KR100746993B1 - 대장균 발현 시스템을 이용한 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 발현 및 정제방법 - Google Patents

대장균 발현 시스템을 이용한 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 발현 및 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 단백질 타이로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)를 대장균을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 여러 벡터를 이용하여 인간 PTP를 대장균에서 효소 활성을 가진 상태로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하여 생산된 다양한 인간 PTP는 PTP의 항체 생산 또는 PTP 관련 질병에 대한 약물 검색을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.
단백질 타이로신 탈인산화 효소(PTP), 대장균

Description

대장균 발현 시스템을 이용한 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 발현 및 정제방법{The expression and purification method of human protein tyrosine phosphatase using E.coli system}
도 1a는 His 표지, TEV(tobacco erch virus), PTP 유전자가 삽입될 벡터 pET28a-MBP(maltose binding protein)의 구조를 나타내는 모식도이고,
도 1b는 PTP 유전자가 삽입될 과발현벡터 pET28a-MBP-HTs의 구조를 나타내는 모식도이고,
MCS: 다중클로닝 부위(multi-cloning site)
(His)6: hexa his-tag, MBP: MBP-표지
도 1c는 PTP가 삽입된 과발현벡터 중 PTP 생산에 성공한 벡터의 종류와 수를 나타낸 벤 다이어그램이고,
도 2a는 pET28a-MBP-PTP 융합벡터를 전기영동하여 나타낸 젤(gel) 사진의 예이고,
좌측으로부터
레인1:pET28a-MBP 벡터; 레인2:pET28a-MBP-pk4-1; 레인3:pET28a-MBP-pk4-2;
레인4:pET28a-MBP-pk7-1; 레인5:pET28a-MBP-pk7-2; 레인6:pET28a-MBP-pk13-1;
레인7:pET28a-MBP-pk13-2; 레인8:pET28a-MBP-pk16-1; 레인9:pET28a-MBP-pk16-2
레인10:pET28a-MBP-pk18-1; 레인11:pET28a-MBP-pk18-2; 레인12:pET28a-MBP-p19-1;
레인13:pET28a-MBP-p19-1; 레인14:pET28a-MBP-p24-1; 레인15:pET28a-MBP-p24-2;
레인16:pET28a-MBP-p25-1; 레인17:pET28a-MBP-p25-2; 레인18:pET28a-MBP 벡터
(레인 4와 5의 경우 융합벡터가 제대로 형성되지 않은 예이며, 추후 재실험하여 완성. 각 컨스트럭트의 맨 뒷자리 1과 2는 서로 다른 두 개의 콜로니로부터 얻어진 플라스미드 벡터임)
도 2b는 제한효소를 이용하여 pET28a-MBP-HTs-PTP 벡터를 절단하여 PTP가 삽입되었는지 확인한 결과를 나타낸 젤(gel) 사진의 예이고,
좌측으로부터
레인1:마커; 레인2:pET28a-MBP-pk4-1; 레인3:pET28a-MBP-pk4-2;
레인4:pET28a-MBP-pk13-1; 레인5:pET28a-MBP-pk13-2;
레인6:pET28a-MBP-pk16-1; 레인7:pET28a-MBP-pk16-2;
레인8:pET28a-MBP-pk18-1; 레인9:pET28a-MBP-pk18-2; 레인10:pET28a-MBP-p19-1;
레인11:pET28a-MBP-p19-2; 레인12:pET28a-MBP-p24-1; 레인13:pET28a-MBP-p24-2;
레인14:pET-28-MBP-p25-1; 레인15:pET-28-MBP-p25-2; 레인16:pET-28-MBP 벡터;
레인16:마커
(레인1-15까지 Ndel/BamHI으로 제한효소 처리하였으며, 레인16은 pET28-MBP 벡터를 XbaI과 XhoI 제한효소로 처리한 것임. 각 컨스트럭트번호의 맨 뒷자리 1과 2는 서 로 다른 두 개의 콜로니로부터 얻어진 플라스미드 벡터임)
도 3은 인간 PTP의 발현에서 정제까지의 전과정을 나타낸 흐름도(flow diagram)이고,
도 4는 정제된 인간 PTP군의 SDS PAGE 결과를 나타낸 그림이고,
도 5는 본 발명의 방법에 의하여 생산된 정제된 인간 PTP의 상대적인 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)를 대장균을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 여러 벡터를 이용하여 인간 PTP를 대장균에서 효소 활성을 가진 상태로 생산하는 방법에 관한 것이다.
단백질 타이로신의 인산화-탈인산화 과정은 세포내 신호전달 체계에서 매우 중요한 수단으로 이용된다. 단백질 타이로신 포스파타제(PTP)는 단백질 내의 타이로신 잔기에 있는 인산기를 가수분해시키는 효소로서, 인간에게는 약 100여종의 PTP가 존재하며, 이 중 약 80~90 종이 실제 PTP로서의 효소 활성을 보이는 것으로 보고 되어 있다(Alonso A. et al. Cell, 117; 699-711, 2004)
세포내 신호전달 체계의 파괴는 쉽게 질병으로 이어지기 때문에 실제로 많은 PTP들이 질병과 관계되어 있다는 것이 알려져 왔고 몇몇 PTP들은 신약 개발의 표적이 되어 왔다(Current Topics in Med. Chem. 3: 739-835, 2003: 전권이 PTP 관련 review) 그러나 당뇨병치료제 개발의 표적효소인 PTP 1B의 경우를 보더라도 10년 이상 무수히 많은 노력을 들여 억제제 개발연구를 진행하여 왔으나 아직까지 치료제 개발에 성공한 예가 보고 되지 않고 있다(Tayler, S.D. Current Topics in Med. Chem. 3, 759-782, 2003) 여기에는 여러가지 이유가 있겠지만 대표적인 이유 중 하나는 약물이 동물이나 인체에 투여되었을 경우 표적 PTP 이외의 다른 PTP에 결합함으로써 예상치 못한 독성을 야기하기 때문일 것으로 생각된다. 이러한 문제를 최소화할 수 있는 방법은 동물실험에 적용하기 전에 약물후보물질에 대하여 가능한 모든 PTP를 대상으로 PTP 특이성 연구를 진행하는 것인데 약 90여종에 달하는 PTP들이 비슷한 활성부위 구조를 가지고 있기 때문에 각각의 PTP에 특이적인 억제제를 개발하는 데 어려움이 있다.
필요한 단백질을 대장균 발현시스템을 이용하여 발현, 정제하는 방법은 적은 비용과 노력으로 대량의 단백질을 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있으나 포유동물과 세균의 세포내 환경 차이 때문에 대장균 시스템을 이용하여 여러 종류의 인간 단백질을 얻고자 할 때에는 각각의 단백질에 대하여 특정한 발현 및 정제조건을 확립할 필요가 있다. 그러나 현재까지는 일부의 PTP 만이 대량으로 발현, 정제될 뿐 대부분의 PTP들은 정제된 사례가 보고된 바 없어 전체 PTP에 대한 선택성 연구가 불가능한 실정이다. PTP가 제대로 정제되지 않는 이유는 본 발명자들이 일반적인 발현 조건을 이용하여 PTP를 정제한 경우, 단지 30종 미만의 PTP 만을 얻을 수 있었던 것과 같이, 일반적인 발현조건에서는 인간 PTP들이 제대로 발현 및 정제되지 않기 때문인 것으로 여겨진다. 이처럼 일반적인 방법으로는 인간 PTP를 대량으로 발현시키는 것이 어렵기 때문에 PTP 특이적인 항체 생산도 지연되고 있으며, 약물 개발 또한 어려움에 처해 있다.
이에 본 발명자들은 각각의 PTP를 활성을 가진 상태로 생산하고자 노력한 결과, 인간 대장균 발현 시스템을 이용하여 각각의 PTP를 발현ㆍ정제하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암, 관절염, 당뇨병을 비롯한 각종 질병과 밀접한 관계가 있어 신약개발에 유용하게 사용될 수 있는 인간 단백질 인산화 타이로신 가수분해효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)를 활성을 가진 채로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
ⅰ) 인간 타이로신 가수분해효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)의 발 현벡터를 제작하여 대장균을 형질전환시키는 단계;
ⅱ) 단계 ⅰ) 의 형질전환된 대장균을 배양하여 PTP의 발현을 유도하는 단계; 및
ⅲ) 단계 ⅱ)의 배양된 대장균으로부터 PTP를 정제하는 단계로 구성되는 인간 PTP를 활성을 가진 상태로 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단계ⅰ)에서 제작된 발현벡터 pET28a-MBP-His-TEV-PTP를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단계ⅰ)에서 제작된 발현벡터 pET28a-GST-PTP를 제공한다
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 ⅰ) 인간 타이로신 가수분해효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)의 발현벡터를 제작하여 대장균을 형질전환시키는 단계;
ⅱ) 단계 ⅰ) 의 형질전환된 대장균을 배양하여 PTP의 발현을 유도하는 단계; 및
ⅲ) 단계 ⅱ)의 배양된 대장균으로부터 PTP를 정제하는 단계로 구성되는 인간 PTP를 활성을 가진 상태로 생산하는 방법을 제공한다.
이제까지 단백질 타이로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)의 절반 이상이 활성상태로 대량 정제된 예가 거의 없을 정도로 정제하기가 어 려운 단백질인데, 본 발명자들은 77 종의 PTP에 대해 대장균으로부터 발현 및 정제하는 방법을 밝혀내었다. 구체적으로 본 발명자들은 대량 생산을 위한 대장균 과발현 벡터인 pET28a에 77 종의 PTP(표 1 참조)를 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 이 중 일반적인 방법으로 발현, 정제되는 26가지의 PTP를 제외한 나머지 PTP를 발현시키기 위하여 pET28a, pET16b를 기본벡터로 한 pET28a-GST-PTP와 pET28a-MBP-His-TEV-MCS-PTP, 즉 pET28a-MBP-HTs-PTP 발현벡터를 제작하였다. pET28a-GST-PTP는 PTP를 글루타치온 수지로 정제하기 위하여 GST로 표지한 발현벡터이고, pET28a-MBP-HTs-PTP는 불용성 봉입체를 형성하는 PTP를 대상으로, 대장균 발현 시스템에서 PTP의 발현, 접힘(folding) 및 용해도를 증가시키기 위하여 말토오스 결합부위(maltose binding protein, MBP)를 융합시킨 발현벡터이다. pET28a-MBP 벡터에는 MBP와 PTP 삽입부위 사이에 단백질 분해효소에 의하여 가수분해 될 수 있는 담배 식각 바이러스(tobacco erch virus) 서열을 삽입하여 정제 후, MBP 부위가 PTP로부터 분리되어 순수한 PTP만 회수할 수 있도록 하였다.
상기 재조합 발현벡터를 도입시킨 대장균 형질전환체를 제작하고 단계ⅱ)에서는 형질전환체 내에서 PTP의 발현을 유도하기 위하여, 여타의 단백질을 발현시키는 일반적인 방법으로 PTP의 발현을 유도하거나(발현조건 가) 불용성 봉입체를 형성하여 제대로 발현되지 않는 PTP의 경우에는 “발현조건 가”와 동일한 조건을 따르되, “발현조건 가”보다 IPTG(isopropyl-ß-D-thiogalacto pyranosid)의 농도를 증가시키거나(발현조건 나) 솔비톨(sorbitol)과 글라이신 베타인(glycin betain)을 첨가한 배지에서 대장균을 배양하거나(발현조건 다) “발현조건 다”와 동일한 조건을 따르되, “발현조건 다”에서 IPTG(isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid)의 농도를 감소시키거나(발현조건 라) 저온에서 발현을 유도하는 방법 중 각각의 PTP에 알맞은 방법을 선택하였다(발현조건 마)(표 1 참조).
상기에서 일반적인 방법이라 함은 대장균 형질전환체를 배양하여 OD600 값이 0.12 이하, 바람직하게는 0.6 내지 0.8, 보다 바람직하게는 0.6이 되었을 때 배양액을 상온보다 낮은 농도, 바람직하게는 18℃ 로 냉각시키고 0.5 mM 이하의 IPTG로 발현을 유도하는 방법을 말한다.
“발현조건 가”의 IPTG 처리 농도는 최종농도 1.0 mM 미만이고 바람직하게는 0.5 mM 이다. “발현조건 나”의 IPTG 처리 농도는 최종농도 1.0 mM 이상이고 보다 바람직하게는 1.0 mM 이다. “발현조건 다”의 솔비톨과 글라이신 베타인을 첨가한 배지에서 최종 솔비톨 농도는 0.1 내지 1 M 이고, 최종 글라이신 베타인 농도는 1M 미만이고 바람직하게는 50 mM이다. “발현조건 라”의 IPTG 처리 농도는 최종농도가 “발현조건 다”의 IPTG 처리 농도보다 낮고 바람직하게는 20 μM이다. “발현조건 마”의 저온은 18℃ 미만이고 바람직하게는 4℃ 이하이며 “발현조건 마”에서 처리하는 IPTG의 최종농도는 0.5 mM 이하이고 바람직하게는 0.1 mM 이다.
단계 ⅲ)에서는 단계 ⅱ)에서 발현 유도 후 회수한 균체를 파쇄하여 각각의 발현벡터에 알맞은 수지를 이용하여 PTP를 정제하였다. 구체적으로, pET28a-PTP에 대해서는 pET28a 벡터 내에 His 태그(tag)가 포함되어 있으므로 탈론(Talon®) 수지(ClonTech)를 이용하였고 pET28a-GST-PTP에 대해서는 GST 수지(정제방법 2)를, pET28a-MBP-HTs-PTP에 대해서는 아밀로즈(amylose) 수지(정제방법 1) 또는 탈론(Talon®) 수지(정제방법 3)를 사용하여 정제하였다. 아밀로즈 수지는 MBP(maltose binding protein)와 결합하며, 탈론 수지는 His 표지와 결합함으로 둘 다 PTP 정제에 이용될 수 있다(표 1 및 도 4 참조).
상기의 방법으로 발현된 PTP에 대하여, 탈인산화 효소 활성 검사 물질인 6,8-다이플로로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트(6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate, DiFMUP)를 이용하여 활성 검사를 실시한 결과, 표 3 및 도 5에 나타난 바와 같이 본 발명의 발현 및 정제방법에 의하여 77종의 인간 PTP가 활성인 상태로 정제되었음을 확인하였다.
상기에서 인간 PTP는 PTPRA(protein tyrosine phosphatase receptor type A, Unitprot 접근번호: P18433), PTPRB(Unitprot 접근번호: P23467), PTPRC(Unitprot 접근번호:Q5T5R0), PTPRD(Unitprot 접근번호: P23468), PTPRE(Unitprot 접근번호: P23469), PTPRF(Unitprot 접근번호: P10586), PTPRG(Unitprot 접근번호: P23470), PTPRH(Unitprot 접근번호:Q2NKN9), PTPRJ(Unitprot 접근번호: Q12913), PTPRK(Unitprot 접근번호: Q15262), PTPRM(Unitprot 접근번호: P28827), PTPRN(Unitprot 접근번호: Q16849), PTPRN2(type N polypeptide 2, Unitprot 접근번호: Q92932), PTPRO(Unitprot 접근번호: Q16827), PTPRR(Unitprot 접근번호: Q15256), PTPRS(Unitprot 접근번호: Q13332), PTPRT(Unitprot 접근번호: O14522), PTPRU(Unitprot 접근번호: Q92729), PTPRZ(Unitprot 접근번호: P23471), PTPN1(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1, Unitprot 접근번호: P18031), PTPN2,(Unitprot 접근번호: P17706) PTPN3(Unitprot 접근번호: P26045), PTPN5(Unitprot 접근번호: P54829), PTPN6(Unitprot 접근번호: P29350), PTPN7(Unitprot 접근번호: P35236), PTPN11(Unitprot 접근번호: Q06214), PTPN12(Unitprot 접근번호: Q05209), PTPN13(Unitprot 접근번호: Q12923), PTPN14(Unitprot 접근번호: Q15678), PTPN18(Unitprot 접근번호: Q99952), PTPN21(Unitprot 접근번호: Q16825), PTPN22(Unitprot 접근번호: Q9Y2R2), PTPN23(Unitprot 접근번호: Q9H3S7), DUSP1(dual specificity phosphatase 1, Unitprot 접근번호: P28562), DUSP2(Unitprot 접근번호: Q05923), DUSP4(Unitprot 접근번호: Q9PW71), DUSP5(Unitprot 접근번호: Q16690), DUSP6(Unitprot 접근번호: Q16828), DUSP7(Unitprot 접근번호: Q16829), DUSP8(Unitprot 접근번호: Q13202), DUSP9(Unitprot 접근번호: Q99956), DUSP10(Unitprot 접근번호: Q9Y6W6), DUSP16(Unitprot 접근번호: Q9BY84), MK-STYX(Map kinase phosphatase-like protein, Unitprot 접근번호: Q9Y6J8), DUSP3(Unitprot 접근번호: P51452), DUSP11(Unitprot 접근번호: O75319), DUSP12(Unitprot 접근번호: Q9UN16), DUSP13A(Unitprot 접근번호:Q9UII6 )DUSP13B(Unitprot 접근번호:Q9QYJ7), DUSP14(Unitprot 접근번호: O95147), DUSP15(Unitprot 접근번호: Q9H1R2), DUSP18(Unitprot 접근번호: Q8NEJ0), DUSP19(Unitprot 접근번호: Q8WTR2), DUSP21(Unitprot 접근번호: Q9H596), DUSP22(Unitprot 접근번호: Q9NRW4), DUSP23(Unitprot 접근번호: Q9BVJ7), DUSP24(Unitprot 접근번호: Q9Y6JB), DUSP25(Unitprot 접근번호:Q9Y216), DUSP26(Unitprot 접근번호:Q4GOw2), EPM2A(epilepsy progressive myoclonus type 2A, Unitprot 접근번호: O95278), SSH1(slingshot homolog 1, Unitprot 접근번호: Q8WYLO), SSH2(Unitprot 접근번호: Q76176), SSH3(Unitprot 접근번호: Q8TE77), PTP4A1(protein tyrosine phosphatase 4a1, Unitprot 접근번호: Q93096), PTP4A2(Unitprot 접근번호: Q12974), PTP4A3(Unitprot 접근번호: O75365), CDC14B(CDC14 cell division cycle 14 homolog B,Unitprot 접근번호: O60729), TPTE(transmembrane phosphoinositide 3-phosphatase and tensin homolog 2, Unitprot 접근번호: Q4R6N0), TENC1(tensin like C1 domain containing phosphatase, Unitprot 접근번호: Q2NL80), MTMR1(myotubularin related protein 1,Unitprot 접근번호: Q13613), MTMR3(Unitprot 접근번호: Q13615, MTMR7(Unitprot 접근번호: Q9Y216), MTMR8, ACP1(acid phosphatase 1 soluble, Unitprot 접근번호: P24666), CDC25A(cell division cycle 25B, Unitprot 접근번호: P30304), CDC25B(Unitprot 접근번호: P30305), CDC25C(Unitprot 접근번호: P30307)로 구성되는 군으로부터 선택되는 PTP이다(표 1 참조).
또한, 본 발명은 상기 단계ⅰ)에서 제작된 발현벡터 pET28a-MBP-HTs-PTP를 제공한다.
본 발명자들은 대장균 발현 시스템에서 불용성 봉입체를 형성하는 PTP의 용해도를 증가시키기 위하여 PTP의 N-말단에 말토오스 결합부위(maltose 결합부위)를 융합시키기로 하였다. 이를 위하여 pET28a의 다중 제한효소 작용부위(multi-cloning site, MCS) 바로 앞에 MBP 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제작하였다. 또한, 정제 후 MBP 없이 순수한 PTP만을 회수하기 위하여 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 단백질 분해효소에 의하여 가수분해 될 수 있는 부분을 MBP의 뒤쪽(downstream)에 도입하고 pET28a-MBP 벡터에서 MBP의 N-말단에 부착되어있는 His 표지가 종종 제 기능을 발휘하지 못하는 단점을 보완하기 위하여 MBP 와 TEV 단백질 분해효소 사이에 6개의 히스티딘(His tag)을 추가로 도입함으로써 pET28a-MBP-His-TEV 벡터, 즉 서열번호 5로 기재되는 pET28a-MBP-HTs를 제작하였다(도 1b 참조).
또한, 본 발명은 상기 단계ⅰ)에서 제작된 발현벡터 pET28a-GST-PTP를 제공한다.
본 발명자들은 불용성 봉입체를 형성하는 PTP 중 불용성 정도가 심하지 않은 PTP에 대해서는 pET28a-MBP-HTs-PTP 벡터가 아닌 pET28a-GST 벡터를 이용하여 pET28a-GST-PTP 발현벡터를 제작하였다. GST(glutathione S-transferase) 즉 글루타치온 S 전이효소로 표지할 경우 GST의 크기가 작아 발현된 PTP에 별다른 영향을 미치지 않으므로 정제한 후에도 MBP와 같은 제거과정을 거치지 않아도 된다. 따라서 불용성 정도가 심하지 않은 PTP의 경우에는 pET28a-GST-PTP 발현벡터를 제작하여 PTP를 정제하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> MBP 융합벡터 제작
<1-1> pET28a-PTP 융합벡터 제작
표 1에 기재된 77개의 PTP 활성도메인에 해당하는 유전자들을 Nde I, Nhe I, BamH I, Xho I 등의 제한효소부위를 이용하여 pET28a 벡터(Novagen)에 삽입함으로써 과발현벡터(overexpression vector) pET28a-PTP를 제작하였다.
<1-2> pET28a-MBP 융합 발현벡터의 제작
대장균 발현시스템에서 PTP의 발현, 접힘(folding)과 용해도를 증가시키기 위하여 PTP의 N-말단에 말토오스 결합부위(maltose binding protein, MBP)를 융합시켰다. 이를 위하여, 시판 중인 MBP 벡터를 이용하는 방법이 있으나, MBP 벡터는 상기 <실시예 1>에서 PTP를 삽입한 과발현 벡터인 pET28a 벡터(Novagen)와는 다른 제한효소 작용부위(multi-cloning site: MCS)를 가지고 있어서, 재조합 벡터를 제조하는데 어려움이 있었다. 따라서, pET28a 벡터의 다중 제한효소 작용부위의 바로 앞에 MBP 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제작하기로 하였다
pET28a-MBP 벡터제작에 필요한 MBP DNA는 pIVEX-MBP 융합벡터(Roche)로부터 제한효소 XbaI과 NdeI을 사용하여 잘라내었다. 이어서 T4 DNA 접합효소(ligase)를 이용하여 잘라낸 MBP DNA와 동일한 제한효소로 처리된 pET28a 벡터를 16℃에서 4 시간 접합반응시킴으로써 pET28a-MBP 벡터를 제작하였다(도 1a)
<1-3> pET28a-MBP-HTs 발현벡터의 제작
정제한 단백질로부터 MBP를 제거하고 순수한 PTP 도메인만을 얻기 위하여, tobacco etch virus(TEV) 단백질 분해효소에 의하여 가수분해 될 수 있는 부분을 MBP의 뒤쪽에 도입하였다.
먼저, 서열번호 1과 2로 각각 기재되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, pProEX HTb 벡터(Invitrogen)를 주형으로 하여, 얻어진 PCR 산물울 NcoI/Ndel으로 처리한 후 pET28a 벡터에 삽입하여 pET28a-TEV 벡터를 완성하였다. 이어서, PacI 제한효소 작용부위를 포함하고 각각 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머, 그리고 pET28a-TEV 벡터를 주형으로 PCR한 후 생성물을 PacI과 Xho I 제한효소로 처리한 후 pET28a-MBP에 삽입함으로써 pET28a-MBP-TEV 벡터를 제작하였다(도 1b) 위에 사용된 두 종류의 PCR 반응조건은 DNA 중합효소(Pfu polymerase , 솔젠트사)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 가. 94℃에서 1분, 나. 55℃에서 1분, 다. 72℃에서 2분간 중합반응하는 과정(가~다)을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 중합반응을 시켜서 완결하였다. 또한, pET28a-MBP 벡터에서 MBP의 N-말단에 부착되어있는 His 표지가 종종 제 기능을 발휘하지 못하는 단점을 보완하기 위하여 MBP와 TEV 단백질 분해효소 사이에 6개의 히스티딘(His tag)을 추가로 도입함으로써 서열번호 5로 기재되는 pET28a-MBP-His-TEV-MCS 벡터를 제작하였으며 이를 간단히 pET28a-MBP-HTs 벡터라고 명명하였다(도 1b).
<1-4> pET28a-MBP-HTs-PTP 재조합 컨스트럭트 제작
77개 중 일반적인 조건에서도 발현이 가능한 실시예 <1-1>의 26 개의 PTP 유전자를 제외한 나머지 63 개의 PTP 유전자를 pET28a-PTP 과발현 벡터로부터 제한효 소 (Nde I, Nhe I, BamH I, 혹은 Xho I)를 사용하여 PTP 유전자를 잘라내었다. 각각의 유전자들과 해당 제한효소로 처리된 pET28-PTP와 pET28-MBP-HTs 벡터를 T4 DNA 접합효소(ligase)로 16℃에서 4 시간 처리함으로써 pET28a-MBP-HTs-PTP 발현벡터를 제작하였다. 상기 벡터로 대장균 DH5a를 형질전환 시키고 30mg/mL의 카나마아신이 포함된 LB 아가(agar) 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 도 2a는 형질전환시킨 대장균으로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 아가로스 젤 전기영동을 함으로써 제작된 pET28a-MBP-PTP 벡터를 확인한 예이다. 도 2b는 정제된 pET28a-MBP-HTs-PTP를 해당 제한효소를 사용하여 37℃에서 2시간 이중 절단(double digestion)한 후, 1% DNA 아가로스 젤 전기영동하여, PTP 유전자가 삽입되었는지 확인한 예이다.
<실시예 2> 대장균 내에서 pET28a-MBP-PTP 의 발현
<2-1> 일반적인 조건에서 PTP 발현(발현조건 가)
실시예<1-3>에서 제작한 pET28a-MBP-PTP나 pET28a-MBP-HTs-PTP 벡터로 대장균 BL21(DE3) Codon Plus(Stratagene) 혹은 E.coli Rosetta DE3(Novagen)를 형질전환시키고 카나마이신을 포함한 LB 고체 배지를 이용하여 37℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 이 때 형성된 단일 콜로니(colony)를 LB 배지(50 mL, 30 mg/mL kanamycin 포함)에 접종하고, 섭씨 37도에서 16시간 배양한 후 적당량을 취하여 LB 배지(1 L, 30 mg/mL kanamycin 포함)에 접종하였다. 대장균 배양액의 양을 조절 하여 OD600이 0.12 이하가 되도록 하고 같은 온도에서 계속 배양하여 OD600이 0.6~0.8에 도달하였을 때, 배양액을 18 ℃로 냉각시킨다. 이어서, 발현유도물질인 IPTG(isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid)를 첨가하여 IPTG의 최종농도가 0.5 mM 이 되도록 하고, 18 ℃에서 18 시간 더 배양하여 MBP 융합 PTP의 발현을 유도하였다.
상기 배양액을 원심분리하여 침전된 균체를 40 mL 세포 용해 완충용액(lysis buffer; PMSF 1mM, pH7.5 50 mM Tris, 200 mM NaCl)에 현탁하고 초음파 발생기로 용해시켰다. 이를 원심분리하여 상층액을 아밀로즈 수지(amylose resin)에 로딩(loading)하고 아래 기술한 배치(batch) 방법으로 정제하였다. 배치방법을 이용한 단백질 정제를 상세히 기술하면 다음과 같다. 10 mL의 컬럼 완충용액(50 mM Tris pH7.5, 200mM NaCl, 5% glycerol, 0.05% β-mercaptoethanol)으로 아밀로즈 레진(1 mL)을 2번 씻어서 활성화시킨 후, 위에서 분리한 상층액을 가하여 4℃ 에서 3시간 동안 천천히 진탕하여 단백질을 레진에 흡착시킨다. 수용액을 여과 제거한 후, 레진을 컬럼(10 mL)로 두 번 씻어 준 후 10 mL의 용출 완충용액(elution buffer: 500 mM 말토오즈를 포함한 컬럼 완충용액)을 가한 후 다시 1 시간 천천히 진탕(rocking)한 후 여과하여, 목표 단백질을 회수한다. 5 mL의 용출 완충용액을 사용하여 한 번 더 반복한 후 합하고 10% SDS-PAGE 젤을 통해 단백질의 크기를 추정함으로써 목표 단백질이 용출되었음을 확인하였다.
상기 과정 중 여러 개의 MBP-PTP 융합단백질 발현시 불용성 봉입체 (inclusion body)를 형성하였는데 이러한 PTP들은 0.5 ~ 1 M 소비톨과 50 mM 글라이신 베타인(glycine betaine)을 포함한 LB 배지를 사용하거나, 저온에서 발현시킴으로써 수용성으로 얻었다(표 1)
<2-2> IPTG 농도 증가(발현조건 나)
상기 실시예 <2-1>의 결과, 발현속도가 느린 PTP들을 대상으로 실시예 <2-1>의 발현 조건 중 IPTG의 농도를 0.5 mM 에서 1.0 mM로 높인 후 단백질을 발현시켰다.
<2-3> 소비톨(Sorbitol) 배지 조건에서의 단백질 발현(발현조건 다)
상기 실시예 <2-1>와 같은 방법으로 접종한 후 하룻밤 배양한 50 mL LB 배지 중 10 mL을 취하여 1L 소비톨 배지(LB 배지에 30 mg/mL kanamycin, 1 M sorbitol 및 50 mM betain 포함)에 넣고 O.D600 = 0.6이 될 때까지 37 ℃에서 배양한다. 인큐베이터(Incubator)를 18℃로 내려 20분간 냉각한 후 IPTG를 가하고 같은 온도에서 24 시간 동안 배양하였다. 소비톨(sorbitol) 배지에서는 자라는 속도가 많이 느리므로 37 ℃에서 8시간 이상 키우고 중간에 O.D를 재어 O.D600 = 0.6까지 자랐는지 확인하였다. 집균 및 단백질 정제는 위의 실시예 <2-1>에 기술된 방법과 동일하다.
<2-4> 발현조건 다보다 IPTG 농도 감소(발현조건 라)
실시예 <2-1>의 조건 중 IPTG 농도를 20 μM 로 조절하여 단백질을 발현시켰다.
<2-5> 저온에서의 단백질 발현(발현조건 마)
<2-1>와 같은 방법으로 접종한 후 하루 밤 배양된 50 mL LB 배지 중 10 mL을 취하여 lℓ LB 배지에 가한 후 O.D600 = 0.6이 될 때까지 37 ℃에서 배양하였다.
배양액을 4 ℃ 진탕기로 옮긴 후 진탕하여 배양액의 온도를 4 ℃ 로 냉각한 후 최종농도 0.1 mM가 되도록 IPTG를 넣어 3일 간 배양하였다. 집균 및 단백질 정제는 실시예 <2-1>에 기술된 방법과 동일하다.
<실시예 3> 단백질 정제
<3-1> 아밀로즈 수지(Amylose resin) 이용(정제방법 1)
원심분리에 의하여 침전된 균체를 25 mL의 세포 용해 완충용액(pH7.5, 50 mM Tris, 200 mM NaCl)에 현탁하고 단백질 분해 효소의 활성을 억제하기 위하여 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하였다. 여기에 초음파를 가하여 세포를 용해시킨 후 30 분간 원심분리하여 상등액을 10 mL의 증류수와 10 mL의 세포 용해 완충용액으로 씻어서 미리 활성화 시킨 아밀로즈 수지 2 mL에 상기 상등액을 넣어 혼합한 후, 진탕기(rocker)를 사용하여 4 ℃에서 5시간 동안 천천히 진탕하는 방법으로 단백질을 수지에 결합시켰다. 상등액을 제거한 후 각각 10 mM 말토오즈(maltose)를 포함한 세포 용해 완충용액(10 mL)을 넣어 10분간 수지를 세척하였다. 마지막으로 용리 완충용액(elution buffer; 500 mM 말토오즈를 포함한 세포 용해 완충용액) 10 mL를 넣고 2 시간 동안 진탕한 후 상등액만 회수하여 목표 단백질을 획득하였다(도 4).
<3-2> 글루타치온 수지(Glutathione resin) 이용(정제방법 2)
GST 표지된 단백질들은 1 x 4 cm 글루타치온 컬럼(column)을 사용하여 실시예 <4-1>과 같이 정제하였다. 20 mM 글루타치온, pH 7.5, 50 mM Tris, 200 mM NaCl 을 포함한 용리 완충용액을 사용하여 수지로부터 목표 단백질을 포함한 분액을 용리시켰다(도 4).
<3-3> 탈론 수지(Talon resin) 이용(정제방법 3)
원심분리에 의하여 침전된 세포를 25 mL의 세포 용해 완충용액(pH7.5, 50 mM Tris, 200 mM NaCl, 5% glycerol, 0.05% β-mercaptoethanol)에 현탁하고 단백질 분해를 억제하기 위하여 1 mM PMSF를 첨가하였다. 초음파를 이용하여 세포를 부순 후 3013 G에서 30분간 원심분리하여 상등액을 증류수 10 mL과 세포 용해 완충용액으로 씻어서 미리 활성화 시킨 1 mL의 탈론 수지와 상기 상등액을 혼합한 후, 진탕기를 사용하여 4 ℃에서 1시간 동안 천천히 진탕하여 단백질을 수지에 결합시켰다. 상등액을 제거한 후 각각 10 mL의 세포 용해 완충용액과 10 mM 이미다졸 완충용액 (imidazole buffer)을 이용하여 10분 간 진탕하여 수지를 씻어주었다. 마지막으로 100 mM 이미다졸을 포함한 세포 용해 완충용액 10 mL를 넣고 1시간 동안 진탕한 후 여과하여 목표 단백질을 회수하였다(도 4).
번호 단백질명 gene 과발현벡터 발현조건 정제방법
1 T4 PTPRA MBP 가 1
2 T7 PTPRB GST 가 2
3 T17 PTPRC MBP 다 1
4 T26 PTPRD pET28a 가 3
5 T37 PTPRE MBP 마 1
6 T48 PTPRF pET28a 가 3
7 T6 PTPRG MBP 마 1
8 T8 PTPRH GST 가 2
9 T23 PTPRJ GST 가 2
10 T39 PTPRK pET28a 가 3
11 T5 PTPRM MBP 가 1
12 T38 PTPRN MBP 가 1
13 T12 PTPRN2 MBP 나 1
14 T15 PTPRO MBP 나 1
15 T10 PTPRR MBP 나 1
16 T22 PTPRS MBP 가 1
17 T20 PTPRT MBP 라 1
18 T31 PTPRU MBP 가 1
19 T28 PTPRZ MBP 가 1
20 PTP1B PTPN1 pET28a 가 3
21 T25 PTPN2 MBP 가 1
22 T36 PTPN3 GST 가 2
23 T41 PTPN5 pET28a 가 3
24 T18 PTPN6 MBP 나 1
25 pk32 PTPN7 MBP 다 1
26 pk28 PTPN11 pET28a 가 3
27 T1 PTPN12 MBP 다 1
28 T32 PTPN13 MBP 가 1
29 T40 PTPN14 MBP 가 1
30 T3 PTPN18 MBP 가 1
31 T2 PTPN21 MBP 가 1
32 T35 PTPN22 MBP 가 1
33 T30 PTPN23 MBP 가 1
34 pk4 DUSP1 MBP 가 1
35 pk5 DUSP2 MBP 가 1
36 pk7 DUSP4 MBP 가 1
37 pk8 DUSP5 MBP 가 1
38 pk9 DUSP6 MBP 나 1
39 pk10 DUSP7 MBP 다 1
40 T33 DUSP8 MBP 가 1
41 pk12 DUSP9 MBP 가 1
42 pk13 DUSP10 MBP 가 1
43 T27 DUSP16 MBP 나 1
44 T53 MK-STYX MBP 가 1
45 pk6 DUSP3 MBP 나 1
46 pk14 DUSP11 MBP 가 1
47 pk15 DUSP12 MBP 가 1
48 pk33 DUSP13A MBP 나 1
49 p44 DUSP13B MBP 나 1
50 pk30 DUSP14 MBP 나 1
51 p21 DUSP15 MBP 가 1
52 pk35 DUSP18 MBP 나 1
53 NE1 DUSP19 MBP 가 1
54 p19 DUSP21 MBP 가 1
55 pk18 DUSP22 MBP 가 1
56 p12 DUSP23 MBP 가 1
57 pk17 DUSP24 MBP 가 1
58 p16 DUSP25 MBP 가 1
59 p20 DUSP26 pET28a 가 3
60 pk19 EPM2A MBP 가 1
61 p18 SSH1 MBP 가 1
62 NE3 SSH2 MBP 가 1
63 pk36 SSH3 MBP 다 1
64 pk3 PTP4A1 pET28a 가 3
65 p49 PTP4A2 MBP 가 1
66 p26 PTP4A3 MBP 가 1
67 T29 CDC14B MBP 가 1
68 T9 TPTE MBP 가 1
69 p24 TENC1 16b-MBP 가 1
70 T24 MTMR1 16b-MBP 마 1
71 T19 MTMR3 MBP 다 1
72 pk16 MTMR7 16b-MBP 가 1
73 p13 MTMR8 MBP 라 1
74 T46 ACP1 MBP 나 1
75 pk1 CDC25A pET28a 가 3
76 T47 CDC25B GST 가 2
77 T45 CDC25C GST 가 2
(88개의 발현 정제를 시도하였으나 77개의 PTP만 성공하였음)
<실시예 4> 단백질의 활성평가
문헌의 예(Pastula C. et al. Comb Chem High Throughput Screen. 6, 341-6, 2003; Welte S et al., Anal. Biochem. 338, 32-38, 2005)를 따라 시판중인 DiFMUP(50~100 mM)와 pNPP(50 mM)를 사용하여 PTP의 효소 활성을 측정하였다(표 2 및 도 5).
정제된 인간 PTP의 효소활성 검사결과
A2. DSP 또는 VH1-유사 PTP
2.1 MKP
T33 DUSP8 O O 활성
PK9 DUSP6 O O 활성
pk8 DUSP5 O O 활성
pk10 DUSP7 O O 활성
PK4 DUSP1 활성
T27 DUSP16 O O 활성
소계 5 5
2.2 비정형 DSP(Atypical DSP)
P12 DUSP23 O O 활성
P16 DUSP25 O O 활성
P19 DUSP21 O O 활성
P21 DUSP15 O O 활성
P25 DUSP13A O O 활성
P44 DUSP13B O O 활성
PK6 DUSP3 O O 활성
PK15 DUSP12 O O 활성
PK18 DUSP22 O X 활성
PK19 EPM2A O O 활성
PK30 DUSP14 O O 활성
PK33 DUSP13A O O 활성
PK35 DUSP18 O O 활성
T53 STYX O O 활성
NE1 DUSP19 O O 활성
pk17 DUSP24 O O 활성
p20 DUSP26 O O 활성
PK18 DUSP22 O O 활성
소계 18 17
2.3 Slingshot
P18 SSH1 O O 활성
NE3 SSH2 O O 활성
pk36 SSH3 O O 활성
소계 3 3
2.4 PRL
P26 PTP4A3 O O 활성
P49 PTP4A2 O O 활성
PK3 PTP4A1 O O 활성
소계 3 3
2.5 CDC14
T29 CDC14B O O 활성
소계 1 1
2.6 PTEN
P24 TENC1 O X 비활성
P45 TENSN O X 비활성
소계 2 0
2.7
pk16 MTMR7 O O 활성
T19 MTMR3 O O 활성
p13/p23 MTMR8 O O 활성
T24 MTMR1 O O 활성
소계 4 4
B. Ⅱ 군 Cys-Based PTP
T46 ACP1 O O 활성
소계 1 1
C. Ⅲ 군
pk1 CDC25A O O 활성
T45 CDC25C O O 활성
T47 CDC25B O O 활성
소계 3 3
테스트한 전체 PTP의 수 70
활성인 PTP의 수 65
비활성인 PTP의 수 5
Ref.에 비활성으로 알려진 것 4
Ref.에 비활성으로 알려졌으나 활성인 것 1
Ref.에 활성으로 알려졌으나 비활성인 것 2
* 상기 표에서 PTP 코드는 발명자가 임의로 실험순서에 따라 명명
* Ref.는 Alonso A. et al. Cell, 117, 699-711, 2004
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 대장균 발현시스템을 이용하여 인간 단백질 인산화 타이로신 가수분해효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)를 활성을 가진 채로 정제하는 방법은 현재, 많은 PTP들이 암, 관절염, 당뇨병을 비롯한 각종 질병과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있고 새로운 기능이 계속 밝혀지고 있으므로 본 발명의 방법에 따라 정제된 PTP는 신약개발을 위한 새로운 표적효소로 이용될 수 있고 고효율 약물검색에 사용될 수 있다.
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Claims (10)

  1. ⅰ) 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)의 발현벡터를 제작하여 대장균을 형질전환시키는 단계;
    ⅱ) 단계 ⅰ) 의 형질전환된 대장균을 배양하여 PTP의 발현을 유도하는 단계로서 상기 발현 유도 단계는
    가) 대장균을 배양하여 IPTG를 최종농도가 0.3 - 0.7 mM로 처리,
    나) 대장균을 배양하고 IPTG를 최종농도가 0.7 - 1.5 mM로 처리,
    다) 대장균을 0.1 내지 1M의 솔비톨과 40 - 60mM의 글라이신 베타인이 첨가된 배지에 배양하고, IPTG를 최종농도가 0.5 - 1.0 mM로 처리,
    라) 대장균을 0.1 내지 1M의 솔비톨과 40 - 60mM의 글라이신 베타인이 첨가된 배지에 배양하고, IPTG를 최종농도가 10 - 50μM로 처리,
    마) 대장균을 배양하고 3 - 6 ℃ 에서 IPTG를 0.1 - 0.2mM로 처리하는 것으로 이루어진 군 중에서 각 PTP가 대장균에서 효소 활성을 갖는 상태로 생성되기에 적합한 발현 유도 처리 조건을 선정하고 상기 선정된 조건하에서 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    ⅲ) 단계 ⅱ)의 배양된 대장균으로부터 PTP를 정제하는 단계로 구성되는 인간 PTP를 활성을 가진 상태로 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 ⅰ)의 발현벡터의 제작을 위한 기본벡터는 pET28a 또는 pET16b 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계 ⅱ)의 발현 유도 조건 ‘가’의 IPTG 최종농도는 0.5mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 단계 ⅱ)의 발현 유도 조건 ‘나’의 IPTG 최종농도는 1.0mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 단계 ⅱ)의 발현 유도 조건 ‘다’의 솔비톨 농도는 1M이고, 글라이신 베타인 농도는 50mM이며, IPTG 최종농도는 0.5mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 단계 ⅱ)의 발현 유도 조건 ‘라’의 솔비톨 농도는 1M이고, 글라이신 베타인 농도는 50mM이며, IPTG 최종농도는 20mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 단계 ⅲ)의 정제단계는 아밀로즈 수지, 글루타치온 수지, 탈론 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 수지를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 인간 PTP는 PTPRA(protein tyrosine phosphatase receptor type A, Unitprot 접근번호: P18433), PTPRB(Unitprot 접근번호: P23467), PTPRC(Unitprot 접근번호:Q5T5R0), PTPRD(Unitprot 접근번호: P23468), PTPRE(Unitprot 접근번호: P23469), PTPRF(Unitprot 접근번호: P10586), PTPRG(Unitprot 접근번호: P23470), PTPRH(Unitprot 접근번호:Q2NKN9), PTPRJ(Unitprot 접근번호: Q12913), PTPRK(Unitprot 접근번호: Q15262), PTPRM(Unitprot 접근번호: P28827), PTPRN(Unitprot 접근번호: Q16849), PTPRN2(type N polypeptide 2, Unitprot 접근번호: Q92932), PTPRO(Unitprot 접근번호: Q16827), PTPRR(Unitprot 접근번호: Q15256), PTPRS(Unitprot 접근번호: Q13332), PTPRT(Unitprot 접근번호: O14522), PTPRU(Unitprot 접근번호: Q92729), PTPRZ(Unitprot 접근번호: P23471), PTPN1(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1, Unitprot 접근번호: P18031), PTPN2,(Unitprot 접근번호: P17706) PTPN3(Unitprot 접근번호: P26045), PTPN5(Unitprot 접근번호: P54829), PTPN6(Unitprot 접근번호: P29350), PTPN7(Unitprot 접근번호: P35236), PTPN11(Unitprot 접근번호: Q06214), PTPN12(Unitprot 접근번호: Q05209), PTPN13(Unitprot 접근번호: Q12923), PTPN14(Unitprot 접근번호: Q15678), PTPN18(Unitprot 접근번호: Q99952), PTPN21(Unitprot 접근번호: Q16825), PTPN22(Unitprot 접근번호: Q9Y2R2), PTPN23(Unitprot 접근번호: Q9H3S7), DUSP1(dual specificity phosphatase 1, Unitprot 접근번호: P28562), DUSP2(Unitprot 접근번호: Q05923), DUSP4(Unitprot 접근번호: Q9PW71), DUSP5(Unitprot 접근번호: Q16690), DUSP6(Unitprot 접근번호: Q16828), DUSP7(Unitprot 접근번호: Q16829), DUSP8(Unitprot 접근번호: Q13202), DUSP9(Unitprot 접근번호: Q99956), DUSP10(Unitprot 접근번호: Q9Y6W6), DUSP16(Unitprot 접근번호: Q9BY84), MK-STYX(Map kinase phosphatase-like protein, Unitprot 접근번호: Q9Y6J8), DUSP3(Unitprot 접근번호: P51452), DUSP11(Unitprot 접근번호: O75319), DUSP12(Unitprot 접근번호: Q9UN16), DUSP13A(Unitprot 접근번호:Q9UII6 )DUSP13B(Unitprot 접근번호:Q9QYJ7), DUSP14(Unitprot 접근번호: O95147), DUSP15(Unitprot 접근번호: Q9H1R2), DUSP18(Unitprot 접근번호: Q8NEJ0), DUSP19(Unitprot 접근번호: Q8WTR2), DUSP21(Unitprot 접근번호: Q9H596), DUSP22(Unitprot 접근번호: Q9NRW4), DUSP23(Unitprot 접근번호: Q9BVJ7), DUSP24(Unitprot 접근번호: Q9Y6JB), DUSP25(Unitprot 접근번호:Q9Y216), DUSP26(Unitprot 접근번호:Q4GOw2), EPM2A(epilepsy progressive myoclonus type 2A, Unitprot 접근번호: O95278), SSH1(slingshot homolog 1, Unitprot 접근번호: Q8WYLO), SSH2(Unitprot 접근번호: Q76176), SSH3(Unitprot 접근번호: Q8TE77), PTP4A1(protein tyrosine phosphatase 4a1, Unitprot 접근번호: Q93096), PTP4A2(Unitprot 접근번호: Q12974), PTP4A3(Unitprot 접근번호: O75365), CDC14B(CDC14 cell division cycle 14 homolog B,Unitprot 접근번호: O60729), TPTE(transmembrane phosphoinositide 3-phosphatase and tensin homolog 2, Unitprot 접근번호: Q4R6N0), TENC1(tensin like C1 domain containing phosphatase, Unitprot 접근번호: Q2NL80), MTMR1(myotubularin related protein 1,Unitprot 접근번호: Q13613), MTMR3(Unitprot 접근번호: Q13615, MTMR7(Unitprot 접근번호: Q9Y216), MTMR8, ACP1(acid phosphatase 1 soluble, Unitprot 접근번호: P24666), CDC25A(cell division cycle 25B, Unitprot 접근번호: P30304), CDC25B(Unitprot 접근번호: P30305), CDC25C(Unitprot 접근번호: P30307)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 대장균 발현시스템에서 불용성 봉입체를 형성하는 PTP(protein tyrosine phosphatase)의 발현 및 정제를 위한 도 1-b의 개열지도를 갖는 발현벡터 pET28a-MBP-HTs.
  10. 삭제
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