KR100750693B1 - 캄프토테신 유사체 및 그의 제조 방법 - Google Patents
캄프토테신 유사체 및 그의 제조 방법Info
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Abstract
화학식 1을 갖는 화합물 및 그의 의약적으로 허용 가능한 염, 및 그의 합성 방법: 식 중, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬기, 알켄닐기, 알킨닐기, 알콕시기, 아릴옥시기, 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서, Rd는 알킬기임), 카바모일록시기, 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 하이드라지노기, 아실기(-C(O)Rf, 여기서, Rf는 알킬기, 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), 아미노기, -SRc(여기서, Rc는 수소, 아실기, 알킬기, 또는 아릴기임)이며, 또는 R1과 R2가 함께 일반식 -O(CH2)nO-를 갖는 치환기를 형성하는 것이고(여기서, n은 1 또는 2의 정수임), R3가 H, 할로겐, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이며, 또는 R2 및 R3가 함께 일반식 -O(CH2)nO-를 갖는 치환기를 형성하며, 여기서, n은 1 또는 2의 정수이고, R4가 H, F, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기, 트리알킬실릴기 또는 C1-3 알콕시기이고, R5가 C1-10 알킬기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기이고, R6, R7 및 R8이 각각 C1-10 알킬기, C2-10 알켄닐기, C2-10 알킨닐기, 아릴기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 10의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고, R11이 알킬렌기, 알케닐렌기 또는 알키닐렌기임.
Description
<관련 특허 출원>
본 출원은 미국특허출원 제 08/085,190 호의 일부계속출원인 미국특허출원 제 08/436,799 호의 또다른 일부계속출원인 미국특허출원 제 08/921,102 호의 일부계속출원에 관한 것으로, 상기 문헌들 전문이 본 발명의 참고문헌이 된다.
<발명의 기술 분야>
본 발명은 신규 화합물 및 그의 제조 방법에 관한 것이며, 좀더 구체적으로, 실릴 캄프토테신 유도체 또는 유사체 및 이같은 실릴 캄프토테신 유사체의 제조 방법에 관한 것이다.
(20S)-캄프토테신(CPT, 아래 참조) 및 그의 유도체는 화학요법에 의한 충실성 종양(solid tumor) 치료에 가장 유망한 작용제 중의 일부이다. 예컨대, Wall, M.E. 등의 J. Ethnopharmacol., 51, 239 (1996); Camptothecin: New Anticancer Agents; Potmesil, M. 및 Pinedo. H. Eds.; CRC, Boca Raton, FL (1995); Bonneterre, J. Bull. Canc., 82, 623 (1995); Sinha, D. K. Drugs, 49, 11 (1995)를 참조할 수 있다. 이 천연 알카로이드는 중국 식물의 추출액으로부터 1966년에 처음으로 분리되었다. 다음에 나타낸 바와 같이, 캄프토테신은 일반적으로, 락톤고리(고리 E)에 퓨즈드된 2-피리디논 고리(고리 D)에, 퓨즈드된(fused) 피롤로[3,4-b]퀴놀린계(고리 ABC)로 이루어지는 퓨즈드된 고리계를 갖는다.
캄포토테신은 토포이소머라제 I 독물의 군에 속한다. 예컨대, Froelich-Ammon, S. J. 등의 J. Biol. Chem., 270, 21429 (1995)를 참조할 수 있다. 지금까지의 연구를 통해, 이 분자가 대개 악성 세포내에서 과발현된 효소, 세포성 효소 토포이소머라제 I에 의해 초나사화된 DNA의 되꼬임(unwinding)을 저해함으로써 작용한다는 것이 강력하게 제시되어 있다. 암 세포들의 강력한 복제에 있어서, 이는 급격한 이상들을 야기시켜 아포프토시스(apiptosis) 및 프로그램화된 죽임을 초래한다. Slichenmyer, W. J. 등의 J. Natl. Cancer Inst., 85, 271 (1993)을 참조할 수 있다. 분자 약리학 레벨에서의 최근 진보 정도가 Pommier, Y. 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8861 (1995)에서 검토되어 있다.
캄프토테신의 초기 임상 시도는 생리학적 적합 배지에 대한 가용성이 낮아서 제한되었다. 게다가, 락톤 고리를 수산화나트륨으로 개방시켜 캄프토테신의 수용성 나트륨염을 형성시키고자 하였던 초기 시도는 항암 활성이 낮은 화합물을 초래하였다. 이후에, 닫힌 락톤-형태가 항암 활성에 있어서 절대적인 필수 요건임이 보고되었다. Wani, M. C. 등의 J. Med. Chem., 23, 554(1980)을 참조할 수 있다. 좀더 최근에는, 구조-활성 연구를 통해 좀더 우수한 가용성과 좀더 우수한 항암 활성을 갖는 유사체 화합물이 확인되어왔다. 예컨대, 토포테칸(TPT) 및 이리노테칸(IRT)는 최근에 미국내에서 판매가 허용되었으며, GI-147211C는 임상 시험의 마지막 단계에 있다. 이들 유사체들은 악성 흑색종, 위암, 유방암, 난소암, 폐암 및 직장암과 같은 다양한 난치의 충실성 종양들에 대해 효과적이며, 특히 서서히-분화하는 암 라인(cancer lines)의 치료에 유망한 것으로 보인다. 예컨대, Kingsbury, W. E. 등의 J. Med. Chem, 34, 98(1991); Sawada, S. 등의 Chem. Pharm. Bull., 39, 1446 (1991); Luzzio, M. J. 등의 J. Med. Chem., 38, 395 (1995); Abigerges, D. 등의 J. Clin. Oncol., 13, 210(1995)를 참조할 수 있다. 또한, 공조 효과 또는 부가 효과가 시스플라틴(cisplatin), 광조사 또는 고열 상태와 병합 치료시에 관찰되었다. Fukuda, M. 등의 Canc. Res., 56, 789 (1996); Goldwasser, F. 등의 Clin., Cancer. Res., 2. 687 (1996); Wang, D.S. 등의 Biol. Pharm. Bull., 9, 354 (1996)를 참조할 수 있다.
대부분의 연구가 캄프토테신의 수용성 유도체 개발에 중점되어 있긴 하지만, 리피드-복합체, 리포솜성 캡슐화 및 습식 밀링(wet milling) 기법과 같은 새로운 배합물들이 최근에 개발되었다. 이러한 배합물들은 물에 대한 가용성이 좋지 않은 캄프토테신에 있어서 새로운 치료 가능성을 부여하는 것이었다. Daoud, S. S. 등으 Anti-Cancer Drugs, 6, 83(1995); Merisko-Liversidge, E. 등의 Pharm. Res., 13, 272 (1996); 및 Pantazis, P., Leukemia Res., 19, 775 (1995)를 참조할 수 있다. 이들 배합물을 장점은 약물의 생물학적 분포에 대한 효과에 있다. Sugrman 및 그의 동료들은 최근에 유리 캄프토테신은 폐 실질내에서 가장 큰 농도를 갖는 반면에, 리피드-복합체를 형성한 캄프토테신은 외장계에서 가장 큰 농도를 나타냄을 보고하였다. 이 결과들은 결장암의 치료에 있어서 새롭고 흥미로운 전망을 제시하고 있다. Sugarman, S. M. 등의 Canc. Chemother. Pharmacol., 37, 531 (1996)을 참조할 수 있다. 불용성 캄프토테신 유사체를 사용하는 또다른 흥미로운 특징으로는, 이들이 대개 그의 수용성 동류물에 비해 우수한 활성을 갖으며 약물-유도 저항성이 적게 발생시키는 것으로 보인다는 것인데, 이는 아마도 이들이 p-글리코프로테인 다중-약물 전달체의 기질이 아니기 때문일 것이다. Pantazis, P., Clin. Canc. Res., 1, 1235(1995)를 참조할 수 있다.
이러한 현 상황 하에서, 우수한 항암 활성과 함께 다양한 가용성 및 생물학적 분포 특성을 갖도록 하기에 좋게 배합되는 신규의 캄프토테신 유사체는 다양한 타임의 암을 치료하는 데 치료학적인 우수한 수단의 축적이란 측면에 있어서 중대한 역할을 할 수 있다.
캄프토테신 및 그의 유사체의 잘 알려진 유익한 생물학적 활성을 제공할 수 있으므로, 추가적인 캄프토테신 유사체 및 캄프토테신 유사체의 제조 방법에 대한 개발이 절실히 요망되고 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 일반적으로 다음 화학식 1을 갖는 화합물을 제공한다:
본 발명은 또한 다음 화학식 2를 갖는 화합물을 합성하는 방법을 제공하고,
상기 화합물은 다음 화학식 3을 갖는 전구물질과,
다음과 같은 일반식을 갖는 아릴 이소니트릴을 반응시키는 4+1 라디칼 고리형성 반응(annulation)/사이클화 반응을 통해 합성되고,
상기 식 중에서, R1 및 R2는 각각 동일하거나 상이하고, 바람직하게는 수소, 알킬기, 알켄닐기, 알킨닐기, 알콕시기, 아릴옥시기, 아실옥시기, -OC(O)ORd 여기서 Rd는 알킬기이며, 카바모일록시기, 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 하이드라지노기, 아실기(-C(O)Rf, 여기서 Rf는 바람직하게는 알킬기, 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시임), 아미노기, -SRc, 여기서 Rc는 수소, 아실기, 알킬기, 또는 아릴기이며, 또는 R1과 R2가 함께 일반식 -O(CH2)nO-를 갖는 치환기를 형성하며, 여기서 n은 1 또는 2의 정수이다.
R3는 바람직하게는 H, 할로겐, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이다. R2 및 R3도 또한 함께 일반식 -O(CH2)nO-를 갖는 치환기를 형성하며, 여기서 n은 1 또는 2의 정수이다.
R4는 바람직하게는 H, F, 트리알킬실릴기, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기, 또는 C1-3 알콕시기이다. R5은 바람직하게는 C1-10 알킬기이다. 바람직한 알킬기는 에틸기이다. R5에 대해 바람직하게 치환된 알킬기에는 알릴기, 프로파질 및 벤질기가 포함된다.
R6, R7 및 R8은 바람직하게는 각각 (동일하거나 상이함) C1-10 알킬기, C2-10 알켄닐기, C2-10 알킨닐기 또는 아릴기이다. R6, R7 및 R8에 대해 바람직하게 치환된 알킬기는 -(CH2)NR9기이고, 여기서 N은 1 내지 10의 정수이고, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 할로게 원자, 시아노기 또는 니트로기이다. R9에 대해 바람직하게 치환된 아미노기에는 알킬아미노기 및 디알킬아미노기가 포함된다.
R11은 바람직하게는 알킬렌기, 알케닐렌기 또는 알키닐렌기이다. R12는 바람직하게는 -CH=CH-CH2- 또는 -C≡C-CH2-이다. X는 바람직하게는 Cl, Br 또는 I이다. 더욱 바람직하게는, X는 Br 또는 I이다. 가장 바람직하게는, X는 Br이다.
본 발명은 또한 다음 화학식 2를 갖는 화합물을 제공하며:
[화학식 2]
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R11은 이 단락 이전 부분에 전술한 바와 같다. 본 발명은 추가로 상기 화학식을 갖으며, 상기 식 중에서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나가 H가 아닌 화합물을 제공한다. 본 발명은 더욱 추가로, 상기 화학식을 갖으며, 상기 식 중에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R11은 가 이 단락 이전 부분에 전술한 바와 같고, R5가 메틸기, C3-10 알킬기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 화합물을 제공한다.
본 발명은 추가로 다음 화학식 3을 갖는 화합물을 제공한다:
[화학식 3]
본 발명은 추가로 다음 화학식 4를 갖는 화합물을 제공한다:
본문에서 "알킬", "아릴" 및 기타 치환기들이라 함은 일반적으로, 별도의 언급이 없는 한, 치환되거나 치환되지 않은 작용기 모두를 칭하는 것이다. 별도의 명시가 없다면, 알킬기는 탄화수소기이며, 바람직하게는 C1-C15(즉, 1 내지 15 개의 탄소 원자를 갖는) 알킬기이고, 좀더 바람직하게는 C1-C10 알킬기이며, 분지상 또는 직쇄상, 비시클릭 또는 시클릭이 될 수 있다. 알킬기의 상기한 바와 같은 정의 및 기타 정의는 또한 이 치환기가 다른 치환기상에서의 치환기인 경우에도 적용할 수 있다(예컨대, 알킬아미노기 또는 디알킬아미노기의 치환기로서 알킬기). "아릴"이라 함은 페닐 또는 나프틸을 의미한다. 본문에서, "할로겐" 또는 "할로"라 함은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드를 칭한다.
"알콕시"라 함은 -ORd을 칭하며, 여기서 Rd는 알킬기이다. "아릴록시"라 함은 -ORe를 칭하며, 여기서 Re는 아릴기이다. 아실기라 함은 -C(O)Rf를 가르키는 것이다. "알켄닐"이라 함은 적어도 하나 이상의 이중 결합을 갖는 직쇄상 또는 분지상 사슬의 탄화수소기, 바람직하게는 2-15 개의 탄소 원자를 갖는, 더욱 바람직하게는 3-10 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 칭하는 것이다(예컨대, -CH=CHRg). "알킨닐" 이라 함은 적어도 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 직쇄상 또는 분지상 사슬의 탄화수소기, 바람직하게는 2-15 개의 탄소 원자를 갖는, 더욱 바람직하게는 3-10 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 칭하는 것이다(예컨대, -CH≡CRh). "알킬렌", "알케닐렌" 및 "알키닐렌"이라 함은 각각 알킬기, 알켄닐기, 및 알킨닐기의 이가 형태를 가르키는 것이다.
전술한 바와 같은 치환기들은 광범위한 범위에서 다양한 치환기들로 치환되어 활성을 갖는 캄프토테신 유사체를 합성할 수 있다. 예를 들어, 알킬기는 바람직하게는, 벤질기, 페닐기, 알콕시기, 히드록시기, 아미노기(예컨대, 유리 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기 및 아릴아미노기를 포함), 알켄닐기, 알킨닐기, 및 아실옥시기를 포함하는 치환기 또는 치환기들로 치환될 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 아미노기(-NRaRb)의 경우, Ra 및 Rb은 바람직하게는 각각 수소, 아실기, 알킬기 또는 아릴기이다. 아실기는 바람직하게는, 알킬기, 할로알킬기(예컨대, 퍼플루오로알킬기), 알콕시기, 아미노기 및 히드록시기로 치환될 수 있다(즉, 이상은 Rf에 해당하는 것들임). 알킨닐기 및 알켄닐기는 바람직하게는 알킬기, 알콕시알킬기, 아미노기 및 벤질기를 포함하는 치환기 또는 치환기들로 치환될 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다(즉, Rg 및 Rh에 해당하는 것들임).
본문에서, "아실록시"라 함은 -OC(O)Rd를 칭하는 것이다.
본문에서, "알콕시카르보닐록시"라 함은 -OC(O)ORd를 칭하는 것이다.
본문에서, "카르바모일록시"라 함은 -OC(O)NRaRb를 칭하는 것이다.
아미노기 및 히드록시는 이 분야에거 잘 알려진 보호기를 포함할 수도 있다. 아미노기에 대한 바람직한 보호기에는 tert-부틸록시카르보닐, 포르밀, 아세틸, 벤질, p-메톡시벤질록시카르보닐, 트리틸이 포함된다. 그 외에, 이 분야의 당업자에게 잘 알려진 적절한 보호기는 Greene, T., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley (1991)에 개시되어있으며, 상기 문헌은 본문의 참고문헌이 된다.
일반적으로, R1, R2, R3, R6, R7 및 R8은 생성된 캄프토테신 유사체의 활성을 유지할 수 있도록 과도하게 방대(bulky)하지 않은 것이 바람직하다. 따라서, 바람직하게는, R1, R2, R3, R6, R7 및 R8은 각각 약 250 미만의 분자량을 갖는다. 더욱 바람직하게는 R1, R2, R3, R6, R7 및 R8은 각각 약 200 미만의 분자량을 갖는다.
본 발명의 캄프토테신 유사체 중 일부는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 포스페이트 및 니트레이트와 같은 무기산과의 염으로서 의약적 용도로 제조할 수 있으며, 상기 염에 국한되는 것은 아니다. 캄프토테신 유사체는 또한 아세테이트, 타르타레이트(tartrate), 퓨마레이트, 숙신네이트, 시트레이트, 메탄설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 스테아레이트와 같은 유기산과의 염으로서 의약적 용도로 제조할 수 있으며, 상기 염에 국한되는 것은 아니다. 기타 산들은 본 발명 화합물 및 그의 의약적으로 허용 가능한 염들을 제조하는 중간체로서 사용할 수도 있다.
정제, 투여 또는 기타 목적을 위해, E-고리(락톤 고리)를 수산화나트륨 또는 수산화칼슘과 같은 알카리 금속으로 개방시켜, 상기 화학식 4의 화합물에서 기재한 바와 같이, 상기 화학식 1을 갖는 본 발명 화합물의 개방된 E-고리 유사체를 생성시킬 수 있으며, 알카리 금속에 상기한 바에 국한되는 것은 아니다. 이렇게 얻어진 중간체들은 물에 대한 가용성이 좀더 크고, 정제하여 산으로 처리한 후에 본 발명의 캄프토테신 유사체의 정제된 형태를 생성시킬 수도 있다.
E-고리는 또한 물이나 기타 용매에 대한 다양한 가용성 특성을 갖는 화학식 1의 화합물 유사체를 생성시킬 수 있도록 변형될 수도 있다. 이러한 목적을 달성하기 위한 방법에는 하이드록사이드 또는 수용성 아미노기로 E-고리를 개방시키거나, 또는 E-고리의 20 번 위치의 히드록시기를 폴리에틸렌 글리콜기와 같은 수용성 치환기로 작용기 치환시키는 것을 포함하는데, 이에 국한되는 것은 아니다. 이같이 제조된 유사체들은 전구-약물(pro-drug)들로서 작용한다. 즉, 이들 유사체들은 생물 유기체에 투여될 경우에 상기 화학식 1의 화합물(폐쇄 E-고리 구조를 갖는)을 재생시킨다. Greenwald, R.B. 등의 J. Med. Chem., 39, 1938 (1996)을 참조할 수 있다.
본 발명의 유사체는 높은 친지질성(lipophilic)을 띠고, 생체내 및 시험관내 모두에서 활성을 증진시키는 것으로 나타났다. 게다가, 그의 A-고리 치환기(들)은 혈액 안정성을 증진시키는 것으로 나타났다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1 및/또는 2의 화합물 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염을 의약적 유효량으로 투여하는 것으로 이루어지는 환자 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 예컨대, 암 및/또는 백혈병에 걸린 환자에게 정맥 주사, 근육 주사, 경구 투여, 피하 투여, 종양내 투여, 피내 주사 및 비경구투여를 포함하는 그 어떠한 통상적인 투여 경로에 의해 투여될 수 있으며, 상기 투여 경로에 국한되는 것은 아니다. 의약적 유효량 또는 투여량은 바람직하게는, 환자의 체중 kg 당 화학식 1 및 2의 화합물 중 한 가지의 0.01 내지 60 mg이다. 일반적으로, 의약적 유효량은 항백혈병성 및/또는 항종양성(항암성) 작용을 보이기에 유효한, 상기 화학식 1 및 2의 화합물들 중 한 가지의 양을 포함한다. 의약적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제과 함께, 상기 화학식 1 및 2의 화합물들 중 한 가지 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염을 활성 성분으로서 함유하는 의약 조성물도 또한 본 발명의 범주내에 포함되는 것이다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1 및 2의 화합물 중 어떠한 것과 의약적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 이 조성물은 예컨대, 상기 화학식 1, 2 및/또는 4의 화합물을 0.1 mg 내지 3 g ,바람직하게는 약 0.1 mg 내지 500 mg으로 함유할 수 있으며, 투여 유형에 적합한 형태로 구성될 수도 있다.
도 1은 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 일반적인 합성 반응식의 일례를 나타낸 것이다.
도 2는 (20S)-11-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신의 합성 일례를 나타낸 것이다.
도 3은 (20S)-10-아세톡시-7-트리메틸실릴캄프토테신 및 (20S)-10-히드록시-7-트리메틸실릴캄프토테신의 합성 일례를 나타낸 것이다.
도 4는 (20S)-10-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신의 합성 일례를 나타낸 것이다.
도 5는 (20S)-10-아미노-11-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신의 합성 일례를 나타낸 것이다.
도 6은 이리노테칸의 신규 유사체의 합성 일례를 나타낸 것이다.
도 7은 상기 화학식 2의 대표적인 3 가지 실릴캄프토테신 유사체의 일례를 나타낸 것이다.
도 8은 프로파질 브로마이드 전구물질의 합성 일례를 나타낸 것이다.
도 9는 상기 화학식 3의 라디칼 전구물질의 반응 일례를 나타낸 것이다.
도 10은 상기 도 9의 라디칼 전구물질과 이소니트릴과의 반응 일례를 나타낸 것이다.
도 11은 상기 도 7의 대표적인 실릴캄프토테신 유사체의 합성 중 최종 단계의 일례를 나타낸 것이다.
도 12는 1 uM의 (20S)-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신, 7-TMSEt CPT, (36c) (DB-172)의 들뜸(excotation) 및 방출(emission) 형광 스펙트럼의 일례를 나타낸 것이다.
도 13은 1 uM의 (20S)-10-아미노-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신, 10-NH2-7-TMSEt CPT (DB-173)의 방출 형광 스펙트럼의 일례를 나타낸 것이다.
도 14는 1 uM의 (20S)-10-히드록시-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신, 10-OH-7-TMSEt CPT (DB-174)의 방출 형광 스펙트럼의 일례를 나타낸 것이다.
도 15는 에탄올, 0.29 M DMPG 및 PBS 내에서 1 uM의 (20S)-10-히드록시-7-(tert-부틸디메틸실릴)캄프토테신, 10-OH-7-TMS CPT (DB-67)의 형광 스펙트럼의 일례를 나타낸 것이다.
도 16은 DMPC에 대한 캄프토테신 유사체의 평형 결합의 일례를 나타낸 것이다.
도 17은 DMPC에 대한 본 발명의 높은 친지질성 캄프토테신 유사체의 평형 결합의 일례를 나타낸 것이다.
도 18은 DMPG에 대한 본 발명의 높은 친지질성 캄프토테신 유사체의 평형 결합의 일례를 나타낸 것이다.
도 19는 37 ℃에서 DMPC 작은 단층판 소체들(SUVs: small unilamellar vesicles)에 대한 본 발명의 높은 친지질성 캄프토테신 유사체의 결합의 이중-상반 플롯(double-reciprocal plots)의 일례를 나타낸 것이다.
도 20은 37 ℃에서 DMPC SUVs에 대한 본 발명의 높은 친지질성 캄프토테신 유사체의 결합의 이중-상반 플롯(double-reciprocal plots)의 일례를 나타낸 것이다.
도 21은 37 ℃, pH 7.4 의 PBS 완충제내에서 DB-172의 안정성에 대한 일례를 나타낸 것이다.
도 22는 시간 및 약물 농도에 대한 DB-172의 형광 세기의 종속성의 일례를 나타낸 것이다.
도 23은 시간 및 약물 농도에 따른 DB-172의 형광 세기의 일례를 나타낸 것이다.
도 24는 DB-172의 카르복실레이트의 pH 및 시간에 따른 총 형광 세기의 일례를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 몇몇 캄프토테신 유사체의 시간에 따른 총 형광 세기의 일례를 나타낸 것이다.
도 26은 인산염 완충 식염수(PBS) 및 인체 혈액내에서 본 발명의 몇몇 캄프토테신 유사체의 약물 안정성의 일례를 나타낸 것이다.
도 27은 PBS, 전혈 및 PBS/인체 혈장 알부민(HSA)내에서 본 발명의 몇몇 캄프토테신 유사체의 약물 안정성의 일례를 나타낸 것이다.
도 28은 경구 투여후에 DB-67의 혈장 농도의 일례를 나타낸 것이다.
상기 화학식 1 및 2의 화합물 중에서, E-고리의 20 번 위치에서 (S)-배열을 갖는 것들이 의약적 용도로 바람직하다.
R1 및 R2는 바람직하게는, 각각(동일하거나 상이함) H, 히드록시기, 할로기, 아미노기, 니트로기, 시아노기, C1-3 알킬기, C1-3 퍼할로알킬기, C1-3 알켄닐기, C1-3 알킨닐기, C1-3 알콕시기, C1-3 아미노알킬기, C1-3 알킬아미노기, C1-3
디알킬아미노기이며, 또는 R1과 R2가 함께 -O(CH2)nO- 의 일반식을 갖는 치환기를 형성하고, 여기서 n은 1 또는 1의 정수를 나타낸다. 좀더 바람직하게는, R1 및 R2는 각각(동일하거나 상이함) H, 메틸기, 아미노기, 니트로기, 시아노기, 히드록시기, 히드록시메틸기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 에틸아미노기, 디에틸아미노기, 아미노메틸기, 메틸아미노메틸기, 디메틸아미노메틸기 등이 있다.
R3은 바람직하게는 F, 아미노기, 또는 히드록시기이다. R4는 바람직하게는 H, 트리알킬실릴기 또는 F이다. R5는 바람직하게는 에틸기이다. R6, R7 및 R8은 바람직하게는, 각각(동일하거나 상이함) C1-6 알킬기, 페닐기 또는 -(CH2)NR
10기이고, 여기서 N은 1 내지 6 범위내의 정수이고, R10은 할로겐 또는 시아노기이다.
제조 방법
본 발명 화학식 1의 화합물들은 도 1에 나타낸 바와 같은 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다. 도 1의 합성 반응식에서, 요오드피리돈(2)을 프로파질 유도체(3)로 먼저 N-알킬화하여 라디칼 전구물질(4)를 생성시킨다. 그 후에, 라디칼 전구물질(4)는 아릴이소니트릴(5)로 라디칼 캐스케이드(radical cascade)를 수행하여 생성물(1)을 얻는다. 상기 N-알킬화 반응은 적절한 조건 하에서 부드럽게 진행시킨다. Curran, D. P.등의 Tetrahedron Lett., 36, 8917 (1995)를 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 본문의 참고문헌이 된다. 요오드피리돈(2)의 합성 및 라디칼 캐스케이드의 조건들은 이미 잘 알려져 있다. 프로파질레이팅(propargylating) 작용제(3)는 적절한 실릴화제 R6R7R8SiX를 이용한 프로파질 알콜의 이가 음이온의 표준 실릴화 반응을 수행한 후에, 상기 프로파질 알콜을 브로마이드, 요오드 또는 설포네이트와 같은 이탈기로 전환시킴으로써 용이하게 제조된다. Curran, D.P. 등의 Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, 2683 (1995)를 참조할 수 있으며, 이 문헌은 본문의 참고문헌이 되고, 1995년 5월 3일자로 출원된 미국특허출원 제 08/436,799호를 참조할 수 있으며, 이 문헌은 본 발명의 참고문헌이 된다.
일반적으로, 헥사메틸디틴, 헥사메틸디실란, 또는 테트라키스(트리메틸실릴)실란을 포함하는 다양한 시약들을 상기 라디칼 캐스케이드에 사용할 수 있으며, 상기 시약들에 국한되는 것은 아니다. 이 반응의 에너지원은 태양광선 램프(sun lamp) 또는 자외선 램프가 될 수 있다. 온도는 바람직하게는 대략 25 내지 150 ℃ 사이로 설정한다. 더욱 바람직하게는, 온도를 대략 70 ℃로 설정한다. 일반적으로 라디칼 캐스케이드에 대한 비활성 이외에 사용 용매에 대한 규제는 없다. 바람직한 용매에는 벤젠, 톨루엔, 아세토니트릴, THF 및 tert-부탄올이 포함된다. 또한, 반응 조건이 온화하기 때문에 이소니트릴 및 알킨에 대한 치환기의 선택은 매우 광범위한 영역에서 이루어질 수 있다.
도 2는 (20S)-11-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신(12)의 일반적인 합성 반응식의 일례를 나타낸 것이다. 이 합성 반응식에서의 문제는 아릴이소니트릴내에서 오르쏘 위치 모두가 사이클화 반응에 이용 가능할 경우에 라디칼 캐스케이드의 위치 선택성을 조정하는 데 있다(즉, 화학식 1의 최종 화합물에서 R4가 H임). 이 문제에 대한 한 가지 해결 방안은 아릴 이소니트릴상에 트리메틸실릴기를 도입하는 것이다(예컨대, 3-플루오로-2-트리메틸실릴페닐 이소니트릴 (9)). 트리메틸실릴 치환기는 사이클화 반응에 있어서 이소니트릴의 오르쏘 위치 중 한 쪽을 차단시키며, 수소화탈실릴화 반응에 의해 캐스케이드 반응 이후에 제거할 수 있다. 이러한 예에서, 마지막 단계에서 트리메틸실릴기 중의 하나만이 제거한다는 측면에서 선택성이 추가로 진행된다.
상기 화학식 1의 몇몇 신규 캄프토테신 유도체의 제조용의 일반적인 합성 반응식의 다른 일례들을 도 3 내지 6, 및 실시예들에 나타내었다.
상기 화학식 2의 제조 방법은 도 7 내지 11에 예시하였다. 이 점에 있어서, 세 가지 대표적인, 신규의 A, B 고리 치환된 실릴캄프토테신 화합물 (36a), (36b) 및 (36c)를 도 7에 예시하였다.
이 유사체의 합성에서 첫 번째 단계는 도 8에 나타낸 바와 같이 프로파질 브로마이드(41)를 제조하는 것이다. 통상적으로 이용 가능한 트리메틸실릴프로판올(37)의 스원(Swern) 산화반응을 통해 트리메틸실릴프로판알(38)을 85% 수율로 생성시켰다. Sakar, T.K. 등의 Tetrahedron 46, 1885(1990)을 참조할 수 있다. Corey, E. J. 및 Fuchs, P.L.의 Tetrahedron Lett., 36, 3769 (1972)에 개시된 방법 A에 따라, 알데히드(38)을 디브로모올레핀(39)로 55% 수율로 전환시켰다. Piers, E. 및 Gaval, A.V., J. Org. Chem., 55, 2374 (1990)을 참조할 수 있다. -78 ℃에서 THF내의 n-BuLi 2 당량을 첨가하고, 22 ℃로 승온시킨 후에 환류시키며 파라포름알데히드로 퀀칭(quenching)하여 생성물(40)을 84% 수율로 생성시켰다. 최종적으로, 트리페닐포스핀과 Br2의 무수 CH2Cl2 용액로부터 프로파질 브로마이드(41)를 87% 수율로 얻었다.
프로파질 브로마이드(41)의 제조를 종결함에 있어서, 라디칼 전구물질(43)은 도 9에 나타낸 바와 같이 제조하였다. N-알킬화 반응 공정에 따라, (42)를 (41)로 알킬화하여 목적하는 라디칼 전구물질(43)을 74% 수율로 얻었다. (43)과 각각의 이소니트릴 (44a) 또는 (44b)와의 반응으로부터 보호기 치환된 실릴캄프토테신 유도체 (45a) 및 (45b)를 도 10 에 나타낸 바와 같이 각각 55% 및 56% 수율로 얻었다. 최종적으로, MeOH/H2O 용액내의 K2CO3 2 당량에 의한 (45a)의 탈보호기화 반응을 통해, 도 10에 나타낸 바와 같이 10-히드록시 유도체(36a)를 47% 수율로 얻었다. 끝으로, CH2Cl2내의 트리플루오로아세트산에 의한 처리를통해 (45b)를 10-아미노 유도체 (36b)로 65% 수율로 전환시켰다.
본 발명의 방법은 또한, (20S)-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신(36c, 도 7)의 편리한 합성법을 제공한다. 페닐 이소니트릴과 요오드 피리돈 (43)과의 반응을 통해, 이 유도체를 52% 수율로 생성시킨다(도 10). (20S)-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36c) 및 (20S)-7-(2-트리메틸실릴)캄프토테신(미국특허출원 제 08/436,799 호에 기재됨) 구조는 최근에 Haysheer 등에 의해 국제특허출원공보 제 WO 98/07727 호에 개시되어 있다. 상기 국제특허출원공보 제 WO 98/07727 호에 기재된 이들 화합물들에 관한 특성 정보는 정확하지 않은 것으로 보인다. 특히, 이들 화합물 둘 다에 대해 제공된 분광학적 데이타는 지정된 구조와 모순을 나타내고 이 특허의 실시예에서 보고되는 분광학적 데이타와도 어떠한 점에서도 일치하지 않는다. 부가적으로, WO 98/07727에서 모든 실릴-함유 캄포테신 모두에 대한 분광학적 데이타가 지정된 구조와 모순된 것으로 보인다.
따라서, 본 발명은 캄프토테신 계열내에서의 공지 구조-활성 관계에 잘 부합되는 단순하고 효과적인 합성 반응식을 제공한다. 실제로, 캄프토테신 골격의 생물학적 활성은 일반적으로 7 및/또는 9-11 번 이외의 위치에서 치환기들에 대해 엄격하거나 매우 한정적으로 허용된다. 합성 후에, 이들 치환기들은 각각 알키닐 유도체(3) 및 아릴이소니트릴 (5)을 통해 유도되었다.
항암 활성 및 인체 혈액 안정성 특성
상기 화학식 1의 몇몇 화합물들의 항암 활성을 다음 표 1에 나타내고, 다음에 추가로 기술한 바와 같은 몇몇 공지 분석을 이용하여 몇몇 공지의 캄프토테신 유사체의 화성과 비교하였다. 다음 표 1에 나타낸 바와 같은, 본 발명의 다양한 예시적 화합물들을 합성하는 것은 이 단락 이후의 실시예 단락에서 추가로 상세히 기재하였다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 캄프토테신(CPT) 및 이리노테칸(IRT)과 비교하여 우수한 항암 활성이 발휘된다.
세포독성 평가
캄프토테신 유도체를 시험관내에서 HL-60(인체 전골수구성 백혈병성), 833K(인체 기형암) 및 DC-3F(햄스터 폐) 세포의 생장에 대한 세포독성 효과를 평가하였다. 이 세포들을 5 × 10-4 cell/mL의 초기 밀도로 배양하였다. 이들은 페니실린(100 ㎍/mL)/스트렙토마이신(100 ㎍/mL)(GIBVO-BRL) 및 10% 열처리 비활성화된 태아 보바인(bovine) 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지(GIBCO-BRL Grand Island, New York)내에서 5% CO2 습윤화 대기 하에서 37 ℃로 유지하였다. 이 평가는 96-웰 마이크로플레이트에서 반복하여 수행되었다. 72 시간 인큐베이션 후에 HL-60 세포들에 대한 상기 화합물들의 세포독성을 XTT-마이크로컬쳐 테트라졸륨 분석으로 측정하였다. Scudiero, D.A., 등의 Cancer Res., 48, 4827 (1988)을 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 본문의 참고문헌이 된다. 2',3'-비스(-메톡시-4-니트로-5-설페닐)-5-[(페닐아미노)카르보닐]-2H-테트라졸륨 하이드록사이드 (XTT)를 예열된(37 ℃) 혈청이 없는 배지내에서 1 mg/mL로 제조하였다. 페나진 메쏘설페이트(PMS) 및 새 XTT를 함께 혼합하여 0.75 mM PMS-XTT 용액을 얻었다(1 mg/mL XTT의 5 mL 당 5 mM PMS 원액 25 uL을 첨가함). 이 혼합물 50 uL를 72 hr 인큐베이션의 마지막에 세포 배양의 각 웰에 첨가하였다. 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션한 후에, 마이크로플레이트 판독기(EL340, Buo-T다 Instruments, Inc., Winooski, Vermont)로 450 nm 및 630 nm에서의 흡수치를 측정하였다.
833K 기형암 충실성 종양 세포 및 DC-3F 햄스터 폐 세포에 대한 캄프토테신 화합물의 세포독성은 세포성 프로테인 함량 측정을 위해 Skehan 등에 의해 개시된 방법으로 96-웰 마이크로플레이트내에서 검측하였다. Skehan 등의 "New Colormetric Cytotoxicity Assay for Anticancer Drug Screening," J. NAt'l Cancer Inst., 82, 1107 (1990)을 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 본문의 참고문헌이 된다. 배양액을 트리클로로아세트산으로 정착시킨 후에, 1% 아세트산에 용해된 0.4% 설포로다마인 B로 30 분 동안 염색하였다. 아세트산으로 정착되지 않은 염료를 씻어내 제거하고, 96-웰 마이크로플레이트 판독기내에서 570 nm의 흡수치를 측정하기 위해 비완충성 트리스(unbuffered Tris) 염기[tris(히드록시-메틸)아미노메탄]로 프로테인-결합된 염료를 추출하였다. 이 실험들은 5 내지 6 가지 농도의 테스트 약물들로 반복하여 수행하였다. 데이타를 컴퓨터 소프트웨어를 통해 분석하였다. Chou, J, 및 Chou, T.C.의 Dose-Effect Analysis with Microcomputers: Quantitation of ED, LD, Synergism, Antagonism, Low-Dose Risk, Receptor-Logand Binding and Enzyme Kinetics, 2nd ed., Biosoft, Cambridge (1987); 및 Chou, T. C.의 "The Median-Effect Principle and the Combination Index for quantitation of Synergism and Antagonism", Synergism and Antagonism in Chemotherapy, Academic Press, San Diego, 61-102(1991)를 참조할 수 있으며, 상기 문헌들은 본문이 참고문헌이 된다.
토포 I 매개성 DNA 분해 평가
DNA분해 평가를 위해, 반응 혼합물은 상기한 바와 같이 20 uL의 최종 부피로의 정제된 DNA 국소이성화효소 I의 존재 하에서, 트리스-HCl 완충액 10 mM, pH 7.5; PBR 초나선화된 이중나선 환상 DNA (4363 염기쌍, Bochringer Mannheim Biochemicals로부터 구입) 0.125 ㎍/mL. 약물(캄프토테신 또는 그의 유도체) 농도 1, 10 및 100 uM을 함유하였다. Hsiang, Y.H. 등의 "Camptothecin Induces Protein-LinkedDNA Breaks Via Mammalian DNA Topoisomerase I", J. Biol. Chem., 260, 14873 (1985)을 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 본문의 참고문헌이 된다. 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션을 수행하였다. 로딩 완충 염료(2% 소듐 도데실 설페이트, 0.05% 브로모페놀 블루 및 6% 글리세롤)을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 전기영동법은 TBE 완충제내에서 에티듐(ethidiun) 브로마이드 (1 ㎍/mL) 플러스 1% 아가로스 겔상에서 컷팅을 수행하고, 25 V에서 18 시간 동안 가동하였다. UV 광 하에서 폴라로이드 필름 타입 55/N을 이용하여 사진을 찍고, 제조사에서 지시한 바에 따라 현상하였다.
초나선화된 DNA의 토포 I 매개성 이완의 억제
DNA 국소이성화효소 I 매개성 DNA 이완에 대한 억제 효과를 연구하기 위하여, Liu 및 Miller에 의해 개시된 방법을 사용하였다. Lie, H. F. 등의 "Cleavage of DNA by Mammalian DNA Topoisomerase II", J. Biol. Chem., 58, 15365 (1980)을 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 본문의 참고문헌이 된다. 이러한 평가를 위해, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 120 mM KCl, 10 mM MgCl, 0.5 mM DTT, 0.5 mM EDTA, 30 ㎍.mL BSA, 20 ㎍/mL PBR322 DNA 및 다양한 양의 효소를 함유하는 반응 혼합물내의, PBR322 DNA 0.18 ㎍, 토포 I(GIBCO-BRL) 0.5 U, 다양한 농축액(캄프토테신 또는 그의 유사체 1-100 uM)을 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고, 5% SBS 및 150 ㎍.mL 프로테인나제 K로 종결시켰다. 샘플을 TAE 가동 완충액내 1% 아가로스상에 로딩하고, 39 V로 밤새 전기영동시키고, EtBr로 염색하고, UV 광 하에서 촬영하였다.
생체내 항암 활성
캄프토테신 유도체의 항암 활성을 육종-180 또는 루이스 폐 마우스 충실성 종양을 갖고 있는 B6D2F1 마우스로 테스트하였다. S-180의 경우, 3 × 10
6 세포들을 3 일째에 피하주사를 통해 접종하였다. 항암 치료를 복강내 주사를 통해 1일째에 시작하여 매일 2 회씩 5 일 동안 수행하였다. 7 일 및 14 일째에 종양 크기를 측정하였다. 평균 종양 크기를 치료군과 비처리된 대조군과의 비율(T/C)로서 기재하였다. 7일 및 14일의 대조군(DMSO 부형제만으로 치료함) 종양 부피는 각각 0.11 cm3 및 0.61 cm3이다. 캄프토테신의 T/C를 "+++"로 정의한다. 2 mg/kg 투여량에서 14일에 캄프토테신 T/C와 비교하여 10%의 증감은 각각 "+" 하나 단위로 증감을 나타내었다.
루이스 폐암의 경우, 종양 세포들(1 × 106)을 0일째에 피하 접종하고 1일째에 복강내 주사로 치료를 시작하여 매일 2 회씩 5일 동안 수행하였다. 효과의 등급은 상기한 바와 같다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 시험관내 항암 세포독성에 대해 테스트된 화학식 1의 캄프토테신 유도체 다수가 하나 내지 세 개의 세포계에서 캄프토테신 보다 우수한 성능을 발휘하였다. 좀더 우수한 항암 세포 독성을 나타내는 이들 화합물들 대부분이 또한, PBR322 DNA의 DNA-국소이성화효소 I-매개성 분해를 증가시키는 데에서, 또는 PBR322 DNA의 DNA-국소이성화효소 I-매개성 이완을 억제하는 데에서도 더욱 우수한 성능을 발휘하였다. 이같은 결과들로부터, 캄프토테신 화합물의 항암 세포독성 효과와 DNA-국소이성화효소 I의 작용을 억제하는 성능 사이의 뛰어난 상관관계를 알 수 있다.
종양 내포 마우스의 생체내 화학치료요법 효과의 경우, 예컨대, 7-트리메틸실릴 캄프토테신이 종양 부피 축소 측면에서 투여량 의존 방식으로 몇몇 동일한 투여량에서 B6D2F1 마우스내 육종 180에 대해 캄프토테신보다 우수한 활서을 나타내었다. 마찬가지로, 루이스 폐암의겨우, 7-트리메틸실릴-11-플루오로 캄프토테신이 캄프토테신보다 4 배나 적은 투여량으로 종양 크기 축소 측면에서 캄프토테신과 동일한 효과를 나타내었다. 따라서, 7-트리메틸실릴-11-플루오로 캄프토테신이 생체내 항암 효과면에서 캄프토테신보다 더욱 효과적임을 알 수 있다.
인체 혈액내에서 안정성
최근에, 캄프토테신의 락톤 및 카르복실레이트 형태들로부터의 내인성 형광 방출이, 이들의 현저히 상한 인체 열핵 성분과의 상혼관계를 명확히하기 위해 연구연구되었다. Burke, T. G. 및 Mi, Z.의 "Ethyl substitution at the 7 position extends the half-life of 10-hydroxycamptothecin in the presence of human serum albumin", J. Med. Chem. 36: 2580-2582(1993); Bruke, T. G., Mishra, A. K., Wani, M. C. 및 Wall, M. E.의 "Lipid bilayer paratitioning and stavility of camptothecin drugs", Biochemistry. 32: 5352-5364 (1993); Burke, T.G. and Mi, Z.의 "Preferential Binding of the Carboxylate Form of Camptothecin by Human Serum Albumin", (1993) Anal. Biochem. 212, 285-287; Burke, T.G. 및 Mi, Z.의 "The Structural Basis of Camptothecin Interactions with Human Serum Albumin: Impact on Drug Stability", (1994) J. Med. Chem. 37, 40-46; Burke, T. G. Munshi, C. B., Mi, Z. 및 Jiang, Y.의 "The Important Role of Albumin in Determining the Relative Human Blood Stabilities of the Comptothecin Anticancer Drugs," (1995) J. Pharma. Sci. 84, 518-519; Mi, Z. 및 Burke, T. G.의 "Differntial Interactions of Camptothecin Lactone and Carboxylate Forms with Human Blood Components", (1994) Biochemistry, 33, 10325-10336l Mi, Z. 및 Burke, T. G.의 "Marked Interspecies Variations Concerning the Interactions of Cmptothecin with Serum Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic Study," (1994) Biochemistry 33, 12540-12545; Mi, Z., Malak, H., 및 Burke, T. G., "Reduced Albumin Binding Promotes the Stability and Activity of Topotecan in Human Blood," (1995) Biochemistry, 34, 13722-13728을 참조할 수 있으며, 상기 문헌들은 본문의 참고문헌이 된다.
pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)내에서, 주파수-대역(frequency-domain) 형광 수명 스펙트로스코피를 통해 인체 혈청 알부민(HSA)가 선별적으로 캄프토테신 락톤 형태보다 200 배 정도의 높은 친화력으로 캄프토테신의 카르복실레이트 형태와 결합한다는 것을 알게 되었다. 이러한 상호관계는 프로테인이 없는 것보다는 HSA 존재 하에서 더욱 신속하고 완전한 캄프토테신의 개방시키는 것을 초래한다. pH 7.4 및 37 ℃의 인체 혈장내에서, 캄프토테신 락톤은 11 min의 t1/2 수치로 카르복실레이트 형태로 신속하고 완전하게 개방되고, 평형치에서 0.2%로 거의 무시할 정도 %의 락톤이 있게 된다. 전혈(whole blood ) 대 혈장내에서, 캄프토테신은 증진된 안정성을 나타내었다(22 분의 t1/2 수치 및 평형치에서 5.3%의 락톤%). 인체 혈액내에서 캄프토테신의 증진된안정성은 적혈구의 지질 이중층과 약물 결합 때문이라고 알려졌다. 캄프토테신은 적혈구막과 결합하고, 약물은 아실 사슬 영역내에 존재하고, 다라서 가수분해로부터 보호차단되어 남게 된다.
몇몇 임상학적으로 흥미를 끄는 캄프토테신 유사체의 인체 혈액 안정성을 비교하였다. 캄프토테신의 경우에서 관찰된 바와 같이, 9-아미노캄프토테신이 HSA를 포함하는 PBS 용액내에서 거의 완전하게(>97%) 가수분해하는 것으로 관찰되었다. 캄프토테신에 비해 현저히 감소된 형광 양자 수율 때문에 9-아미노 동류물의 락톤 및 카르복실레이트 형태의 상대 결합 친화도를 분광학적으로 정량하는 시도가 수행되지는 않았지만, HPLC 데이타가 락톤 형태에 비해 카르복실레이트 형태에 선별적으로 결합하는 HSA와 일치하는 바이다. 혈장에서, 9-아미노 유사체의 >99.5%가 카르복실레이트로 전환되는 것이 관찰되었으며, 이러한 결과는 캄프토테신을 사용하여 얻어진 안정성 데이타와 매우 유사하다. 전혈에서, <0.5% 및 5.5%가 각각 9-아미노캄프토테신 및 캄프토테신의 분획들이었으며, 평형시에 락톤 형태로 남아 있었다. 9-아미노캄프토테신에 비해 캄프토테신의 경우에서 평형시에 남아 있는 락톤의 약 10-배 정도 더 많은 레벨은, 부분적으로 캄프토테신의 수용성 환경으로부터 전혈내에 존재하는 적혈구 막으로의 전이에 대한 좀더 큰 성능 및 증진된 친지질성 때문에 초래되는 것일 수도 있다.
캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신의 인체 전혈내에서 평형시 남아 있는 락톤의 낮은 레벨들(각각, <0.5% 및 5.3%)과 뚜렷한 대조를 이루는 것으로, 토포테칸(11.9%), CPT-11(21.0%) 및 SN-38(19.5%) 모두는 향상된 혈액내 안정성은 나타낸다. 토포테칸의 평형시 락톤 레벨이 9-아미노캄프토테신에 비해 20-배나 큰 반면에 10-히드록시-7-에틸캄프토테신(SN-38) 및 IRT(CRT-11)의 락톤의 해당 레벨은 9-아미노캄프토테신의 경우에 대략 40-배 정도 크다. 토포테칸, CPT-11 및 SN-38의 상대 안정성에서의 현저한 증가는 이들의 HSA와의 유리한 상호작용과 연관된 것일 수 있다. 이들 작용제는 HSA에 의한 카르복식레이트 약물 형태의 선별적 결합을 억제 및 저해하는 7- 및 9- 위치에서의 구조적 치환기들을 포함한다. 최근에 시간-분해능(resolved) 형광 비등방성의 기법이 사용되어, 캄프토테신 카르복실레이트가 HSA와 결합하고 단백질과 매우 연관성이 높은 용액에 친화력이 높은 조건 하에서, 토포테칸 및 CPT-11의 카르보실레이트 형태는 HAS와 결합하지 않는 것이 밝혀졌다. SN-38의 경우, HSA가 선별적으로 이 작용제의 락톤 형태와 결합하여, 락톤-카르복실레이트 평형을 락톤쪽으로 이동시키는 것을 나타내는 직접적인 분광학적 증거가 얻어졌다.
따라서, 이러한 관찰들로부터 HSA가 캄프토테신의 상대적 인체 혈액내 안정성을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 명확하다. 캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신의 경우, 단백질은 열린 고리 종류와결합하여 카르복실레이트쪽으로 락톤-카르복실레이트 평형 상태를 이동시켜, 카르복실레이트 약물 형태에 대한 유도관과 같은 역할을 한다. 그러나, 토포테칸, CPT-11, 및 SN-38의 경우, 이같은 카르복실레이트 약물 형태의 선택적 결합이 관찰되지 않는다. 캄프토테신 및 그의 9-아미노 유사체와의 상황과는 대조적으로, HSA는 선별적으로 SN-38의 락톤 형태와 결합하여 이 생물학적 활성 종류의 좀더 높은 순환상의 레벨을 촉진시킨다.
통상적으로 임상학적으로 캄프토테신과 관련하여 발생하는 활성 약물의 신속하고 광범위한 손실은, 향상된 인체 혈액 안정성 및 감소된 단백질 결합 상호작용을 갖는 캄프토테신을 확인하는 데 매우 유리할 수도 있다는 것을 나타낸다. 이 점에 있어서, 본 발명의 캄프토테신 유사체는 높은 항암 활성을 유지하며 동시에, 향상된 인체 혈액 안정성을 나타내는 작용제를 초래하는 고유의 특성을 나타내는 것이다.
리피드 이중층 분할(즉, 친지질성) 및 락톤 고리 안정성의 측정을 위한 실험 방법
약품. 모든 캄프토테신 유사체는 20(S) 배열를 갖고, 형광 검측에 의한 HPLC 분석을 통해 측정된 높은 순도(>98%)를 갖는 것이었다. 모든 기타 작용제들은 시약급이었으며, 추가 정제 과정 없이 사용하였다. Milli-Q UV PLUS 정제 시스템(Bedford, MA)로부터 공급되는 고순도의 물을 모든 실험에 이용하였다.
약물 원액의 제조. 약물 원액을 디메틸설폭사이드(A.C.S. 분광광도계적 등급, Aldrich, Milwaukee, WI)를 2 × 10-3 M 농도로 제조하여 4 ℃ 암실에서 보관하였다. L-α-디메리스토일포스파티딜클로린(DMPC) 및 L-α-디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)를 Avanti Polar Lipids, Albaster, AL로부터 구입하여 추가 정제 과정없이 사용하였다. 기타 약품들 모두는 시약급으로 추가 정제 과정 없이 사용하였다.
소체의 제조. 작은 단층판 소체(SUV) 현탁액을 Burke 및 Tritton의 "The Structure Basis of Anthracycline Selectivity for Unilamellar Phosphatidylcholine Vesicles: An Equilibrium Binoinl Study", Biochem 24: 1768-1776(1985)에 개시된 방법에 따라 실험하는 날 제조하였다. 간략하게, 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4)내에 200 mg/mL 리피드를 함유하는 리피드 현탁 원액을 리피드의 TM 이상에서 5-10 min 동안 회전(Vortex) 혼합하여 제조하였다. 그 후에, 이 리피드 분산액을 배쓰-타입 소니케이터(sonicator: Laboratory Supplies Co., Hicksville, NY)를 이용하여 이들이 광학적으로 투명해질 때까지 3-4 시간 동안 소니케이팅하였다. DMPG의 SUV 제조의 경우 7.4에서 6.8로 pH 감소가 관찰되고, 이에 따라, 이들 SUV 현탁액의 pH를 PBS내 2.5 M NaOH 소량을 사용하여 7.4로 조정한 후에, 추가 소니케이션을 수행하였다. 각 타입의 소체 현탁액을 37 ℃에서 30 분 동안 아닐링한 후에, 실험에 사용하였다.
형광 기기. 항정-상태 형광 측정은 온도 조절 가능한 큐벗(cuvette) 장치가 장착된 SLM Model 9850 스펙트로플로오로미터상에서 얻어졌다. 이 기기는 IPM PS/2 model 55 SX 컴퓨터로 인터페이스되었다. 들뜸 및 방출 스펙트럼이 8 nm의 들뜸 분해능(resoltion) 및 4 nm의 방출 분해능으로 기록되었다. 모든 경우에, 스펙트럼은 바탕(background) 형광에 대해 보정되고, 바탕값 스펙트럼을 감산함으로써 비표지된 리피드 또는 용매를 산란시켰다. 항정-상태 형광 세기 측정은 폴라라이저(polarizer) 없이 수행되었다. 항정-상태 비등방성 (a) 측정은 두 개의 편극화된 세기들의 동시 측정용 "T-포멧(format)"으로 이 장치를 이용하여 검측하였다. 폴라라이저의 정력은 물내에서 0.25 ㎛ 폴리스틸렌 마이크로스피어(Polysciences, Inc., Warrington, PA)의 묽은 현탁액을 이용하여 통상적으로 점검되거, >0.99의 비등방성 수치를 얻었다. 또한, 폴라라이저 배치는 글리코겐의 묽은 수용액을 이용하여 점검하였다. 비등방성은 a = (IVV - GIVH)/(IVV
+ GIVH)로부터 산측되었으며, 여기서 G = IVH/IHH이고, 아래첨자들은 각각 들뜸 및 방출(emission) 폴라라이저의 수직(vetical) 및 수평(horizontal) 위치와 관련된 것이다.
캄프토테신의 비등방성 측정은 370 nm의 들뜸광과 약물의 형광 시그널을 바탕 산란 및/또는 잔류 형광과 분리할 수 있도록 하는 각 방사 채널에 대한 롱 패스 필터들(long pass filters)을 이용하여 수행하였다. 모든 방사 필터들은 Oriel Corp(Stamford, CT)로부터 구입하였다. 들뜸광과 방사 필터를 병용함으로써 바탕 시그널과 형광을 적절하게 분리할 수 있다. 산란광과 함께 바탕 형광의 기여는 전형적으로 전체 세기의 1% 미만이었다. 캄프토테신 및 그의 관련 동류물의 락톤 고리는 대략 20 min.의 반감기로 수용성 배지내에서 가수분해되었으며, 모든 측정은 약물 원액과 열적으로 미리 평형을 이룬 용액들을 혼합한 후에 가능한 짧은 시간(약, 0.5 내지 1 min)내에 완결시켜, 이 실험에서 가수분해 생성물이 없도록 하였다.
평형 결합 상수의 측정. 형광 비등방성 적정 방법은 Burke, T. G., Mishra, A.K., Wani, M. C. 및 Wall, M. E.의 "Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs", Biochemistry 32: 5352-5364 (1993)에 기재된 바와 같으며, 리피드 농도를 변화시키고 1 × 10-6 M의 총 약물 농도를 함유하는 리포솜 현탁액내 약물의 결합된(bound) 종류 및 유리된 종류의 농도를 측정하는 데 이용하였다. 모든 실험들은 글래스 튜브내에서 수행하였다. 전체 결합 상수를 K = [AB]/[AF][L]로서 정의하고, 여기서 [AB]는 결합된 약물의 농도를 나타낸 것이며, [AF]는 유리된 약물을 나타낸 것이고, [L]은 샘플의 리피드 농도를 나타낸 것이다.결합 등온식의 이중-상반 플롯{1/(약물의 결합 분획) vs. 1/[리피드]}은 선형이고, K 값은 선형 최소 스퀘어즈(linear least squares) 분석 방법에 의해 이들의 슬로프로부터 측정되었다. K = [AB]/[AF][L] 관계에 기초한 컴퓨터 프로그램을 가동시켜 전체 약물 및 특정 수치의 K에 대해 결합된 약물 레벨을 예측하였다.
락톤 고리 개방화 반응의 동력학. 다양한 혈액 성분들의 존재 하에서 캄프토테신의 가수분해 동력학을 정량적인 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 의해 전술한 바와 같은 Mi 및 Burke (1994)의 문헌에 기재된 바와 같이 측정하였다. 전혈 및 분획화된 혈액 샘플의 제조는 전술한 바와 같이 수행하였다. Sigma Chemical(St. Louis, MO)제의 고순도(>97%)의 결정화된 HSA를 이용하였다. HSA 원액을 7.40 ± 0.05의 최종 pH를 갖는 PBS 완충액으로 제조하였다. HSA 농도는 39,800 M-1cm-1(Porter, 1992)의 흡광 상수를 이용하여 278 nm에서의 UV 흡수치로 측정하였다. ahes 기타 작용제들은 시약급으로 추가 정제 없이 사용하였다. Milli-Q UV PLUS 정제 시스템(Bedford, MA)로부터 공급되는 고순도의 물을 모든 실험에 이용하였다.
세포 배양 실험의 시험관내에서 측정된 본 발명의 높은 친지질성 캄프토테신의 항암 활성
세포. 세포독성 측정은 MDA-MB-435 발암성 인체 유방암 세포를 이용하여 수행하였다. 이 세포들은 약물 농도 범위에 72 시간 동안 노출시킨 후에, 설포로다민 B(SRB) 분석을 이용하여 생존력을 측정하였다. SRB 분석은 표준 분석을 이용하여 수행하였다.
본 발명의 캄프토테신 유사체가 리피드 소체에 대해 예외적으로 높은 평형 결합 상수를 나타냄을 검증하는 형광 비등방성 적정
도 12 내지 15는 몇몇 신규 캄프토테신 유사체의 형광 들뜸 및 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 12는 인산염 완충 식염수 용액내에서 1 uM DB-172의 들뜸 및 방출 스펙트럼을 약술한 것이다. 상기 도면으로부터 리피드 이중층을 샘플에 도입할 때, 약물가 막 사이의 상호 작용을 나타내는 화합물의 형광 방출이 증가하는 것을 알 수 있다. 용매를 에탄올로 바꿀 경우, 형광 또한 달라진다. 도 13 내지 15는 각각 DB-173, DB-174, 및 DB-67의 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. 각 경우에 있어서, 리피드 이중층으로의 약물 분배로서의 형광 세기에 현저한 증가가 있다. 각 경우에, 약물의 막과의 상호작용시 좀더 낮은 파장으로의 방출 스펙트럼내 이동 또는 주요한 블루-쉬프팅이 또한 있다. 도 12 내지 15에 제공된 스펙트럼 데이타로부터 신규 작용제가 형광성을 나타내고 샘플에 대한 리피드 이중층 막의 첨가시에 약물의 스펙트럼 인자들이 변화된다는 것을 명확히 알 수 있다. 다음 표 2는 신규 캄프토테신 유사체와 이전에 만들어진 동류물의 최대 들뜸 및 방출 파장을 비교하였다. 캄프토테신의 고유의 형광 특성 때문에, 항정-상태 형광 비등방성 측정의 민감성 방법이 다양한 동류물과 지질 이중층의 결합 상호작용 강도를 측정하는 데 이용될 수 있게 된다.
| DMPC 및 DMPG SUVs에 결합된 및 용액내 캄프토테신 유사체 형광 스펙트럼 인자 | ||||
| 화합물 (S) | 들뜸(nm) | 방출 (nm) | ||
| PBS | PBS | DMPC | DMPG | |
| 캄프토테신 | 367 | 430 | 422 | 415 |
| 7-메틸캄프토테신 | 366 | 421 | 418 | 405 |
| 7-에틸캄프토테신 | 367 | 422 | 419 | 406 |
| 7-프로필캄프토테신 | 366 | 422 | 419 | 406 |
| 7-메틸-10-에톡시캄프토테신 | 376 | 430 | 401 | 400 |
| 7-에틸-10-메톡시캄프토테신 | 376 | 430 | 403 | 406 |
| 7-프로필-1-메톡시캄프토테신 | 376 | 430 | 404 | 404 |
| DB-67 | 400 | 550 | 445 | 440 |
| DB-172 | 370 | 424 | 424 | 422 |
| DB-173 | 395 | 526 | 503 | 502 |
| DB-174 | 380 | 550 | 433 | 431 |
| DB-202 | 377 | 450 | 439 | 437 |
| CHJ-792 | 400 | 531 | 517 | 519 |
본문에서 다음과 같은 정의를 사용한다: DB-172, (20S)-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36c); DB-173, (20S)-10-아미노-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36b); DB-174, (20S)-10-히드록시-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36a); DB-67, (20S)-10-히드록시-7-(tert-부틸디메틸실릴)캄프토테신; DB-148, (20S)-7-(3-클로로프로필디메틸실릴)캄프토테신; DB-158, (20S)-10-히드록시-7-(3-클로로프로필디메틸실릴)캄프토테신; DB-202, (20S)-7-(tert-부틸디메틸실릴)캄프토테신; CHJ-792, 10-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신 (20); DB-124, 10-히드록시-7-(3-디메틸아미노프로필디메틸실릴)캄프토테신 하이드로클로라이드염; 및 DB-104, 7-(3-디메틸아미노프로필디메틸실릴)캄프토테신 하이드로클로라이드염.
항정-상태 형광 비등방성 (a) 측정은 다음과 같은 페린(Perrin) 방정식을 통한 형광 분자의 회전율과 관련된 것이며:
식 중, ao는 탈분극화 회전 없이 한정 형광 비등방성을 나타낸 것이며, τ 는 들뜸-상태 수명을 나타낸 것이고, Φ는 플루오로포어의 회전 상관성 시간을 나타낸 것이다.상기 방정식은 형광 화합물의 τ 또는 Φ 값내에서의 변화가 항정-상태의 비등방성을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
PBS, 글리세롤 및 메탄올내에서의 캄프토테신의 들뜸-상태 수명치는 37 ℃에서 측정되었다. 수명치는 각각 4.7 ns, 3.8 ns 및 3.5 ns으로 측정되었다. 마찬가지로, DMPC 이중층과 결합할 때 캄프토테신의 수명치도 37 ℃에서 측정되었으며, 막-결합 약물에 대한 평균치는 3.7 ns로 관찰되었다.
따라서, 전술한 바와 같은 수명 측정은 캄프토테신의 들뜸-상태 수명이 미세 환경 변화(예컨대, 용매 변화 또는 수용성 환경으로부터 인지질막으로의 플루오로포어 재배치 등)에 비교적 덜 민감한 것임을 나타낸다. 회전 운동에 강한 영향을 미치는 전이(예컨대, 용매 점도에서의 변화 또는 리포솜 입자와 같은 거대 매크로분자 어셈블리와의 플루오로포어의 결합 등) 동안에 τ값이 비교적 일정하게 남아 있는 플루오로포어의 경우, 상기 페린 방정식은 a 및 Φ값들 사이에 직접적인 상관관계가 존재할 것임을 나타낸다(즉, 형광 화합물의 Φ 값이 증가하게 되면, 이에 따라 항정-상태 비등방성 수치가 역시 같이 변화됨).
캄프토테신 유사체의 항정-상태 형광 비등방성 수치들은 용매 점도 및 적은 단층판 리피드 소체와의 결합에 매우 민감하다. 예컨대, 토포테칸은 PBS내에서 0.008의 a 값을 갖으나, 점도성 용매 옥탄올 및 글리세롤에서는 a 값이 각각 9-배 및 40-배로 증가된다. 약물이 DMPC 또는 DMPG로 이루어진 소체에 결합하는 경우 캄프토테신의 a 값 수치가 21-배 증가하는 것이 관찰되었다. 막 결합에 대해 캄프토테신 약물의 a가 민감하기 때문에, 형광 비등방성 적정 방법을 캄프토테신 유사체와 리피드 이중층과의 평형 결합 연구에 이용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이 실험은, 세트내 구성원들 중에서 리피드 농도가 0 내지 0.29 M로 변화되는 동안에, 각각의 약물 농도가 일정한(전형적으로 1 또는 2 uM) 샘플들의 세트에 대한 a 값을 측정하는 것으로 이루어졌다.
새로 합성된 캄프토테신류로부터의 놀라운 형광 방출의 결과(스펙트럼 인자들들은 상기 표 2에 약술하여 나타냄)로서, 도 16 내지 18에 약술된 흡수 등온선은 비교적 어떠한 바탕 시그널도 나타나지 않았다. 1 uM의 약물 농도 및 방사광을 바탕 시그널로부터 분리하는 롱 패스 필터들을 이용함으로써(즉, 존재 가능한 불순물에 기인한 외부 형광 시그널 및 들뜸광 산란됨), PBS 완충액에 용해된 약물로부터의 시그널 레벨이 막이 없이 전형적으로 99.97%이고, 막 존재 하에서는 99.97% 이상이였다. 흡수 등온성은 캄프토테신 약물의 전체 결합 상수(overall association constants)를 측정하는데 이용하였다. 전체 결합 상수는 다음과 같이 정의되며:
식 중, [AB]는 결합된 약물의 농도를 나타낸 것이며, [AF]는 유리된 약물을 나타낸 것이고, [L]은 샘플의 리피드 농도를 나타낸 것이다. 상기 방정식은 유리 리피드 농도가 대략 총 리피드 농도와 동일한 경우에(즉, 유리 리피드 농도가 결합 약물의 농도에 비해 현저히 큰 경우에) 유효하다. 이 조건이 충족된다면, K는 이중상반 플롯의 슬로프의 역수로부터 측정될 수 있다. 이러한 이중 상반 플롯(대표적인 데이타는 도 19 및 20에 나타냄)에서, 1/총 약물 결합 분획은 1의 y-인터셉트 값으로(결합 부위 동차성을 나타내는 시스템에 대해) 1/리피드 농도에 대해 플로팅된다. 신규한 캄프토테신 유사체와 DMPC 및 DMPG 작은 단층판 소체(SUV) 조제물들과의 결합에 대한 이같은 이중-상반 플롯은 우수한 상관 계수를 갖는 선형을 나타내었다. 이들 플롯들 및 기타 다른 타임의 막 조제물과의 약물 결합에 대한 해당 플롯들의 선형성은, 이들 리피드 농도에서 결합하는 플루오로포어가 상기 방정식으로 적절하게 기재된 것임을 나타낸다.
다음 표 3에 약술된 연구는 리피드 이중충에 대한 캄프토테신 결합의 구조적 기초를 검사한 것이다. 생리학적 조건에 근사한 pH 및 온도 조건 하에서 수행된 이 연구들에 두 가지 타입의 막이 포함되었으며, 이들 막들은 체액-상(fluid-phase) 및 전기중성 L-α-디미리스토일포스페이티딜콜린(DMPC); 및 체액-상 및 음극-하전된 L-α-디미리스토일포스페이티딜글리세롤(DMPG)을 포함한다. DMPC 및 DMPG는 동일한 사슬 길이를 갖으나, 이들의 머리 부분 치환기상의 하전 상태가 상이하다.
| pH 7.4 및 37 ℃의 PBS 완충액내에서 전기 중성의 DMPG, 음극-하전된 DMPG의단층판 소체와 상호작용을 하는 캄프토테신 유사체의 전체 결합 상수 | ||
| 화합물 | KDMPC (M-1) | KDMPG (M-1) |
| 20(S)-캄프토테신 | 100 | 100 |
| 7-메틸-20(S)-캄프토테신 | 150 | 180 |
| 7-에틸-20(S)-캄프토테신 | 250 | 300 |
| 7-프로필-20(S)-캄프토테신 | 540 | 600 |
| 7-메틸-10-메톡시캄프토테신 | 220 | 200 |
| 7-에틸-10-메톡시캄프토테신 | 340 | 330 |
| 7-프로필-10-메톡시캄프토테신 | 440 | 570 |
| 7-메틸-10-히드록시캄프토테신 | 220 | 90 |
| 7-에틸-10-히드록시캄프토테신 | 260 | 160 |
| 7-프로필-10-히드록시캄프토테신 | 550 | 250 |
| 7-부틸-10-히드록시캄프토테신 | 2100 | 1270 |
| DB-67 | 2700 | 2800 |
| DB-172 | 10500 | 10600 |
| DB-172(카르복실레이트 형태) | 385 | 155 |
| DB-173 | 5800 | 5800 |
| DB-174 | 9000 | 6600 |
| DB-174(카르복실레이트 형태) | 540 | 60 |
| CHJ-792 | 820 | 360 |
상기 표 3의 연구에 있어서, 결합 등온선은 형광 비등방성 적정법을 이용하여 작성되고, K 값은 이중-상반 플롯의 슬로프로부터 측정되었다. 이 K 값들은 10%의 불확정성으로 적용된다. 전체적으로, 상기 표 3에 포함된 데이터의 가장 놀라운 인자는 7 위치에서의 단독 치환 또는 7 및 10 번 위치에서의 이중 치환을 통해 달성될 수 있는 강한 변형이다. 상기 표 3에는 이전에 잘 알려진 캄프토테신 화합물이 포함되어 있다. 이들 작용제들에 대한 데이타는 종래 화합물과 비교하여 본 발명의 신규 캄프토테신의 높은 친지질성 특성을 나타내기 위해 포함되었다. 토포테칸은 캄프토테신에 대한 값보다 10 배 정도 작은 DMPC 리포솜에 대한 K 값을 갖는다. 상기 표 3으로부터, 본 발명의 화합물이 캄프토테신 또는 토포테칸보다 더욱더 친지질성임을 명확히 알 수 있다. 예컨대, DMPC 또는 DMPG로 이루어진 막에 대한 DB67의 친화도는 캄프토테신의 해당 값보다 27-배 및 28-배 크다. DB172 및 DB174은 캄프토테신과 비교할 때 DMPC 막과 100-배 및 90-배 정도 더 결합하기 쉽다. DB173은 또한 높은 친지질성으로, 캄프토테신으로 관찰되는 것보다 58-배 정도 큰 DMPC 막에 대한 K 값을 나타낸다. 약술하면, 상기 표 1에 나타낸 본 발명의 신규 화합물은 α-히드록시-δ-락톤 고리계를 갖는 기타 종래의 캄프토테신 유사체와 비교하였을 때 지금까지 가장 높은 막 친화성을 나타내는 것이라 할 수 있다.
수용액내에서 높은 친지질성 캄프토테신의 반응성 비교
도 21은 생리학적 온도로 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액내에서의 DB172의 안정성을 나타낸 것이다. 다양한 농도의 DB172에 대한 시간에 따른 락톤 분획의 플롯을 상기 도면으로 나타내었다. 약물을 물 부피에 비해 DMSO 부피가 매우 작도록(0.5% 미만) DMSO 농축 원액으로부터 덜은 용액에 첨가하였다. 약물 안정성은 첨가된 약물의 농도에 명확한 의존성을 나타내는 것으로 나타났다. 좀더 희석된 약물 농도에서, 약물은 α-히드록시-δ-락톤 고리계를 갖는 다른 캄프토테신류에 대해 이전에 관찰된 바와 같이 가수분해된다. 높은 약물 농도에서, DB-172의 락톤 고리의 현저한 안정성이 관찰되었으며, 이러한 발견은 전형적으로 다른 캄프토테신류에 대해서는 관찰되지 않은 것이다.
도 22는 pH 및 시간에 따른 DB172의 형광 세기의 의존성을 나타낸 것이다. 이 실험에 있어서, DB172는 락톤 형태로서 용액에 첨가된다. 약물이 락톤 형태로 남아 있는 낮은 pH에서, 시간에 대한 세기의 변화가 가장 작다. 락톤이 좀더 쉽게 가수분해되어 카르복실레이트 형태를 형성하도록 하는 조건이 되는 pH 10에서는, 형광세기에 있어서 현저한 변화가 관찰된다. 락톤으로 이루어진 pH 10 비형광성 미셀성(miscellular) 집합체(aggregates)가 분해되어 모노머성 형광 물질로서 용액내에서 존재하는 경향성을 갖는 열린-고리 카르복실레이트 형태를 형성함을 알 수 있다.
도 23은 농도에 따른 DB172의 형광 세기를 조사한 것이다. 저농도의 락톤 약물을 용액에 첨가한 후에 형광 시그널에서의 변화가 가장 큰 반면에, 고농도(10 uM)에서는 형광 세기 변화가 최소화되었다. 이는 저농도에서, 적은 형광성을 나타내는 DB172의 미셀성 집합체가 분해되어 형광성의 카르복실레이트 물질을 형성할수 있으나, 약물이 고농도인 경우, 작용제가 결합된 형태로 또는 형광성이 적은 상태로 남아 있는 쪽에 유리하게 평형이 작용한다. 도 24는 DB172의 카르복실레이트 형태를 pH 10에서 용액에 첨가하였을 때는 형광 시그널에서의 변화가 관찰되지 않은 반면에, 락톤을 형성될 수 있는 좀더 낮은 pH 수치에서는 시간에 따라 형광 세기가 감소됨을 나타낸 것이다. 다시 한번, 낮은 pH에서 발생하는 이 형광성 저하는 형광 양자 수율 적은 락톤 집합체가 형성되었기 때문에 나타난 것이다.
도 21 내지 24는 미세 분자 약물 농도에서 자체-결합하고 미셀(micelles)을 형성하는 DB172 락톤 특별한 성능에 관한 것이다. 이 미셀성 DB172 집합체는 적은 형광성을 나타낸다. 카르복실레이트가 형성되도록 가수분해가 가능한 조건이라면, 이 샘플의 형광 세기가 증가한다. 도 25는 락톤 약물 형태를 용액에 첨가한 후에 샘플의 형광 방출에서의 변화를 비교한 것이다. 이 실험에서, 각 약물에 대한 수치를 시간이 0일 때 1의 값으로 표준화하고, 시간 = 0에서 상기 약물이 집합체인 경우에 분해하는 다양한 유사체의 성능을 시간에 따라 관찰하였다. 이 작용제 중 몇몇의 경우, 카르복실레이트를 형성하는 가수분해가 용액내에서 발생된다. 카르복실레이트 형태는 자체-결합되어 형광성이 감소되기 쉽지 않기 때문에, 약물 가수분해에 의한 집합체의 분해는 형광 세기에 따라 진행된다. DB172가 시간 = 0에서 매우 높은 정도까지 자체-결합하는 반면에, 기타 작용제들은 아주 적은 정도로 자체-결합하고 있어서 이들의 시그널은 시간에 따라서도 좀더 일정하고 가수분해 반응에 민감하지 않다. DB173 및 DB67은 용액내에서 DB172에 비해 모노머성 약물로서 발견되기가 매우 쉬운 것으로 나타난다. 이는 환자 투여용 용액이 집합체로서 결합된 DB172 입자 현탁액보다는 좀더 균일상이 될 수 있다는 점에서 유리한 특징이 될 수 있다.
인체 혈액내에서 높은 친지질성 캄프토테신의 현저하게 증진된 안정성
본 발명의 높은 친지질성 캄프토테신의 활성 락톤 형태가 또한, 수용성 유사체와 비교하여 혈액과 같은 인체 조직내에서 좀더 장시간 동안 존속된다는 것도 입증되었다. 도 26은 PBS 완충액(패널 A)내에서 대 전혈(패널 B)내에서 유리 형태로 존재하는 몇몇 신규 캄프토테신 유사체의 안정성을 비교한 것이다. 여기에는 다음과 같은 화합물들이 포함된다: 7-t-부틸디메틸실릴캄프토테신 (DB202), 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시캄프토테신 (DB67), 7-(3-클로로프로필)디메틸실릴캄프토테신 (DB148), 및 7-(3-클로로프로필)-디메틸실릴캄프토테신 (DB158). 도 27은 PBS 완충액만내에서(패널 A), HSA의 생리학적 관련 30 mg/mL 레벨을 갖는 PBS 완충액내에서(패널 B) 및 인체 혈액(패널 C)내에서의 DB172, DB173 및 DB174에 대한 안정성 데이타를 나타낸 것이다. 모든 실험은 생리학적 온도에서 수행되었다.
생물학적 활성이며 친지질성인 화합물, 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시캄프토테신(DB-67)이 130 min t1/2 및 30의 평형시 락톤%(9-아미노캄프토테신(<0.3%), 캄프토테신(5.3%), 토포테칸(8.6%), CPT-11(21.0%) 및 SN-38(19.5%)에 대한 인체 전혈내에서 평형치에서의 락톤%와 비교) 값으로, 인체 혈액내에서 우수한 안정성을 나타내는 것으로 나타났다. 이 안정성 데이타를 다음 표 4에 나타내었다. 신규 DB67 작용제는 캄프토테신 보다 25-배 정도 더 친지질성인 것으로 나타났으며, 그의 10-히드록시 작용기가 HSA 존재 하에서의 안정성을 증진시키는 데 현저한 공헌을 하는 것으로 나타났다. DB67은 뇌종양 치료에 대한 이상적인 후보 물질이 될 수 있다. 캄프토테신에 비해 몇 배 더 큰 고유 활성으로, DB67은 인체 혈액내에서 매우 높은 평형 락톤 레벨을 나타내고, 캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신과 같이 인체 알부민과 단단한 결합을 형성하지 않고, 이 작용제가 혈뇌장벽을 용이하게 가로지를 수 있도록 할 수 있는 높은 친지질성을 갖는다.
또한 DB-173(평형시 락톤 36%) 및 DB174(평형시 락톤 33%)의 매우 높은 인체 혈액 안정성도 주목할만한 결과이다. 이들 수치들은 임상학적 관련 수용성 캄프토테신보다 현저히 크고, 이들은 치환되지 않은 A-고리를 갖는 DB-172와 같은 친지질성 캄프토테신과 유리하게 경쟁할 수 있다.
경구 생체적합성을 나타내는 높은 친지질성 캄프토테신
도 28은 DB-67이 위장계로부터 흡수되는 것을 증명하는 데이타를 포함하는 것이다. 5 mg/kgd로 투여한 후에 달성되는 혈액 레벨을 평가하기 위해, 4 마리의 동물들에게 DMSO에 용해시킨 DB-67를 1 mL 위내 주사하였다. 원액은 1.6 mg/mL 농도로 DB67을 함유하였다. 30 min, 1 hr, 2 hr 및4 hr의 시점에서, 혈액 샘플 1 mL를 심장 천공을 통해 채혈하여 모았다. 이 샘플들을 3 min 동안 원심분리하고 분석을 수행하기 전까지 냉동시켰다. 약물의 대부분의 활성 락톤 약물로서 존속하여 DB67 레벨이 40 ng/mL 이상까지 상승됨을 관찰하였다. 따라서, 본문에 기재한 바와 같은 신규의 높은 친지질성 유사체가 경구 투여될 수 있으며, 투여후에 혈류내에서 존재할 것이다.
인체 혈청 알부민 존재 하에서도 높은 항암 성능을 나타내는 높은 친지질성 캄프토테신
앞에 전술한 바와 같이, 수용액상에서 캄프토테신의 자발적 가수분해를 통해 닫힌 고리의 락톤 형태보다 활성이 크게 떨어지는 열린 고리의 카르복실레이트 형태가 생성된다. 따라서, 락톤과 카르복실레이트 형태 사이에서 평형은 약물 활성을 좌우하는 매우 중요한 인자이다. 지금까지의 연구 결과, 인체 혈청 알부민(HSA)이 카르복실레이트 형태와 선택적인 상호작용을 함으로써 캄프토테신의 카르복실레이트쪽으로 유리하게 평형에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이같은 HSA의 효과 때문에, 캄프토테신의 생물학적으로 활성인 락톤 형태의 레벨은 종양 부위에서는 희석될 수 있다. 약물 구조의 변형을 통해 약물-HSA 상호작용을 증가시킬 수 있다. 10-OH 치환기는 HSA에 대한 약물의 친화도를 대략 20-배정도 감소시키고, 추가 7-에틸 치환기는 추가로 결합을 락톤 형태에 유리한 쪽으로 변경시킨다. 본 발명의 혈액-안정성 캄프토테신 유사체의 세포독성에 대한 HSA의 효과를 측정하기 위하여, 캄프토테신 유사체의 세포독성 효과를 연구하였다.
설포로다마인 B(SRB) 분석을 이용하였다. 이 분석은 살아있는 세포내에서 총 단백질 레벨을 측정한다. 죽은 세포로부터의 단백질은 용해되고 TCA 정착 이전의 세정 단계에서 제거된다. 그러나, 초기 단계의 사망시에 세포 역시 막이 보존되어, 내부에 단백질이 함유되어 있을 수도 있다. 결과적으로, 490 nm에서의 광학 밀도가 어느 정도에서 과대 평가되고, 세포 독성이 과소 평가될 수 있다. SRB 분석을 유효화하기 위해, 다양한 범위의 화학치료요법 작용제를 다중 패널의 종양 세포 라인을 통해 테스트하고, 표준 테트라졸륨(MIT) 분석 및 클론원성 분석과 밀접한 상관관계가 있음을 발견하였다. SRB 분석은 지금까지 매우 중시되어진 분석이며 최근에는 NCI로부터 항암 약물 스크린용 표준 분석으로서 인증되었다.
1 mg/mL HSA 존재 하에서 및, 부재 하에서 MDA-MB-435 발암성 전이성 인간 유방암 세포에 대한 다양한 캄프토테신의 세포독성을 다음 표 5에 나타내었다. 약물에 72 시간 동안을 노출시킨 세포에 대한 세포독성 수치를 다음 표 5에 나타내었다. 총괄적으로, HSA는 캄프토테신의 IC50 지수를 현저히 약화시킬 수 있으나, HSA가 신규의 높은 친지질성 유사체의 세포독성에 있어서는 영향을 미치는 정도가 현저히 감소되지 않는다. 사실, 1 mg/mL HSA는 DB173의 세포독성 활성에 대해서는 전혀 영향을 미치지 않았다. HSA 존재 하에서, DB173은 인간 유방암 세포에 대한 낮은 nM의 성능을 나타낸다. 알부민 존재 하에서도 효능이 있는 이 작용제의 성능은 신체 조직 및 혈액 전반에 이같은 단백질이 다량 존재하기 때문에 잠재적인 유의성이 크다고 할 수 있다.
| 인체 혈청 알부민의 존재 및 부재 하에서 MDA-MB-435 발암성 전이성 인간 유방암 세포에대한 캄프토테신 및 유사체의 IC50 지수 | ||
| 화합물 | IC50 지수(nM)(w/o HSA) | IC50 지수(nM)(w/ HSA) |
| 캄프토테신 | 8 | >200 |
| 7-에틸-10-히드록시캄프토테신 (SN-38) | 20 | -- |
| DB-174 | 12 | -- |
| DB-67 | 7 | 22 |
| DB-173 | 4 | 4 |
따라서, 본 발명자들은 캄프토테신 구조의 7 번 위치에 실릴기 또는 실릴알킬기(예컨대, 트리메틸실릴기 또는 트리메틸실릴에틸기)를 도입하는 것이 전형적으로, 캄프토테신(예컨대, (20S)-CPT와 비교하여 실시예 1의 화합물 참조) 및 기타 종래의 캄프토테신 유사체보다 항암 활성 및 인체 혈액 적합성이 우수한 화합물을 야기시키는 것을 알게 되었다. 7 번 및 1 번 위치에서 이중 치환은 더욱 유리하다(예컨대, 화합물 DB-173 및 DB-174 참조). 실릴기 또는 실릴알킬기는 또한 이리노테칸 시리즈에서도 유익하다(예컨대, 이리노테칸과 비교하여 실시예 6 화합물 참조).
실시예 1의 화합물의 10 번 위치에 히드록시기를 도입하여 실시예 5의 화합물을 생성시키는 경우에 항암 활성은 실질적으로 변화 없이 유지된다. 실시예 6의 화합물은 SN-38 관련된 것으로, 이리노테칸의 활성 대사산물이다. 트리메틸실릴기가 11 번 위치에서 불소 원자(예컨대, 실시예 7 화합물 참조) 또는 10 번 또는 11 번 위치에 일차 아민기(예컨대, 각각 실시예 8 및 9 참조)와 함께 도입될 경우에서도, 본 연구에서 높은 활성이 관찰되었다. 또한, 12 번 위치에서 플루오로 원자의 도입은 캄프토테신보다 약 2 배 정도 활성이 저하된 유사체가 초래되었다((20S)-CPT와 비교하여 실시예 11 참조). 이 결과는 이미 문헌을 통해 개시된 12-치환된 캄프토테신의 좋지 않은 활성을 고려하였을 때 놀라운 것이다.
본 발명의 신규한 캄프토테신 유사체는 고유한 생물물리학적 및 생리학적 특성을 갖는다. B-고리 변형 및 A- 및 B- 고리 변형된 이러한 높은 친지질성 캄프토테신 유사체는 인체 혈액내에서 현저하게 향상된 α-히드록시-δ-락톤 고리 안정성을 나타낸다. 본 발명의 캄프토테신 유사체는 또한 경구 생체적합성을 나타내고 인체 혈청 알부민의 존재 하에서도 유효한 항함 활성을 나타낸다.
따라서, 포유류(인간 또는 동물)가 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염을 의약적으로 유효한 양으로 상기 포유동물에게 투여하는 것으로 이루어지는 방법으로 치료될 수도 있다. 이에 의해 상기 포유류의 증상이 개선될 수 있다.
본 발명의 화합물은 다음과 같은 다양한 투여 형태로 투여될 수 있다: 예컨대, 비경구투여(예컨대, 정맥주사, 경피주사, 근육내주사 또는 피하주사); 경구투여(예컨대, 정제, 마름모꼴 정제, 캡슐, 현탁액 또는 액상 용액 ); 좌약 형태로 직장내 또는 질내 투여; 또는 국소투여(예컨대, 페이스트, 크림, 겔 또는 로션).
투여에 적합한 양은 이 분야의 당업자라면 충분히 결정할 수 있는 것이며, 사용되는 화학식 1의 특정 화합물, 조제물의 농도, 투여 방식, 투여 시간과 빈도, 및 환자의 이상 증상에 대한 개선 정도에 따라 달라질 것이다. 특정 환자에 따른 추가 인자들에 의해 투여량이 조절될 필요가 있다. 이러한 인자들에는 환자의 연령, 체중, 성별 및 섭생법 등이 있다. 투여량은 한 번에 투여되거나 여러 번으로 나누어 다양한 시간 간격으로 투여될 수도 있다.
다음 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것이며, 본 발명을 이에 국한시키고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1>
(20S)-7-트리메틸실릴캄프토테신의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(3-트리메틸실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
0 ℃, 아르곤 분위기 하에서의 DME(2.5 mL) 및 DMF(0.60 mL)내의 (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈 [요오드피리돈 (2), 250 mg, 0.746 mmol] 용액에, 미네랄 오일내 60% NaH(31.3 mg, 0.783 mmol)을 첨가하였다. 10 분 후에 LiBr(150 mg, 1.75 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 15 분이 경과한 후에, 3-트리메틸실릴-2-프로피닐 브로마이드(430 mg, 2.24 mmol)을 주입하고, 이 반응 혼합물을 어두운 곳에서 65 ℃로 20 h 동안 가열하였다. 최종 용액을 브라인(brine: 20 mL)에 붓고, AcOEt(6 ×15 mL)로 추출하고 건조시켰다(Na2SO4). 용매를 제거한 후에 얻어진 잔류물로 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/AcOEt 95:5)를 수행하여 포말(foam) 형태의 생성물 283 mg(85%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-트리메틸실릴캄프토테신
아르곤 분위기 하에서의 상기 (1)에서 제조된 화합물(36.6 mg, 0.082 mmol), 페닐 이소니트릴(0.25 mol) 및 헥사메틸디틴(42 mg, 0.123 mmol)의 벤젠(1.3 mL) 용액을 70 ℃에서 275W GE 썬램프(sunlamp)로 10 시간 동안 광조사하였다. 최종 반응 혼합물을 농축시킨 후에, 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 96:4) 처리하여 엷은 황색 고체 18.8 mg(54%)을 생성시켰다:
<실시예 2>
(20S)-7-tert-부틸디메틸실릴캄프토테신(DB-202)의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(3-tert-부틸디메틸실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드 피리돈 (2) (200 mg, 0.60 mmol) 및 3-tert-부틸디메틸실릴-2-프로피닐 브로마이드(280 mg, 1.20 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1)로 처리한 후에 백색 포말(foam) 형태의 생성물 173 mg(59%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-tert-부틸디메틸실릴캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기 (1)에서 제조된 화합물(48.7 mg, 0.10 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH 96:4; CH2Cl
2/아세톤 9:1) 처리하여 황백색(off yellow) 고체 24.8 mg(54%)을 생성시켰다:
<실시예 3>
(20S)-7-tert-부틸디페닐실릴캄프토테신의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(3-tert-부틸디페닐실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드피리돈 (2) (200 mg, 0.60 mmol) 및 3-tert-부틸디페닐실릴-2-프로피닐 브로마이드(428 mg, 1.20 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1)로 처리한 후에 백색 포말(foam) 형태의 생성물 258 mg(70%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-tert-부틸디페닐실릴캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기 (1)에서 제조된 화합물(48.7 mg, 0.10 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH 96:4; CH2Cl
2/아세톤 9:1) 처리하여 밝은 황색 고체 26.5 mg(45%)을 생성시켰다:
<실시예 4>
(20S)-10-아세톡시-7-트리메틸실릴캄프토테신의 제조(도 3 참조)
(1) 4-아세톡시페닐 이소니트릴 (14)
0 ℃에서 CH2Cl2(10 mL)내의 4-아세토포름아닐라이드 (13) (358 mg, 1.0 mmol) 용액에, 테트라브로모메탄(0.70 g, 2.1 mmol), 트리페닐포스핀(525 mg, 2.1 mmol), 및 트리에틸아민(320 mL, 2.1 mmol)을 연속적으로 첨가한 후에, 생성된 혼합물을 어두운 곳에서 3 시간 동안 환류시켰다. 용매를 증발시킨 후에, 조질의 생성물을 얼음-냉각시킨 Et2O(20 mL)로 빻았다(triturated). 용매를 증발시키고 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(헥산/AcOEt 8:2) 처리하여 엷은 갈색 고체 243 mg(76%)을 얻었다:
(2) (20S)-10-아세톡시-7-트리메틸실릴캄프토테신 (15)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기 1-(1)에서 제조된 화합물(44.5 mg, 0.10 mmol)과 상기 (1)에서 제조된 화합물(48.3 mg, 0.30 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/아세톤 10:1) 처리한 후에 엷은 황색 오일상의 생성물 29.9 mg(63%)를 얻었다:
<실시예 5>
(20S)-10-히드록시-7-트리메틸실릴캄프토테신의 제조 (16)
상기 실시예 5-(2)에서 제조된 화합물 (15) (16.8 mg, 0.035 mmol)과 K2CO3 (9.6 mg, 0.070 mmol)의 MeOH(100 mL)와 H2O(100 mL) 용액을 실온에서 1시간 30 분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 AcOH로 산성화하고, 브라인(10 mL)으로 희석시킨 후에 AcOEt(10 ×10 mL)로 추출하였다. 모두 합친 유기층을 건조시켜(NaSO4) 증발시키고, 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH/AcOH 90:10:2; CHCl3/아세톤 2:1) 처리하여 백색 고체 15.1 mg(99%)을 얻었다:
이 화합물을 NH2CH2CH2NMe2와 반응시킨 후에 EtCOCl과 반응시켜, 생물학적 테스트용의 E-고리가 열린 유사체를 얻었다.
<실시예 6>
(20S)-7-트리메틸실릴-이리노테칸의 제조 (도 6 참조)
(1) [1,4'] 바이피페리디닐-1'-카르복실산 4-니트로 페닐에스테르 (32)
-78 ℃에서 150 mL의 건조 THF내의 4-니트로페닐 클로로포르메이트 용액에 트리에틸아민(10.7 mL, 76.2 mmol)을 첨가한 후에, 40 mL의 THF내의 4-피페리디노피페리딘 (30) (4.51 g, 25.6 mmol) 용액을 첨가하였다. 이 용액을 2 시간 동안 교반한 후에, 용매를 제거하고 잔류물을 AcOEt로 취한 후에, 여과하고 증발시켰다. 조질의 황색 고체를 용리액으로서 AcOEt를 사용하며 중성 알루미나를 통과시켜 증발시킨 후에 백색 고체 6.73 g(79%)를 얻었다:
(2) [1,4'] 바이피페리디닐-1'-카르복실산 4-아미노-페닐에스테르
상기 (1)에서 제조된 화합물(1.012 g, 3.03 mmol)의 AcOEt(125 mL) 용액에, 10% Pd/C(0.15 g)을 첨가하였다. 이 반응 장치를 아르곤으로 수차례 퍼지시킨 후에, 1 L 벌룬의 H2를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반한 후에, 촉매를 셀라이트를 통과시켜 여과하여 제거하고 용매를 증발시켜 백색 고체 835 mg(91%)를 얻었다:
(3) [1,4'] 바이피페리디닐-1'-카르복실산 4-포르밀아미노-페닐에스테르 (33)
0 ℃에서 디시클로헥실카르보디이미드 (272 mg, 1.32 mmol)의 CH2Cl2(5 mL) 용액을 교반하며, 98% 포름산(60.7 mg, 1.32 mmol)을 적가하였다. 10 분 후에, 생성된 혼합물을 실린지를 통해, 0 ℃의 상기 실시예 (2)에서 제조된 화합물(200 mg, 0.66 mmol)의 피리딘(5 mL) 용액에 첨가하였다. 그 후에, 이 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 3 시간 동안 교반시켰다. 피리딘 용매를 증발시키고 잔류물을 CH2Cl2에 취하여, 여과하고 증발시켜 염기성 알루미나 컬럼(CH2Cl2/MeOH 95:5)에 직접 적용하여, 실온에서 포름아미드 탄소-질소 결합 주위에 힌더드된(hindered) 회전으로부터 유래되는 시스 및 트랜스 회전 이성질체의 혼합물로 이루어진 백색 고체 118 mg(83%)를 얻었다:
(4) [1,4'] 바이피페리디닐-1'-카르복실산 4-이소니트릴로-페닐에스테르 (34)
상기 실시예 (3)에서 제조된 화합물 (90.1 mg, 0.272 mmol)의 CH2Cl2(10 mL) 용액에, 연속적으로 트리에틸아민(69.5 mg, 0.688 mmol) 첨가하고, 0 ℃에서 건조 CH2Cl2 내의 트리포스겐(68 mg, 0.229 mmol) 용액을 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한 후에, 7% NaHCO3(5 mL)로 씻어주고 건조시켰다(MgSO4). 용매를 증발시킨 후에 얻어진 조질의 갈색 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(Et2O/Et2NH 95:5) 처리하여 백체 고체 67.2 mg(79%)을 얻었다:
(5) (20S)-7-트리메틸실릴-이리노테칸 (35)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기 1-(1)에서 제조된 화합물(44.5 mg, 0.10 mmol), 상기 (4)에서 제조된 화합물(93.9 mg, 0.30 mmol), 및 건조 벤젠(1.5 mL)내의 헥사메틸디틴(50 mg, 0.15 mmol)을 275w GE 썬램프로 70 ℃에서 9 시간 동안 광조사하였다. 반응 용매를 증발시키고, 가용성을 증진시킬 수 있도록 DMSO 몇 방울과 함께 MeOH에 용해시키고 워터스(Waters) 역상 HPLC에 주입하였다. 효과적인 분리를 위해 사용된 조건은 다음과 같다. 워터스 490E 포르그램화 가능한 멀티-파장 검측기, 사르젠트(Srgent) 웰츠(Welch) 플로터 및 워터스 C-18 25×10 카트리지 컬럼이 장착된 워터스 600E 시스템 콘트롤러를 사용하였다. 그래디언트 용리 [5:95 MeCN/H2O (0.1% TFA)로부터 30:70 MeCN/H2O (0.1% TFA)까지]를 40 분에 걸쳐서 20 mL/min의 속도로 처리하여 동결건조한 후에 세미-정제된 회색 고체를 얻었다. 이 회색 고체를 1 mm 플레이트를 이용하여 크로마토크트론(chromatotron)상에서 추가 정제하여(CHCl3/EtOH 70:30) 황색 고체 12 mg(19%)를 얻었다:
<실시예 7>
(20S)-11-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신의 제조(도 2 참조)
(1) 3-플루오로-2-트리메틸실릴벤즈알데히드 (7)
3-플루오로-2-트리메틸실릴벤즈알데히드의 제조 방법은 선택적인 오르쏘-금속화 반응을 통해 진행된다. Comins, D.L. 등의 J. Org. Chem., 49, 1078 (1984)를 참조할 수 있다. 또한, Sniechus, V.의 Chem, Rev., 90, 879 (1990)을 참조할 수도 있다. THF(50 mL)내의 N,N,N'-트리메틸에틸렌디아민(2.70 mL, 20 mmol) 용액에 1.6 N n-BuLi 헥산 용액(13 mL, 21 mmol)을 -20 ℃에서 천천히 적가한 후에, 15 분 경과하고 3-플루오로벤즈알데히드(2.10 mL, 20 mmol)을 첨가하였다. 이 온도에서 15 분이 경과한 후에, 1.6 N n-BuLi 헥산 용액(38 mL, 60 mmol)을 주입하고 이 용액을 -35 ℃에서 1시간 30 분 동안 교반하였다. 클로로트리메틸실란(15 mL, 120 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 최종 용액을 얼음-냉각된 1 N HCl(150 mL)에 붓고, Et2O(3 × 100)로 신속하게 추출하고 브라인으로 씻어주어 건조시켰다(Na2SO4). 용매를 증발시킨 후에, 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(헥산/AcOEt 95:5) 처리한 후에 오일상의 생성물 3.25 g(83%)를 얻었다:
(2) 3-플루오로-2-트리메틸실릴벤조산
그 후에, 유리산에 대한 통상의 산화반응을 수행하였다. Hill, L. R. 등의 J. Org. Chem., 50, 470 (1985)를 참조할 수 있다. 상기 (1)에서 제조된 화합물(3.41 g, 17.3 mmol)의 tert-부탄올(20 mL) 용액에, 연속적으로 2-메틸-2-부텐의 2N THF(55 mL, 110 mmol) 용액을 첨가한 후에 10분 동안에 걸쳐서 서서히, 물(18 mL)내의 80% NaClO2(2.55 g, 22.5 mmol) 및 NaH2PO4·H2O(3.10 g, 22.5 mmol) 수용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 16 시간 동안 교반하고, tert-부탄올을 증발시키고, 잔류물을 1 N NaOH(50 mL)로 취하고 헥산으로 씻어주었다(3 × 20 mL). 물층을 1 N HCl을 사용하여 pH 2로 산성화시키고, NaCl로 포화시키고, Et2O(3 × 50 mL)로 추출하였다. 모은 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 증발시켜 백색 고체 3.13 g(85%)을 얻었다:
(3) 3-플루오로-2-트리메틸실릴페닐 이소시아네이트 (8)
중간체 이소시아네이트의 제조 방법은 커티어스 자리옮김반응(Curtius rearrangement)를 통해 수행하였다. Capson, T. L. 등의 Tetrahedron Lett., 25, 3515 (1984) 및 본문의 참고문헌들을 참조할 수 있다. 상기 (2)에서 제조된 화합물(3.03 g, 14.3 mmol)의 CH2Cl2(20 mL) 용액에 옥살릴클로라이드(1.30 mL, 15.0 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후에 얻어진 잔류물을 THF(10 mL)로 희석시키고, 얼음-냉각시킨 NaN(3.70 g, 57 mmol)의 H2O(20 mL)와 아세톤(50 mL) 용액에 격렬하게 교반하면서 주입하였다. 0 ℃에서 15 분, 실온에서 1 분이 경과한 후에, 이 용액을 Et2O(4 × 50 mL)로 추출하고 건조시켰다(Na2SO4). 용매를 증발시킨 후에 생성된 잔류물을 톨루엔으로 1시간 30 분 동안 환류시킨 후에, 용매를 제거하여 엷은 황색 오일상의 생성물 2.85 g(79%)를 얻었다:
(4) 3-플루오로-2-트리메틸실릴페닐 이소니트릴 (9)
이후의 탈산소화반응(deoxigenation)을 통해 목적하는 이소니트릴을 생성시켰다. Baldwin, J.E. 등의 Tetrahedron, 39, 2689 (1983)을 참조할 수 있다. 트리에틸아민(4.10 mL, 29.3 mmol)을 0 ℃에서 트리클로로실란의 2 N CH2Cl2 용액(8.40 mL, 16.8 mmol)에 서서히 적가한 후에, 5 분이 경과하고, 상기 실시예 (3)에서 제조된 화합물 (2.35 g, 11.2 mmol)을 첨가하였다. 0 ℃에서 1 시간 30 분, 실온에서 30 분이 경과한 후에, 상기 용액을 NH3로 포화시키고, 셀라이트를 사용하여 여과하고 5% NaH2PO4로 씻어주어 건조시켰다(Na2SO4). 그 후에, 용매를 증발시켜 얻어진 조질의 생성물을 플래쉬-크로마토그래피(헥산/AcOEt 95:5)로 처리하여 엷은 자주빛 액상 생성물 1.42 g(66%)을 얻었다:
(5) (20S)-11-플루오로-7,12-비스(트리메틸실릴)캄프토테신 (11)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기 1-(1)에서 제조된 화합물(43.5 mg, 0.098 mmol)과 상기 실시예 (4)에서 제조된 화합물(76 mg, 0.39 mmol)을 제공하고, 플래쉬- 크로마토그래피(CHCl3/아세톤 20:1)로 처리한 후에 엷은 황색 오일상의 생성물 33.4 mg(67%)을 얻었다:
(6) (20S)-11-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신 (12)
상기 실시예 (5)에서 제조된 화합물(19.5 mg, 0.038 mmol)의 48% HBr(1 mL) 용액을 50 ℃로 20 시간 동안 가열하였다. 이 반응 혼합물을 포화 NaHCO3(10 mL)에 격렬히 교반하며 붓고, AcOEt(5 × 10 mL)로 추출하여 건조시켰다(Na2SO4). 용매를 증발시킨 후에, 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/아세톤 8:1)로 처리하고 엷은 황색 고체 12.5 mg(83%)을 얻었다:
<실시예 8>
(20S)-10-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신(CHJ-792)의 제조(도 4 참조)
(1) 4-tert-부틸록시카르보닐아미노페닐 이소니트릴 (18)
상기 이소니트릴은 통상의 Boc-보호기 치환 반응 및 탈수 반응을 통해 2 단계로 제조되었다. Einhorn, J. 등의 Synlett, 7 (1991)을 참조할 수 있다. 4-아미노포름아닐라이드 (1.71 g, 12.6 mmol), 디-tert-부틸-디카보네이트 (2.87 g, 13.2 mmol) 및 NaHCO3(1.11 g, 13.2 mmol)의 무수 EtOH(50 mL) 혼합물을 클리닝 배쓰내에서 4 시간 동안 소니케이팅(sonicate)하였다. 최종 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 농축시켜 건조시켰다. 잔류물을 절반(half) 브라인 (50 mL)로 취해, AcOEt(6 × 30 mL)로 추출하고 건조시켰다(Na2SO4). 용매를 증발시킨 후에, 잔류 오일상을 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 95:5)로 처리하여 4-tert-부틸록시카르보닐아미노포름아닐라이드를 2.85 g(96%)을 백색 고체로서 얻었다. 이 중간체(945 mg, 4.0 mmol)을 상기 실시예 5-(1)에 기재한 바와 같은 조건에 적용하여 플래쉬-크로마토그래피(헥산/AcOEt 9:1)로 처리한 후에 엷은 갈색 고체 502 mg(58%)을 얻었다:
(2) (20S)-10-tert-부틸록시카르보닐아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신 (19)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기 실시예 1-(1)에서 제조된 화합물(44.5 mg, 0.10 mmol)과 상기 실시예 (1)에서 제조된 화합물(65 mg, 0.30 mmol)을 제공하여, 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/아세톤 6:1)로 처리한 후에 엷은 황색 고체 32.5 mg(60%)을 얻었다:
(3) (20S)-10-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신 (20)
상기 실시예 (2)에서 제조된 화합물(75.5 mg, 0.141 mmol) 및 TFA(500 mL)의 CH2Cl2(2 mL) 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반시켰다. 그 후에, 이 반응 혼합물을 포화 NaHCO(50 mL)에 붓고, AcOEt(10 × 15 mL)로 추출하고 건조시켰다(Na2SO4). 용매를 증발시킨 후에 얻어진 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 95:5)로 정제하여 황색 고체 55.4 mg(90%)을 얻었다:
<실시예 9>
(20S)-11-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신의 제조
(1) 3-tert-부틸록시카르보닐아미노페닐 이소니트릴
상기 이소니트릴은 상기 실시예 8-(1)에 기재된 바와 같이 동일한 방법에 따라 2 단계로 제조되었다. 첫 번째 단계에서, 3-아미노포름아닐라이드 (1.80 g, 13.2 mmol)의 Boc-보호기 치환 반응을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 95:5)로 처리한 후에 3-tert-부틸록시카르보닐아미노포름아닐라이드 2.65 g(85%)을 백색 고체로서 얻었다. 그 후에, 이 중간체(412 mg, 1.74 mmol)을 상기 실시예 5-(1)에 기재한 바와 같은 조건에 적용하여 플래쉬-크로마토그래피(헥산/AcOEt 9:1)로 처리한 후에 갈색 고체 190 mg(50%)을 얻었다:
(2) (20S)-11-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기 실시예 1-(1)에서 제조된 화합물(44.5 mg, 0.10 mmol)과 상기 실시예 (1)에서 제조된 화합물(65.5 mg, 0.3 mmol)을 제공하여, 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 95:5; CHCl3/아세톤 5:1)로 처리한 후에 엷은 황색 오일상 생성물 23.1 mg(43%)을 얻었다. 그 후에, 이 중간체(14.7 mg, 0.027 mmol)을 상기 실시예 8-(3)에 기재된 바와 같은 조건에 따라 탈보호기화하고 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 9:1)로 정제한 후에, (20S)-11-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신 11.8 mg(99%)을 황색 고체로서 다른 이성질체를 배제한 채로 얻었다:
<실시예 10>
(20S)-11-플루오로-10-아미노-7-트리메틸실릴캄프토테신의 제조(도 5 참조)
(1) 4-tert-부틸록시카르보닐아미노-3-플루오로-1-니트로벤젠 (22)
2-플루오로-4-니트로아닐린 (21) [Katritsky, A. R. 등의 J. Org. Chem., 51, 5039 (1086)에 따라 제조됨](2.16 g, 13.9 mmol)의 CH2Cl2(25 mL) 용액에, 연속적으로 디-tert-부틸 디카보네이트 (3.19 g, 14.6 mmol), 트리에틸아민 (2.95 mL, 20.8 mmol) 및 4-디메틸아미노피릴딘 (210 mg, 1.67 mmol)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 최종 용액을 CH2Cl2(75 mL)으로 희석시키고, 얼음-냉각된 5% 시트르산(4 × 50 mL)로 씻어주고 건조시켰다(Na2SO4). 용매를 증발시킨 후에, 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(헥산/AcOEt 9:5)로 처리하여, 용리 순서에 따라 첫 번째로는 모노-보호기 치환된 유도체, 4-tert-부틸록시카르보닐아미노-3-플루오로-1-니트로벤젠 1.95 g(55%), 두 번째로는 비스-보호기 치환된 유도체, 4-디-tert-부틸록시카르보닐아미노-3-플루오로-1-니트로벤젠 1.13 g(23%)을 얻었다. 상기 모노-보호기 치환된 유도체의 특성은 다음과 같다:
(2) 4-tert-부틸록시카르보닐아미노-3-플루오로아닐린 (24)
상기 니트로기의 아민 치환기로의 환원 반응은 통상적인 방법에 따라 실시되었다. Ram, S. 등의 Tetrahedron Lett., 25, 3415 (1984)를 참조할 수 있다. 상기 실시예 (1)에서 제조된 화합물(1.62 g, 6.32 mmol)과 암모늄 포르메이트(1.70 g, 27 mmol)의 무수 MeOH(12 mL) 용액에, 10% Pd-C(400 mg)를 한번에 첨가하였다. 실온에서 2 시간이 경과한 후에, 최종 용액을 셀라이트를 통해 여과하여 농축시키고, 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 9:1)에 직접 적용하여 엷은 황색 오일상의 생성물 1.40 g(98%)을 얻었다:
(3) 4-tert-부틸록시카르보닐아미노-3-플루오로페닐 이소니트릴 (25)
0 ℃의 디시클로헥실카르보디이미드(1.51 g, 7.31 mmol)의 CHCl(15 mL) 용액을 교반하며, 이 용액에 포름산(275 mg, 7.31 mmol)을 적가하였다. 10 분 후에, 생성된 혼합물을, 0 ℃의 상기 실시예 (2)에서 제조된 화합물(1.28 g, 5.66 mmol)의 CH2Cl2(10 mL)와 피리딘(0.61 mL, 7.50 mmol) 용액에 5 분 동안에 걸쳐서 첨가하였다. 그 후에, 이 반응 혼합물을 실온으로 온도를 상승시키고 16 시간 동안 교반하였다. 셀라이트상에서 여과한 후에, 최종 용액을 농축시키고 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/AcOEt 85:15)로 처리하여 4-tert-부틸록시카르보닐아미노-3-플루오로포름아미드 1.44 g(100%)을 백색 고체로서 얻었다. 이 중간체(1.38 g, 5.43 mmol)을 CH2Cl2(20 mL)에 용해시키고, 0 ℃에서 연속적으로 테트라브로모메탄(1.93 g, 5.80 mmol), 트리페닐포스핀(1.52 g, 5.80 mmol) 및 1,4-디아자바이시클로[2.2.2]옥탄 (DABCO, 650 mg, 5.80 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후에, 이 조질의 생성물을 얼음-냉각된 Et2O(20 mL)로 빻고 셀라이트상에서 여과하였다. 용매를 증발시킨 후에 얻어지는 잔류물을 플래쉬-크로마토그래피(헥산/AcOEt 95:5로부터 9:1까지)로 정제하여 엷은 갈색 고체 660 mg(51%)을 얻었다:
(4) (20S)-10-tert-부틸록시카르보닐아미노-11-플루오로-7-트리메틸실릴-캄프토테신 (26) 및 (20S)-10-tert-부틸록시카르보닐아미노-9-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신 (27) (각각 1.9:1의 혼합물)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 실시예 1-(1)에서 제조된 화합물(66.8 mg, 0.15 mmol)과 상기 실시예 (3)에서 제조된 화합물(110 mg, 0.50 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 96:4; CHCl3/아세톤 10:1)로 처리한 후에, 상기 위치 이성질체를 함유하는 엷은 황색 오일상 생성물 47.6 mg(57%)을 얻었다:
(5) (20S)-10-아미노-11-플루오로-7-트리메틸실릴-캄프토테신 (28)
상기 실시예 4에서 제조된 화합물(41.3 mg, 0.0746 mmol)을 상기 실시예 8-(3)에 기재된 조건에 따라 탈보호기화하였다. 워크업(workup) 후에, 조질의 생성물을 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/아세톤/MeOH 70:10:1.5)로 처리하여, 용리 순서에 따라, 첫 번째로는 순수한 (20S)-10-아미노-11-플루오로-7-트리메틸실릴-캄프토테신 14.1 mg(42%), 그 다음에 (20S)-10-아미노-11-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신과 (20S)-10-아미노-9-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신의 약 1:1 혼합물 15.2 mg을 얻었다. 상기 (20S)-10-아미노-11-플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신의 특성은 다음과 같다:
<실시예 11>
(20S)-11,12-디플루오로-7-트리메틸실릴-캄프토테신 및 (20S)-9,10-디플루오로-7-트리메틸실릴캄프토테신(각각 3:1의 혼합물)의 제조
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 실시예 1-(1)에서 제조된 화합물(44.5 mg, 0.10 mmol)과 2,3-디플로오로페닐 이소니트릴[워크업하기전에 실온에서 2 일 동안 교반하여 Weber, W. P. 등의 Tetrahedron Lett., 13, 1637 (1972)에 따라 20% 수율로 제조됨] (42 mg, 0.30 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CHCl3/MeOH 95:5; CHCl3/아세톤 10:1로부터 4:1까지)로 처리한 후에, 상기 위치 이성질체를 함유하는 엷은 황색 오일상의 생성물 22.6 mg(50%)을 얻었다:
<실시예 12>
20S-7-트리이소프로필실릴캄프토테신의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(트리이소프로필실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드피리돈 2, (200 mg, 0.598 mmol)을 트리이소프로필실릴-2-프로피닐 브로마이드(329 mg, 1.196 mmol)과 혼합하였다. 크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1) 처리하여 백색 포말 형태의 생성물 41.1 mg(13%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-트리이소프로필실릴캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기한 바와 같은 피리돈(41 mg, 0.077 mmol)로부터 밝은 황색 고체 23.3 mg(60%)을 생성시켰다:
<실시예 13>
20S-7-트리이소프로필실릴캄프토테신의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(트리에틸실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드피리돈 2, (150 mg, 0.450 mmol)을 트리에틸실릴-2-프로피닐 브로마이드(210 mg, 0.90 mmol)과 혼합하였다. 크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1) 처리하여 백색 포말 형태의 생성물 97.0 mg(45%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-트리에틸실릴캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기한 바와 같은 피리돈(48.7 mg, 0.10 mmol)으로부터 밝은 황색 고체 29.8 mg(65%)을 생성시켰다:
<실시예 14>
(20S)-7-(디메틸-(1'S,2'S,5'S) 7,7 디메틸노르피닐실릴)캄프토테신의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(디메틸-(1S,2S,5S) 7,7 디메틸노르피닐실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드피리돈 2 (150 mg, 0.450 mmol)을 디메틸-(1S,2S,5S) 7,7 디메틸노르피닐실릴-2-프로피닐 브로마이드(281 mg, 0.90 mmol)과 혼합하였다. 크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1) 처리하여 백색 포말 형태의 생성물 100.8 mg(39%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-(디메틸-(1'S,2'S,5'S) 7,7 디메틸노르피닐실릴)캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기한 바와 같은 피리돈(57.0 mg, 0.1 mmol)로부터 밝은 황색 고체 29.4 mg(54%)을 생성시켰다:
<실시예 15>
(20S)-7-(3-시아노프로필디메틸실릴)캄프토테신
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(3-시아노프로필디메틸실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
Rico 및 그의 동료들에 의해 개시된 방법(J. Org. Chem. 1994, 59, 415)에 따라, 요오드피리돈 2, (150 mg, 0.450 mmol)을 3-시아노프로필디메틸실릴-2-프로피닐 브로마이드(165 mg, 0.678 mmol), K2CO3(124 mg, 0.90 mmol), Bu4N
+Br-(14.5 mg, 0.045 mmol), H2O(0.02 mL) 및 톨루엔(3.6 mL)과 혼합하였다. 이 혼합물을 1 시간 동안 환류시켰다. 여과하여 크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1) 처리한 후에, 백색 오일상의 생성물 34.0 mg(15%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-(3-시아노프로필디메틸실릴)캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기한 바와 같은 피리돈(25.0 mg, 0.05 mmol)으로부터 밝은 황색 고체 9.8 mg(41%)을 생성시켰다:
<실시예 16>
(20S)-7-(3-할로프로필디메틸실릴)캄프토테신(클로로프로필 유도체는 DB-148임)의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드( 및 6-브로모)-3-옥소-7-(3-클로로프로필디메틸실릴-2-프로피닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드피리돈 2 (150 mg, 0.450 mmol)을 3-클로로프로필디메틸실릴-2-프로피닐 브로마이드(228 mg, 0.90 mmol)과 혼합하였다. 크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1) 처리하여 맑은 오일상의 생성물 75.4 mg(33%)을 얻었다. NMR로부터 목적하는 클로로 유도체에 더하여 알킬 브로마이드가 전자가 우세하게 1.6:1의 비율로 존재함을 알 수 있었다:
(2) (20S)-7-(3-할로프로필디메틸실릴)캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기한 바와 같은 피리돈(51 mg, 0.1 mmol)으로부터 밝은 황색 고체 23 mg(49%)을 생성시켰다. 스펙트럼 데이터 분석을 통해, 이 고체가 염소, 브롬 및 요오드 유도체의 1.6:1:1.3 비율에 해당하는 3 성분 혼합물로서 밝혀졌다:
<실시예 17>
(20S)10-아세톡시-7-tert-부틸디메틸실릴캄프토테신의 제조
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기한 바와 같은 피리돈(34.5 mg, 0.071 mmol)과 p-아세톡시이소니트릴로부터 밝은 황색 고체 21.3 mg(58%)을 얻었다:
<실시예 18>
(2) (20S)10-아세톡시-7-tert-부틸디메틸실릴캄프토테신
상기 실시예 2-(2)에 기재된 방법에 따라, 상기한 바와 같은 피리돈(34.5 mg, 0.071 mmol)로부터, 동일한 크로마토그래피 조건을 사용하여, 밝은 황색 고체 21.3 mg(58%)을 생성시켰다:
<실시예 19>
(20S)10-히드록시-7-tert-부틸디메틸실릴캄프토테신(DB-67)
상기 실시예 5에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 실시예 18에 기재된 바와 같은 화합물(13.4 mg, 0.026 mmol)을 히드록시 유도체로 전환시켰다. 제조 TLC 플레이트상에서의 정제(2:1 CH2Cl2:아세톤) 과정을 통해 황색 고체 10.6 mg(85%)를 얻었다:
<실시예 20>
(20S)-7-(트리메틸실릴메틸)캄프토테신의 제조
(1) (S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(4-트리메틸실릴-2-부티닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드피론 (2) (200 mg, 0.60 mmol)과 4-트리메틸실릴-2-부티닐 브로마이드(245 mg, 1.20 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 9:1) 처리한 후에 백색 포말 형태의 생성물 77.7 mg(28%)을 얻었다:
(2) (20S)-7-(트리메틸실릴메틸)캄프토테신
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 (1)에서 제조된 화합물(46 mg, 0.10 mmol)로부터 플래쉬 크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH 96:4; CH2
Cl2/아세톤 9:1) 처리한 후에 밝은 황색 고체 16.2 mg(38%)를 얻었다:
<실시예 21>
(20S)-10-히드록시-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36a) (DB-174)
(1) (4,4-디브로모-부트-3-엔닐)트리메틸실란
상기 공지 화합물은 Piers, E.; Gavai, A. V. J. Org. Chem. 1990, 55, 2374내 방법을 변형하여 제조하였다. 플래임(flame) 건조 플라스크에, 건조 CH2Cl2(150 mL) 및 트리페닐포스핀(16 g, 61.2 mmol)를 넣었다. 온돌르 0 ℃로 낮추고 CBr4(10.15 g, 30.6 mmol)을 나눠 첨가하였다. 30 분 후에, 3-트리메틸실릴프로판알(2.0 g, 15.3 mmol)의 건조 CH2Cl2(20 mL) 용액을 첨가하였다. 0 ℃에서 1 시간 후에, 반응물을 에테르로 희석시키고 셀라이트를 통해 여과하였다. 셀라이트를 에테르(4 × 50 mL)로 헹궈주고 합친 에테르 용액을 H2O(100 mL), 포화 NaHCO3(100 mL), 포화 NH4Cl(100 mL) 및 브라인(100 mL)로 추출하였다. 유기층을 건조시켜(MgSO4) 여과하고 증발시켜 조질의 백색 고체를 얻었다. 이 고체 잔류물을 펜탄으로 씻어주었다. 이 펜탄 용액을 농축시켜, 오일상의 잔류물을 실리카겔상에서 크로마토그래피 처리하여(펜탄 100%) (4,4-디브로모-부트-3-엔닐)트리메틸실란을 3.7 g 중량의 투명 오일상으로서 얻었다. 1H NMR로부터 남은 펜탄의 27%가 오염물질이며 이로써 보정된 수율은 62%임을 알 수 있었다:
(2) 5-트리메틸실라닐펜트-2-인-1-놀 (40)
플래임 건조 플라스크에, (4,4-디브로모-부트-3-엔닐)트리메틸실란(3.43 g, 12 mmol)을 첨가하였다. 건조 THF(150 mL)를 첨가하고, 이 혼합물을 -78 ℃로 냉각시켰다. BuLi 1.6 N 헥산 용액(24 mmol, 15 mL)를 첨가하고, 이 혼합물을 -78 ℃에서 1 시간 동안 교반하고, 22 ℃로 가온한 후에 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 끝으로, 파라포름알데히드(1.4 g)을 첨가하고 이 혼합물을 환류시켰다. 3.5 h 경과후에, 반응물을 22 ℃로 냉각시키고 NH4Cl 포화수용액(50 mL)를 첨가하였다. 플라스크내 반응물을 분별 깔데기에 옮겨담고, 에테르로 추출하였다(3 × 200 mL). 유기층을 건조시켜(Na2SO4), 여과하고 증발시켜 조질의 황색 오일상 물질을 생성시켰다. 실리카겔상에서 플래쉬 크로마토그래피(펜탄/에테르 5:1)를 통해, 5-트리메틸실라닐펜트-2-인-1-올 1.57 g(84%)를 얻었다:
(3) (5-브로모펜트-2-인닐)트리메틸실란 (41)
플래임 건조 플라스크에, PPh(1.76 g, 6.73 mmol)을 첨가한 후에 건조 CH2Cl2(60 mL)를 첨가하였다. 이 혼합물을 얼음 배쓰내에 넣고, 브롬(0.34 mL, 6.41 mmol)을 적가하였다. 소량의 PPh3를 반응액의 색상이 황색에서 투명하게 될 때까지 첨가하였다. 0 ℃에서 0.5 h 경과 후에, 5-트리메틸실라닐펜트-2-인-1-올(1.0 g, 6.41 mmol)을 CH2Cl2(5 mL)에 용해시켜 적가하였다. 0 ℃에서 4 h 경과 후에, 반응 혼합물을 분별 깔데기에 붓고 펜탄으로 희석시켜 H2O(100 mL) 및 NaHCO3 포화 수용액(100 mL)로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(MgSO4) 여과하여 부피를 50 mL로 줄였다. 이 조질의 용액을 실리카겔 패드상에서 펜탄(500 mL)으로 크로마토그래피 처리하였다. 펜탄을 증발시킨 후에, (5-브로모펜트-3-인닐)트리메틸실란(1.2 g, 87%)를 투명 오일상으로서 얻었다:
(4) (20S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(5-트리메틸실라닐펜트-2-이닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈 (43)
상기 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 요오드피론 (2), (0.2 g, 0.6 mmol)과 (5-브로모펜트-3인닐)트리메틸실란(260 mg, 1.19 mmol)을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CH2Cl2/AcOEt 95:5) 처리한 후에 (20S)-4-에틸-4-히드록시-6-요오드-3-옥소-7-(5-트리메틸실라닐펜트-2-인닐)-1H-피라노[3,4-c]-8-피리돈 0.21 g(74%)을 백색 포말 형태로 얻었다:
(5) (20S)-10-아세톡시-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (45)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 (4)에서 제조된 화합물(56.8 mg, 0.12 mmol)과 p-아세톡시페닐 이소니트릴(48 mg, 0.3 mmol)을 제공하고 플래쉬 크로마토그래피(CH2Cl2/아세톤 10:1) 처리한 후에 (20S)-10-아세톡시-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 33.2 mg(55%)을 황갈색 고체로서 얻었다:
(6) (20S)-10-히드록시-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36a)
MeOH(0.2 mL)와 H2O(0.2 mL)내에서의, 상기 (5)에서 제조된 화합물(17.7 mg, 0.035 mmol)과 K2CO3(9.7 mg, 0.07 mmol)의 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 AcOH로 산성화시키고(8 drops), 브라인(10 mL)으로 희석시키고 EtOAc로 추출하였다(10 × 20 mL). 합친 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 증발시켰다. 이 조질의 잔류물을 두 번의 크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH/AcOH 96:3:1 이후에 CH2Cl2/아세톤 5:1)로 처리한 후에 (20S)-10-히드록시-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 7.6 mg(47%)을 황색 고체로서 얻었다:
이 화합물은 평균 유효 농도 10-100 ng/mL로 신경교종 세포의 일부 세포 라인(U87, A172, SG388, T98G, LN-Z308)에서 세포 증식을 억제시키는 활성을 나타내었다.
<실시예 22>
(20S)-10-아미노-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36b) (DB-173)
(1) (20S)-10-tert-부틸록시카르보닐아미노-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (45b)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 실시예 21-(4)에서 제조된 요오드피리돈(56.8 mg, 0.12 mmol)의 용액을 4-tert-부틸록시카르보닐아미노페닐 이소니트릴(65.4 mg, 0.3 mmol)과 반응시켰다. 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2/아세톤 10:1) 처리하여 (20S)-10-tert-부틸록시카르보닐아미노-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 38 mg(56%)을 황갈색 고체로서 얻었다:
(2) (20S)-10-아미노-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36b)
상기 실시예 (2)에서 제조된 캄프토테신 유도체(17.5 mg, 0.031 mmol)을 트리플루오로아세트산(0.25 mL)를 첨가하였다. 22 ℃에서 3 시간 경과한 후에, 이 혼합물을 포화 NaHCO3(20 mL)에 붓고 EtOAc(10 × 15 mL)로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 농축시켜 크로마토그래피(CH2Cl2/아세톤 85:15) 처리하여 황색 고체 9.4 mg(65%)을 얻었다:
<실시예 23>
(20S)-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 (36c) (DB-172)
상기 실시예 1-(2)에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 실시예 21-(4)에서 제조된 요오드피리돈(56.8 mg, 0.12 mmol)과 페닐이소니트릴(30.9 mg, 0.3 mmol)의 혼합물을 제공하고, 플래쉬-크로마토그래피(CH2Cl2/아세톤 10:1) 처리하여 (20S)-7-[(2-트리메틸실릴)에틸]캄프토테신 28 mg(52%)을 황갈색 고체로서 얻었다:
본 발명은 상기 실시예들과 함께 상세하게 기재되어 있으나, 이러한 상세 내용은 단지 이러한 예시의 목적으로서만 이해되어야 할 것이며, 이 분야의 당업자라면 다음의 특허청구범위에 의해서만 한정될 수 있는 본 발명의 요지를 벗어나지 않고도 다양한 변형이 가능함을 알 수 있을 것이다.
Claims (59)
- 다음 화학식 2를 갖는 화합물 및 그의 의약적으로 허용 가능한 염의 합성 방법으로서,[화학식 2]다음 화학식 3을 갖는 전구물질과,[화학식 3]다음 식을 갖는 아릴 이소니트릴을 반응시키는 4+1 라디칼 고리형성 반응/사이클화 반응을 통한, 상기 화학식 2를 갖는 화합물 및 그의 의약적으로 허용 가능한 염의 합성 방법.식 중, R1 및 R2는 각각 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬기, 히드록시알킬기, 할로알킬기, 아미노알킬기, 알킬아미노알킬기, 디알킬아미노알킬기, 알켄닐기, 알킨닐기, 알콕시기, 아릴옥시기, 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서, Rd는 알킬기임), 카바모일록시기, 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 하이드라지노기, -C(O)Rf (여기서, Rf는 알킬기, 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, -SRc(여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, 알킬기, 또는 아릴기임)이며, 또는 R1과 R2가 함께 일반식 -O(CH2)nO-(여기서, n은 1 또는 2의 정수임)기를 형성하고,R3는 H, 할로겐 원자, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이며, 또는 R2 및 R3가 함께 일반식 -O(CH2)nO-(여기서, n은 1 또는 2의 정수임)기를 형성하고,R4는 H, F, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기, 트리알킬실릴기 또는 C1-3 알콕시기이고,R5는 C1-10 알킬기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기이고,R6, R7 및 R8은 각각 C1-10 알킬기, C2-10 알켄닐기, C2-10 알킨닐기, 아릴기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 10의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고,R11은 알킬렌기, 알케닐렌기 또는 알키닐렌기이고,R12는 -CH=CH-CH2- 또는 -C≡C-CH2-이고, X는 Cl, Br 또는 I임.
- 제 1 항에 있어서, R4가 H인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 히드록시기, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 시아노기, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기 또는 C1-3 알콕시기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, C1-3 퍼할로알킬기, C1-3 아미노알킬기, C1-3 알킬아미노기, 또는 C1-3 디알킬아미노기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 메틸기, 아미노기, 니트로기, 시아노기 또는 히드록시기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 에틸아미노기, 디에틸아미노기, 히드록시메틸기, 아미노메틸기, 메틸아미노메틸기 또는 디메틸아미노메틸기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R3가 F, 아미노기 또는 히드록시기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R5가 에틸기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 각각 동일하거나 상이하고, C1-6 알킬기, 페닐기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 6의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 메틸기인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R2 및 R3가 메틸렌디옥시기, 또는 1,2-에틸렌디옥시기를 형성하는 것인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R2가 OH인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R2가 NH2인 방법.
- 제 1 항에 있어서, R11이 C1-C10 알킬렌기, C2-C10 알케닐렌기 또는 C2-C10 알키닐렌기인 방법.
- 제 14 항에 있어서, R11이 C1-C6 알킬렌기, C2-C6 알케닐렌기 또는 C2-C6 알키닐렌기인 방법.
- 제 14 항에 있어서, R11이 (CH2)m 이고, 여기서, m은 1 내지 6의 정수인 방법.
- 제 1 항에 있어서, X가 Br 또는 I인 방법.
- 다음 화학식 2를 갖는 화합물 및 그의 의약적으로 허용 가능한 염:[화학식 2]식 중, R1 및 R2는 각각 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬기, 히드록시알킬기, 할로알킬기, 아미노알킬기, 알킬아미노알킬기, 디알킬아미노알킬기, 알켄닐기, 알킨닐기, 알콕시기, 아릴옥시기, 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서, Rd는 알킬기임), 카바모일록시기, 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 하이드라지노기, -C(O)Rf (여기서, Rf는 알킬기, 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, -SRc(여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, 알킬기, 또는 아릴기임)이며, 또는 R1과 R2가 함께 일반식 -O(CH2)nO-(여기서, n은 1 또는 2의 정수임)기를 형성하고,R3는 H, 할로겐 원자, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이며, 또는 R2 및 R3가 함께 일반식 -O(CH2)nO-(여기서, n은 1 또는 2의 정수임)기를 형성하고,R4는 H, F, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기, 트리알킬실릴기, 또는 C1-3 알콕시기이고,R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소, 할로겐, 알킬기, 아미노기 또는 니트로기가 아니며,R5는 C1-10 알킬기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기이고,R6, R7 및 R8은 각각 C1-10 알킬기, C2-10 알켄닐기, C2-10 알킨닐기, 아릴기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 10의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고,R11은 알킬렌기, 알케닐렌기 또는 알키닐렌기임.
- 제 18 항에 있어서, R4가 H인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 히드록시기, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 시아노기, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기 또는 C1-3 알콕시기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, C1-3 퍼할로알킬기, C1-3 아미노알킬기, C1-3 알킬아미노기, 또는 C1-3 디알킬아미노기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 메틸기, 아미노기, 니트로기, 시아노기 또는 히드록시기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 에틸아미노기, 디에틸아미노기, 히드록시메틸기, 아미노메틸기, 메틸아미노메틸기 또는 디메틸아미노메틸기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R3가 F, 아미노기 또는 히드록시기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R5가 에틸기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 각각 동일하거나 상이하고, C1-6 알킬기, 페닐기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 6의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 메틸기인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R2 및 R3가 메틸렌디옥시기, 또는 1,2-에틸렌디옥시기를 형성하는 것인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R2가 OH인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R2가 NH2인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R11이 C1-C10 알킬렌기, C2-C10 알케닐렌기 또는 C2-C10 알키닐렌기인 화합물.
- 제 31 항에 있어서, R11이 C1-C6 알킬렌기, C2-C6 알케닐렌기 또는 C2-C6 알키닐렌기인 화합물.
- 제 31 항에 있어서, R11이 (CH2)m 이고, 여기서, m은 1 내지 6의 정수인 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4 중 둘 이상은 H가 아닌 화합물.
- 제 18 항에 있어서, R5가 메틸기, C3-10 알킬기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 화합물.
- 다음 화학식 3을 갖는 화합물:[화학식 3]식 중, R5가 C1-10 알킬기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기이고,R6, R7 및 R8이 각각 C1-10 알킬기, C2-10 알켄닐기, C2-10 알킨닐기, 아릴기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 10의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고,R11이 알킬렌기 또는 알케닐렌기이고,R12가 -CH=CH-CH2- 또는 -C≡C-CH2-이고, X는 Cl, Br 또는 I임.
- 제 36 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 각각 동일하거나 상이하고, C1-6 알킬기, 페닐기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 6의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기인 화합물.
- 제 36 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 메틸기인 화합물.
- 제 36 항에 있어서, X가 Br 또는 I인 화합물.
- 다음 화학식 4를 갖는 화합물 및 의약적으로 허용 가능한 염.[화학식 4]식 중, R1 및 R2는 각각 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬기, 히드록시알킬기, 할로알킬기, 아미노알킬기, 알킬아미노알킬기, 디알킬아미노알킬기, 알켄닐기, 알킨닐기, 알콕시기, 아릴옥시기, 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서, Rd는 알킬기임), 카바모일록시기, 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 하이드라지노기, -C(O)Rf (여기서, Rf는 알킬기, 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, -SRc(여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, 알킬기, 또는 아릴기임)이며, 또는 R1과 R2가 함께 일반식 -O(CH2)nO- (여기서, n은 1 또는 2의 정수임)기를 형성하고,R3는 H, 할로겐 원자, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이며, 또는 R2 및 R3가 함께 일반식 일반식 -O(CH2)nO- (여기서, n은 1 또는 2의 정수임)기를 형성하고,R4는 H, F, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기, 트리알킬실릴기 또는 C1-3 알콕시기이고,R5는 C1-10 알킬기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기이고,R6, R7 및 R8은 각각 C1-10 알킬기, C2-10 알켄닐기, C2-10 알킨닐기, 아릴기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 10의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고,R11은 알킬렌기, 알케닐렌기 또는 알키닐렌기이고,R13은 H, -C(O)Rf, 또는 -C(O)ORd 임.
- 제 40 항에 있어서, R4가 H인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 히드록시기, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 시아노기, C1-3 알킬기, C2-3 알켄닐기, C2-3 알킨닐기 또는 C1-3 알콕시기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, C1-3 퍼할로알킬기, C1-3 아미노알킬기, C1-3 알킬아미노기, 또는 C1-3 디알킬아미노기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 메틸기, 아미노기, 니트로기, 시아노기 또는 히드록시기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 동일하거나 상이하고, H, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 에틸아미노기, 디에틸아미노기, 히드록시메틸기, 아미노메틸기, 메틸아미노메틸기 또는 디메틸아미노메틸기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R3가 F, 아미노기 또는 히드록시기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R5가 에틸기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 각각 동일하거나 상이하고, C1-6 알킬기, 페닐기 또는 -(CH2)NR9기이고, 여기서, N은 1 내지 6의 정수이며, R9는 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬 아미노기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R6, R7 및 R8이 메틸기인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R2 및 R3가 메틸렌디옥시기, 또는 1,2-에틸렌디옥시기를 형성하는 것인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R2가 OH인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R2가 NH2인 화합물.
- 제 40 항에 있어서, R11이 C1-C10 알킬렌기, C2-C10 알케닐렌기 또는 C2-C10 알키닐렌기인 화합물.
- 제 53 항에 있어서, R11이 C1-C6 알킬렌기, C2-C6 알케닐렌기 또는 C2-C6 알키닐렌기인 화합물.
- 제 53 항에 있어서, R11이 (CH2)m 이고, 여기서, m은 1 내지 6의 정수인 화합물.
- 제 18 항의 화학식 2의 화합물 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염의 유효량을 함유하는 암 또는 백혈병 치료용 약학 조성물.
- 제 56 항에 있어서, 암은 뇌종양, 유방암 또는 백혈병인 것인 약학 조성물.
- 제 4O 항의 화학식 4의 화합물 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염의 유효량을 함유하는 암 또는 백혈병 치료용 약학 조성물.
- 제 58 항에 있어서, 암은 뇌종양, 유방암 또는 백혈병인 것인 약학 조성물.
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