KR100770746B1

KR100770746B1 - 항염활성을 갖는 감귤 유래 노빌레틴과 그 분리.정제방법

Info

Publication number: KR100770746B1
Application number: KR1020060053848A
Authority: KR
Inventors: 김세재; 최수연; 고희철; 박지권; 정완석; 한상헌
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2007-10-30
Anticipated expiration: 2026-06-15

Abstract

본 발명은 항염활성을 갖는 감귤 유래 노빌레틴과 그 분리. 정제방법에 관한 것이다.

본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 분리.정제는, 감귤과피를 동결건조하고, 80 % 메탄올을 넣고 추출한 후, 여과하고 농축한 다음, 이 농축물을 헥산(Hexane)과 물로 분배 추출하고, 그 중 물층을 에틸아세테이트(EtOAc)로 분배 추출하고, 이 에틸아세테이트 추출물을 농축한 다음, 순상 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 분획하고, 이 분획물들을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴 함량이 가장 큰 분획물을 선택하고, 선택된 분획물을 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 정제하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해 감귤류로부터 노빌레틴을 고순도로 분리 및 정제하는 방법이 제공되며, 염증인자로부터 기인하는 다수의 염증 질환에 효과적인 감귤 유래 노빌레틴이 제공된다.

노빌레틴, 감귤, 항염, 분리, 정제

Description

항염활성을 갖는 감귤 유래 노빌레틴과 그 분리.정제방법{NOBILETIN FROM CITRUS HAVING ANTI-INFLAMMATION ACTIVITY, AND THE METHOD OF SEPARATION AND PURIFY}

도 1은 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 분리 및 정제공정

도 2는 본 발명의 노빌레틴 분리 과정 중 순상 칼럼크로마토그래피 분획물의 TLC 전개결과

도 3은 본 발명의 노빌레틴 분리 과정 중 순상칼럼크로마토그래피 분획물의 크로마토그램

도 4는 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 1차 분리.정제 크로마토그램

도 5는 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 분리.정제물 확인결과 그래프

도 6는 노빌레틴의 화학식 구조

도 7은 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 ¹H 와 ¹³C의 NMR 구조확인 결과

도 8은 본 발명의 노빌레틴에 대한 유도형 일산화질소 생성 억제 활성을 나타내는 그래프

A : 리포폴리사카라이드로 유도 B : 인터페론-감마로 유도

C : 리포폴리사카라이드와 인터페론-감마 혼합 투여로 유도

LPS : 리포폴리사카라이드(100 ng/㎖), IFN-γ : 인터페론-감마(100 U/㎖)

LPS +IFN-γ : 리포폴리사카라이드(10 ng/㎖)+인터페론-감마(10 U/㎖)

NOB : 노빌레틴, TGT : 탄저레틴 , NGN : 나린제닌 , NG : 나린진 ,

HPT : 헤스페레틴, HT : 헤스페리딘, FA : 페룰릭산, RT : 루틴

도 9는 본 발명의 노빌레틴의 동시처리 및 후처리에 대한 유도형 일산화질소 생성 억제 활성을 나타내는 그래프

*** P < 0.0005

도 10은 본 발명의 노빌레틴에 대한 일산화질소 생성 억제활성을 나타내는 그래프

*** P < 0.0005

도 11은 본 발명의 노빌레틴에 대한 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 발현에 대한 억제활성을 나타내는 전기영동 사진

*** P < 0.0005

도 12는 본 발명의 노빌레틴에 대한 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로오시게나제-2의 mRNA 발현억제 활성을 나타내는 전기영동 사진

LPS : 리포폴리사카라이드(100 ng/㎖)

도 13은 본 발명의 노빌레틴에 대한 전염증성 사이토카인의 생성 억제활성을 나타내는 그래프

** P < 0.005, *** P < 0.0005

도 14는 본 발명의 노빌레틴에 대한 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현 억제활성을 나타내는 전기영동 사진

LPS : 리포폴리사카라이드(100 ng/㎖)

도 15는 본 발명의 노빌레틴에 대한 핵전사인자-κB 활성화 억제활성 결과를 나타내는 그래프

*** P < 0.0005, LPS : 리포폴리사카라이드(100 ng/㎖)

도 16은 본 발명의 노빌레틴에 대한 핵전사인자-κB 뉴클레오티드 결합 억제활성을 나타내는 전기영동사진

LPS : 리포폴리사카라이드(100 ng/㎖)

도 17은 본 발명의 노빌레틴에 대한 억제성-κB 분해 억제 및 합성 촉진 활성 결과를 나타내는 전기영동사진

LPS : 리포폴리사카라이드(100 ng/㎖)

도 18은 본 발명의 노빌레틴에 대한 ERK1/2 활성화 억제활성 결과를 나타내는 전기영동 사진

현재까지 감귤류로부터 약 60 여종의 플라보노이드가 분리되었으며, 새로운 생리활성 성분이 계속 발견되고 있다.

감귤류에 유래하는 주요 플라보노이드 화합물은 루틴(rutin) 및 디오스민(diosimine)과 같은 일반적인 플라보노이드 및 헤스페리딘(hesperidin), 나린진(naringin)과 같은 감귤 특유의 플라보노이드, 그리고 채소나 과일에서는 보고되지 않은 감귤류 고유에서만 발견된 폴리메톡시플라보노이드(polymethoxyflavonoid)인 노빌레틴 등과 같은 플라보노이드가 존재하고 있다(Raman, G. et al., Separation and Purification Technology , 45, pp147-152, 2005).

최근에 미국과 일본에서 오렌지 및 감귤 과피에 들어있는 폴리메톡시 플라본(polymethoxy flavones)인 노빌레틴(5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone ; nobiletin)이 동물실험에서 혈중 콜레스테롤을 효과적으로 떨어뜨리다는 것이 보고되었다.

또한, 동물실험 및 세포실험에서 항암 및 항염 활성이 있다고 발표되면서 이들에 대한 관심과 연구가 활기를 띠고 있다(Wu et al., 2006; Ohnishi et al., 2004; Yoshimizu et al., 2004; Tanaka et al., 2004; Sato et al., 2004).

그러나, 노빌레틴은 감귤류에만 존재한다고 보고되었으며, 감귤 부위 중에서도 과피 부위에 소량 존재한다는 알려져 있으므로, 활성이 높지만 생산성이 떨어지는 노빌레틴의 단점을 보완하기 위하여 노빌레틴을 다량 함유한 감귤을 탐색하고, 탐색된 감귤류를 토대로 하여 보다 효율적이고, 편리한 분리 방법을 개발하고, 노빌레틴에 대한 고순도의 분리 및 정제에 대한 기술 개발이 필요한 실정이다.

한편, 면역계의 주요 요소 중 하나인 대식세포는 염증의 중요한 매개인자이다. 활성화된 대식세포는 정상세포를 손상시킬 수 있는 염증인자인 일산화질소 및 프로스타글란딘 E₂를 각각 생성하는 효소인 유도성 일산화질소합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 발현을 초래한다.

또한, 대식세포의 활성화는 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 인 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루키-1β 및 인터루킨-6을 생성하는데, 이들 모두 강력한 염증인자들이다.

대식세포에 의한 사이토카인의 생성은 다른 사이토카인의 분비 유도, 세포 기능의 변화, 세포 분열 또는 분화를 유발할 수 있다.

대식세포는 박테리아 산물인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 및 인터페론-감마(interferon-gamma; IFN-γ)를 포함하는 많은 인자에 의해 활성화되며, 핵전사인자-κB의 활성화가 염증인자들의 생성에 중요한 역할을 한다.

즉, 일산화질소, 프로스타글란딘 E₂, 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨-1베타, 인터루킨-6는 조직의 손상이나 감염에 대한 신체의 방어 메커니즘에서 중요한 역할을 한다.

따라서, 천연물질로부터 상기 염증인자들의 생성 및 활성화를 억제하는 화합물들을 찾기 위한 광범위한 노력들이 계속되고 있다.

또한, 폴리메톡시 플라본이 우수한 항염 활성을 가지고 있다는 것은 보고되었으나 항염 활성에 있어서 이들의 작용점 및 분자적 작용 메커니즘에 대한 확실한 규명은 이루어지지 않았으므로, 이에 대한 보다 많은 연구가 필요한 실정이다.

본 발명은 상기의 목적을 해결하기 위해, 감귤류로부터 노빌레틴을 다량 함유하고 있는 감귤류를 분석하고, 그 감귤류로부터 노빌레틴 화합물을 고순도 분리 및 정제하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 염증인자로부터 기인하는 다수의 염증 질환에 효과적인 항염활성이 뛰어난 감귤 유래 노빌레틴을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 분리.정제는, 감귤의 과피와 과육의 분리하여 과육을 준비하는 제1공정, 감귤과피를 동결건조하고, 80 % 메탄올을 넣고 추출하는 제2공정, 메탄올추출물을 여과하는 제3공정, 이 여과물을 농축하는 제4공정, 이 메탄올추출농축물을 헥산(Hexane)과 물로 분배 추출하고, 그 중 물층을 에틸아세테이트(EtOAc)로 분배 추출하는 제5공정, 이 에틸아세테이트 추출물을 농축하여 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 제6공정, 이 에틸아세테이트 분획물을 순상 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 분획하는 제7공정, 제7공정에서 얻은 분획물을 박층 크로마토그래피(TLC)를 실시하여 분획물을 분리하는 제8공정, 제8공정에서 분리된 분획물을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴 함량을 분석하여 가장 함량이 큰 분획물을 얻는 제9공정, 제9공정에서 선택된 분획물을 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 1차 정제하는 제10공정, 이 1차 정제한 노빌레틴을 다시 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 2차 정제하는 제11공정을 거쳐 분리.정제하는 것으로 구성된다(도 1).

또한, 본 발명의 감귤 과피에서 분리한 폴리메톡시 플라본(polymethoxy flavone, PMF)인 노빌레틴(nobiletin)은 염증인자인 일산화질소(NO)의 생성을 억제하고, 유도형 일산회질소의 합성효소의 단백질 및 mRNA 발현을 억제하며, 프로스타글란딘 E2 염증인자의 생성을 억제하고, 사이클로옥시게나제-2의 단백질 및 mRNA 발현을 억제하며, 종양괴사인자-알파, 인터루킨-1베타, 인터루킨-6의 mRNA 발현을 억제하고, 억제성-κB-알파(I-κB-α)의 분해를 억제하고 이들의 합성을 촉진함으로써 핵전사인자-κB(NF-κB)의 활성을 억제하며, 또한 ERK1/2의 활성을 억제하는 항염활성을 나타낸다.

본 발명의 발명자들은 감귤류에서 노빌레틴이 다량 함유되어 있는 감귤류를 먼저 선별하고, 선별된 감귤류로부터 추출분획하여 그 중 노빌레틴 함량이 큰 분획물을 찾고, 그 분획물을 다시 분리.정제하여 고순도의 노빌레틴을 얻기 위해 수많은 연구를 하여 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 분리.정제방법을 찾게되었다.

본 발명에 사용한 감귤류는 2005년 8월부터 12월에 걸쳐 채집한 신선한 미성숙 제주산 감귤(표 1)로 감귤 전문가의 감정하에 동정하였으며, 채집된 감귤은 각각 과육과 과피로 분리한 후, 흐르는 물에 수세하여 사용하였다.

수세된 과피는 동결건조기(Ilshin co., Ltd.)를 사용하여 3 일간 건조하였고, 분쇄기(HM-390, Hanil)를 이용하여 분말화하였다.

노빌레틴의 함량을 분석하기 위한 과피의 추출은 동결건조된 각 25 종의 감귤과피 100 g에 70 % 에탄올 1 ℓ를 가하여 3 일간 추출하였고, 이를 2 회 반복하였다.

감귤과피 추출물은 감압농축한 후, 재차 동결건조기를 사용하여 건조하였다.

노빌레틴 분석을 위해 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였고, 검출범위는 PDA(photodiode array detector) 검출기를 이용하여 가장 흡광도가 높은 파장인 320 nm를 선택하여 분석하였다.

이때 사용된 표준시약은 Wako사의 표준시약을 사용하였다.

고속액체크로마토그래피에 사용되는 이동상은 각각 아세토니트릴/초산(995/5, v/v), 증류수/초산(995/5, v/v)을 사용하여 분석하였고, 고속액체크로마토그래피의 이동상 조건은 기울기 용리를 적용하여 분석하였다.

이때 노빌레틴의 성분 분석을 위한 고속액체크로마토그래피의 조건과 이동상의 기울기 용리 조건을 표 2와 표 3에 수록하였다.

<표 1> 노빌레틴의 정성 및 정량을 위한 감귤종

Code	감귤명	학명	Code	감귤명	학명
1	지각	Citrus aurantium	14	삼보감	Citrus sulcata
2	감자	Citurs benikoji	15	탱자	Citrus trifoliate
3	동정규	Citrus erythrosa	16	장수금감	Citrus
4	당유자	Citrus grandis	17	시퀘샤	Citrus depressa
5	청귤	Citrus nippokoreana	18	이예감	Citrus iyo
6	병귤	Citrus platymamma	19	청견	Citrus sinensis
7	사두감	Citrus pseudogulgul	20	궁천조생	Citrus unshiu
8	진귤	Citrus sunki	21	상야조생	Citrus unshiu
9	홍귤	Citrus tachibana	22	남감20호	Citrus unshiu
10	유자	Citrus junos	23	팔삭	Citrus hassak
11	빈귤	Citrus leiocarpa	24	한라봉	Citrus reticulata
12	편귤	Citrus tangerina	25	세토카	Citrus sinensis
13	하귤	Citrus natsudaidai	-	-	-

<표 2> 노빌레틴의 정성 및 정량 분석을 위한 HPLC의 조건

고속액체크로마토그래피(HPLC) 시스템	분석 조건
컬럼(Column)	Atlantis dC-18 (3.9 × 150mm ID. 5μm)
검출기(Detector)	Photodiode array Detector
유속(Flow rate)	1.0 ㎖/min
주입 부피(Injection volume)	10 ㎕
컬럼 온도(Column temp.)	40 ℃

<표 3> 노빌레틴의 정성 및 정량 분석을 위한 이동상 조건

Program order	Time(min)	Mobile phase
Program order	Time(min)	Acetonitrile(%)	H2O(%)
1	0	20	80
2	10	20	80
3	11	45	55
4	16	45	55
5	17	75	25
6	20	75	25
7	21	20	80
8	22	20	80

상기와 같이 고속액체크로마토그라피를 이용하여 노빌레틴을 다량 함유하고 있는 감귤의 목록을 확인하였다.

그 결과, 진귤(16.40mg/g), 시퀘샤(15.64mg/g), 홍귤(15.19mg/g), 병귤(11.10mg/g), 세토카(9.24mg/g), 한라봉(8.26mg/g), 빈귤(7.92mg/g)이 다른 감귤에 비하여 높은 함량을 보였으며, 그 외 청견(4.63mg/g), 편귤(3.69mg/g), 감자(2.67mg/g), 이예감(2.53mg/g), 당유자(2.11mg/g)가 다소 높은 노빌레틴을 함유하고 있었고, 그 외의 감귤에서 노빌레틴은 농도가 낮거나 검출되지 않았다(표 4).

<표 4> 감귤과피의 노빌레틴 함량 분석결과

종 류	노빌레틴 량(㎎/g)	종 류	노빌레틴 량(㎎/g)
지각	0.92	삼보감	0.81
감자	2.67	탱자	0.29
동정귤	1.85	장수금감	미검출
당유자	2.11	시퀘샤	15.64
청귤	1.90	이예감	2.53
병귤	11.10	청견	4.63
사두감	0.04	궁천조생	1.21
진귤	16.40	상야조생	1.41
홍귤	15.19	남감20호	1.20
유자	미검출	팔삭	0.25
빈귤	7.92	한라봉	8.26
편귤	3.69	세토카	9.24
하귤	0.24	-	-

따라서, 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴은 진귤, 시퀘샤, 홍귤, 병귤, 세토 카, 한라봉, 빈귤, 청견, 편귤, 감자, 이예감, 당유자를 이용하여 분리.정제하는 것이 보다 다량의 노빌레틴을 얻을 수 있음을 확인하였다.

상기와 같이 확인한 노빌레틴이 다량 함유되어 있는 감귤류를 이용하여 다음과 같이 추출분획물을 제조하였다.

감귤류를 준비하여 과피부분을 동결 건조한 다음, 믹서기로 잘게 분쇄하고, 80 % 메탄올을 가하여 실온에서 3 일간 2 회 반복하여 추출한 다음, 얻어진 추출물을 모두 합치고, 이를 여과지를 사용하여 여과한 후 감압회전농축기(Rotavapor R-200, BUCH)로 농축하고, 이 농축물은 재차 동결건조기를 사용하여 잔여수분을 제거한 후 시료로 사용하였다.

상기에서 얻어진 메탄올추출농축물을 헥산(Hexane)과 물을 같은 부피비율로 넣고 분배 추출하였고, 다시 물층에 물층과 같은 부피의 에틸아세테이트(EtOAc)를 넣고 분배 추출하였고, 마지막으로 물층에 물층과 같은 부피의 부탄올(n-BuOH)을 넣고 순차적으로 분배 추출하였다.

이렇게 얻어진 분획물의 각 층을 감압회전농축기를 사용하여, 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획과 물 분획을 얻었다.

각각의 분획물을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴 함량을 분석한 결과, 실험한 모든 종의 감귤류에서 공통적으로 에틸아세테이트 분획물에서 노빌레틴이 가장 많이 함유되어 있는 것을 확인하였다.

따라서, 노빌레틴 함유량이 가장 많은 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 노빌레틴을 분리.정제하였다.

즉, 에틸아세테이트 분획물을 순상 칼럼 크로마토그래피(silica gel, 150g, 3×30cm)를 실시하여 분취하였고, 분리에 사용된 이동상 용매는 헥산에서 에틸아세테이트로 에틸아세테이트에서 메탄올(n-Hexane → EtOAc → MeOH)로 각각의 용매 비율을 서서히 증가시키는 방법으로 10 ㎖씩 분취하였다.

분취한 분획물은 TLC(silicagel 60F 254, Merck, Darmstadt, Germany.)를 이용하여 TLC 판에 분취된 분획물을 점적하여 분석하였다.

그 결과 비슷한 띠를 나타내는 200 여개의 분획물 중 유사한 전개를 나타내는 분획물을 서로 합하고(도 2), 분취한 분획물을 재차 고속액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴 함량을 조사한 다음, 가장 함량이 큰 분획물을 선택하였다(도 3).

선택된 분획물을 선택된 분획물을 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 2차에 걸쳐 분획하여 정제함으로써(도 4), 고순도 노빌레틴을 분리.정제하였다(도 5).

본 발명의 감귤 과피에서 분리한 폴리메톡시 플라본(polymethoxy flavone, PMF)인 노빌레틴(nobiletin)은 염증인자인 일산화질소(NO)의 생성을 억제하여 항염활성을 나타낸다.

노빌레틴은 일산화질소를 포함하여 프로스타글란딘 E₂(prostaglandin E₂; PGE₂), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터루킨-1베 타(interleukin-1β; IL-1β) 및 인터루킨-6 (interleukin-6; IL-6)의 생성 억제, 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2)의 단백질 및 mRNA 발현 억제, 억제성-κB-알파(I-κB-α)의 분해를 억제하고 이들의 합성을 촉진함으로써 핵전사인자-κB(NF-κB)의 활성을 억제하며, 또한 ERK1/2(the extracellular signal-activated kinases)의 활성을 억제하여 항염활성을 나타낸다.

한편, 유도성 일산화질소 합성효소(iNOS)에 의한 일산화질소의 과다한 생성은 염증성 질환을 포함한 다수 질환의 발병 및 진행에서 중요한 역할을 한다.

또한, 사이클로옥시게나제는 염증과 통증의 중요한 매개인자인 프로스타글란딘의 생합성에서 속도-결정 단계를 촉진시키는 효소이며, 이 효소는 사이클로옥시게나제-1 (COX-1)과 사이클로옥시게나제-2 (COX-2)의 두가지 이성질체가 존재한다.

그 중, 사이클로옥시게나제-2는 정상적인 환경에서는 발현되지 않다가 사이토카인, 호르몬 및 성장인자 등의 다양한 자극에 의해 유도되는 유도형 효소로서, 이 효소의 과다한 발현은 염증 반응 동안에 유도된다고 알려져 있다.

종양괴사인자-알파는 염증 반응에서 중심적인 역할을 한다.

이들은 백혈구를 활성화시키고 이들의 혈관 외 염증 부위로의 이동을 촉진함으로써 보호성 염증 반응에 참여하지만, 높은 농도의 종양괴사인자-알파는 강력한 발열원으로 작용하며 다른 염증 매개성 사이토카인들의 생성을 유도한다.

과다 발현된 종양괴사인자-알파가 류마티스 관절염외에도 다수의 다른 장애 및 질환에 관여하며 이들의 저해제가 광범위하고 다양한 질환의 치료에 유용하다고 밝혀진 바 있다.

인터루킨-1베타 역시 염증 반응에 참여하며 흉선 세포(thymocyte)의 증식, 섬유아세포 성장인자의 활성 및 활막세포에서 프로스타글란딘의 방출을 자극한다.

인터루킨-1베타의 부적절한 과다 발현은 종양괴사인자-알파 및 인터루킨-6과 마찬가지로 염증 질환을 포함한 다수의 질환과 연관되어 있다.

인터루킨-6은 다면발현(pleiotropy) 및 과잉 작용을 나타내는 또 다른 전-염증성 사이토카인이며 면역 반응, 염증 및 조혈과정에 참여한다.

인터루킨-6의 생성 억제가 류머티스 관절염의 치료를 개선하는 것으로 보고되었으며, 죽상동맥경화증의 진행 및 관상 심장 질환의 진행에도 관여한다고 알려져 있다.

핵전사인자-κB는 상기 염증인자들의 생성에 관여하는 특히 중요한 전사인자로서, 세포가 리포폴리사카라이드 또는 산화성 스트레스 등에 의해 자극된 경우, 억제성-κB는 프로테아좀(proteasome)에 의해 분해되며, 이때 억제성-κB로부터 분리된 핵전사-κB는 핵으로 들어가 프로모터 영역 중의 특이적인 κB 서열과 결합하여 염증, 면역, 성장 및 세포사멸(apoptosis) 과정과 관련된 표적 유전자의 전사를 활성화시켜, 핵전사-κB를 활성화시키는 신호 전달의 억제는 염증 및 면역질환의 핵심 단계를 붕괴시키게 된다.

본 발명의 감귤 유래 노빌레틴은 일산화질소, 프로스타글란딘 E₂와 이들을 생성하는 효소인 유도성 일산화질소 합성효소와 사이클로옥시게나제-2, 종양괴사인자-알파, 인터루킨-1베타 및 인터루킨-6의 부적절한 생성과 발현, 그리고 이들의 발현에 관여하는 ERK1/2, 억제성-κB-알파 및 핵전사인자-κB의 활성화를 억제한다는 사실을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴은 다수의 염증성 질환 및 면역 질환의 억제 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

RAW 264.7 대식세포에서 감귤 과피의 대표적 활성 성분으로 알려진 탄저레틴, 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌, 루틴, 페룰릭산 및 폴리메톡시 플라본인 노빌레틴의 일산화질소 억제 활성을 비교 분석하였다.

대식세포의 활성화는 리포폴리사카라이드 및 인터페론-감마를 단독투여하거나 이들을 혼합 투여하여 유도하였다.

리포폴리사카라이드와 인터페론-감마의 혼합 투여는 시너지효과에 의해 이들을 단독투여를 한 경우보다 더 많은 일산화질소의 생성을 유도한다.

실험 결과, 본 발명의 노빌레틴이 가장 우수한 일산화질소 억제 활성을 나타냈음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서는 감귤 유래 노빌레틴의 항염활성 및 작용 메커니즘을 연구하였다.

1. 노빌레틴을 대식세포주에 리포폴리사카라이드와 동시처리하였을 때 노빌 레틴은 일산화질소, 프로스타글란딘 E₂, 종양괴사인자-알파, 인터루킨-1베타 및 인터루킨-6의 생성, 유도성 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 및 mRNA의 발현, 억제성-κB-알파(I-κB-α)의 분해, 핵전사인자-κB(NF-κB)의 활성 및 ERK1/2의 활성화를 억제하였다.

따라서, 본 결과는 노빌레틴이 ERK1/2의 활성화 경로 및 핵전사인자-κB의 활성화에 작용하는 기전을 저해하여 상기 염증인자들의 생성을 억제함으로써 항염증 활성을 가지는 것을 보여준다.

2. 대식세포를 인터페론-감마 혹은 리포폴리사카라이드와 인터페론-감마를 혼합 투여하여 활성화시킨 경우에도 노빌레틴은 유도성 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 및 mRNA의 발현을 억제함으로써 이들 효소의 각각의 생성물인 일산화질소 및 프로스타글란딘 E₂의 생성을 억제하였다.

3. 항염증제의 사용은 정상 조직의 손상을 초래하는 염증성 질환의 치료에 사용하게 된다. 따라서 항염증제 후보물질을 염증 반응이 진행되고 있는 환경에 처리하였을 때 지속적인 염증인자들의 과다 생성을 억제한다면 더 유용한 염증 억제제가 될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 자극제로 6시간 동안 대식세포를 활성화시킨 다음에 노빌레틴을 처리하여 노빌레틴의 항염증 활성을 관찰하였다.

그 결과, 노빌레틴은 이미 활성화된 대식세포에서 지속적인 유도성 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 발현을 억제함으로써 이들 효소들의 각각의 생성물인 일산화질소 및 프로스타글란딘 E₂의 생성을 억제하였다.

이 결과는 노빌레틴이 다수의 염증성 질환의 치료를 위한 치료제로 유용함을 보여준다.

이하, 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 분리,정제방법 및 노빌레틴의 항염활성에 대해 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 분리.정제

2005년 8월에 채집한 신선한 미성숙 제주산 진귤을 준비하였다.

준비한 진귤은 각각 과육과 과피로 분리한 후, 흐르는 물에 수세하여 과피를 동결건조하였다.

동결 건조된 진귤 과피 900 g을 믹서기로 잘게 분쇄하고 난 후, 80 % 메탄올을 가하여 실온에서 3 일간 2 회 반복하여 추출하였다.

얻어진 추출물을 모두 합치고, 이를 여과지를 사용하여 여과한 후 감압회전농축기(Rotavapor R-200, BUCH)로 농축하였다.

이 농축물을 1 ℓ 헥산(Hexane)과 H₂O 1 ℓ로 분배 추출하였고, 다시 물층을 1 ℓ 에틸아세테이트(EtOAc)로 분배 추출하였다.

이렇게 얻어진 에틸아세테이트 분획추출물을 감압회전농축기를 농축하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었다.

이 에틸아세테이트 분획물을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴 함량을 조사한 다음 가장 함량이 큰 에틸아세테이트 분획물을 선택하였다.

이 에틸아세테이트 분획물을 순상 칼럼 크로마토그래피(silica gel, 150g, 3×30cm)를 실시하여 분취하였고, 분리에 사용된 이동상 용매는 헥산에서 에틸아세테이트로 에틸아세테이트에서 메탄올(n-Hexane → EtOAc → MeOH)로 각각의 용매 비율을 서서히 증가시키는 방법으로 10 ㎖씩 분취하였다.

이때, 이동상 용매는 클로로포름 : 메탄올 : 물을 7.5 : 2.5 : 1의 비율로 조제한 후, 분액깔대기를 사용하여 하층의 용매만을 이동상 전개용매로 사용하였다.

TLC 분석을 위한 발색시약으로는 메탄올에 황산을 10 %가 되도록 희석한 1ℓ 용액에 p-anisaldehyde를 0.5 ㎖를 첨가한 용액을 사용하였으며, 이 용액에 분획물을 점적하여 전개용매로 전개시킨 TLC 판을 적신 후, 120 ℃ 핫플레이트에서 발색하여 비슷한 띠를 나타내는 200 여개의 분획물 중 유사한 전개를 나타내는 분획물을 서로 합하여 5 개의 분획물을 얻었다(도 2).

분취한 분획물을 재차 고속액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴 함량을 조사한 다음, 가장 함량이 큰 분획물을 선택하였다(도 3).

선택한 분획물을 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 1차 정제하였다.

이때, 재순환 분취용 액체크로마토그래피의 이동상은 아세토니트릴/초 산(995/5, v/v), 증류수/초산(995/5, v/v)를 50 : 50의 비율로 혼합하여 사용하였고, 이동상은 4 ㎖/min이 되도록 하였고, UV 검출기는 320nm 파장을 선택하여 정제하였다.

재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 3개의 분획물을 얻었고 그중 노빌레틴이라고 예상되어지는 분획물을 감압회전농축기로 농축하여 1차정제물을 얻었다(도 4).

이 1차정제물을 다시 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴의 순도가 높게 정제될때까지 재순환하여 2차 정제하였고, 본 발명의 고순도 노빌레틴을 제조하였다(도 5).

<실험예 1> 노빌레틴의 구조확인 실험

본 발명의 실시예 1의 방법으로 분리. 정제한 노빌레틴을 준비하였다.

상기 노빌레틴의 보다 명확한 구조를 확인하기 위하여 아래의 표 5와 같은 조건으로 ¹H -NMR, ¹³C-NMR 분석을 통해 동정하여 노빌레틴 화합물을 확인하였다(도 6, 7).

<표 5> NMR을 통한 노빌레틴의 구조확인 실험조건

¹H-NMR	d(ppm)	¹³C-NMR	d(ppm)
3	6.62(s)	2	161.5
2'	7.58(d) (J=2.1)	3	107.1
5'	7.14(d) (J=8.4)	4	176.6
6'	7.68(dd) (J=2.1, 8.4)	5	145.0
OCH3	4.07	6	139.1
OCH3	4.04	7	152.2
OCH3	3.96	8	148.5
OCH3	3.91	9	149.0
OCH3	3.89	10	115.7
OCH3	3.85	1'	124.6
		2'	109.7
		3'	150.5
		4'	153.2
		5'	112.4
		6'	120.2
		6-OCH3	62.3
		7-OCH3	62.2
		8-OCH3	61.9
		5-OCH3	61.8
		3'-OCH3	56.1
		4'-OCH3	56.1

<실험예 2> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 일산화질소 생성 억제활성 실험

본 발명의 감귤에서 분리. 정제한 노빌레틴을 준비하였다.

표준시액으로 구입한 탄저레틴, 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌, 루틴, 페룰릭산을 준비하였다.

상기 물질들의 일산화질소 생성 억제 활성을 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포에서 배지에 축적된 일산화질소의 산화물질인 아질산염(nitrite)의 농도를 측정하여 평가하였다.

이때, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 구입하여, 10 % FBS, 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)에서 37 ℃, 5 % CO2 조건 하에서 배양하 여 준비하였다.

준비한 RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 웰당 2×10⁴세포수/ 200 ㎕가 되도록 분주하여 24 시간 동안 배양하였다.

세포에 리포폴리사카라이드(100 ng/ml), 인터페론-감마(100 U/ml) 또는 리포폴리사카라이드와 인터페론-감마 혼합물(10 ng/ml + 10 U/ml)을 처리하였다.

이때 6, 13, 25 및 50 μM 농도의 상기 성분들을 동시에 처리하고 24 시간 동안 추가로 배양하였다.

각각의 대조군에는 시료를 처리하지 않았다.

세포 배양 후 새포운 96-웰 플레이트에 세포 배양 배지를 각각 100 ㎕ 씩 첨가하고 Griess 시약 (2.5% 인산용액에 녹인 1% 설파닐아미드 (sulfanilamide)용액과 0.1% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 (naphthylethylenediamine dihydorchloride) 용액을 가볍게 섞은 것)을 100 ㎕ 씩 가하여 5분 동안 반응시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배지에 들어있는 아질산염의 농도는 아질산염 표준곡선으로부터 산출하였다. 상기 성분들이 아질산염의 생성을 50 % 억제하는 농도(IC₅₀)를 산출하여 이들의 항염 활성을 비교하였다.

한편, MTT 분석법에 의해 각 성분들이 세포 생존에 미치는 영향을 관찰하였다.

RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 웰당 2×10⁴세포수/ 200 ㎕가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후에 6, 13, 25 및 50 μM 농도의 상기 성 분들을 첨가하였다.

계속해서 추가로 24시간 동안 세포를 배양한 후에 배지를 제거하고 0.5 ㎎/㎖ MTT 용액을 함유하는 DMEM 배지 200 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 1시간동안 세포를 배양한 다음 MTT 용액을 제거하고 살아있는 세포에 의해 생성된 포르마잔(formazan)을 200㎕ DMSO에 용해하였다.

570 nm에서 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 측정하였다. 세포생존률에 미치는 시료의 영향은 대조군(플라보노이드를 처리하지 않은 세포)에서 형성된 포르마잔(formazan)의 흡광도를 세포생존률 100 %로 하여 측정하였다.

그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 리포폴리사카라이드(A), 인터페론-감마(B) 또는 리포폴리사카라이드와 인터페론-감마(C) 혼합 투여로 유도된 일산화질소 생성에 대한 각 성분의 농도에 따른 억제 활성을 보여준다.

표 6은 100 μM에서의 이들 성분들의 억제율(%)을 보여주며, 100 μM 농도내에서 IC50값이 산출되는 경우는 그 값을 표기하였다.

본 발명의 노빌레틴이 세 가지 자극 모두에서 가장 높은 일산화질소 생성 억제 활성을 보였으며, 탄저레틴 역시 높은 억제 활성을 나타냈다.

리포폴리사카라이드에 의한 일산화질소 억제 활성은 노빌레틴이 월등히 높았으며, 그 다음으로 탄저레틴 > 헤스페레틴 > 나린제닌 순으로 높았다.

인터페론-감마로 일산화질소를 유도한 실험에서는 노빌레틴과 탄저레틴이 높 은 억제활성을 나타내었는데, 저농도에서는 탄저레틴이 노빌레틴보다 더 높은 억제활성을 보였으나, 고농도로 갈수록 노빌레틴의 억제 활성이 더 증가하는 양상을 나타냈다.

리포폴리사카라이드와 인터페론-감마를 혼합 투여한 실험에서도 노빌레틴이 월등히 높은 억제활성을 보였으며, 그 다음으로 탄저레틴이 높은 활성을 나타냈다.

한편, 각 성분들의 일산화질소 억제 활성이 세포독성에 의한 것이 아니라는 것을 확인하게 위해 MTT 분석법에 의해 각 성분들이 세포 생존에 미치는 영향을 관찰하였다.

그 결과, 이들은 본 실험에 사용한 최고 농도인 100 μM에서 유의적인 세포독성을 나타내지 않았다. 따라서 이들의 일산화질소 억제활성이 세포독성에 의한 것이 아니라는 것을 확인하였다.

<표 6> 활성화된 대식세포에서 일산화질소 생성에 대한 감귤 과피 성분들의 억제율 결과

구 분	% Inhibition at 100 μM (IC₅₀, μM)
구 분	LPS	IFN-γ	LPS+IFN-γ
노빌레틴	81.3 ± 1.0 (26.4)	54.6 ± 0.5 (78.3)	68.4 ± 0.7 (49.7)
탄저레틴	55.7 ± 0.1 (90.5)	43.7 ± 3.0	28.2 ± 1.0
나린제닌	47.2 ± 1.2	38.1 ± 2.0	18.3 ± 1.4
나린진	13.0 ± 1.7	13.8 ± 3.9	7.3 ± 0.6
헤스페레틴	50.9 ± 0.2 (99.8)	-	24.4 ± 2.2
헤스페리딘	12.9 ± 0.3	-	-
페룰릭산	18.4 ± 0.7	24.6 ± 0.4	17.4 ± 2.6
루틴	31.9 ± 0.3	9.2 ± 3.4	21.8 ± 0.7

* 억제률 (%) < 0.5 %, IC₅₀; 일산화질소 생성을 50 % 억제하는 농도,

* LPS; 리포폴리사카라이드(100 ng/ml), IFN-γ; 인터페론-감마(100 U/ml),

LPS+IFN-γ; 리포폴리사카라이드(10 ng/ml)+인터페론-감마(10 U/ml)

<실험예 3> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 일산화질소 및 프로스타글란딘 E₂ 생성 억제 활성 실험

RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 웰당 2×10⁴세포수/ 200 ㎕가 되도록 분주하여 24 시간 동안 배양하였다.

24 시간 후에 노빌레틴(12.5, 25, 50, 100 μM)과 리포폴리사카라이드(100 ng/ml), 인터페론-감마(100 U/ml) 혹은 리포폴리사카라이드+인터페론-감마(10 ng/ml+10 U/ml)를 동시처리하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다.

또 다른 실험에서는 각각의 상기 물질로 6 시간 동안 대식세포를 활성화 시킨 후에 노빌레틴을 처리(후처리)하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다.

각각의 대조군에는 노빌레틴을 처리하지 않았다.

일산화질소의 양은 배지에 축적된 일산화질소의 산화물질인 아질산염 (nitrite)의 농도를 측정하여 평가하였다.

배양 후 96-웰 플레이트에 웰당 세포 배양 배지를 100 ㎕ 씩 가하고 Griess 시약을 100 ㎕ 씩 가하여 5분 동안 반응시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

배지에 들어있는 아질산염의 농도는 아질산염 표준곡선으로부터 산출하였다.

프로스타글란딘 E₂ 분석배지에 축적된 프로스타글란딘 E₂의 농도를 제조사(R&D)의 프로토콜에 따라 효소면역분석법으로 정량하였다.

그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이 노빌레틴의 동시처리 또는 후처리가 리포폴리사카라이드 (A), 인터페론-감마(B) 또는 리포폴리사카라이드와 인터페론-감마(C) 혼합 투여로 유도되는 일산화질소 생성에 미치는 효과를 보여준다.

노빌레틴은 동시처리 뿐만 아니라 후처리 시에도 각각의 대조군과 비교하였을 때 실험에 사용한 가장 낮은 농도인 6 μM부터 일산화질소의 생성을 유의적으로 감소시켰으며 농도 의존적으로 일산화질소의 생성을 억제하였다.

노빌레틴 자체는 50 μM에서 일산화질소의 생성을 유도하지 않았다.

도 10은 노빌레틴의 동시처리 또는 후처리가 리포폴리사카라이드(A), 인터페론-감마(B) 또는 리포폴리사카라이드와 인터페론-감마(C) 혼합 투여로 유도되는 프로스타글란딘 E₂ 생성에 미치는 효과를 보여준다.

노빌레틴은 각각의 대조군과 비교하였을 때 6 μM부터 프로스타글란딘 E2의 생성을 유의적으로 감소시켰으며 또한 농도 의존적으로 억제하였다.

노빌레틴 자체는 50 μM에서 프로스타글란딘 E₂의 생성을 유도하지 않았다.

<실험예 4> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 발현 억제 활성 실험

1. 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 발현 유 도

RAW 264.7 세포를 6-웰 플레이트(well plate)에 웰당 1×10⁶세포수/ 2 mL가 되도록 분주하여 24 시간 동안 배양하였다.

24 시간 후에 노빌레틴(6, 13, 25, 50 μM)과 리포폴리사카라이드(100 ng/ml), 인터페론-감마(100 U/ml) 혹은 LPS+인터페론-감마(10 ng/ml+10 U/ml)를 동시처리하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다.

또 다른 실험에서는 각각의 상기 물질로 6 시간 동안 대식세포를 활성화 시킨 후에 노빌레틴을 처리(후처리) 하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다.

각각의 대조군에는 노빌레틴을 처리하지 않았다.

2. 웨스턴 블롯(Western blot)

상기 1 에 의해 세포를 배양 한 후에 배지를 제거하고 세포를 인산완충용액 (Phosphate buffered saline)으로 씻은 후 세포 전체 단백질을 용해 완충액 (lysis buffer)으로 추출하였다.

추출물을 원심분리하고 상등액을 취해 단백질 정량 시약(Bio-Rad)으로 단백질을 정량하였다. 30 ㎍의 단백질을 7.5 % 또는 10 % SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하고 단백질을 PVDF 막으로 이전하였다.

5 % 전지분유로 1 시간동안 블라킹 (blocking)시킨 후 적합한 비율로 희석된 유도형 일산화질소 합성효소(anti-iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2 (anti-COX-2)에 대한 항체를 첨가하여 하룻밤동안 4 ℃에서 반응하였다.

그 후 TTBS (Tween 20/Tris-buffered saline) 용액으로 5 분간 5 회 세척하고, 적합한 비율로 희석한 토끼 이차 항체 또는 마우스 이차 항체를 첨가하여 1 시간동안 상온에서 반응시킨 다음, 다시 TTBS 용액으로 5 분 간격으로 3 회 씻어낸 후 현상하였다.

3. 결과

도 11에서 보는 바와 같이, 리포폴리사카라이드(100 ng/ml), 인터페론-감마(100 U/ml) 혹은 리포폴리사카라이드+인터페론-감마(10 ng/ml+10 U/ml) 혼합 투여는 RAW 264.7세포에서 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 발현을 유도하였다.

그러나, 노빌레틴은 동시처리 뿐만 아니라 후처리 시에도 각각의 대조군과 비교하였을 때 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2 단백질의 발현을 농도 의존적으로 억제하였다.

노빌레틴 자체는 이들의 단백질의 발현을 유도하지 않았다. 이 결과는 노빌레틴이 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 발현을 저해함으로써 염증인자인 일산화질소 및 프로스타글란딘 E₂의 생성을 억제한다는 것을 보여준다.

<실험예 5> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 mRNA 발현 억제 활성

본 발명의 노빌레틴의 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2 단백질 발현 억제 활성이 mRNA 발현을 억제하는 전사조절수준에서 이루어지는지를 관찰하였다.

상기 효소의 mRNA 발현은 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법으로 측정하였다.

RAW 264.7세포에 6, 13, 25, 50 μM 노빌레틴을 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)와 동시처리하고 추가로 6 시간 동안 더 배양하였다.

Tri reagent (Molecular Research Center, Inc., U.S.A.)를 사용하여 세포내의 전체 RNA를 분리하였다.

세포에 Tri reagent를 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리하였다.

상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하고 윈심분리하여 RNA를 침전시키고 75 %의 DEPC가 처리된 에탄올로 세척한 후, 건조시켜 DEPC 처리된 증류수에 녹였다.

260 nm에서의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280 nm의 비율이 1.7-1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다.

cDNA의 합성은 ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, U.S.A.)의 방법에 따라 합성하였다.

분리한 RNA 1 μg을 oligo (dT)18 primer, dNTP (0.5 μM), 1 unit RNAse 억제제, 그리고 M-MuLV 역전사효소 (2 U)로 70°C에서 5 분, 25°C에서 5 분, 42°C 에서 1시간, 그리고 70°C에서 10 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA로부터 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2를 증폭시키기 위해서 각각에 대한 5’ 와 3’ 프라이머(표 7)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 하였다.

중합효소연쇄반응은 첫 cycle의 변성온도(denature)는 94°C에서 5분간, 두 번째부터는 94°C에서 30초간 반응하였다.

Annealing temperature는 유도형 일산화질소 합성효소는 56°C, 사이클로옥시게나제-2는 55 ℃ 에서 30 초간 반응하고, extension은 72 ℃에서 45 초씩 유도형 일산화질소 합성효소는 25 번, 사이클로옥시게나제-2는 21 번 반응하고 마지막 반응은 7 분간 반응하였다.

증폭된 cDNA를 1.5 % 아가로즈 겔에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 확인하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)는 RAW 264.7세포에서 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 mRNA 발현을 유도하였다.

그러나, 노빌레틴은 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 억제하였다.

이 결과는 노빌레틴이 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)로 유도되는 유도형 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 mRNA 발현을 억제함으로써 이들의 단백질 발현을 억제하고, 계속해서 일산화질소 및 프로스타글란딘 E₂의 생성을 억제한다는 것을 보여준다.

<실험예 6> 감귤 유래 노빌레틴의 종양유발인자-알파, 인터루킨-1베타, 인터루킨-6 생성 억제 활성 실험

대식세포에서 리포폴리사카라이드로 유도되는 전-염증성 사이토카인인 종양유발인자-알파, 인터루킨-1베타, 인터루킨-6 생성에 대한 본 발명의 노빌레틴의 억제 활성을 평가하였다.

또한, 역전사-중합효소연쇄반응법에 의해 노빌레틴의 상기 전-염증성 사이토카인의 생성 억제 활성이 전사조절수준에서 이루어지는지를 관찰하였다.

24 시간 후에 노빌레틴(6, 13, 25, 50 μM)과 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)를 동시처리하여 6 시간 동안 추가로 배양하였다.

배지에 축적된 상기 전-염증성 사이토카인의 농도를 제조사(R&D)의 프로토콜에 따라 효소면역분석법으로 정량하였다.

한편, 역전사-중합효소연쇄반응을 종양유발인자-알파, 인터루킨-1베타, 인터루킨-6에 대한 primer (표 7)를 사용하여 실험예 5의 실험방법에 의해 진행하였다.

다만, extension을 종양유발인자-알파는 18번, 인터루킨-1베타와 인터루킨-6 는 23번 반응하였다.

<표 7> 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머

유전자명	프라이머 염기서열		절편크기	서열번호
TNF-α	F	5’-TTG ACC TCA GCG CTG AGT TG-3’	374 bp	1
TNF-α	R	5’-CCT GTA GCC CAC GTC GTA GC-3’	374 bp	2
IL-1b	F	5’-CAG GAT GAC ATG AGC ACC-3’	447 bp	3
IL-1b	R	5’-CTC TGC AGA CTC AAA CTC CAC-3’	447 bp	4
IL-6	F	5’-GTA CTC CAG AAG ACC AGA GG-3’	308 bp	5
IL-6	R	5’-TGC TGG TGA CAA CCA CGG CC-3’	308 bp	6
iNOS	F	5’-CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG CAG C-3’	496 bp	7
iNOS	R	5’-GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G-3'	496 bp	8
COX-2	F	5’-CAC TAC ATC CTG ACC CAC TT-3’	696 bp	9
COX-2	R	5’-ATG CTC CTG CTT GAG TAT GT-3’	696 bp	10
β-actin	F	5’-AGG CTG TGC TGT CCC TGT ATG C-3’	395 bp	11
β-actin	R	5’-ACC CAA GAA GGA AGG CTG GAA A-3’	395 bp	12

그 결과, 도 13, 14와 같이, 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)는 RAW 264.7세포에서 종양유발인자-알파, 인터루킨-1베타, 인터루킨-6 생성을 유도하였다.

그러나, 노빌레틴은 이들 전-염증성 사이토카인의 생성을 6 μM부터 유의성있게 감소시켰으며, 농도 의존적으로 억제하였다(도 13).

또한, 노빌레틴은 이들의 mRNA 발현도 농도의존적으로 억제하였다(도 14).

이 결과는 노빌레틴이 리포폴리사카라이드로 유도되는 종양유발인자-알파, 인터루킨-1베타 및 인터루킨-6의 mRNA 발현을 억제함으로써 이들의 생성을 억제한다는 것을 보여준다.

<실험예 7> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 핵전사인자-κB (NF-κB) 활성화에 대한 억제활성 실험

본 발명의 노빌레틴에 대한 핵전사인자-κB (NF-κB) 활성 저해능을 루시퍼 레이즈 (luciferase) 분석법을 사용하여 RAW 264.7 세포에서 평가하였다.

96well plate에 well당 2×10⁴개의 세포가 되도록 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 24 시간 동안 배양하였다.

FuGENE 6 transfection reagent (Roche, USA)을 이용하여 pNF-kB-Luc와 phRL-TK로 구성된 리포터벡터 혼합물을 세포에 도입시켰다.

24 시간 후에 6, 13, 25, 50 μM 노빌레틴과 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)를 동시처리하고 추가로 24 시간 동안 더 배양하였다.

루시퍼레이즈 활성을 Dual-Glo Luciferase Activity kit (Promega, USA)를 이용하여 luminometer (Berthold, Germany)로 측정하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)는 RAW 264.7세포에서 음성대조군보다 핵전사인자-κB의 활성을 약8배 정도 증가시켰다.

그러나, 노빌레틴은 핵전사인자-κB의 활성화를 6 μM부터 유의적으로 감소시켰으며 농도 의존적으로 활성을 억제하였다.

<실험예 8> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 핵전사인자-κB (NF-κB) 뉴클레오티드 결합 억제 활성 실험

24 시간 후에 노빌레틴(50 μM)과 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)를 동시처리하여 0, 30 혹은 60분 동안 추가로 배양하였다.

대조군에는 노빌레틴을 처리하지 않았다.

세포배양액을 제거 후, 차가운 인산완충용액을 첨가하여 세포를 현탁시키고, 미세원심분리 시험관으로 옮겼다.

시험관을 4500×g에서 3 분 동안 4 ℃에서 원심분리하여 세포를 수확한 후 핵추출물을 제조하였다.

핵추출은 NE-PERⓡ⁽Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents, PIERCE, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다.

핵전사인자-κB 결합 활성 분석은 Promega사의 전기영동 이동도 변화 분석 (Electrophoretic Mobility Shift Assay; EMSA) 시스템을 사용하여 분석하였다.

핵전사인자-κB가 결합하는 공통 뉴클레오티드 프로브 제작은 인산화 반응을 이용하여 표지하였다.

1 ㎕의 핵전사인자-κB 공통 올리고뉴클레오티드(1.75 pmol/㎕)에 1 ㎕의 T4 polynucleotide kinase 10?Buffer, 1 ㎕의 [γ-³²P]ATP (3,000 Ci/mmol), 5-10 unit의 T4 polynucleotide kinase를 첨가하고 최종 부피가 10 ㎕가 되게 nuclease-free water를 가하여 37 ℃에서 10 분간 반응하여 방사능표지 프로브를 제작하였다.

DNA 결합반응은 6 ㎍의 핵 단백질에 gel shift binding 5×buffer를 첨가하여 상온에서 10 분간 반응시킨 후 1 ㎕의 ³²P 표지된 핵전사인자-κB 프로브를 넣어 20 분간 반응시켰다.

DNA-단백질 복합체를 6 % DNA retardation 겔(Novex)에서 전기영동 시켰다. 겔을 건조한 다음 자동방사선 사진법에 의해 분석하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 대식세포주를 리포폴리사카라이드로 자극하였을 때, 30분 후에 핵전사인자-κB (p65/p50)의 뉴클레오티드 결합 활성이 증가하는 것이 관찰되었으며 이 결합 활성은 1시간 까지 지속되었다.

노빌레틴의 동시처리는 핵전사인자-κB (p65/p50)의 결합 활성을 30 분과 60 분에서 모두 억제시켰다.

<실험예 9> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 억제성-κB 분해 억제 및 합성 촉진 활성 실험

24 시간 후에 노빌레틴(50 μM)과 리포폴리사카라이드(100 ng/ml)를 동시처리하여 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150분 동안 추가로 배양하였다.

각 시간의 대조군에는 노빌레틴을 처리하지 않았다.

이후, 세포의 전체 단백질을 분리하고, 25 ㎍의 단백질을 12 % SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였다.

단백질을 PVDF 막으로 이전하고, 억제성-κB 단백질의 시간에 따른 변화와 이에 대한 노빌레틴의 영향을 관찰하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 억제성-κB 단백질은 리포폴리사카라이드에 의해 분해가 유도되었으며, 그 후 새로운 합성과 분해가 반복적으로 유도되었다.

그러나, 노빌레틴의 동시처리는 억제성-κB 단백질의 분해를 지연시켰으며, 또한, 새로운 억제성-κB 단백질의 합성을 촉진시켰다.

<실험예 10> 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴의 ERK1/2 활성화의 억제활성 실험

RAW 264.7 세포를 6-웰 플레이트(well plate)에 웰당 1×106세포수/ 2 mL가 되도록 분주하여 24 시간 동안 배양하였다.

24 시간 후에 노빌레틴(6, 13, 25, 50 μM)과 리포폴리사카라이드(100 ng/ml), 인터페론-감마(100 U/ml) 혹은 리포폴리사카라이드+인터페론-감마(10 ng/ml+10 U/ml)를 동시처리하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다.

단백질을 PVDF 막으로 이전하고, phosopho-ERK1/2에 대한 항체로 세포내의 ERK1/2의 활성화를 관찰하였다.

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 리포폴리사카라이드, 인터페론-감마 혹은 리포폴리사카라이드와 인터페론-감마 혼합 투여는 24 시간까지 지속적으로 ERK1/2를 인산화하여 활성화시켰다.

그러나, 노빌레틴의 동시처리는 이 활성화를 농도 의존적으로 억제시켰다.

본 발명에 의해 감귤류로부터 노빌레틴을 다량 함유하고 있는 감귤류를 분석하고, 그 감귤류로부터 노빌레틴 화합물을 고순도 분리 및 정제하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 감귤 유래 노빌레틴은 일산화질소, 프로스타글란딘 E₂, 종양괴사인자-알파, 인터루킨-1베타 및 인터루킨-6의 생성, 유도성 일산화질소 합성효소 및 사이클로옥시게나제-2의 단백질 및 mRNA의 발현, 억제성-κB-알파(I-κB-α)의 분해, 핵전사인자-κB(NF-κB)의 활성 및 ERK1/2의 활성화를 억제하여 염증인자로부터 기인하는 다수의 염증 질환에 효과적인 항염활성이 뛰어난 감귤 유래 노빌레틴이 제공된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

노빌레틴정제물의 제조방법에 있어서,

감귤의 과피와 과육을 분리하여 과피를 준비하는 제1공정,

감귤과피를 동결건조하고, 80 % 메탄올을 넣고 추출하는 제2공정,

메탄올추출물을 여과하는 제3공정,

이 여과물을 농축하는 제4공정,

이 메탄올추출농축물에 헥산(Hexane)과 물로 분배 추출하고, 그 중 물층을 에틸아세테이트(EtOAc)로 분배 추출하는 제5공정,

이 에틸아세테이트 추출물을 농축하여 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 제6공정,

이 에틸아세테이트 분획물을 순상 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 분획하는 제7공정,

제7공정에서 얻은 분획물을 박층크로마토그래피(TLC)를 실시하여 분획물을 분리하는 제8공정,

제8공정에서 분리된 분획물을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 노빌레틴 함량을 분석하여 가장 함량이 큰 분획물을 얻는 제9공정,

제9공정에서 선택된 분획물을 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 1차 정제하는 제10공정,

이 1차 정제한 노빌레틴을 다시 재순환 분취용 액체크로마토그래피를 이용하여 2차 정제하는 제11공정으로 구성된,

감귤 유래 노빌레틴정제물의 제조방법.
제1항에 있어서,

감귤은 진귤, 시퀘샤, 홍귤, 병귤, 세토카, 한라봉, 빈귤, 청견, 편귤, 감자, 이예감, 당유자 중 선택된 1종 이상인 것이 특징인,

감귤 유래 노빌레틴정제물의 제조방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 노빌레틴정제물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 개선 및 예방용 조성물.
제3항에 있어서,

일산화질소, 프로스타글란딘 E₂(prostaglandin E₂; PGE₂), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터루킨-1베타(interleukin-1β; IL-1β) 및 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6) 중 1 종 이상의 생성을 억제하는 것이 특징인,

염증질환 개선 및 예방용 조성물.
제3항에 있어서,

유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS)와 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2; COX-2) 중 선택된 1 종 이상의 단백질 및 mRNA 발현을 억제하는 것이 특징인,

염증질환 개선 및 예방용 조성물.
제3항에 있어서,

억제성-κB-알파(inhibitory-κB-α; I-κB-α)의 분해를 억제하고 합성을 촉진하며, 핵전사인자-κB(nuclear factor-κB; NF-κB)와 ERK1/2(the extra-cellular signal-activated kinases) 중 선택된 1 종 이상의 활성화를 억제하는 것이 특징인,

염증질환 개선 및 예방용 조성물.