KR100769576B1

KR100769576B1 - 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 ｔａｔ펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 이의 제조방법, 및이를 포함하는 피부 슬리밍 화장료 조성물

Info

Publication number: KR100769576B1
Application number: KR1020020014062A
Authority: KR
Inventors: 송영숙; 강내규; 박선규; 조완구; 강세훈
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2007-10-23
Also published as: KR20030026813A

Abstract

본 발명은 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 자가 침투신호를 갖는 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 피부 슬리밍 화장료 조성물에 관한 것이다. 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드는 높은 안정성과 우수한 피부 침투성을 가지므로, 우수한 지방 분해 효과 및 그 효과의 지속성을 향상시킨 피부 슬리밍제를 제공한다.

피부 슬리밍제, 지방 분해, 부갑상선 호르몬, Tat 펩타이드, Tat-hPTHDP 융합 펩타이드

Description

사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 ＴＡＴ 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 피부 슬리밍 화장료 조성물 {FUSION PEPTIDE COMPRISING TAT PEPTIDE AND HUMAN PARATHYROID HORMONE DERIVED PEPTIDE, ITS PREPARATION METHOD, AND SLIMMING COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 자가 세포침투성 Tat 펩타이드(transactivator of transcription peptide)가 결합된 융합 펩타이드, 및 이를 포함하는 피부 슬리밍 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 부갑상선 호르몬(human parathyroid hormone, hPTH)은 인체의 부갑상선에서 생산되는 84 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 호르몬으로서 신장과 뼈에서 칼슘의 향상성을 조절하는 기능을 하며, 소량만 인체에 투여하여도 신진대사나 뼈 형성에 영향을 미친다[Morel F., et. al., Academic press, 1983 39, 271 ; Norman, A.W. et. al., Endocrinal Rev., 1982 3, 336]. 이외에도 부갑상선 호르몬은 칼슘 조절, 혈관 수축, 림프 흐름, 아드레날린 조절 등의 역할, 및 지방분해를 촉진하는데, 특히 부갑상선 호르몬의 아미노산 서열 중 1에서 34까지의 아미노 산으로 이루어진 펩타이드가 사람의 지방 세포에 작용하여 지방 분해를 촉진한다는 연구 결과가 보고되었다[Werner S. et. al., Horm. Metab. Res., 1973 5, 292, Tanigushi A., et. al., J. Lip. Res., 1987 28, 490]. 부갑상선 호르몬이 지방 세포 수용체에 작용하면 cAMP 생성이 촉진되는 조절 메커니즘에 의해 지방 분해가 촉진된다고 보고를 통해서 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드가 슬리밍에 효과가 있을 것으로 예상되어 여러 펩타이드를 합성하여 스크리닝한 결과, 부갑상선 호르몬의 아미노산 서열 9-19, 12-16, 및 12-14 서열의 펩타이드가 슬리밍에 효과가 있음이 밝혀졌다(프랑스 특허출원 제 2788058호, PCT 공개공보 WO 00/40611, Richard L., et. al., S.P.C. 2001, Dec, 30). 그러나 이들 펩타이드는 수용성의 물성으로 인하여 피부흡수력이 미약하여 지방분해 효과를 크게 기대하기 어렵다는 단점을 가지고 있어, 외피로부터의 흡수력이 증가되어 생체 내에서의 슬리밍 효과가 극대화된 새로운 피부 슬리밍제의 개발이 시급하다고 하겠다.

이러한 펩타이드 슬리밍제의 피부 흡수를 증가시키기 위한 하나의 방법으로, 펩타이드의 지용성을 증가시키기 위해 펩타이드에 팔미틴산 등 긴 사슬의 지방산을 그래프팅하는 방법(프랑스 특허출원 제 2788058호, PCT 공개공보 WO 00/40611호)이 제시되었으나, 그 흡수 증대효과는 크게 개선되어진 수준이 아니었다.

따라서 피부에 자극이 없고, 외피로부터의 흡수력이 증가되고, 안정성이 향상, 및 생체 내에서의 슬리밍 효과가 극대화된 새로운 피부 슬리밍제에 대한 연구와 개발이 필요한 실정이다.

상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 비자극성이고, 외피와 내피에 쉽고 안전하게 침투하면서도 피부질환의 유발 문제가 없고, 우수한 지방 분해 효과를 지속적으로 갖는, 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 자가 세포침투성질을 가지는 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 상기 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다

본 발명의 또 다른 목적은 세포침투성이 우수하고, 지방분해 효과 및 그 지속성이 우수한, 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 상기 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 슬리밍 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드(Tat-hPTHDP)를 제공한다:

상기 식에서, []_Tat는 자가 세포침투성 Tat 펩타이드로서, R₁은 글루타민, 라이신, 알지닌, 및 글리신의 곁사슬(side chain)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되며, n은 4 내지 12 범위의 정수이고,

[]_hPTHDP는 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드로서, 서열번호 1에 나타난 펩타이드 중 연속적인 3 내지 34 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고, R₂는 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산의 곁사슬이며, m은 3 내지 34 범위의 정수이다.

이하에서 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드(Tat-hPTHDP)를 제공하고자 한다.

[화학식 1]

상기 식에서, []_Tat는 자가 세포침투성 Tat 펩타이드로서, ( )_n 속의 화학식은 아미노산 서열을 나타내며, R₁은 글루타민, 라이신, 알지닌, 및 글리신의 곁사슬로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되며, n은 4 내지 12 범위의 정수이다.

상기 식에서, []_hPTHDP는 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드로서, 서열번호 1에 나타난 펩타이드 중 연속적인 3 내지 34 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고(m = 3∼34), 바람직하게는 서열번호 1에 나타난 펩타이드 중 연속적인 3 내지 11 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고(m = 3∼11), 예컨대 서열번호 2의 펩타이드 또는 서열번호 3의 펩타이드의 전부 또는 일부를 포함하는 펩타이드이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 4의 펩타이드(m = 6), 서열번호 5의 펩타이드(m = 5), 또는 서열번호 6의 펩타이드(m = 3)이고, R₂는 상기 펩타이드를 구상하는 아미노산의 곁사슬이고, m은 3 내지 34 범위의 정수이다.

상기 사람의 부갑상선 호르몬의 아미노산 1 내지 34 번까지의 서열은 다음과 같으며, 이 서열은 또한 서열번호 1에 나타낸다.

N-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-C

본 발명에 사용된 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드(hPTHDP; human parathyroid hormone derived peptide)는 하기 화학식 2로 표시된다:

사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드는 서열번호 1에 나타난 펩타이 드 중 연속적인 3 내지 34 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고(m = 3∼34), 바람직하게는 서열번호 1에 나타난 펩타이드 중 연속적인 3 내지 11 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고(m = 3∼10), 예컨대 서열번호 2의 펩타이드 또는 서열번호 3의 펩타이드의 전부 또는 일부를 포함하는 펩타이드이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 4의 펩타이드(m = 6), 서열번호 5의 펩타이드(m = 5), 또는 서열번호 6의 펩타이드(m = 3)이고, R₂는 상기 펩타이드의 곁사슬이고, m은 3 내지 34 범위의 정수이다.

보다 구체적으로, 서열번호 1번에 나타난 펩타이드의 전부 또는 일부이거나, 아미노산 1번에서 10번인 서열번호 2의 펩타이드(hPTH 1-10, Ser-Val-Ser-Vlu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn), 또는 아미노산 9번에서 19번인 서열번호 3의 펩타이드(hPTH 9-19, His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu)를 전부 또는 일부를 포함하거나, 아미노산 1번에서 6번인 서열번호 4의 펩타이드(hPTH 1-6, Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln), 아미노산 12번에서 16번인 서열번호 5의 펩타이드(hPTH 12-16, Gly-Lys-His-Leu-Asn)와 아미노산 12번에서 14번인 서열번호 6의 펩타이드(hPTH 12-14, Gly-Lys-His)이다.

최근 다양한 인체의 질환이 세포 단백질의 비정상적인 활성에 기인한다는 사실에 따라 이들 단백질의 활성을 조절함으로써 치명적인 인체질환을 치료할 수 있는 물질의 개발이 전 세계적으로 관심의 대상이 되고 있다. 그러나 펩타이드와 단백질은 다른 화합물에 비하여 생리작용에 대한 선택성과 효용성이 매우 우수함에도 불구하고, 세포내부로 직접 전달이 어렵다는 단점 때문에 효과적인 약물 전달 수단으로서의 실용화가 현실적으로 어려운 실정이었다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 최근에는 중요한 생리활성을 갖는 다양한 생체 기능 단백질을 세포내로 효율적으로 침투시키는 단백질 침투 기술(protein penetration technology)을 이용함으로써 인체 질환 치료에 필요한 물질을 직접적이고 효율적으로 전달 또는 흡수시킬 수 있게 되었다. 상기 단백질 침투기술은 자가 침투신호(self-penetration)를 갖는 인간 면역결핍 바이러스(HIV: Human Immunodeficiency Virus type-1)가 가지는 단백질의 일종인 Tat 펩타이드가 자발적으로 세포막을 통과하여 쉽게 세포내로 침투 및 이동하는 특성을 이용하는 경우가 대표적이다. 이러한 기능은 Tat 펩타이드 서열의 중간 부위인 단백질 형질도입 부위(protein transduction domain)의 특성 때문에 나타나며, 아직 그 정확한 메카니즘(mechanism)은 알려지지 않은 상태이다(Frankel, A.D. and Pabo, C.O.(1988) Cell 55, 1189-1193. Green, M. and Loewenstein, P.M.(1988) Cell 55, 1179-1188. Ma, M. and Nath, A.(1997) J. Virol. 71, 2495-2499. Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B.(1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017.).

본 발명자들은 상기와 같은 Tat 펩타이드의 세포침투특성에 주시하여 연구한 결과, 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드와 같은 원하는 피부 활성 성분을 자가 침투신호를 갖는 Tat 펩타이드에 화학적으로 공유 결합시킴으로써 이들 융합 펩타이드를 피부 내 세포로 직접적이고 효율적으로 침투시키는 사실을 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서 사용된 자가 세포침투성 Tat 펩타이드는 Tat 펩타이드 그 자체 또는 이로부터 유래된 펩타이드를 나타내며, 상기 Tat 펩타이드 또는 이로부터 유래된 펩타이드는 그 자체 또는 이와 결합된 물질과 함께 세포침투능을 갖는 펩타이드를 말한다.

구체적으로 HIV Type-1(human immunodeficiency virus)의 Tat 펩타이드의 주요 특징은 전체 단백질 중 N-말단의 구간내 펩타이드 서열부위가 침투하고자 하는 세포의 지질막(lipid barrier)을 여는 신호를 갖고 있다는 것이며, 그 서열은 다음과 같으며, 이 서열은 또한 서열번호 7에 나타낸다.

Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(또는 RKKRRQRRR)

자가 세포침투성 Tat 펩타이드의 구성 아미노산은 20 개의 아미노산 중에 라이신(lysine, 이하, Lys 또는 K이라 함), 알지닌(arginine, 이하, Arg 또는 R이라 함), 글루타민(glutamine, 이하, Gln 또는 Q이라 함) 등은 모두 구조적으로 아민기(amine group)와 카르복실기(carboxyl group)를 가지고 있기 때문에, 알코올과의 반응을 통하여 카르복실기와 에스테르화(esterfication) 반응으로 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래된 펩타이드와 결합시킬 수 있다. 본 발명의 대표적인 자가 세포침투성 Tat 펩타이드(n = 9)로는 서열번호 7의 Tat 펩타이드(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg 또는 RKKRRQRRR), 서열번호 8의 Tat 펩타이드(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys 또는 KKKKKKKKK), 서열번호 9의 펩타이드(Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg 또는 RRRRRRRRR) 등이며, 이들은 hPTHDP와 축합 반응으로 화학적으로 결합될 수 있다.

상기 자가 세포침투성 Tat 펩타이드는 하기 화학식 3으로 표시된다:

상기 R₁은 글루타민(glutamine : Gln), 라이신(lysine : Lys), 알지닌(arginine : Arg), 및 글리신 (glycine : Gly)의 곁사슬로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 종 이상의 치환기이며, 상기 Tat 펩타이드는 4개 아미노산 내지 12개 아미노산으로 이루어지는 펩타이드이며, 더욱 바람직하게는 라이신 및 알지닌으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이다. 또한 상기 화학식 3 중에서 n은 4 내지 12인 정수이며, 더욱 바람직하게는 8 내지 10이며, 가장 바람직하게는 n이 9인 것이다.

본 발명은 자가 세포침투성 Tat 펩타이드에 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래된 펩타이드(hPTHDP)를 결합시킨 융합 펩타이드(Tat-hPTHDP)를 제조하는 방법을 제공한다.

더욱 자세하게는, 본 발명의 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 제조는 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다.

첫째는 재조합 발현벡터를 이용하는 생물학적 방법으로서, (a) HIV-1 Tat 유전자가 포함되어 있는 발현벡터인 pSVC21로부터 자가 침투신호 영역을 가지는 N-말단부위(N-terminal)를 6 개의 히스티딘 택(6 His tag)이 포함되어진 단백질 발현벡 터(expression vector)인 pET 벡터에 PCR(polymer chain reaction) 기법을 이용하여 HIV-1의 Tat 유전자를 클로닝(cloning)하여 융합 단백질의 형태로 발현시킬 수 있는 벡터를 제조하는 단계, 그리고 (b) 상기 pET-Tat 발현 벡터를 이용하여 대장균 내에서의 재조합 His-Tat-hPTHDP 펩타이드의 형태로 대량 발현시킨 후, 순수 분리 정제하는 단계를 포함하는 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 제조방법이다.

둘째, (a) pET-Tat-hPTHDP 발현 벡터에 목표 단백질(target protein), 예컨대 카탈라제(catalase) 또는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 등을 삽입하여 His-Tat-hPTHDP 목표단백질의 융합단백질로 대량 발현하고 순수 분리 정제하는 단계를 포함하는 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 제조방법이다.

셋째, 펩타이드 합성용 유기합성기기를 이용하여 순수한 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드를 합성하는 방법이다. 이 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 제조법은 Merrifield의 고체상(solid phase) 펩타이드 합성법으로(J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154(1963)) ABI사의 펩타이드 합성기를(Model 431A)를 이용하여 글루타민(Gln), 라이신(Lys), 알지닌(Arg), 및 글리신(Gly)으로 이루어지는 군으로부터 1 종 이상 선택한 아미노산을 갖는 Tat 펩타이드를 포함하는 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 아미노산의 C-말단과 N-말단의 반응성을 갖는 모노머를 축합 반응시켜 합성하였다.

고체상 합성은 적당한 레진에 α-아미노기가 보호된 아미노산을 카르복실 말단의 아미노산부터 커플링(coupling)시킴으로서 시작된다. 이때 α-아미노기가 보호된 아미노산을 히드록시 메틸 레진이나 클로로메틸레이티드 레진에 에스테르 결 합으로 붙인다. α-아미노기를 보호하는 그룹으로는 Fmoc(9-fluorenyl methoxycarbonyl)이나 Boc(t-butyloxycarbonyl)을 사용하고 Fmoc으로 보호된 아미노산은 ABI나 Pharmacia사 혹은 Calbiochem사를 통해 구입하였다. 아미노산 잔기가 반응성이 있는 아미노산은, 예컨대 Arg 잔기의 아미노 그룹이나 Gly, Lys, Gln의 반응성 잔기는 트리틸(Trt), 4-메톡시-2,3,트리메틸벤젠 술포닐(Mrt), 터르-부틸(t-Bu)과 같은 적당한 그룹으로 보호된 Fmoc-아미노산을 이용한다. 펩타이드 합성은 고체 지지체(solid support) 레진에 붙어있는 펩타이드 체인의 아미노 말단에 순차적으로 α-아미노기가 보호된 아미노산을 활성화시킨 후 커플링시키며, 합성이 끝나면 레진으로부터 펩타이드를 절단하고, 보호그룹은 트리플로오로아세트산(TPA)과 같은 시약으로 제거한다. 펩타이드는 TFA 용액으로부터 여과나 원심분리 또는 디에틸에테르로 추출하여 분리하며 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)나 다른 방법으로 정제할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 상기 화학식 1로 표시되는 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드는 화학적인 안정성, 지방 분해 효과와 그의 지속성, 및 안전성이 우수한 피부 슬리밍제로서 사용될 수 있다. 이에 대한 자세한 활성 평가는 실시예에서 기술한다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 피부 슬리밍 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물을 0.000001 내지 5.0 중량%를 함유한다. 0.000001 중량% 미만으로 포함하는 경우에는 실질적인 슬리밍 효과를 기대하기 어렵고, 5.0 중량%를 초과할 경우에는 제형 및 제품의 안정성에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있기 때문이다.

본 발명이 적용될 수 있는 화장품의 종류에는 특별히 제한이 없으며, 통상적인 화장품 제형이 모두 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 피부외용연고나, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형으로 제조될 수 있다. 여기에서 피부외용연고는 화학식 1로 표시되는 화합물의 유효성분 이외에 바셀린 50.0 내지 97.0 중량%, 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1 내지 5.0 중량%를 함유하도록 제조되며, 유연화장수는 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 다가알콜류 1.0 내지 10.0 중량%, 및 폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 등의 계면활성제 0.05 내지 2.0 중량%를 함유하도록 제조된다. 영양화장수 및 영양크림은 화학식 1로 표시되는 화합물의 유효성분 이외에 스쿠알란, 바셀린, 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5.0 내지 20.0 중량%, 및 세탄올, 스테아릴알콜, 밀납 등의 왁스성분 3.0 내지 15.0 중량%을 함유하고, 에센스는 글리세린, 프로필렌글리콜 등 다가알콜류 5.0 내지 30.0 중량%를 함유한다. 마사지크림은 화학식 1로 표시되는 화합물의 유효성분 이외에 유동파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일을 30.0 내지 70.0 중량% 함유하여 제조되며, 팩은 폴리비닐알콜을 5.0 내지 20.0 중량% 함유하는 필오프(peel off) 팩 또는 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5.0 내지 30.0 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조된다.

한편, 또한 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 피부 슬 리밍 화장료 조성물은 일반 피부화장료에 배합되는 보통의 성분, 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

본 발명의 화합물의 생리활성을 확인하기 위하여 실시된 경피 흡수 실험, 피부 자극성 실험, 지방분해 효과, 및 슬리밍 효과를 수행한 결과, 본 발명의 화합물은 우수한 경피흡수력을 가지며, 지방분해 효과, 슬리밍 효과 등의 실험에서 우수한 효과가 있음이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 그의 활성도와 비자극성, 피부 흡수력이 뛰어난 슬리밍 효과 지속성에 기인하여 화장품의 크림, 로션, 겔 등의 모든 형태로 첨가하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 다음의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: Tat-hPTHDP 융합 펩타이드(KKKKKKKKKGKH)의 제조

(1) Tat-PTHDP 융합 펩타이드의 제조

본 발명에 사용된 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드는 KKKKKKKKKGKH 서열을 가지는 12개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며, 그의 합성은 펩타이드 자동합성기(Applied Biosystems Model 431A)를 이용하여 고체상(solid phase) 펩타이드 합성법으로 합성하였다. 0.25 mmol의 파라히드록시 메틸페닐옥시메칠 폴리스티렌(HMP) 레진을 표준 반응용기(38 mL)에 넣고, 합성하려는 펩타이드의 카르복시 말단의 Fmoc-아미노산을 넣고 합성을 시작하였다. 1 mmol의 Fmoc-아미노산이 들어있는 카트리지를 카르복실 말단 아미노산에서부터 아미노산 말단의 아미노산까지 배열순서대로 가이드웨이에 배열한다. 이때 카트리지의 금속 뚜껑을 제거하고 맨 처음과 맨 끝에는 아미노산이 들어있지 않은 빈카트리지를 놓았다.

펩타이드 합성은 ABI사에서 개발한 표준 스케일 Fmoc 커플링 프로토콜(protocol)에 따라 시행 전에 파라메타를 편집하고 자동합성 메뉴에 따라 시행하였다(ABI User's Manual. Jan, 1992 참조). 표준 스케일 Fmoc을 사용할 때는 디프로텍션(deprotection)을 N-메틸 피롤리딘(NMP)으로 희석한 20 % 피페리딘을 사용하여 21 분 동안 수행하였으며, NMP로 9 분 동안 세척하고 커플링을 71 분 동안 실시하였다. 커플링에는 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT)을 사용하였고 NMP로 7 분간 세척하는 시스템을 이용하였다.

(2) 상기 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 분리 및 정제

합성이 완료된 후 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 분리는 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 고체 지지체(solid support)로부터 분리해내고, ABI사 매뉴얼(Introduction to Cleavage Techniques, P6-19(1990))을 참고로 하여 펩타이드를 분리하였다. 즉 합성이 끝나면 펩타이드가 붙은 레진을 둥근 플라스크에 넣고 냉각시킨 후, 결정 페놀 0.75 g, 1,2-에탄디티올(EDT) 0.25 mL, 티오아니솔 0.5 mL, 증류수 0.5 mL, 및 TFA 10 mL를 넣고 뚜껑을 닫고 실온에서 1∼2 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 레진과 반응액을 규화(sintered) 유리 깔대기를 통해 저진공으로 여과하여 레진과 펩타이드 용액을 분리하였다. 플라스크와 유 리 깔대기를 5∼10 mL 디클로로메탄(DCM)으로 씻어 이 용액이 펩타이드 용액과 섞이게 하였으며, 50 mL 이상의 차가운 디에틸에티르를 첨가하여 펩타이드의 침전물을 얻었다. 이 침전물을 저진공으로 깔대기로 여과하여 깔대기 위에 모아진 침전물을 건조시킨 후, 30 % 초산에 녹여 냉동 건조시켰다. 이렇게 하여 얻어진 펩타이드를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였다. 이때 칼럼은 C₁₈ analytical column(Pharmacia)을 사용하였으며, 완충용액 A는 10 % 아세토니트닐 + 0.05 % TFA를 사용하여 평형화시키고, 완충용액 B는 80 % 아세토니트닐 + 0.05 % TFA를 사용하여 펩타이드를 용출하였다. 그 결과 고순도로 정제된 펩타이드를 얻었으며 합성수율은 30 ±5 % 정도였다.

실시예 2. 지방 분해 효과 시험

상기 실시예 1에서 제조된 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 피부 슬리밍(slimming)제로서의 유용성을 측정하기 위하여, 지방분해 효과를 실험하였다.

지방분해능(lipolysis) 평가는 지방분해시에 지방세포가 글리세롤을 분비한다는 성질을 이용하였다. 이 시험에서는 전지방세포(pre-adipocyte)인 3T3-L1 세포를 이용하였다. 3T3-L1 세포를 24-웰 플레이트에 2 ㎍/mL의 인슐린(insulin), 2 ㎛의 덱사메타손(dexamethasone), 111 ㎍/mL의 이소부틸메틸크산틴(isobutylmethylxanthine)을 처리한 배지에서 48 시간 배양한 후, 2 ㎍/mL의 인슐린이 처리된 배지로 약 9 일 동안 배양하여 3T3-L1 세포가 지방 세포로 분화되어 지방이 세포내에 충분히 축적된 다음, 여기에 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물을 적용하여 24 시간 배양하였다.

이때 대조군(blank)으로는 시료를 적용하는 대신 완충액만을 0.1 mL 첨가한 것으로 하였으며, 비교군(control)으로는 지방분해 효과가 우수한 물질로 알려진 이소프로테놀(isoprotenol)을 이용하였다(Dawn L. Brasaemle et. al Biochimi. Biophys. Acta 1483 (2000) 251∼262). 그 후 배양액 중 50 ㎕을 혼합하여 37 ℃에서 24 시간 반응시켰으며, 분광광도계(spectrophotometer, Beckman DU-7500)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하여 지방 분해 증가율을 계산하였다. 증가율을 산정하는 식은 하기에 나타낸 바와 같으며, 그 결과는 표 1과 같다.

A : 증가제가 첨가되지 않은 것의 540 nm에서의 흡광도

B : 증가제가 첨가된 것의 540 nm에서의 흡광도

구분	농도 (M)	지방분해 증가율 (%)
화학식 1로 표시되는 화합물	10^-8	8.6
	10^-7	17.4
	10^-6	10.3
	10^-5	43.4
이소프로테놀 (isoprotenol)	10^-8	17.3
	10^-7	34.5
	10^-6	39.0
	10^-5	12.5

실험 결과, 본 발명에 사용된 화학식 1로 표시되는 화합물은 10^-5 M의 농도에서 43 %의 증가율로 호르몬제제인 이소프로테놀과 유사한 지방 분해 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 슬리밍 효과에 대한 임상실험

슬리밍 효과를 알아보기 위하여 허벅지에 국부비만 또는 셀룰라이트(cellulite)가 있는 18∼46 세 된 건강한 성인 여성 5 명을 대상으로 임상실험을 실시하였다(Method of testing primary irritant substances 38(187): pp1500-1541).

시료는 상기 실시예 1에서 제조된 융합펩타이드를 수중유형 화합물(O/W emulsion)을 제조하여 시험하였다. 한쪽 다리에는 대조군(시료가 없는 수중유형 유화물)을, 다른 한쪽 다리에는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 포함하는 수중유형 유화물을 한 달 동안 도포한 후, 지방층 두께를 영상분석기로 정량화하였다.

실험 결과, 본 발명에 사용된 화학식 1로 표시되는 화합물은 18%의 지방층 감소로 슬리밍 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 경피흡수(피부 세포내 침투) 실험

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 피부 세포내 침투, 이를 통상적으로 경피흡수라 하므로 본 명세서에서는 경피흡수로 통칭한다. 경피흡수 실험은, 실시예 1에서 제조된 융합펩타이드를 사용하여 실험하였다.(참고문헌: LehmanPA, Slattery JT, Franz TJ. Percutaneous absorption of retinoids : Influence of vehicle, light exposure, and dose, J. Invest Dermatol., 91; 56-61, 1988).

자세하게는, 8 주령의 암컷 누드 마우스의 등 부위 피부를 1.7 ㎠ 크기로 절취하고, 상기 융합 펩타이드를 적용한 후 경피흡수 측정기기(Franz cell)를 이용하여 24 시간 후 수용기(receptor) 용액과 생쥐의 등 부위 피부에 흡수된 물질을 추출하여 고압 액체크로마토그래피(HPLC)와 매tm 액체크로마토그래피(LC mass)로 정량 분석하여, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물이 경피 흡수된 량을 정량하였다. 실험 결과, 본 발명에 사용된 화학식 1로 표시되는 화합물의 경피흡수율이 우수함을 알 수 있었다.

실시예 5. Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 알러지 테스트(LLNA)

화장품 원료로서의 화학식 1로 표시되는 화합물에 대한 안전성 실험으로는 운반 매개물로 에탄올을 사용하는 실험법을 택하였다[참고문헌 : Kimber Ⅰ(1990) : Identification of contact allergens using the murine local lymph node assay, J. Appl. Toxicol. 10(3); 173-180]. 화학식 1로 표시되는 화합물을 각각 0.5 %, 1.0 % 용액으로 제조 시행하였다. 즉 생쥐(Balb/c)의 양쪽 귀에 50 ㎕씩 3 일간 발라준 후 쥐로부터 이개임파절(auricular lymph node)을 분리하였다. 임파절을 분쇄하여 단일세포 상태로 만든 후 방사성 동위원소인 [³H]-메틸티미딘([³H]-methyl thymidine)을 첨가하여 24 시간 배양한 다음, β-신틸레이션 계수기(scintillation counter(Beckman LS 6000 TA, USA))를 이용하여 세포의 증폭 도(dpm, disintegrations per minute)를 측정한 결과, 본 발명에 사용된 화학식 1로 표시되는 화합물은 대조군에 비해 낮은 알러지 유발가능성을 나타내었다.

실시예 6. Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 피부 자극성 시험

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 피부 자극성 시험을 위하여, 기니아 피그(Guinea Pig)를 이용한 첩포 시험(patch test)을 수행하였다[참고문헌 : ①Draize, J.H.(1959) : Dermal toxicity. Assoc. Food and Drug officials, US. Appraisal of the safety of chemicals in Food, Drugs and Cosmetics., pp46-59, Texas State Dept. of Health, Austin, Texas. ② Federal Register(1973) : Method of testing primary irritant substances 38(187) : pp1500-1541]. 시료는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 여러 농도로 수중유형 유화물을 제조하여 시험하였다.

먼저 시료 도포 부위인 등 부위의 털을 제거하고 피부 자극을 최소화하기 위해 24 시간 동안 환경 적응을 시킨 후, 시료 도포 부위를 설정(1.5 ㎝ ×1.5 ㎝)한 후, 시료와 거즈를 적용하고 시료의 증발 및 손실을 방지하기 위해 고형 재질의 박지로 밀봉한 다음 탄력붕대로 48 시간 동안 고정하였다. 폐쇄첩포 제거 후 2 시간, 24 시간(첩포 후 48 시간, 72 시간)째 자극의 정도를 판정하여 자극지수(PII: primary cutaneous irritation index)와 자극도를 표 2에 나타내었다.

시료	농도 (%)	자극지수 (PII)	자극도
대조군	-	0.60	미세자극
화학식 1로 표시되는 화합물	0.01	0.62	미세자극
	0.1	0.65	미세자극
	0.5	0.71	미세자극

상기 표 2를 통하여, 본 발명에 사용된 화학식 1로 표시되는 화합물은 피부에 매우 안전함을 확인할 수 있었다.

실시예 7. Tat-hPTHDP 융합 펩타이드의 세포독성 시험

화장품에 사용되는 원료로서의 1차 안전성을 검증하고자 화학식 1로 표시되는 화합물에 대하여 V79-4 세포(차이니스 햄스터, 폐 조직 섬유아세포의 연속 세포주)를 배양하여 MTT 시험[참고 문헌 : Mossman T.(1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth & survival : application to proliferation & cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63]을 수행하여 독성을 시험한 결과, 화학식 1로 표시되는 화합물은 0.1의 농도(%, w/v) 이상에서는 점차 아주 약한 독성을 나타내었으나, 0.01 이하의 농도(%, w/v)에서는 거의 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

본 발명의 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드에 자가 침투신호를 갖는 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 Tat-hPTHDP 융합 펩타이드, 그리고 이를 포함하는 피부 슬리밍제를 제공하여, 본 발명의 슬리밍제는 자가 세포침투성 Tat 펩타이드의 존재로 인해, 기존의 hPTHDP에 비해, 피부에 대한 흡수력이 뛰어나고, 비자극성이며, 우수한 지방 분해 효과 및 그 효과의 지속성을 갖는 장점이 있다.

<110> LG HOISEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> FUSION PEPTIDE COMPRISING TAT PEPTIDE TO HUMAN PARATHYROID HORMONE DERIVED PEPTIDE, ITS PREPARATION METHOD, AND SLIMMING COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> DPP020537 <150> 10-2001-60245KR <151> 2001-09-27 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPTHDP sequence <400> 1 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Gln Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPTHDP sequence <400> 2 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPTHDP sequence <400> 3 His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPTHDP sequence <400> 4 Ser Val Ser Glu Ile Gln 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPTHDP sequence <400> 5 Gly Lys His Leu Asn 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPTHDP sequence <400> 6 Gly Lys His 1 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat peptide sequence <400> 7 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat peptide sequence <400> 8 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat peptide sequence <400> 9 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-hPTHDP sequence <400> 10 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Lys His 1 5 10

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 사람의 부갑상선 호르몬에서 유래한 펩타이드(hPTHDP)에 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드(Tat-hPTHDP):

[화학식 1]

상기 식에서, []_Tat는 서열번호 8의 펩타이드 또는 서열번호 9의 펩타이드이고,

[]_hPTHDP는 서열번호 2의 펩타이드, 서열번호 3의 펩타이드, 서열번호 4의 펩타이드, 서열번호 5의 펩타이드 및 서열번호 6의 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 펩타이드.
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제 1 항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 슬리밍 화장료 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 제 1 항에 따른 화합물을 0.000001 내지 5.0 중량%로 포함하는 피부 슬리밍 화장료 조성물.