Jeju Island.
준비한 감귤을 세척한 다음 분쇄기에 넣고 분쇄하였다.The prepared citrus fruits were washed and then put into a grinder and ground.
이 분쇄물을 30 % 에탄올에 녹여 3회 추출하고, 동결건조하여 온주감귤 추출물을 제조하였다.This pulverized product was dissolved in 30% ethanol and extracted three times, and lyophilized to prepare Wenzhou citrus extract.
<실험예 1> 본 발명의 당유자 유래 플라보노이드 분획물 성분분석 실험Experimental Example 1 Analysis of Component Analysis of Flavonoid Fraction of Sugar Citrus Fruit of the Present Invention
본 발명의 실시예 1에서 제조한 당유자 유래 플라보노이드 분획물을 준비하였다.The sugar citron derived flavonoid fractions prepared in Example 1 of the present invention were prepared.
이 분획물은 Water 사의 Delta Prep 4000 HPLC를 이용하여 정량하였다.This fraction was quantified using Delta Prep 4000 HPLC from Water.
정량에 이용한 네오헤스페리딘(neohesperidin)과 나린진(naringin)은 Sigma사의 제품을 이용하였다.Neohesperidin (neohesperidin) and naringin (naringin) used in the quantification was used by the product of Sigma.
컬럼은 Prep Nova-pack 7.8×300 mm을 이용하였고, 이동상은 H2O : MeOH : 아세트산 = 57 : 43 : 0.5 를 이용하였다.The column used Prep Nova-pack 7.8 × 300 mm and the mobile phase used H 2 O: MeOH: acetic acid = 57: 43: 0.5.
그 결과 전체 분획물 중 네오헤스페리딘(neohesperidin)이 약 64 %, 나린진(naringin)이 약 29 % 를 차지하고 있음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that neohesperidin (neohesperidin) of about 64%, naringin (naringin) accounted for about 29%.
<실험예 2> 본 발명의 당유자 유래 네오헤스페리딘이 포함된 플라보노이드 분획조성물의 항산화 활성 실험Experimental Example 2 Antioxidant Activity Test of Flavonoid Fraction Composition Containing Sugar-Derived Neohesperidin of the Present Invention
본 발명의 실시예 1의 당유자 유래 플라보노이드 분획조성물을 준비하였고, 본 발명의 비교예 1에서 제조한 감귤 추출물을 준비하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.The sugar-oil-derived flavonoid fraction composition of Example 1 of the present invention was prepared, and the citrus extracts prepared in Comparative Example 1 of the present invention were prepared and the following experiments were performed.
1. DPPH 자유라디칼 소거활성1. DPPH free radical scavenging activity
항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거작용은 자유라디칼에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인체에 노화를 억제하는 척도로 사용되, 항산화능 측정에 많이 이용되고 있다.The most characteristic mechanism of antioxidants is the reaction with free radicals. The free radical scavenging action is used as a measure of antioxidant activity in plants and aging in the human body by donating electrons to free radicals.
DPPH 자유라디칼 소거활성은 본 발명의 실시예 1의 분획조성물을 여러 농도에 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조군으로는 트롤록스, 엘아스코르빈산, 케르세틴을 사용하였다.DPPH free radical scavenging activity was measured by absorbance at 517 nm after the fraction composition of Example 1 of the present invention was added to 0.4 mM DPPH solution at various concentrations for 10 minutes at room temperature. Corvinic acid, quercetin was used.
그 결과, 비교예 1의 감귤추출물은 DPPH 자유라디칼 소거활성 실험결과가 측정되지 않았고, 본 발명의 실시예 1의 플라보노이드 분획조성물의 IC50이 492.2 ± 14.8 로 나타났다.As a result, the citrus extract of Comparative Example 1 did not measure the DPPH free radical scavenging activity, and the IC 50 of the flavonoid fraction composition of Example 1 of the present invention was 492.2 ± 14.8.
따라서, 본 발명의 실시예 1의 당유자 유래 네오헤스페리딘이 포함된 플라보노이드 분획조성물의 DPPH 자유라디칼 소거활성이 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다(표 1).Therefore, it was confirmed that the DPPH free radical scavenging activity of the flavonoid fraction composition containing the sugar-derived neohesperidine of Example 1 of the present invention was excellent (Table 1).
<표 1> DPPH 자유라디칼 소거활성 실험결과<Table 1> DPPH free radical scavenging activity test results
* IC50은 DPPH의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 각 시료의 농도를 통계처리한 값.* IC 50 is the statistical value of the concentration of each sample that appears when the absorbance of DPPH is reduced by 50%.
* BHA는 부틸하이드록시아니솔(butylated hydroxy anisole)임.* BHA is butylated hydroxy anisole.
2. NO 자유기 소거활성2. NO free radical scavenging activity
질소산화물(Nitric oxide ; NO)은 활성종으로서 세포독성이 강하며, 다향의 NO가 생성되면 nitrosation, nitration과 같은 간접적 효과 및 산화반응을 야기하여 유해한 효과를 나타내게 된다.Nitric oxide (NO) is an active species that has strong cytotoxicity. When multi-directional NO is produced, indirect effects such as nitrosation and nitration and oxidative reactions cause harmful effects.
본 발명에 대한 NO 자유기 소거활성을 실험하기 위해 생리적 조건에서 자연적으로 NO를 생성하는 물질인 SNP(sodium nitroprusside)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 검색하였다.In order to test the NO free radical scavenging activity of the present invention, the absorbance was measured at 550 nm using SNP (sodium nitroprusside), which is a material that naturally generates NO under physiological conditions.
그 결과, 본 발명의 실시예 1의 당유자 분획조성물의 질소산화물 자유기 소 거활성은 500 ㎍/㎖ 농도에서 40.7 ± 3.0 %로 나타났으며, 비교예 1의 감귤추출물에서는 15.2 ± 0.2로 활성이 낮았음을 알 수 있었다(표 2).As a result, the nitrogen oxide free radical scavenging activity of the sugar fraction fraction composition of Example 1 of the present invention was found to be 40.7 ± 3.0% at a concentration of 500 ㎍ / ㎖, 15.2 ± 0.2 in the citrus extract of Comparative Example 1 It was found that this was low (Table 2).
<표 2> NO 자유기 소거활성 실험결과<Table 2> NO free radical scavenging activity test results
3. 과산화 자유라디칼 소거활성3. Free radical scavenging activity
PMS/NADH system을 이용하여 생성된 과산화 음이온(superoxide anion)의 양을 NBT 환원방법에 의해 517 nm에서 측정하여 검색하였다. The amount of superoxide anion produced using the PMS / NADH system was detected by measuring at 517 nm by the NBT reduction method.
실험의 정확도는 과산화억제효소(superoxide dismutase ,SOD)를 가지고 확인하였다.The accuracy of the experiment was confirmed with superoxide dismutase (SOD).
그 결과, 본 발명의 실시예 1의 당유자 유래 네오헤스페리딘이 포함된 플라보노이드 분획조성물이 감귤추출물인 비교예 1에 비해 과산화 자유라디칼 (superoxide free radical) 소거활성이 월등히 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다(표 3).As a result, it was confirmed that the flavonoid fraction composition containing the sugar-derived neohesperidin of Example 1 of the present invention was superior in scavenging activity of superoxide free radicals compared to Comparative Example 1, which is a citrus extract ( Table 3).
<표 3> 과산화 자유라디칼 소거활성 실험결과<Table 3> Experimental Results of Free Radical Scavenging Activity
4. 크산틴 산화효소 억제활성4. Xanthine Oxidase Inhibitory Activity
크산틴 산화효소(xanthine oxidase)는 산화적 환경에서 크산틴 탈수소효소로부터 생성된다.Xanthine oxidase is produced from xanthine dehydrogenase in an oxidative environment.
크산틴 산화효소는 하이포크산틴을 산화시켜 최종적으로 요산과 산소를 형성하며, 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생되게 된다.Xanthine oxidase oxidizes hypoxanthine and finally forms uric acid and oxygen, and oxygen free radicals and hydrogen peroxide groups are generated from this oxygen.
요산의 축적은 고요산형증과 통풍을 유발하는 것으로 알려져 있고, 크산틴 산화효소에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다.Accumulation of uric acid is known to cause hyperuricosis and gout, and oxygen free radicals produced by xanthine oxidase cause cell damage.
따라서, 산소유리기의 자유기를 소거할 수 있는 물질은 산화적 손상의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, a material capable of eliminating free radicals in the oxygen free group can be usefully used for preventing oxidative damage.
크산틴(Xanthine)을 기질로 하여 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)에 의해 생성된 요산(uric acid)의 양을 290 nm에서 흡광도를 측정하여 검색하였다. Using xanthine as a substrate, the amount of uric acid produced by xanthine oxidase was measured by absorbance at 290 nm.
실험의 정확도는 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 억제제인 알로푸리놀(allopurinol)을 가지고 확인하였다.The accuracy of the experiment was confirmed with allopurinol, a xanthine oxidase inhibitor.
그 결과, 비교예 1의 감귤추출물은 활성이 측정되지 않았고, 본 발명의 실시예 1의 당유자 플라보노이드 분획조성물의 IC50 값은 과산화생성 억제활성은 41.9 ± 0.07로, 요산생성 억제활성은 132.7 ± 15.4 로 나타나, 본 발명의 실시예 1이 비교예 1보다 활성이 월등히 높게 나타났음을 확인할 수 있었다(표 4).As a result, the citrus extract of Comparative Example 1 was not measured activity, IC 50 of the sugar-containing flavonoid fraction composition of Example 1 of the present invention The value of the peroxidation inhibitory activity was 41.9 ± 0.07, the uric acid production inhibitory activity was 132.7 ± 15.4, it was confirmed that Example 1 of the present invention was significantly higher than Comparative Example 1 (Table 4).
또한, 본 발명의 실시예 1의 분획조성물은 크산틴 옥시다제 억제활성과 더불 어 과산화 생성억제 활성을 보여주었으며, 이는 PMS/NADH법에 의한 수퍼옥사이드 소거활성과 일치하는 결과이다.In addition, the fraction composition of Example 1 of the present invention showed the xanthine oxidase inhibitory activity and the peroxidation inhibitory activity, which is consistent with the superoxide scavenging activity by the PMS / NADH method.
<표 4> 크산틴 산화효소 억제활성 실험결과<Table 4> Experimental results of xanthine oxidase inhibitory activity
* IC50 값을 계산할 수 없음.* IC 50 The value cannot be calculated.
** 최대농도에서 < 5% 라디칼 소거활성** <5% radical scavenging activity at maximum concentration
<실험예 3> 본 발명의 당유자 유래 네오헤스페리딘이 포함된 플라보노이드 분획물의 항염활성 실험Experimental Example 3 Anti-inflammatory Activity of Flavonoid Fractions Containing Sugar-derived Neohesperidin of the Present Invention
본 발명의 실시예 1의 당유자 유래 플라보노이드 분획조성물을 준비하였고, 본 발명의 비교예 1에서 제조한 감귤 추출물을 준비하여 항염활성을 실험하였다.The sugar-oil-derived flavonoid fraction composition of Example 1 of the present invention was prepared, and the anti-inflammatory activity was prepared by preparing the citrus extracts prepared in Comparative Example 1 of the present invention.
1. 세포독성1. Cytotoxicity
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 여러 가지 농도의 시료를 첨가한 후 24 시간 동안 배양하였다. Various concentrations of samples were added to RAW 264.7 cells, a mouse macrophage line, and cultured for 24 hours.
배지를 제거한 후 0.5 ㎎/㎖의 MTT용액을 첨가하고 1 시간 동안 배양하였다.After removing the medium, 0.5 mg / ml MTT solution was added and incubated for 1 hour.
MTT 용액을 제거하고 DMSO를 첨가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포마즌 (formazan) 침전물을 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.The MTT solution was removed and DMSO was added to dissolve the forazan precipitate produced by the reduction of MTT and the absorbance was measured at 540 nm.
각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.The average absorbance values for each sample group were obtained, and growth inhibition was examined by comparing with the absorbance values of the control group.
그 결과, 본 발명의 실시예 1의 플라보노이드 분획조성물은 거의 세포독성을 나타내지 않았다. As a result, the flavonoid fraction composition of Example 1 of the present invention showed little cytotoxicity.
2. In vitro 실험2. In vitro experiment
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 LPS(100ng/ml)와 여러 가지 농도의 시료를 동시에 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다.LPS (100 ng / ml) and various concentrations of samples were simultaneously added to RAW 264.7 cells, a mouse macrophage line, and cultured for 24 hours.
생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 nitrite의 형태로 측정하였다.The amount of NO produced was measured in the form of nitrite present in the cell culture using Griess reagent.
50 %의 세포독성을 나타내는 농도인 TC50 값을 LPS로 유도된 NO의 생성을 50 % 억제하는 IC50값으로 나누어 선택지수를 구하였다.The TC 50 value, a concentration of 50% cytotoxicity, was divided by the IC 50 value that inhibits the production of LPS-induced NO by 50%.
그 결과, 표 5와 도1에서 보는 바와 같이 본 발명의 실시예 1의 당유자 유래 네오헤스페리딘이 포함된 플라보노이드 분획조성물이 비교예 1의 감귤추출물보다 산화질소 생성 억제활성도 뛰어나고 독성이 낮아 항염활성이 월등히 뛰어났음을 확인하였다.As a result, as shown in Table 5 and Figure 1, the flavonoid fraction composition containing the sugar-derived neohesperidin of Example 1 of the present invention is more excellent in inhibiting the nitric oxide production and lower the toxicity than the citrus extract of Comparative Example 1, the anti-inflammatory activity is low It was confirmed that it was excellent.
<표 5> 항염활성 실험결과<Table 5> Anti-inflammatory activity test results
본 발명에 의해 당유자로부터 생리활성이 뛰어난 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물의 제조방법이 제공된다.The present invention provides a method for producing a flavonoid fraction composition containing neohesperidin excellent in physiological activity from sugar-sugar.
또한, 본 발명의 생리활성이 뛰어난 당유자 유래 네오헤스페리딘을 포함하는 플라보노이드 분획조성물이 제공된다. In addition, there is provided a flavonoid fraction composition comprising neohesperidine derived from the sugar citron excellent in physiological activity of the present invention.
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