KR100729638B1

KR100729638B1 - 미역포자엽으로부터 분리한 항혈액응고활성을 가진황산화푸코스다당 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100729638B1
Application number: KR1020050042732A
Authority: KR
Inventors: 배태진; 김기웅; 최옥수
Original assignee: 배태진
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2007-06-19
Anticipated expiration: 2025-05-20
Also published as: KR20060119596A

Abstract

본 발명은 미역포자엽을 효소분해하여 얻은 다당분해물에서 단백질과 알긴산을 제거한 조 푸코이단을 이온교환과 겔크로마토그래피에 의한 정제 및 한외여과기로 탈염, 농축하여 제조되는 항혈액응고능을 지닌 황산화푸코스다당에 대한 것으로 안전성이 우수하고 내인성혈액응고인자에 관여하는 항혈액응고활성이 우수한 미역포자엽 유래 황산화푸코스다당 및 그 제조방법에 관한 것이다.

황산화푸코스다당, 푸코이단, 미역포자엽, 항혈액응고활성

Description

미역포자엽으로부터 분리한 항혈액응고활성을 가진 황산화푸코스다당 및 그 제조방법{Anti coagulative Fucosidan isolated from Sporophyll in Undaria pinnatifida and its prepration method}

도1은 미역포자엽으로부터 다당류액을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도2은 다당류액으로부터 조 푸코이단액을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도3은 조 푸코이단으로 부터 항혈액응고성 푸코이단을 제조하는 방법에 관한것이다.

도4는 정제 푸코이단의 분획물의 전당 흡광도와 분자량에 관한 것이다.

도5는 마우스꼬리정맥에 각 농도별로 MKF-3를 투여하고 APTT, TT 활성을 측정한 그림이다.

도 6은 MKF-3를 마우스에 투여한 후 생체내 잔존시간을 나타낸 것이다.

본 발명은 미역포자엽으로 부터 분리한 항혈액응고활성을 지닌 황산화푸코스 당 및 그 제조방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 갈조류인 미역(Undaria pinnatifida)의 포자엽(Sporophyll)로 부터 혈액응고, 혈소판응집에 의한 혈액응고를 저해함으로써 혈관의 혈전생성을 방지하는 항혈액응고활성을 가진 황산화푸코스다당 및 그 제조방법에 관한 것이다.

미역포자엽은 갈조류 곤포과에 속하는 미역의 생식소로서 봄철에 미역이 자라면서 줄기의 밑부분 가장자리에 주름이 생겨 포자엽으로 변하고 거기에 유주자 주머니가 생긴다. 수온이 14℃ 이상 되면 유주자가 방출되고 모체는 녹아버리는데, 이 현상이 22℃까지 계속된다. 가을이 되면 암수의 배우체에서 각각 알과 정자가 나와 수정하고 곧 발아하여 아포체가 된다. 이것이 자라서 육안으로 볼 수 있는 엽상체가 되는데, 이것이 미역의 본체이다.

미역포자엽에는 황산기함량이 많은 황산다당이 20%가량 존재하며 이를 황산화푸코스다당 또는 푸코이단(fucoidan)이라고 하며 항암기능, 항바이러스 기능, 항종양 기능, 면역증강 기능 등 다양한 생리활성 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.

현대사회의 주요한 사망 원인 중 하나는 혈전증으로 인한 심장과 혈관의 병변이라 할 수 있다. 황산화 다당의 일종인 헤파린은 근 50년동안 혈전증 치료제로서 사용되어왔다. 이 밖에 무척추동물과 해조류에서 황산다당이 다량 함유되어 있는 것으로 보고되어 있어서 현재 세계적으로 헤파린 대체 약품개발에 박차를 가하고 있다.

대부분의 혈전색전증 치료과정은 항응혈성 치료를 요구한다. 여기에 헤파린 이 사용되어 왔다. 또한 헤파린은 혈액투석과 혈관외과 수술등에서 외부순환용제로서 사용되고 있다.

헤파린은 인슐린에 이어 두번째로 많이 사용되는 천연치료혼화제이다.

헤파린의 주요한 혈액응고작용은 항트롬빈작용과 트롬빈과 facter Xa에 특이적인 억제자로 작용하는 헤파린 보조인자 II의 강화작용을 통하여 성취된다.

항혈전증효과가 항응혈성작용에 매우 의존적인 것으로 가정된다.

최근 분별법 또는 표준 헤파린의 분열에 의하여 얻어진 저분자헤파린은 혈전 색전증의 예방법을 위해 대안이 되었다.

헤파린은 혈소판감소증 발달, 출혈효과, 선천적 또는 후천적 항트롬빈결핍에 대한 무효과, 트롬빈과피브린결합에 대한 무능력 등의 부작용을 가지고 있다.

더구나 헤파린은 돼지내장이나 소의 허파에서 추출하는데 그 수율이 현저히 낮다. 게다가 포유류에서 프리온(prion) 관련 사고와 항트롬빈 치료가 추가로 요구되는 등 항혈액응고 및 항트롬빈 효과를 지닌 대체물질에 대한 연구가 필요시 되고 있다.

이에 본 발명자들은 해양의 천연자원인 미역포자엽을 이용하여 항혈액응고성분을 지닌 물질을 찾기 위해 연구한 결과, 미역포자엽 황산다당이 우수한 항혈액응고효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 미역포자엽으로부터 항혈액응고효과가 뛰어난 천연 황산다당인 푸코이단 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목 적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 건조미역포자엽을 절단하는 단계와 효소를 이용하여 미역포자엽을 분해하는 단계와, 효소분해물의 점도를 저하시키는 단계와, 효소분해물 중의 단백질과 알긴산을 제거하는 단계와, 투석을 통하여 탈염하는 단계와 이온교환크로마토그래피를 통하여 황산다당을 수집하는 단계와 gel chromatography를 통하여 분자량 분포에 따라 분획하는 단계와 분획된 푸코이단을 한외여과기로서 농축탈염하는 단계와 각 농축분획물에 대하여 항혈액응고 활성을 측정하여 해당 획분을 농축하여 얻은 푸코이단에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

미역포자엽의 절단은 건조 미역 절단기를 이용하여 포자엽을 1/2로 절단한다.

효소분해수율을 높이기 위해서는 미세절단하는 것보다 미역포자엽을 1/2로 절단하는 것이 바람직하다. 이는 미세절단할 경우 포자엽 내의 점질다당의 유출시간이 효소분해초기에 영향을 미쳐 분해공정 중 점도가 조기에 상승하여 분해공정이 원활하지 않기 때문이다.

절단된 미역포자엽을 시판효소인 에스씨원(에스티바이오스 (주))의 효소로 분해하여 다당분해액을 조제한다. 미역포자엽을 효소분해 추출하면 열수 추출하거나 에탄올 등의 용매추출시 보다 높을 수율을 확보할 수 있으며, 분해종료 후 잔사 발생율이 적다는 장점이 있다.

푸코이단 정제과정을 원활하게 진행하기 위하여 효소분해물의 점도를 초기에 감소시켜야 한다. 이는 효소분해 후 가압추출을 통하여 1차 감소시키고 여과 공정시 고압균질기를 통하여 균질화 하므로서 점도를 감소시킬 수 있다.

효소분해액 중 미역포자엽의 단백질을 제거하기 위하여 프로테아제 NP(태평양화학)로 당과 결합되어 있는 단백질을 유리시키거나 단백질을 펩티드 이하로 유리시키고 가열에 의하여 실활 및 응고 시킨다음 미역포자엽 단백질의 침전이 잘 일어나는 등전점인 pH 4.0으로 조절하여 단백질을 침전시키고 원심분리하여 침전물을 제거하였다.

효소분해액 중의 황산다당과 결합되어 있는 알긴산을 제거하기 위하여 제단백 효소분해액에 10배량의 0.1N HCl을 가하여 하룻밤 동안 교반추출하고, 염화칼슘용액을 가하여 알긴산을 침전시키고 원심분리하여 제거한 후 상등액을 NaOH로 중화하였다. 여기에 CPC(Cetylpyridium Cloride)를 가하여 다당류를 불용성 침전화시켜 이침전에 4M 식염수를 가하여 37℃로 가용화 하였다. 여기에 에틸알콜을 가하여 다당을 침전시키고 원심분리로 침전을 모아 식염수로 다시 수용액에 가용화시켜 다당류액을 획득하였다.

다당류액을 투석을 통하여 탈염하는 단계는 한외여과기를 이용한 농축투석법을 사용하였다. 분자량 1,000-3,000 범위의 한외여과기를 사용하여 순환농축하여 탈염하였다.

황산다당의 수집은 탈염농축된 다당류액을 강염기성 음이온교환수지를 이용 하여 황산기를 흡착한 후 탈착하여 회수하여 한외여과기로 농축하였다.

항혈액응고 활성을 나타내는 푸코이단 분획을 획득하기 위하여 겔크로마토그래피(Gel-chromatography)를 통하여 분자량 분포에 따라 분획하여 한외여과기로 농축하고 필요에 따라 건조시켜 사용할 수 있다.

상기 미역포자엽 효소분해액로 부터 얻은 푸코이단 분획물은 in vitro 및 in vivo 실험에서 효과를 나타내었고, 부작용이 발생하지 않았다.

상기 푸코이단 분획물에 대한 항혈액응고활성 측정은 APTT(activated partial thromboplastin time) 항혈액응고활성 및 TT(thrombin time) 항응고활성 과 collagen-induced platelet aggregation test에 의해 하였으며, 그 결과 우수한 항혈전효가가 있는것으로 나타났다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 아래 실시예들은 본 발명을 예시하는 것이지만 그 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1)

미역포자엽 저점도 효소분해액의 제조

미역포자엽상의 다당의 효율적인 추출을 위하여 셀룰라제 계통의 다당분해복합효소인 에스씨원(에스티바이오스(주))을 이용한 분해를 적용하였다. 효소분해 초기 점질다당의 과다한 유출로 인해 분해활성이 저하되는 현상을 막기위해 미역포자엽 조체를 미세분말화 하지않고 조체를 1/2로 절단하여 사용하였다.

절단된 미역포자엽 50kg(수분 7%함유)을 반응기에 넣고 정제수를 포자엽의 2 배인 100kg을 가한후 5분간 감속기 속도를 40rpm으로 조정하여 교반 후 유출액을 방출하는 것으로 탈염 및 수세를 행하였다. 여기에 포자엽 건조중량의 14배인 651L의 정제수를 투입하고 구연산 2.6kg과 제이인산칼륨 5.0kg을 가하여 80℃ 30분간 교반용해 하여 pH를 5.0으로 조정한 후 효소액 4.5L(60,000 Unit)를 가하여 60℃에서 4시간 분해한 후 121℃ 1시간 가압하여 효소를 실활시키면서 점도를 저하시킨다. 효소분해액을 여과하여 규조토여과기로 1㎛이상 물질을 제거하고 고압균질기(Niro, 일본)로 1,000 bar로 균질화 하여 점도를 10cps 이하로 저하시켰다. 상기의 공정으로 저점도효소분해액을 637L를 획득하였고, 액중의 고형분 함량은 5.6%, 획득수율은 88.9%였다.

(실시예 2)

미역포자엽 다당류액의 제조

미역포자엽 중에 약 10%-13% 의 단백질이 존재하고, 이러한 단백질은 알긴산과 함께 황산다당과 결합되어 있거나 최종 제품상의 푸코이단 순도를 저하시키는 요인이 되므로 적절히 제거하여야 한다. 저점도효소분해액의 최종 pH는 5.5이다. 이는 프로테아제 NP(태평양화학)의 적정 pH 범위이므로 별도의 pH 조정없이 단백질분해효소로써 액 중의 단백질을 분해하여 유리시킨다. 프로테아제NP를 액량 637L에 대하여 1kg를 첨가하여 55℃ 3시간 분해하여 90℃로 가온하여 실활하고 미역포자엽단백질의 등전점인 pH 4.0으로 조정하여 단백질을 침전시켰다.

상기 액 중의 알긴산을 제거하기 위하여 액량의 2%가 될때까지 염화칼슘을 투입하여 30분 교반하여 알긴산을 칼슘염형태로 침전시킨다.

상기 단백질과 알긴산 침전을 disk separater(Westfilia, 독일)로 5000 x g 조건에서 연속 원심분리하여 분리하여 내고 다당류액 598L를 획득하였다. 최초 투입액량 대비 83.5%의 수율을 나타내었다.

(실시예 3)

푸코이단의 분리

상기 다당분해액에서 황산화푸코스다당을 획득하기 위하여 다당류액을 산용액에 의한 다당의 분해를 통하여 황산화 L-fucose를 주로하는 헥사폴리사카라이드(hexapolysaccharide) 단위체 생성을 유도하였다. 598L의 다당류액에 최종농도가 0.2N이 되도록 HCl을 투입한다. 즉 598L에 약 10L의 HCl을 투입하여 70℃ 4시간 교반 추출한다. 안정성의 문제로 가온하지 않을 경우는 실온에서 18시간 교반하기도 한다. 상기 다당류분해액에 대하여 NaOH로 중화하고, 원심분리를 통화여 염화물과 불용성 물질을 제거한 액에 CPC(Cetylpiridium Cloride)를 1%가 되도록 가하여 황산화다당을 불용성화 하여 침전시킨다. 이 침전에 최종농도 3M이 되도록 NaCl을 가하여 40℃에서 1시간 교반하여 수용성화 시킨다. 여기에 최종농도가 75%가 되도록 알콜을 가하여 다당을 침전시키어 원심분리에 의해 침전을 회수한다. 상기 액을 원심분리하여 침전물을 회수하고, 침전물의 10배량의 식염수를 가하여 다시 수용화시킨다음 한외여과기로 투석하여 염분을 제거하여 조 푸코이단 액을 획득한다.

(실시예 4)

푸코이단의 정제

분리된 조 푸코이단을 정제하기 위하여 0.01N HCl와 NaOH로 재생한 DIAION SA10AP(강염기성 음이온교환수지, 삼양사)를 이온수지탑(직경 20cm x 높이 150cm)에 충진하여 상기 분리된 푸코이단액을 용리시켜 흡착한 후 2.0M 식염수로 재 용리하여 탈착 수집하였다. 상기 수집액에 2배량의 정제수를 가하여 분자량 cut-off 3,000 da 한외여과기를 사용하여 5회 탈염 및 농축하고, 상기 농축액을 25mM Tris-HCL(pH 7.0)과 1:1(v/v)로 Toyopearl HW-65s을 충진한 Moduline Purification System(직경 14cm x 160cm)으로 여과 분취하여 fucose를 표준품으로하여 페놀황산법으로 전 당함량을 측정한 피크의 유형에 따라 합하고 이를 동결건조하여 정제하였다. 도3의 공정에 의하여 도4의 MKF-1(평균분자량 600,000), MKF-2(평균분자량 250,000), MKF-3(평균분자량 40,000)을 획득하였다.

각 분획물의 푸코이단 순도를 측정하기 위하여 하기 실험을 행하였다.

실시예 3에서 획득한 조푸코이단의 일반성분 및 전당함량, 구성당함량을 조사하였고, 각 분획물의 전당함량, 황산기함량, 구성당조성 분석을 행하였다.

조 푸코이단의 일반성분

시료	수분	단백질	지방	탄수화물	회분
조 푸코이단	8.0	3	1.3	72.1	15.6

조 푸코이단의 일반성분 조성으로 미루어 볼때 미역 포자엽에 존재하는 11%-12%의 단백질이 상당히 제거되었으며, 탄수화물의 함량이 높은 것으로 나타났다. 이는 푸코스를 주로 하는 다당의 함유량이 높을 것으로 추정되었다.

조 푸코이단, 푸코이단 분획물의 우론산, 황산기, 구성당조성

시료	우론산 (%)	황산기 (%)	구성당 조성(%)
시료	우론산 (%)	황산기 (%)	fuc	gal	glu	xyl	rib
MKF-1	6.4	37.8	54.4	12.5	1.8	3.5	1.87
MKF-2	2.5	32.1	62.1	10.4	0.98	8.7	0.52
MKF-3	1.1	42.1	70.6	8.5	1.02	5.3	0.84
조푸코이단	3.65	35.2	17.28	10.93	1.33	4.65	1.66

조푸코이단과 정제 푸코이단 분획물의 구성당과 황산기 함량의 분석 결과 조푸코이단의 우론산 함량에 비하여 정제과정을 거치므로 인해 알긴산의 기본구조체인 우론산의 함량이 분획물의 분자량이 감소하는 것과 같이 감소하였으며, MKF-3 푸코이단 분획물이 푸코스를 구성당 중 70.6%로서 주로 보유하며, 황산기 함량이 42.1%로 가장 높은 결과를 나타내었다.

(실시예 5)

항혈액응고 활성 측정법

MKF-1, MKF-2, MKF-3 의 푸코이단 분획물의 항혈액응고성을 측정하여 활성이 가장 높은 분획물을 선택하고, 항혈액응고성 활성을 지닌 푸코이단 정제법을 설립하고자 하기와 같은 실험을 행하였다.

Acivate partial thromboplastin time(APTT)

정상의 citrate-anticoagulated human plasma 90㎕에 각 분획물 10㎕를 가하여 37℃ 1분간 정치한 후 100㎕의 kolin/bovine brain phospholipid 시약을 가하여 37℃ 2시간 배양한다. 0.25M 염화칼슘을 여기에 가하여 혼합한 후 혈액응고 시간을 혈액응고자동분석기(Sysmex Ca-540)을 사용하여 측정하였다. 활성은 헤파린(193 I.U./mg) 표준품을 사용하여 측정한 검량선을 기초로 I.U./mg으로 나타내었다.

APTT는 내인성 혈액응고 경로에서 기인하는 혈액응고 시험법이며 혈액응고 작용에 있어서 각기 다른 기작을 지니는 시료간의 비교에 적절하다.

Thrombin time(TT)

정상의 citrate-anticoagulated human plasma 90㎕에 각 분획물 10㎕를 가하여 37℃ 1분간 정치한 후 100㎕의 thrombin 시약을 혼합하고 혈액응고 시간을 혈액응고자동분석기로 측정하였다. TT는 공통혈액응고 경로를 시험하는 일반적인 방법이며 각기 다른 기작에 의한 혈액응고 비교에 적절하다.

Prothrombin time(PT)

정상의 citrate-anticoagulated human plasma 90㎕에 각 분획물 10㎕를 가하여 37℃ 1분간 정치한 후 Prothromboplastin C+를 혼합하여 혈액응고자동분석기를 이용하여 측정하였다. PT는 외인성 혈액응고경로를 확인하는 시험법이며, 각 분획물 시료의 서로 다른 혈액응고반응 비교에 적절하다.

결과

분획물	농도(㎍/ml)	APTT	TT	PT
MKF-1	20 50 100	90 284 420	58 168 320	20 25 20
MKF-2	20 50 100	95 320 480	48 140 172	36 48 45
MKF-3	20 50 100	410 550 710	170 325 512	50 52 51

각 분획물의 내인성, 외인성, 및 공통경로별 활성을 측정해본 결과 항혈액응고활성은 상기표와 같이 나타났다. MKF-1, MKF-2, MKF-3 모두 APTT와 TT는 농도 의존적으로 상승하는 반면 PT는 유의적 효과가 미비 하였다. MKF-3의 활성이 전반적으로 가장 높았으며 APTT,TT,PT 대조구의 응고시간은 각각 30, 17, 12초 로서 대조구와 비교해 볼때 MKF-3는 높은 활성을 나타내었다. 상기의 결과로 미루어 볼때 황산기함량이 42.1%로 가장 높으며 fucose를 주 구성당으로 하고 전당함량이 78%인 MKF-3는 헤파린설페이트와 같이 다당류성 항응고 물질인 것으로 나타났다.

혈액응고 활성 경로 해석에서 Heparin류는 내인성경로에 관여하여 APTT를 주로 측정하고, Coumarin류는 외인성 경로에 관여하는 것으로서 관련약물과 응고인자결핍 등을 PT로 측정하고 있다. MKF-3는 APTT, TT는 농도에 따라 증가하나 PT는 증가하지 않으므로 내인성경로와 공통경로에 작용하는 다당이었다.

(실시예 6)

혈소판 응집 저해활성

분획물 시료의 혈소판 응집 저해활성을 알아보기 위해 각 분획물 들을 사용하여 혈소판 응집 저해활성을 측정하였다.

전혈 450㎕와 등장액(0.85% NaOH) 535㎕를 혼합한 혈액에 10mg/ml 농도의 각각의 시료들을 10㎕씩 넣은 다음 34℃에서 배양하고, 배양액에 콜라겐 5㎕를 넣어 혈소판을 응집시켜 유도된 전극간의 저항 값 변화를 측정하였고 대조군으로서는 등장액 10㎕를 사용하여 측정하였다.

대조군(등장액) 저항값을 기준하여 시료의 저항값 계산하기 위해 하기 수학식에 따라 백분율로 나타내었다.

수학식 1

혈소판응집저해활성(%)=(대조군저항값-시료 저항값)/대조군 저항값 × 100

결과

푸코이단 분획물	혈소판응집저해활성(%)
MKF-1	17.36
MKF-2	15.45
MKF-3	38.46

상기 표에서와 같이 MKF-3이 가장 높은 활성을 나타내었다.

혈액응고 fator 분석

혈액응고의 작용단계를 확인하고자 항혈액응고활성과 혈소판응집저해활성이 가장 뛰어난 MKF-3를 대상시료로 선정하여 100ug/ml 농도로 혈장에 용해한 후, Coagulation Analyzer를 이용하여 외인성 인자 즉, factor Ⅱ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ 등은 PT 측정으로 내인성 인자 즉, factor Ⅷ,Ⅸ, XI,XⅡ 등은 APTT법으로 측정하였다.

결과

Factor	Anticoagulant activity(%)	Standard range(%)
Factor Ⅰ(피브리노겐)	61.1	33-66
Factor Ⅱ(프로트롬빈)	115	60-140
Factor Ⅴ	64.6	60-140
Factor Ⅶ	151	60-140
Factor Ⅷ	18.2	60-140
Factor Ⅸ	8.71	60-140
Factor Ⅹ	131	60-140
Factor XI	7.5	60-140
Factor XⅡ	20.8	60-140
Lupus anticoagulant Ab	41.2	35-45

내인성 경로 응고인자 중 기여도가 큰 인자를 알아보기위해 Lupus anticoagulant(LA)의 Factor 분석을 이용하여 인지질의존성 응과 활성을 측정하여 본 결과를 상기 표에 나타내었다. MKF-3는 LA항체 활성에는 영향을 주고 않았으나 응고과정 중 factor Ⅷ,Ⅸ, XI,XⅡ의 활성 저해가 높은 것으로 볼때 내인성 경로를 주로 저해하는 것으로 나타났다.

Thrombin에 대한 저해양식 실험

분획시료 MKF-3의 Thrombin에 대한 저해 양식을 조사하기 위하여 순수 fibrinogen 1.0ml, 시료(25,50,100,500,1000㎍/ml)용액 0.1ml 혼합액을 37℃ 5분간 반응시킨 후 350nm에서 흡광도를 측정하여 Thrombin에 대한 저해양식을 측정하였다.

결과

농도(㎍/ml)	ABS (350 nm)
농도(㎍/ml)	MKF-3	Heparin
25	0.21	0.18
50	0.18	0.17
100	0.17	0.19
500	0.25	0.20
1,000	0.20	0.15

헤파린설페이트는 ATⅢ(antithrombin Ⅲ)와 결합하여 factor Xa 및 Thrombin활성을 저해하는 항응고제로서 ATⅢ가 없는 상태에서는 Thrombin 에 대한 응고활성을 나타내지 못한다.

fibrin을 기질로 하여 Trombin에 대한 저해양식을 검토한 결과 농도와 흡광도의 상관관계가 뚜렷이 보이지 않으므로서 Heparin과 유사하게 ATⅢ가 없는 상태에서는 Thrombin에 작용하지 않음을 알 수 있었다. MKF-3 푸코이단 분획물은 항혈액응고 활성의 Factor 분석과 Thrombin 저해 활성을 미루어볼때 ATⅢ의 활성을 증대시켜 응고인자 중 serine Proteinase활성을 저해하므로써 응고활성을 나타내는 것임을 알 수 있었다.

(실시예 7)

미역포자엽의 항혈액응고활성을 갖는 MKF-3 푸코이단 분획물이 생체내에서 항응고활성을 나타내는지 알아보고자 동물실험을 행하였다.

생체내 항혈액응고효과

ICR계 마우스(5주령, 1주일 적응)를 2시간 절식시키고 생리식염수에 MKF-3을 농도별(0,10,40,70,100mg/kg)로 용해시켜 8마리를 1군으로하여 꼬리정맥에 주사하고 15분 후, 마우스로부터 심장채혈법으로 혈액 1.0ml을 취하여 3.8% sodium citrate 용액 0.1ml에 혼합한 다음 3,000rpm 으로 10분 동안 원심분리하여 얻은 혈장의 항응고활성을 APTT와 TT법으로 응고시간을 측정하였다.

결과

MKF-3의 생체내 항응고 효과를 측정한 결과는 도 5에 나타내었다. 무투여군의 대조군 쥐의 혈액응고 시간은 APTT 30초, TT 12초 인 반면 MKF-3을 투여한 군 중에서 APTT는 40mg/kg 이상의 농도에서 급격히 응고시간이 지연되었으며, 반면 TT의 영향은 미비하였다. 임상에서 혈액응고 이상 환자의 혈액응고 시간이 정상인의 응고시간의 30%임을 고려하여 볼 때 미역포자엽의 MKF-3 푸코이단은 40mg/kg정도에서도 항혈액응고 효과가 있음을 나타내었다.

생체내 잔존 항응고 활성을 APTT와 TT로 측정한 결과, 도6과 같이 MKF-3은 쥐 생체내에서 시료투여 2시간 후 항혈액응고 활성이 최고로 증가하여 6시간 이후로 낮게 유지됨으로써 MKF-3는 생체내 체류시간이 8시간 이내로 쉽게 배설되는 물질인 것으로 나타났다.

경구투여에 의한 독성실험

ICR계 마우스(수컷, 5주령 1주간 적응) 24마리를 각 군당 6마리씩 4군으로 구분하여 생리 식염수에 용해시킨 MKF-3을 100mg/kg, 300mg/kg, 500mg/kg, 1,000mg/kg씩 1일1회 경구투여로 투여한 후 1, 3, 6, 12, 15일째 각 군의 체중변화를 측정하고 마지막 15일째의 생존한 마리수를 백분율로 표시하였다.

결과

실험군	마리 수	초기 중량(g)	최종 중량(g)	생존마리 수	생존율(%)
100mg/kg	6	29.7±1.3	35.1±1.2	6	100
300mg/kg	6	28.8±0.5	36.2±0.2	6	100
500mg/kg	6	29.4±1.1	34.8±1.5	6	100
1,000mg/kg	6	19.1±0.4	34.2±0.8	6	100

MKF-3 푸코이단 분획을 1일 1회 15일 동안 경구투여하면서 중량과 생존률을 측정한 결과 표_와 같이 모든 군에서 체중이 증가하였고, 생존율도 100%로 나타났다. 체중의 증가는 무투여군이 36±0.2인 것으로 미루어 보아 체중증가는 일 수에따라 자연적으로 증가한 것으로 보이며, 육안상의 관찰로도 무투여군 과 같이 이상증상이 보이지 않으므로써 MKF-3 푸코이단의 높은 안전성을 보였다.

미역포자엽 효소분해물로 부터 황산화푸코스다당 획분을 MKF-1,MKF-2, MKF-3 의 3분획을 획득하였으며, 그 중 MKF-3은 내인성 혈액응고 경로에 APTT, TT 항혈액응고 활성이 농도에 의존적으로 높은 것으로 나타났다.

본 발명은 미역포자엽 효소분해물로 부터 획득한 MKF-3 황산화푸코스다당은 혈액응고체계에서 내인성 경로에 관여하는 factor Ⅷ,Ⅸ, XI,XⅡ의 활성저해가 높으며 외인성 경로에는 관여하지 않고, ATⅢ의 활성을 증대시켜 응고인자 중 Serine Proteinase 활성을 저해하므로써 항혈액응고 활성을 지니는 것으로 나타났으며, 전당 함량 78%, 황산기 함량이 42.1%, 푸코스 함량(구성당 비율)70.6%인 황산화 푸코스 다당이었다. 또한 MKF-3의 평균분자량은 40,000 으로서 그 수율은 미역포자엽 건조중량에 대해여 8.3%였다. 마우스 생체에 대한 항혈액응고능은 40mg/kg 투여부 터 APTT 활성이 급격히 증가하였고, 8시간 이후 배설되며, 1000mg/kg 투여시에도 부작용이나 생존율에는 영향을 미치지 않는 것으로 보아 안전성이 높은 내인성 혈액응고 경로에 효과적인 혈액응고활성을 미치는 항혈액응고성 물질로 밝혀졌다.

따라서 본 발명의 획득물인 MKF-3는 헤파린설페이트의 대체약물 또는 항응고활성을 지니는 식품소재로서 활용이 기대되는 바이다.

Claims

(a) 미역포자엽을 다당분해효소로 분해하는 단계; (b) 상기 분해물을 가압추출 후 여과하여 저점도효소분해액을 제조하는 단계; (c) 저점도효소분해액에서 단백질 및 알긴산을 제거하여 다당분해액을 제조하는 단계; (d) 다당분해액 중의 다당류를 산성용액에 의해 분해하고 탈염하여 조 푸코이단액을 제조하는 단계; (e) 조 푸코이단액을 이온교환크로마토그래피을 통해 푸코이단을 수집하는 단계; (f) 상기 수집물을 분자량에 따라 분획하는 단계를 포함하는 푸코이단 분획물의 제조방법.
제1항의 제조방법에 의해 제조된 푸코이단 분획물.
제1항의 제조방법에 의해 제조된 푸코이단 분획물을 포함하는 항혈액응고활성을 지닌 식품 조성물