KR100762202B1 - 용혈성 미생물을 선택적으로 탐지하는 방법 - Google Patents

용혈성 미생물을 선택적으로 탐지하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 용혈성 미생물을 선택적으로 탐지하는 방법 및 이에 이용되는 바이오센서 시스템에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 사용하여 용혈성 미생물에 의하여 리포좀이 파괴 또는 변형되는 현상을 이용하여 특정 미생물의 존재에 의한 신호를 탐지함으로써 미생물을 선택적으로 진단하는 방법 및 (1) 표준 미생물 시료; (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀; (3) 신호 측정기; (4) 각종 반응 용액; 및 (5) 완충용액들로 구성된 미생물에 대한 진단용 바이오센서에 관한 것으로서, 본 발명의 진단 방법 및 진단용 바이오센서는 병원성 미생물이 존재하는 때에만 선택적으로 반응 신호를 전달할 수 있으므로 용혈성 미생물 관련 질환을 간편하게 진단하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.
용혈성 미생물, 진단용 바이오센서, 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀, 용혈성 미생물 관련 질환

Description

용혈성 미생물을 선택적으로 탐지하는 방법 {A method for selective detection of hemolytic bacteria}
도 1은 본 발명의 미생물에 인해 발생한 전류를 측정하는 장치를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 리포좀을 이용하여 미생물에 의해 발생한 전류를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 리포좀을 이용하여 비용혈성 대장균 NCIB 10772 균주의 존재 하에 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주에 의해 발생한 전류를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명의 리포좀을 이용하여 용혈성 대장균 MC4100-pLG570-hly + 균주에 의해 발생한 전류를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 다중 라멜라 소포체 (MLVs) 및 단일 라멜라 소포체 (SUVs)를 이용하여 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주를 탐지한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 리포좀을 이용하여 비용혈성 대장균 NCIB 10772 균주의 존재 하에 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주를 탐지한 결과를 나타 낸 것이다.
도 6은 본 발명의 DCPIP 가 삽입된 리포좀 또는 DCPIP 가 포집된 리포좀을 이용하여 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주를 전기화학적으로 탐지한 결과를 각각 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 용혈성 미생물에 의한 전류 신호의 발생 과정으로 모식적으로 나타낸 것이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1: 작동 전극 2: 상대 전극
3: 러그인 모세관에 대한 기준 전극 4: 내부 셀의 질소 입구
5: 내부 셀의 시료 주입구 6: 내부 셀의 질소 출구
7: 외부 셀의 질소 입구 8: 외부 셀의 시료 주입구
9: 질소 출구 10: 물 입구
11: 물 출구 12: 자기 교반기
13: 내부 셀 격막
21: 매개물질이 포집된 리포좀
22: 미생물 효소의 작용에 의한 매개물질의 분비
23: 신호 측정기에서 환원된 매개물질에 의한 신호 발생
본 발명은 미생물에 특이적으로 반응하는 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 사용하여 특정 미생물의 존재에 의한 신호를 탐지함으로써, 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 방법 및 (1) 표준 미생물 시료; (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀; (3) 신호 측정기; (4) 각종 반응 용액; 및 (5) 완충용액들로 구성된 병원성 미생물에 대한 진단용 바이오센서에 관한 것이다.
식품 및 음료수 분야, 임상미생물 연구 분야 그리고 환경 감시 분야에 있어서 세균을 찾아내고 그 숫자를 측정하는 것은 매우 중요하나 (수에히로, J. 등, Sens. Actuators B: Chem ., 109: 209 ~ 216, 2005), 기존에 사용된 방법은 느리고 부정확하다. 구체적으로, 콜로니 측정 (colony counting) 및 중합효소 연쇄반응 (PCR) 등은 시간이 오래 걸리고 지속적인 관찰이 불가능하기 때문에 보다 빠르면서 지속적인 관찰도 가능한 새로운 방법이 요구된다 (캐디, N. C. 등, Sens. Actuators B: Chem ., 107: 332 ~ 341, 2005).
최근 들어 미생물 검사에 관한 새로운 방법이 계속 연구되고 있는 바, 신속하고 정확하며 심지어 세균의 동정도 가능한 탐지 방법을 개발하기에 이르렀다. 그럼에도 불구하고, 병원성 미생물을 진단하는 연구 분야는 아직 미흡하며, 그 이유는 병원성 미생물이 비병원성 미생물들 사이에도 많이 존재하여 다른 미생물들에 의한 신호 증가와 구별하는 것이 어렵기 때문이다.
게다가 개발되고 있는 진단 방법은 비교적 복잡한 전처리 과정을 거쳐야 하며 현장에서 간단히 측정하기에는 그 방법이 복잡하기 때문에 보다 간편한 병원성 미생물 검색 및 측정 방법의 개발이 또한 요구되고 있다.
지금까지 병원성 미생물을 탐지하는 방법으로는 다양한 전류 측정 센서 (amperometric sensor)가 제안되어 있다. 구체적으로, 미생물의 대사 과정에서 발생한 전자는 매개물질이 받아 환원되고 다시 일정 전압이 인가되어 있는 전극에서 산화되며, 이와 같이 전극으로 전달된 전자는 외부 회로를 통해 전류를 발생시키는 과정을 거친다. 이러한 산화-환원 반응을 통해 발생한 전류를 대입하고 상호 비교하여 일정량의 매개물질을 이용할 때 발생하는 전류 값을 측정하면 미생물의 농도를 확인할 수 있다.
그러나, 상기와 같이 기본 원리가 대략적으로 정립되고 이러한 방법이 미생물 탐지에 있어서 다양한 장점이 있음에도 불구하고, 간편하게 자동으로 분석되는 센서 또는 센서 시스템으로 개발되거나 상기 센서의 감도를 향상시키는 측면에서 많은 제한이 있어 왔다.
한편, 용혈성 (hemolytic activity)은 혈액내의 존재하는 적혈구 등의 세포를 파괴하는 능력을 말한다. 이러한 용혈성은 병원성 미생물인 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes), 스테파이로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 대장균 (Escherichia coli H5 O157) 균주 등이 가지고 있 으며, 이들 병원성 미생물이 생산하는 각종 독소 및 효소의 작용에 의해 발생하는 것으로 보고되어 있다.
따라서, 용혈성 미생물에서 발생하는 독소 및 효소가 파괴할 수 있는 구조물, 즉 상기에서 기술한 바와 같은 리포좀에 각종 염료 또는 전자전달 매개체 (electrochemical mediator)를 포집한 다음 병원성 미생물을 혼합하게 되면 미생물이 생산하는 독소 또는 효소에 의하여 그 내용물이 외부로 유출될 수 있다. 그 결과, 유출된 내용물은 외부에서 주입한 특정 시약과 혼합되면 특정 발색을 유발하여 병원성 미생물의 존재를 확인하는 데 이용될 수 있다. 이와 같이 리포좀에 특정 발색 시약을 포집시키는 이외에도, 리포좀에 전자 전달 매개체를 사용하면 외부로 유출되어 미생물 존재에 의하여 생물 전기화학적으로 환원될 수 있다.
이에 본 발명자들은 병원성 미생물을 탐지하는 방법을 개발하고자 계속 연구한 결과, 매개물질인 2,6-디클로로페놀인돌페놀 (DCPIP) 등을 적용한 리포좀을 이용하면 특정 미생물의 존재에 의한 전류 신호를 탐지하여 선택적으로 병원성 미생물을 진단할 수 있으므로, 표준 미생물 시료, 각종 특이 검색시약을 포함하는 리포좀 및 신호 측정기 등으로 구성된 진단용 바이오센서를 제작하고 비용혈성 미생물의 존재 시에는 반응하지 않으면서 병원성 미생물의 존재 시에는 선택적으로 반응하는 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 병원성 미생물을 선택적으로 탐지하는 방법 및 이에 이용되는 바이오센서 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 사용하여, 특정 용혈성 미생물에 의하여 리포좀이 파괴 또는 변형되면서 용출되는 반응 시약이 미생물과 반응하여 발생하는 신호를 탐지함으로써 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 표준 미생물 시료; (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀; (3) 신호 측정기; (4) 각종 반응 용액; 및 (5) 완충용액들을 포함하는 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 바이오센서를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 기존의 방법을 개선한 것으로서 용혈성 미생물에 의하여 파괴되는 리포좀의 성질을 이용하여, 리포좀에 매개물질을 포집하고 이를 용혈성 미생물의 검색에 적용한다. 구체적으로, 용혈성 세균에 의하여 리포좀 구조가 분해되고 이로 인해 상기 매개물질이 방출되면, 산화-환원이 가능한 미생물이 이 매개물질을 이용하여 전자를 전달하게 되는 과정을 이용한 것이다. 따라서, 이 과정에서 적당한 조건 하의 작업 전극에서 나타나는 전류는 실험 시료 내에 포함된 용혈성 미생물의 농도에 비례하여 표시되게 된다.
본 발명에서 사용한 리포좀은 인지질 이중막을 가지는 구조로서 직경은 수백에서 수천 ㎚ 에 이를 수 있고, 해당 용도에 따라 그 내부에는 원하는 물질을 포집하거나 삽입시킬 수 있다. 이 때 리포좀의 외부에는 해당 목적에 따라 다양한 물질도 부착할 수 있으며, 리포좀의 크기, 형태 및 막의 개수도 자유로이 용도에 따라 조절할 수 있다. 또한, 필요에 따라 염료/매개체 및 양친매성 물질의 혼합물인 미셀 (micelle) 등이 유사한 효과를 나타내면서 리포좀의 대용물로 사용될 수도 있다.
본 발명은 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 사용하여, 특정 미생물에 의한 신호를 탐지하여 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 사용하여, 특정 용혈성 미생물에 의해 상기 리포좀이 파괴 또는 변형되면서 용출되는 반응 시약이 미생물과 반응하여 발생하는 신호를 탐지함으로써 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 방법에서는 상기 미생물 특이 검색시약으로 발색시약 또는 전기화학적 분석시약을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 전기화학적 분석시약으로 2,6-디클로로페놀인돌페놀 (2,6-dichlorophenolindolphenol; DCPIP)을 사용하는 것은 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 진단 방법에 사용한 상기 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀은 초음파 발생법 또는 진탕법 등에 의해 제작되고, 상기 검색시약이 포집되거나 삽입된 단일 라멜라 소포체 (small unilamellar vesicle; SUV) 및/또는 다중 라멜라 소포체 (multilamella vesicle; MLV)를 제작하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 진단 방법에 사용한 상기 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀은 리포좀의 대용물로서 염료/매개체 및 양친매성 물질의 혼합물인 미셀 (micelle)을 사용하는 것이 가능하다.
즉, 본 발명에 따른 상기 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀은 염료/매개체로 검색시약 및 인지질과 같은 양친매성 분자를 혼합하여 제작된 미셀로 대신하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법에 사용한 상기 특정 미생물에 의한 신호는 리포좀에 포집된 검색시약에 의해 전달되는 전류의 변화 또는 광학적 발색 신호로 표시될 수 있다.
본 발명의 진단방법은 상기 용혈성 미생물로서 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes), 리스테리아 웰쉬메리 (Listeria welshimeri), 스테파이로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 대장균 (Escherichia coli H5 O157) 균주 등을 포함하는 병원성 미생물 등을 선택적으로 탐지한다.
또한, 본 발명은
(1) 표준 미생물 시료; (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀; (3) 신호 측정기; (4) 각종 반응 용액; 및 (5) 완충용액들을 포함하여 구성된 바이오센서로서, 첨가되는 미생물 시료에 대해 상기 미생물 특이 검색 시약을 포함하는 리포좀이 미생물 시료 내의 용혈성 미생물에 의해 선택적으로 파괴 또는 변형되면서 용출되는 반응 시약이 미생물과 반응하여 발생하는 신호를 상기 전기화학적 신호 측정기로 탐지하는 것을 특징으로 하는 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 바이오센서를 제공한다.
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본 발명의 바이오센서는 상기 (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀에서 상기 미생물 특이 검색시약으로 전기화학적 분석시약을 사용하고, 상기 전기화학적 분석시약으로는 2,6-디클로로페놀인돌페놀을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 바이오센서는 상기 (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀으로서 초음파 발생법 또는 진탕법에 의해 제작된 검색시약이 포집되거나 삽입된 단일 라멜라 소포체 (SUV) 및/또는 다중 라멜라 소포체 (MLV) 중 하나 이상을 포함한다.
또한, 본 발명의 바이오센서는 상기 (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 리포좀의 대용물로서 염료/매개체 및 양친매성 물질의 혼합물인 미셀 (micelle)을 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 바이오센서는 상기 (3) 신호 측정기로서 특정 용혈성 미생물에 의해 나타나는 상기 미생물 특이 검색 시약에 의한 전류의 변화 또는 광학적 발색 신호를 측정하는 장치를 사용한다.
또한 본 발명의 바이오센서는 상기 미생물 특이 검색시약으로 전기화학적 분석시약을 사용하는 경우, 상기 전류의 변화 신호를 측정하는 상기 (3) 신호 측정기로서 작동 전극 및 상대 전극이 백금선으로 구성되고, 기준 전극은 포화 카로멜 전극(SCE; Saturated Calomel Electrode)로 구성된 전류 전위의 측정기 (potentiostat) 등을 사용한다.
또한, 본 발명의 바이오센서는 상기 용혈성 미생물로서 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes), 리스테리아 웰쉬메리 (Listeria welshimeri), 스테파이로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 대장균 (Escherichia coli H5 O157) 균주 등을 선택적으로 탐지한다.
본 발명의 바이오센서는 실험 시료에 일반적인 비병원성 미생물만의 존재할 때는 반응하지 않으나 병원성 미생물이 함께 존재하는 때에는 선택적으로 반응한 다.
구체적으로, 리스테리라 모노사이젠스와 같은 감염성 미생물이 시료 내에 존재하는 경우, 산화-환원 매개체를 통해 전자가 세균의 전자전달계에서 일정한 전압을 띄는 작업 전극으로 전달되므로, 세균의 농도에 따라 전류 신호가 발생한다. 특히, 본 발명에서와 같이 상기 매개체가 리포좀에 포집하거나 삽입하면 전극에서 환원되어 발생되는 신호가 조정될 수 있다. 이 때 리포좀에 의한 신호의 조절은 이미 잘 보고된 바와 같이 미생물에 의한 용혈성에 의해 이루어진다. 도 7 에서 보는 바와 같이, 용혈성 미생물이 리포좀의 인지질 이중막을 공격하면 내부의 매개물질들이 흘러나와 미생물과 반응하여 신호를 내게 된다. 이 때 비용혈성 미생물은 신호가 아주 미약하거나 거의 없게 되므로, 용혈성 미생물을 선택적으로 탐지할 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미생물의 배양
본 발명에서는 미생물의 용혈성을 확인하기 위하여, 각 미생물 균주를 말 혈액 아가배지 (horse blood agar medium; Unipath, UK)에서 미리 하루 동안 배양한 다음 살균된 BHI 배지 50 ㎖에 상기 배양액 0.5 ㎖를 접종하여 다시 37℃로 진탕 배양기에서 호기적으로 배양하였다. 미생물의 성장 단계 중 초기 정지기에 원심분리기를 이용하여 (10,000 ×g, 15 분, 4℃) 미생물을 분리하고, 0.01 M 소듐 포스페이트 완충용액 (sodium phosphate buffer; pH 7.0)으로 씻어내었다. 그 다음 미생물은 농도를 확인하기 위하여 다시 액상 희석되어 각 균주마다 증식 표준곡선을 만드는데 사용되었다. 본 발명에서 사용한 균주는 다음과 같다: 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes NCTC 7973): 용혈성; 대장균 (Escherichia coli MC4100-pLG570-hyl+): 용혈성; 대장균 (Escherichia coli NCIB 10772): 비용혈성; 리스테리아 웰쉬메리 ( Listeria welshimeri NCTC 11857): 비용혈성; 스테파이로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus C23): 용혈성; 스테파이로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis C3): 비용혈성; 프로테우스 불가리스 (Proteus. vulgaris NCTC 10020): 비용혈성.
실시예 2: 리포좀의 제작
본 발명에서는 리포좀에 포집되는 전기화학적 활성을 가진 매개물질로 2,6-디클로로페놀인돌페놀 소듐염 (2,6-dichlorophenolindophenol sodium salt; DCPIP)를 사용하였다.
또한 상기 매개물질이 포집된 리포좀을 제작하기 위하여, 단일 라멜라 소포체 (small unilamellar vesicles; SUV)는 순수한 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine; PC)을 이용하여 처리하였다. 구체적으로 상기 PC 용액을 진공 증착기에서 상온 60 rpm 으로 1시간 동안 건조시키고 모든 용매를 제거한 다 음 그 결과 형성된 PC 필름을 0.01 M DCIPI 완충용액 (0.01 M 소듐 포스페이트, pH 7.0)을 사용하여 수화시켰다. 다음 PC-DCPIP 현탁액 (emulsion)을 초음파 파쇄기를 사용하여 현탁 시키고, 상기 현탁액은 세파덱스 컬럼 (Sephadex gel exclusion column; G-50, 시그마사 제품)을 통과시킴으로써 전기화학적 셀로 사용될 수 있는 단일 라멜라 소포체 (SUVs)를 포함하는 분획만을 분리하였다.
또한, 상기 매개물질이 포집된 다중 라멜라 소포체 (multilamellar vesicles; MLV)는 50 ㎎ PC 를 상기 DCPIP 완충용액과 혼합하고 볼텍스 처리한 다음 상기와 같이 젤 컬럼을 통과시킴으로써 분리하였다.
또한, 상기 매개물질이 삽입된 단일 라멜라 소포체 (DCPIP-intercalated SUVs; DI-SUVs)는 먼저 비어있는 리포좀 (empty liposome)을 만든 다음 상기와 동일한 과정으로 순수한 PC 를 건조시키고 0.1 M 염화칼륨이 포함된 0.01 M 소듐 포스페이트 완충용액으로 수화시켰다. 그 결과 나온 PC 현탁액은 다시 파쇄시키고, 젤 크로마토그래피 상에 325 nm 위치에 관찰되는 비어있는 리포좀만을 분리하였다. 그 다음 상기 매개물질을 삽입하기 위하여, 0.1 ㎖의 비어있는 리포좀을 0.1 ㎖의 0.001 M DCPIP 용액과 혼합하여 질소 가스에 10분 동안 처리하였다. 이 때 삽입되지 않은 DCPIP 는 투석 과정으로 제거하였다.
실시예 3: 전기화학적 셀의 제작
본 발명은 미생물 존재에 의한 신호를 탐지하는 측정기를 얻기 위하여 다음과 같이 전기화학적 셀을 제작하였다. 도 1 에 보는 바와 같이, 작업 전극과 상대 전극으로는 백금선을 사용하였고, 기준 전극으로는 SCE 를 사용하여 전류 전위를 측정하는 포텐쇼스탓 (potentiostat; model POS73, Bank electronics, Germany)을 통하여 전압을 걸어주었다. 작동 전극을 둘러싸는 투석막이 적은 부피로 시료 미생물 및 리포좀이 사용되는 것이 가능하게 하였다. 도 1 은 용혈성 미생물에 인해 발생한 전류를 측정하는 장치를 나타낸 것으로 각 부분은 1: 작동 전극; 2: 상대 전극; 3: 러그인 모세관에 대한 기준 전극; 4: 내부 셀의 질소 입구; 5: 내부 셀의 시료 주입구; 6: 내부 셀의 질소 출구; 7: 외부 셀의 질소 입구; 8: 외부 셀의 시료 주입구; 9: 질소 출구; 10: 물 입구; 11: 물 출구; 12: 자기 교반기; 13: 내부 셀 격막; 및 외부 셀(도식하지 아니함)이다.
실시예 4: 용혈성 미생물의 신호 측정
본 발명은 용혈성 미생물에 의해 선택적으로 유발되는 전기화학적 신호를 측정하기 위하여, 상기 리포좀을 첨가하지 않은 경우와 리포좀을 첨가한 경우를 모두 실험하고 바탕 전류가 안정화된 다음 미생물을 접종하였다.
도 2 는 본 발명의 리포좀을 이용하여 미생물에 의해 발생한 전류를 측정하는 과정을 나타낸 것이다. 구체적으로, DCPIP 가 포집된 SUVs 가 존재하는 경우 및 존재하지 않는 경우에서 비용혈성 대장균 NCIB 10772 의 전류 측정 결과를 보여주는 데, 리포좀이 없으면 대장균 현탁액을 첨가할 때 시간 함수로 전류가 증가하고 기존의 환원/재산화 반응 분석 결과와 일치하지만, 리포좀이 있으면 변화가 관찰되지 않는다.
도 3a는 본 발명의 리포좀을 이용하여 비용혈성 대장균 NCIB 10772 균주의 존재 시에 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주에 의해 발생한 전류를 측정한 결과이다. 상기 대장균을 첨가하면 아무런 변화가 관찰되지 않으나 용혈성 균주를 첨가하면 전류 변화 신호가 즉시 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 이 때 비용혈성 대장균이 전류를 발생시키지 않는 이유는 리포좀 내에 포집된 매개물질 DCPIP 가 방출되지 못하기 때문이다.
도 3b는 본 발명의 리포좀을 사용한 경우와 사용하지 않은 경우, 동일한 조건 하에 용혈성 대장균 MC4100-pLG570-hly + 균주에 의해 발생한 전류를 측정한 결과이다. 그 결과, 리포좀이 없이 자유 DCPIP 만이 있으면 급격히 전류 신호가 증가하고 미생물의 활동이 저하되며 (도 3b의 곡선 A 참조), 리포좀이 있으면 전류 측정 신호가 완만히 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 3b의 곡선 B 참조).
이외에도 다양한 용혈성 미생물 또는 비용혈성 미생물들을 선택하여 조사한 결과는 하기 표 1 에 나타나있다.
[표 1]
균주 용혈 활성 전류 신호
자유 DCPIP 리포좀 DCPIP (SUVs)
스테파이로코커스 아우레우스 C23 + + +
스테파이로코커스 에피더미스 C3 1- + ND
리스테리아 웰쉬메리 NCTC 11857 - + ND
프로테우스 불가리스 NCTC 10020 - + ND
대장균 NCIB 10772 - + ND
도 4는 본 발명의 리포좀, MLVs(A) 및 SUVs(B) 를 이용하여 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주를 탐지한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, 비용혈성 대장균을 첨가하면 전류 신호에 변화가 없지만 (곡선 A 의 지점 1 참조), 용혈성 리스테리아 균주를 첨가하면 전류 신호가 변화하는 것 (곡선 A 의 지점 2 참조)을 관찰할 수 있었다. 또한, 본 발명의 단일 라멜라 소포체 (SUVs)를 사용한 경우가 다중 라멜라 소포체 (MLVs)를 사용한 경우보다 전류 신호가 더욱 높게 형성되는 것을 알 수 있었다. 이 때 MLVs 는 용혈성 효소의 작용 및 리포좀 구조의 파괴가 조금 늦게 진행되어 전류 신호가 덜 효과적으로 전달되기는 하지만 리포좀의 제작은 상대적으로 용이한 장점이 있다.
도 5는 본 발명의 리포좀을 이용하여 비용혈성 대장균 NCIB 10772 균주의 존재 하에 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주를 탐지한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, 비용혈성 대장균에 의해서는 전류 신호가 거의 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 본 발명의 DCPIP 가 삽입된 리포좀 또는 DCPIP 가 포집된 리포좀을 이용하여 용혈성 리스테리아 모노사이토젠스 NCTC 7973 균주를 전기화학적으로 탐지한 결과를 각각 비교하여 나타낸 것이다. 그 결과, DCPIP 가 삽입된 단일 라멜라 소포체 (DI-SUVs)가 진단 민감도가 더욱 탁월하고 미생물 존재 및 전류 신호 간의 상관관계가 더욱 명확한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 미생물의 농도가 105 cfu-1 미만인 경우 전류 신호가 너무 작으므로 정확한 진단을 위한 보완이 필요하다.
결론적으로, DI-SUVs 리포좀을 사용한 경우 용혈성 미생물의 농도와 발생 전류간의 상관관계는 5×105 내지 2×107 cfu ㎖-1 범위 내에서 일정하게 나타났다 이 때 작업 전극에 걸린 전압은 기준 전극에 대해 0.3 V 이고 실험은 pH 7.0 및 30℃에서 진행되었다. 본 발명의 탐지 방법은 리스테리아 모노사이토젠스 (L. monocytogenes)에서 가장 두드러진 반응을 나타냈지만, SUVs 및 MLVs 리포좀을 사용한 경우 각각에서 상관관계가 그다지 없었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 실험 결과들은 병원성 균주에 대한 선택적인 탐지에 전류 측정법과 리포좀을 적용한 기술이 효력이 있음을 보여주었다. 상기 결과를 근거로 하여 DCPIP 가 포집되거나 삽입된 리포좀 구조와 구성은 미생물 탐지의 감도 범위를 개선시키는 데 중요하고, 전류 신호의 강도는 DCPIP 가 리포좀 구조에 노출되는 정도에 따라 결정되며, 리포좀의 이중막의 두께 정도에 반비례하는 점을 확인하였다. 특히, 용혈성 미생물의 특정 탐지에 있어서 중요한 작용은 DCPIP 가 포집된 리포좀의 효소 관여 방출과 미생물에 의한 환원 정도이므로, 리포좀의 이중막 구조 자체가 인지질에 대한 효소적 공격을 저해할 수도 있기 때문에 리포좀의 막을 친수성을 가지는 얇은 막으로 미리 전처리하면 진단 민감도를 높일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 이용한 병원성 미생물의 선택적인 진단 방법 및 (1) 표준 미생물 시료; (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀; (3) 신호 측정기; (4) 각종 반응 용액; 및 (5) 완충용액들로 구성된 진단용 바이오센서는 병원성 미생물이 존재하는 때에만 선택적으로 반응 신호를 전달할 수 있어, 용혈성 미생물 관련 질환을 간편하게 높은 감도로 진단하고 특히 병원성 균주를 10 ~ 30분의 빠른 시간 안에 탐지하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (15)

  1. 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀을 사용하여, 특정 용혈성 미생물에 의해 상기 리포좀이 파괴 또는 변형되면서 용출되는 반응 시약이 미생물과 반응하여 발생하는 신호를 탐지함으로써 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 특이 검색시약은 전기화학적 분석시약인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 전기화학적 분석시약은 2,6-디클로로페놀인돌페놀 (2,6-dichlorophenolindolphenol; DCPIP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀은 초음파 발생법 또는 진탕법에 의해 제작된 검색시약이 포집되거나 삽입된 단일 라멜라 소포체 (small unilamellar vesicle; SUV) 혹은 다중 라멜라 소포체 (multilamella vesicle; MLV) 중의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀은 검색시약 및 인지질을 혼합하여 제작된 미셀로 대신하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 특정 미생물에 의한 신호는 리포좀에 포집된 검색시약에 의해 전달되는 전류의 변화인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 용혈성 미생물은 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes), 리스테리아 웰쉬메리 (Listeria welshimeri), 스테파이로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 또는 대장균 (Escherichia coli H5 O157) 균주 중의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. (1) 표준 미생물 시료; (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀; (3) 신호 측정기; (4) 각종 반응 용액; 및 (5) 완충용액들을 포함하여 구성된 바이오센서로서, 첨가되는 미생물 시료에 대해 상기 미생물 특이 검색 시약을 포함하는 리포좀이 미생물 시료 내의 용혈성 미생물에 의해 선택적으로 파괴 또는 변형되면서 용출되는 반응 시약이 미생물과 반응하여 발생하는 신호를 상기 전기화학적 신호 측정기로 탐지하는 것을 특징으로 하는 용혈성 미생물을 선택적으로 진단하는 바이오센서.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀에서 상기 미생물 특이 검색시약은 전기화학적 분석시약인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 전기화학적 분석시약은 2,6-디클로로페놀인돌페놀인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 (2) 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀은 초음파 발생법 또는 진탕법에 의해 제작된 검색시약이 포집되거나 삽입된 단일 라멜라 소포체 (SUV) 또는 다중 라멜라 소포체 (MLV) 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 미생물 특이 검색시약을 포함하는 리포좀은 검색시약 및 인지질을 혼합하여 제작된 미셀로 대신하여 사용하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 (3) 신호 측정기는 특정 용혈성 미생물에 의해 나타나는 상기 미생물 특이 검색 시약에 의한 전류의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 전류의 변화 신호를 측정하는 상기 (3) 신호 측정기는 작동 전극 및 상대 전극이 백금선으로 구성되고, 기준 전극은 표준 칼로멜 전극(SCE; Saturated Calomel Electrode)로 구성된 전류 전위의 측정기 (potentiostat)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  15. 제 8항에 있어서, 상기 용혈성 미생물은 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes), 리스테리아 웰쉬메리 (Listeria welshimeri), 스테파이로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 또는 대장균 (Escherichia coli H5 O157) 균주 중의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
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