KR100699302B1 - 석류 씨 오일을 함유하는 화장료의 제조방법

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KR100699302B1

Publication number: KR100699302B1
Application number: KR1020050038295A
Authority: KR
Inventors: 황명오
Original assignee: 주식회사한일양행
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2005-05-09
Publication date: 2007-03-26
Also published as: KR20060116279A

본 발명은 종래의 합성 항산화제에 필적하는 우수한 항산화성을 나타내는 천연 항산화제 성분으로서 석류 씨(Pomegranate seed : 石榴子) 추출 오일을 함유하는 미백 및 노화방지 기능성 화장료의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면, 석류 씨를 볶은 다음, 고온에서 압착, 착유하고, 압착 추출 오일을 탈검, 탈산, 탈색, 탈취한 후, 통상의 화장료 전 중량에 대하여 0.0001~20중량%를 혼합하는 단계로 구성되는 석류 씨 추출 오일을 함유하는 화장료의 제조방법이 제공되며, 천연 과실인 석류의 종자로부터 유래하므로 피부 자극성이 거의 없고, 안정성이 우수하며, 항산화 효과가 기존의 합성 항산화제에 비해 손색이 없으므로 유중유 또는 수중유 화장료로 적용하면 우수한 미백 효과 또는 흑색화 방지 효과와, 우수한 노화 방지 및 보습 효과를 갖는 매우 안전한 기능성 화장료를 얻을 수가 있다.

석류 씨, 오일, 화장료, 항산화

석류 씨 오일을 함유하는 화장료의 제조방법{Preparing method for cosmetics containing oil derived from Pomegranate seeds}

도 1은 석류 씨 추출 오일 500ppm을 포함하는 리놀레인산 기질의 과산화물가 변화를 나타내는 그래프도이다.

도 2는 석류 씨 추출 오일을 포함하는 O/W(Oil in Water) 현탁액 기질의 과산화물가 변화를 나타내는 그래프도이다.

도 3은 석류 씨 추출 오일의 아질산염 소거능(scavenging ability)을 나타내는 그래프도이다.

본 발명은 석류 씨(Pomegranate seed: 石榴子) 추출 오일을 함유하는 화장료의 제조방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 종래의 합성 항산화제에 필적하는 우수한 항산화성을 갖는 천연 항산화제 성분으로서 석류 씨로부터 추출한 높은 안전성을 갖는 천연 오일을 함유하는 미백 및 노화방지 기능성 화장료의 제조방법에 관한 것이다.

생체 내에서 빛과 각종 약물 등에 의해 과잉 생성된 유해한 자유 라디칼 및 다양한 활성 산소는 지질, 단백질 ,핵산 등과 같은 생체 물질을 변성시킴으로써 노화 및 발암의 주요한 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 미백, 노화방지, 또는 피부 흑색화 완화용 기능성 화장료는 피부에 도포하였을 때 멜라닌 생성 경로를 차단하기 위한 목적과 함께, 화장품 유연제 원료로 사용되는 유지, 오일 등이 공기나 물중에 용해된 용존 산소 및 자외선 등으로부터 유발되는 활성 라디칼에 의해 산화되고 분해 되는 것을 방지 내지 지연시킬 목적으로 항산화제를 포함시키고 있다.

이러한 항산화제의 대표적인 예로서는 합성 항산화제로서의 디부틸 하이드록시 톨루엔(BHT)과 천연 항산화제로서의 토코페롤을 들 수 있다. 그러나 BHT는 항산화 효과는 우수하지만 독성이 있어 피부 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 통상적으로 α-토코페롤을 지칭하는 토코페롤은 항산화 효과가 우수한 천연 항산화제이기는 하나 상업적으로는 합성 토코페롤을 사용하고 있으므로 그 부산물에 의한 피부 부작용 우려가 있음과 아울러, 근자의 많은 연구 결과는 α-토코페롤이 인체 내에서 충분한 항산화 효과를 발휘하기 위해서는 산화된 α-토코페롤을 재활용(recycling) 시키는 비타민 C와 같은 다른 항산화제가 필요한 것으로 보고하고 있고, α-토코페롤의 단독 사용은 이 보다 더욱 강력한 항산화 효과를 나타내며 독성이 강한 퍼옥시 니트라이트(peroxynitrite) 유리기 중화능을 갖는 α-토코페롤의 생체 내 감소를 초래하는 것으로 보고하고 있으며, 더욱이 상대적으로 고가라는 문제점이 있다.

화장료에 있어서의 미백 내지 흑색화 방지 작용은 멜라닌 색소 침착으로 인한 기미나 주근깨의 생성을 억제하는 작용을 지칭하며, 상기한 멜라닌 색소는 티로신(Tyrosine) 또는 도우파(Dopa)로부터 티로시나제(Tyrosinase)에 의해 도우파크롬(Dopachrome)으로 되고 자동 산화 반응을 거처 멜라닌 고분자로 변환 생성되는 것으로 알려져 있다.

따라서 상기한 멜라닌 생성 경로를 차단하는 천연 물질을 함유하는 화장료를 개발하기 위한 시도가 최근 활발히 이루어지고 있다.

종래 이러한 노력의 일환으로서, 오갈피나무의 수피를 메탄올과 물의 혼합액으로 추출하고 유기용매로 세척하여 천연 항산화제를 얻는 방법(한국특허공개 제1999-0048807)과, 녹차 잎을 탄산칼슘이 첨가된 물로 추출하고 흡착 수지에 흡착시킨 후 유기용매로 용리하고 에틸아세테이트로 전용시킨 다음, 이를 농축하고 건고(乾固)시켜 캬테킨 분말로서의 천연 항산화제를 분리하는 방법(한국특허공고 제93 -5694호) 등이 제안되어 있다.

그러나 상기한 방법은 모두 사용 재료가 벌크량(bulk amount)이고 그 처리가 용이하지 않은 셀룰로오스 조직의 수피 또는 잎을 이용하고 있으므로 추출에 필요한 시약의 소모량이 막대하고, 추출에 장시간이 소요된다는 단점이 있어 공업적 적용이 곤란하다는 문제점이 있었다.

또한, 울금, 산사자, 약쑥, 당귀, 두총, 구기자, 산초인 등을 에탄올로 추출하고 농축하여 항산화성 물질을 얻는 방법(한국특허공개 제96-3620호)이 제안되어 있으며, 이 방법은 비교적 간단한 추출 방법으로 효과가 좋은 천연 항산화제를 얻을 수는 있으나, 사용 재료가 비교적 고가인 생약제이고, 추출에 장시간이 소요 된다는 단점이 있어 상기와 마찬가지로 공업적 생산에는 부적합하다는 문제점이 있다.

근자에는 소나무과 식물의 수피 또는 잎에서 물과 유기용매를 사용 하여 추출한 추출물에 물과 지용성 용매를 가하고 분배시켜 수용액 층을 얻은 다음, 이를 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 이용하여 분리한 후 재결정시킨 항산화제로서의 퓨라논 물질을 얻는 방법(한국특허공개 제95-29281호)이 제안되어 있다. 그러나 이 방법은 목적 물질의 분리에 고가의 정밀 기기인 HPLC를 이용하므로 많은 시간과 비용이 소모되고 수율이 현저히 낮아서 경제성이 매우 열등한 문제점이 있다.

이 밖에도, 다양한 외래 식물 소재로부터 천연 항산화제를 분리하는 방법(미국특허 제5,427,806호, 제5,209,870호, 제5,102,659호, 제5,026,550호, 제4,923,679호)이 제안되어 있으나, 이들 방법들은 원료 수급에 문제가 있으며 분리 방법도 순수한 물질의 분리에 치중하고 있어 분리 과정이 복잡하고 분리에 많은 비용과 시간이 소모된다는 문제점이 있다.

이와 같이, 효과적인 천연 항산화제를 얻기 위한 종래의 방법들은 물이나 유기 용매를 이용하여 항산화성 성분들을 추출하고 농축한 후, 이를 칼럼 크로마토그래피나 HPLC 등을 이용하여 항산화 효과가 우수한 성분을 분리 정제하는 것으로 요약될 수 있다. 그러나 상기한 종래의 방법들은 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 껍질 등과 같은 부피가 큰 원재료를 물 또는 유기용매로 추출하기 때문에 추출에 소모되는 시약의 소비량이 막대하고, 추출 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라, 순수한 물질을 얻 으려는 분리 방법을 채택함으로 분리 비용이 높아져 천연 항산화성 성분을 대량 생산하기 위한 공업화에는 어려움이 있다.

한편 본 발명과 관련된 석류(Punica granatum Linne)는 석류과(Punicaceae)에 속하는 낙엽활엽 교목으로 석류씨는 석류자(石榴子, Granati Semen), 석류가지, 줄기 및 뿌리는 석류피(石榴皮, Granati Cortex), 석류과실의 껍질은 석류피(石榴皮, Granati Pericarpium)라고 하며, 페르시아 등의 서아시아와 인도 서북부, 지중해 등이 원산지이나 우리나라에서도 남부지방에 자생하고 있다.

최근 들어 석류 씨 중의 퓨니킨산(punicic acid), 에스트로겐(estrogen), 에스트라디올(estradiol), β-시스토스테롤(β-sistosterol)의 생리활성 및 섭취 효과가 보고 되면서 석류 씨에 대한 많은 연구들이 발표되고 있다. 석류나 콩과류에서 발견되는 피토에스트로겐(phytoestrogen)의 주성분은 이소플라본(isoflavones)과 리그난(lignans) 등의 페놀성 화합물이며, 이들 페놀성 화합물은 천연의 성호르몬과 공통성을 갖는 구조를 가지고 있어 암, 심장혈관질환, 골다공증 등의 만성질환에 대해서 예방효과가 있는 것으로 보고 되어있다(Junko, MO, Yoko, OH, Hideyuki, YH and Hiroyuki, Y, 'Pomegranate extract improves a depressive state and bone properties in menopausal syndrome model ovariectomized mice', Journal of Ethnopharmacology, 92(1): 93-101, 2004; Aviram, M and Dornfeld, L, 'Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure', Atherosclerosis, 158(1): 195-198, 2001; Poyrazoglu, E, Gokmen, V and Artik, N, 'Organic acids and phenolic compounds in pomegranates (Punica granatum L.) grown in Turkey', Journal of Food Composition and Analysis, 15(5): 567-575, 2002; Goldfien, A. and Monroe, SE, 'In Basic & clinical endocrinology', 5th Ed.(Greenspan, F.S. and Strewler, G.J. eds) Appleton Lange Company, London, 474-477, 1997.)

식물계에 널리 분포되어 있는 이들 페놀성 물질은 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며, 또한 페놀성 히드록실(phenolic hydroxyl)기를 가지고 있기 때문에 항산화효과 등의 다양한 생리활성 기능을 갖고 있는 것으로 보고 되어있다(Husain, SR, Cillard, J and Cullard, P, 'Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids', Phytochem., 26:2489-2491, 1987; Takahara, U, 'Inhibition of lipoxygenase -dependent lipid peroxidation by quercetin', Phytochemistry, 24: 1443-1446, 1985).

또한 석류 씨 기름 중에 다량 함유되어 있어 있는 퓨니킨산과 같은 공액 지방산(conjugated fatty acid)은 항암작용물질로 알려져 있음과 아울러, 면역증진, 항산화작용, 체지방 감소 등에도 효과적임이 보고 되면서 공액 지방산을 다량 함유한 새로운 기능성 용도에 대한 연구가 진행되고 있다(Longtin, R, 'The pomegranate: nature's power fruit', J. Natl. Cancer Inst., 95: 346-348, 2003; Nugteren, DH and Christ-Hazelhof, E, 'Naturally occurring conjugated octadecatrienoic acids are strong inhibitors of prostaglandin biosynthesis', Prostaglandins, 33: 403-417, 1987; Suzuki, R, Noguchi, R, Ota, T, Abe, M, Miyashita, K and Kawada, T, 'Cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on mouse tumor and human monocycytic leukemia cells', Lipids, 36: 477-482, 2001; Schubert, SY, Lansky, EP and Neeman, I, 'Antioxidant and eicosanoid enzyme inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice flavonoids', J. Ethnopharmacol, 66: 11-17, 1999).

일반적으로 식물로부터 추출되는 천연 항산화물의 항산화효과는 그 추출방법 및 추출조건 등에 따라 유효물질의 함량 및 함유패턴이 현저히 다르므로 그 생리적 활성도 다르게 나타남이 일반적이다.

본 발명자들은 안전성이 높고 피부자극이 없으면서도 항산화 효과가 우수한 천연 항산화성 물질에 대해 연구하던 중, 석류 씨 추출 오일이 우수한 항산화 효과 및 미백 작용을 갖고 있다는 점을 규명하고 이를 효율적으로 분리할 수 있는 방법 및 이 방법을 이용하여 분리된 추출물이 함유된 노화 방지 및 미백 기능을 갖는 화장료의 제조방법을 개발하기에 이른 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 종래의 천연 항산화제에 필적하는 우수한 항산화성을 가지면서도 높은 안전성과 안정성을 가지며, 상대적으로 저가인 효과적인 항산화제로서 천연 혼합 오일 형태의 석류 씨(Granati Semen: 石榴子) 추출 오일을 함유하는 미백 및 노화방지, 그리고 흑색화 방지 기능을 갖는 화장료의 효과적인 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

삭제

상기한 본 발명의 목적을 원활히 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 일 양태(樣態)에 따르면, 석류 씨를 80~150℃에서 1~15분간 볶는 단계;160~240℃에서 압착하여 착유하는 단계; 압착 추출 오일을 탈검, 탈산, 탈색, 탈취하여 석류 씨 오일을 얻는 단계; 상기한 석류 씨 오일을 통상의 화장료 전 중량에 대하여 0.0001~20중량%, 바람직하게는 0.001~3중량%, 더욱 바람직하게는 0.01~1.0중량%를 혼합하는 것으로 구성되는 수중유(oil-in-water: O/W) 또는 유중유(oil-in-oil: O/O) 화장료의 제조방법이 제공된다.

삭제

이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 있어서의 석류 씨 오일은 항산화 특성과 세포 활성화 기능을 갖는 폴리페놀을 포함하고 있으므로 피부의 대사 과정 중에 생성되어 피부 건조와 노화의 주요한 원인이 되는 것으로 알려져 있는 유해한 자유 라디칼 및 활성 산소를 제거함으로써 피부를 보호하고 피부 세포 구성 성분인 리놀레인산의 피부 보호막 활성화를 촉진하여 보습력을 높이므로 미백 작용 내지 흑색화 방지 작용, 피부 탄력 증진에 따른 주름 제거 기능을 보유한다.

본 발명의 제조방법에 따른 화장료에 함유되는 석류 씨 오일은 수분 함량 3~7%로 건조된 석류 씨를 80~150℃에서 1~15분간 볶은 다음, 160~240℃에서 압착하여 착유하고, 압착 추출 오일을 통상적인 탈검, 탈산, 탈색 및, 탈취 처리하여 얻어지며, 필요시 빙점을 이용하여 다중포화지방산을 농축한다.

또한 본 발명에 있어서 석류 씨 추출 오일의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은, 제한적인 것은 아니나, 석류 씨 추출 오일 전 중량에 대하여 각각 3.7~4.3중량%및 1.5~2.1중량%이다. 특정하게는 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량이 석류 씨 추출 오일 전 중량에 대하여 각각 약 4.0중량% 및 약 1.8중량%이다.

그리고, 본 발명에 있어서 석류 씨 추출 오일의 지방산 조성은, 제한적인 것은 아니나, 팔미틴산(palmitic acid) 3.5~3.9중량%, 스테아린산(stearic acid) 2.2~2.6중량%, 올레인산(oleic acid) 7.6~8.0중량%, 리놀레인산(linoleic acid) 8.0~8.4중량%, 리놀레닌산(linolenic acid) 7.4~7.8중량%이며, 일반적인 종자 유에서는 검출되지 않는 공액(Conjugated) 옥타데카트리에노인산(octadecatrienoic aicds)의 피크(peak)가 검출되었고 그 함량은 62~68중량%, 특정하게는 약 65중량% 수준이며, 그 주성분은 퓨니킨산(Punicic acid)이다. 석류 씨 추출 오일의 지방산 조성 중 상기한 퓨니킨산의 함량은 정제 정도에 의존적이기는 하나 45~75중량%의 범위이다.

한편, 최 등은 석류 농축액의 지방산 조성을 분석한 결과, 미리스틴산(myristic acid) 약 13.1중량%, 팔미틴산 약 8.3중량%, 스테아린산 약 69.4중량%, 올레인산 약 6.8중량%라고 보고하고 있어서(최원균, 정교순, 조규성, 황명오, 유영숙; '이란산 흑석류 농축액과 그 제품 성분 및 함유된 피토에스트로겐류에 관한 연 구', 한국식품과학회지, 15; 119-125, 2002), 석류 과즙과 석류 씨의 지방산 조성은 크게 다른 것으로 판명되었다.

본 발명자들은 석류 씨 오일로부터 공액 옥타데카트리에노인산(conjugated octadecatrienoic acid)을 분리 동정한 결과, 이 중 퓨니킨산(punicic acid)(9, 11, 13번 위치에 이중결합을 함유)의 함량은 약 71중량%에 이르는 것을 확인하였다.

상기한 공액 옥타데카트리에노인산은 리놀레닌산의 탄소의 이중결합 위치가 다른 기하학적 이성질체로써 8번과 10번, 9번과 11번, 11번과 13번의 탄소원자에 이중결합을 형성하고 시스와 트랜스형의 이성질체를 포함하여 많은 이성질체가 존재하며 이들 중에는 퓨니킨산(9-cis, 11-trans, 13-cis), 알파-엘레오스테아린산(alpha-eleostearic acid)(9-cis, 11-trans, 13-tans), 카탈린산(catalic acid)(9-trans, 11-trans, 13-cis), 트리코사닌산(trycosanic acid)(9-cis, 11-cis, 13-trans)이 알려져 있다(Takagi, T, 'Stearic configurations of parinaric and punicic acid', J. Amer. Oil Chemist's Soc., 43: 249, 1966; Hopkins CY and Chrisholm MJ, 'Survey of the conjugated fatty acids of seed oils', J. Amer. Oil Chemist's Soc., 45 : 178, 1968). 한편, 공액 옥타데카트리에놀산은 항암작용, 항산화작용, 항동맥경화증, 면역증진에 효과가 있는 것으로 보고 되어 있다((Longtin, R, 'The pomegranate: nature's power fruit', J. Natl. Cancer Inst., 95: 346-348, 2003; Nugteren, DH and Christ-Hazelhof, E, 'Naturally occurring conjugated octadecatrienoic acids are strong inhibitors of prostaglandin biosynthesis', Prostaglandins, 33: 403-417, 1987; Suzuki, R, Noguchi, R, Ota, T, Abe, M, Miyashita, K and Kawada, T, 'Cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on mouse tumor and human monocycytic leukemia cells', Lipids, 36: 477-482, 2001).

본 발명에 있어서의 석류 씨 추출 오일에 대한 DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질)의 라디칼 소거능(전자 공여능)은 9.5~9.9%이고, 특정하게는 약 9.7%로서 총 페놀 함량 25중량%로 농축한 경우 약 60.6%의 활성을 나타낸다. 순도 99%이상인 BHT(dibutyl hydroxy toluene)의 DPPH 라디칼 소거능 활성이 36.9%, 합성 α-토코페롤의 DPPH 라디칼 소거능 활성이 93.2%인 것과 비교하면, 총 페놀 함량 25중량%의 천연 석류 씨 추출 오일의 경우가 BHT나 합성 α-토코페롤, 특히 BHT를 사용하는 것보다 안전할 것으로 판단된다.

또한 본 발명에 있어서의 석류 씨 추출 오일은 리놀레인산 기질에서 항산화효과를 발휘하며, 리놀레인산 기질에 200ppm을 첨가한 경우에는 비록 그 효과가 미약하나 그 농도 증가에 따라 항산화 효과도 증가하며, 500ppm 농도로 첨가하면 현저한 항산화효과를 나타낸다.

따라서 본 발명에 있어서의 석류 씨 추출 오일은 유중유(oil-in-oil) 화장료에 응용 가능하다.

본 발명에 있어서의 석류 씨 추출 오일은 수중유(oil-in-water: O/W) 에멀젼 시스템에서 크게 증가된 항산화효과를 나타내며, 수중유 에멀젼 기질 중에서의 500ppm의 석류 씨 추출 오일의 항산화효과는 상대적으로 합성 α-토코페롤 보다는 약간 낮지만 석류 씨 추출 오일이 과실로부터의 안전한 천연 복합물인 점을 감안한다면 석류 씨 추출 오일의 수중유 에멀젼 시스템에서의 항산화효과는 α-토코페롤에 필적하는 수준이다.

또한 본 발명에 있어서의 석류 씨 추출 오일은 아질산염 소거능을 가진다. 아질산염은 2급 및 3급 아민류와 반응하여 니트로사민(nitrosamine)을 형성하며 니트로사민은 체내에서 디아졸알칸(diazolalkane) (C_nH_2nN₂)으로 변화하여 핵산이나 단백질 또는 세포내의 성분을 알킬화함으로써 암을 유발함과 아울러, 아질산염 자신이 독성을 갖고 있기 때문에 일정한 농도 이상 계속 섭취 시 혈액 중의 헤모글로빈을 산화시켜 메트헤모글로빈증(methemoglobinemia)을 유발하는 것으로 알려져 있다(Kato, Hand Lee IE. Chyune NY. Kim SB. Hayase F. 'Inhibitory of nitrosamine formation by nondilyzable melanoidins', Agric. Biol. Chem. 51(1): 1333-1338, 1987; Gray, JI and Dugan, Jr LR. 'Inhibition of N-nitrosamine formation in model food systems', J. Food Sci., 40: 981-984, 1975). 그리고 니트로화 반응은 함유된 아스콜빈산(ascorbic acid), 페놀성 구아이아콜(Phenolic guaiacol), resorbicinol(레소르비시놀) 등의 페놀계 물질에 의해 억제될 수 있는 것으로 알려져 있다(Leaf, CD, Vecchio, AJ, Roe, DA and Hotchkiss, JH: 'Influence of ascobic acid dose on N-nitrosoproline formation in humans', Carcinogenesis, 8: 791-795, 1987).

본 발명에 있어서의 석류 씨 추출 오일의 아질산염 소거능은 100ppm 농도에서는 미약하지만, 500ppm 농도 이상에서는 크게 증가하는 경향을 나타내며 2,000ppm의 첨가 농도에서는 39~42% 정도, 특정하게는 약 39.6%의 강한 아질산염 소거능을 나타낸다. 한편 아스콜빈산 및 BHT의 아질산염 소거능은 2,000ppm 농도에서 각각 약 93.8% 및 약 72.2%이므로, 석류 씨 추출 오일의 아질산염 소거능은 아스콜빈산의 약 42.2%, 그리고 BHT의 약 54.8%이나, 그러나 석류오일 100ppm은 아스콜빌산의 500ppm과 동일한 활성을 보이고 있다. 이에 본 발명에 있어서의 석류 씨 추출 오일이 천연 복합물인 점을 감안한다면 상기한 아질산염 소거능 값은 매우 유의적이다.

일반적으로 전자공여능과 아질산염 소거능은 폴리페놀 함량에 비례하는 것으로 알려져 있으나(이기동, 장학길, 김현구: '버섯류의 항산화성 및 아질산염 소거작용', 한국식품과학회지, 29: 432-436, 1997), 석류 씨의 경우에 있어서는 추출 오일에서 폴리페놀함량이 낮지만 상대적으로 강한 소거능을 보이는 점이 특이하다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 비교예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다.

(실시예)

실시예 1: 석류 씨 오일의 추출

수분 함량 3.5%의 건조된 흑석류씨를 120℃에서 5분간 볶은 후, 가열압출 방 식의 착유기(NEW KJ 900, 이조기공)를 사용하여 200℃에서 압착하였다. 압착 추출된 기름에 수산화나트륨을 첨가하여 유리자방산을 제거하고, 유기산으로 검질을 제거하여 증류수로 수세한 후 카본을 사용하여 탈색시키고 나서 100℃의 진공상태에서 불활성가스로 이취성분을 제거하였다.

실험예 1: 석류 씨 추출 오일의 총 페놀 및 총 플라보노이드 정량

석류 씨 추출 오일의 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.

총 페놀 함량은 폴린-데니스(Folin-Denis)법(AOAC. 1984. Official Methods of Analysis. 14th ed. Method 9.110., Association of Official Analytical Communities, Arlington, VA. USA)에 의하여 분석하였다. 즉, 폴린-데니스 시약은 텅스텐 나트륨 10g, 포스포몰리브덴산 2g, 인산 5mL를 메스플라스크에 넣고 증류수로 정용한 후 삼각플라스크에 옮겨 2시간 동안 환류 조작하여 사용하였다. 실험방법으로는 캡 튜브에 증류수를 7mL씩 넣고 DMSO(dimethysulfoxide)에 용해시킨 시료를 1mL씩 넣은 후 폴린-데니스 시약을 0.5mL 첨가한 후, 정확히 3분 후에 무수 탄산나트륨 포화용액 1mL, 증류수 0.5mL를 넣은 다음, 725nm에서의 흡광도를 측정하고 표준용액과 비교하여 총 페놀 함량을 구하였다. 표준용액으로는 탄닌산(Sigma co., St. Louis, USA)을 사용하였다.

총 플라보노이드 함량(Teresa-Satue, M, Huang, SW and Frankel, EN: Effect of natural antioxidants in virgin olive oil on oxidative stability of refined, bleached and deodorized oilve oil. J. Am. Oil Chem. Soc., 72(4): 1131-1137, 1995)은 석류 씨 추출 오일을 일정량 취한 다음, 50% 메탄올 용액 5mL로 정용한 시료 용액 1mL과 디에틸렌 글리콜 10 mL을 혼합하고 여기에 1N-NaOH 용액 1mL을 가하고 잘 혼합한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준검량곡선은 나린진(Sigma co., St. Louis, USA)을 이용하여 작성하였다.

그 결과를 하기의 표 1에 나타낸다.

[표 1]

석류 씨 추출 오일의 총 페놀 및 플라보노이드 함량

	총 페놀 함량(중량%)	총 플라보노이드 함량(중량%)
석류 씨 추출 오일	4.0	1.8

실험예 2: 석류 씨 추출 오일의 지방산 조성

석류 씨 추출 오일의 지방산 조성을 분석하기 위한 전처리는 AOAC법(AOAC. 1995. Official Methods of Analysis. 16th ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington DC. USA.)에 따라 행하였다. 즉, 석류 씨 추출 오일 시료를 250mL 삼각플라스크에 0.15~0.2g 정도 취한 다음, 0.5N NaOH/메탄올 4mL을 가한 후, 환류, 냉각하면서 10분간 가열하였다. 이어서, 14% BF₃/메탄올 5mL을 가하고 2분간 반응시킨 다음, 헥산 5mL를 가하고 1분간 가열하였다. 반응 후 삼 각플라스크를 분리 냉각시키고, 이를 시험관에 옮겨 포화 식염수를 가하고 헥산층을 분취하여 가스크로마토그래피에 주입하여 분석하였다.

사용한 칼럼은 SUPELCOWAX^TM-10(0.32mm i.d.(내경)×60m×0.25㎛ 필름 두께, USA), 검출기는 불꽃이온화검출기(FID), 온도는 주입기 240℃, 검출기 250℃, 오븐 180℃/1min-3℃/min-240℃/15min, 운반기체는 헬륨, 주입량은 1㎕이었다.

석류 씨 추출 오일의 지방산 조성은 팔미틴산 3.7중량%, 스테아린산 2.4중량%, 올레인산 7.8중량%, 리놀레인산 8.2중량%, 리놀레닌산 7.6중량%였으며, 공액트리엔산(Conjugated octadecatrienoic aicds)의 약 65중량% 수준이었다.

분석 결과를 대두 오일과 비교하여 하기의 표 2에 나타낸다.

[표 2]

석류 씨 추출 오일의 지방산 조성

지방산 성분	대두 오일	석류씨 오일
C_16:0	11.4	3.7
C_18:0	4.4	2.4
C_18:1	25.2	7.8
C_18:2	52.9	8.2
C_18:3	6.1	7.6
공액 C_18:3	-	65.0

실험예 3: 석류 씨 추출 오일의 전자공여능 측정

석류 씨 추출 오일의 전자공여능(Electron donating ability, HDA)을 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 환원성을 이용하여 516nm에서 자외선/가 시광선 분광광도계(UV/Visible spectrophotometer)로 측정하였다(Blois, MS : Antioxidant determmation by the use of a stable free radical. Nature 26 : 1199-1200, 1958).

즉, 석류 씨 추출 오일 0.15mL과 0.035% DPPH 용액(6.25×10^-5M) 3mL을 시험관에서 5초 동안 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 혼합한 후 30분 후의 대조구에 대한 흡광도의 감소비율로서 수소(전자)공여능을 측정하였다.

DPPH의 라디칼 소거능을 측정한 결과 석류 씨 추출 오일 자체의 소거능은 9.7%였으며, 총 페놀 함량 25중량%인 경우를 기준으로 계산하면 약 60.6%의 활성을 나타내는 것으로서, BHT의 36.9% 및 합성 α-토코페롤의 93.2%를 나타낼 때의 소거능과 비교한다면 총페놀 함량 25%로 농축된 천연 석류 씨 추출 오일의 경우가 보다 안전할 것으로 판단된다.

그 결과를 하기의 표 3에 나타낸다.

[표 3]

석류씨 추출물의 전자공여능

	전자 공여능(%)
석류 씨 추출 오일	9.7

실험예 4: 석류 씨 추출 오일의 리놀레인산 기질에서의 항산화효과

석류 씨 추출 오일을 리놀레인산(linoleic acid)(Sigma Co., USA)에 200ppm 및 500ppm의 농도로 각각 첨가하였다. 또한 기존 항산화제 중 합성 α-토코페롤 (Aldrich chemical Co., USA)도 위와 동일한 방법을 사용하여 비교, 조사하였다.

이와 같이 각각 상기한 농도로 석류 씨 추출 오일이 첨가된 리놀레인산을 100mL 비커에 50g씩 분취하여 40℃로 유지되는 항온기에 저장하면서 일정 저장 기간별로 과산화물가(A.O.A.C: Official methods of analysis. 15th ed., Association of official analytical chemists. Washington, D.C., Cd 8-35. 1990)를 측정하였다.

석류 씨 추출 오일을 리놀레인산 기질에 각각 200ppm 농도로 첨가한 후 과산화물가의 변화를 측정한 결과, 석류 씨 추출 오일을 첨가한 기질 및 대조구의 6일째 과산화물가는 각각 79.6meg/kg 오일 및 79.2meg/kg 오일로서, 200 ppm 농도의 석류 씨 추출 오일을 첨가로는 그 항산화효과가 인정되지 않았다. 그러나, 석류 씨 추출 오일을 500ppm의 농도로 첨가한 리놀레인산 기질의 저장 6일째 과산화물가는 75.4meg/kg 오일로 뚜렷한 항산화효과를 보였다.

석류 씨 추출 오일의 첨가농도를 200ppm에서 500ppm으로 증가시킴에 따라 항산화 효과도 증가하였으며, 500ppm의 석류 씨 추출 오일 첨가구는 200ppm의 합성 α-토코페롤 첨가구에 비교하면 높은 항산화효과를 갖는 것으로 나타났다. 대조구의 유도기간은 4.1일인 반면, 석류 씨 추출 오일 첨가구는 4.4일로 1.07배의 연장효과를 보였다.

그 실험 결과를 도 1로 첨부한다.

결과적으로 석류 씨 추출 오일은 리놀레인산 기질에서의 항산화효과를 발휘하는 것으로 판명되었으며, 이러한 결과로부터 석류 씨 추출 오일은 유중유(oil- in-oil) 화장료에 적용 가능한 것으로 판단되었다.

실험예 5: 석류 씨 추출 오일의 리놀레인산 수중유 에멀젼

기질에서의 항산화효과

리놀레인산 에멀젼으로서 리놀레인산 1.3mL를 99.5% 에탄올 100mL에 용해시킨 후 10mL씩 원추형 튜브(conical tube)에 넣고 석류 씨 추출 오일 및 합성 α-토코페롤을 각각 200 ppm 농도가 되도록 첨가하였다. 그리고 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)을 10mL 첨가한 뒤 증류수 4.5mL 넣고 40±1℃ 항온기에 저장하면서 하루 간격으로 항산화효과를 측정하였다.

항산화효과는 티오시아네이트법(thiocyanate method)19)를 사용하여 측정하였다. 즉 75% ethanol 4.7mL에 각 시료 0.1mL과 30% 암모늄 티오시아네이트 0.1mL를 넣고, 정확히 3분 후 20mM 염화 제이철(iron(Ⅱ)chloride)(3.5% HCl 중) 0.1mL를 넣고 500nm에서 자외선/가시광선 분광광도계로 흡광도를 측정하여 각 시료의 과산화물 함량의 지표로 삼았다.

수중유(oil-in-water: O/W) 에멀젼 시스템에서 석류 씨 추출 오일을 첨가한 기질의 항산화효과를 평가한 결과, 석류 씨 추출 오일을 첨가한 기질의 저장 10일째의 흡광도는 1.275로서, 대조구의 2.525 보다 낮은 흡광도를 보였다.

리놀레인산 기질에서 항산화효과가 상대적으로 낮았던 석류 씨 추출 오일 첨가구는 O/W 에멀젼 시스템에서는 항산화효과가 크게 증가됨을 보였다.

대조구의 유도기간은 3.7일인 반면 석류 씨 추출 오일을 첨가한 기질은 5.2일로서 대조구에 대해 1.33배의 연장효과를 보였다. 한편 합성 α-토코페롤을 첨가한 비교구의 유도기간은 6.9로서 대조구에 대해 1.86배의 연장효과를 보였다. 이러한 결과는 비록 O/W 에멜젼 기질에서의 항산화효과의 크기는 상대적으로 합성 α-토코페롤이 높지만, 석류 씨 추출 오일이 천연의 복합물인 것을 고려하면 석류 씨 추출 오일의 O/W 에멀전에서의 항산화효과는 매우 유의적이며 합성 α-토코페롤에 필적할 수 있는 것으로 평가되었다.

상기한 실험 결과를 도 2로 첨부한다.

실험예 6: 아질산염 소거능

아질산염 소거작용은 Gray와 Dugan의 방법(Gray, JI and Dugan, JLR : Inhibition of N-nitrosamine formation in model food system. J. Food Sci., 40(4) : 981-985, 1975)에 의하여 측정하였다.

즉 1mM NaNO₂ 용액 1mL에 일정농도의 시료 1mL를 가하고 0.1N HCl (pH 1.2)로 반응용액의 pH를 1.2로 조정한 다음 총량을 10mL로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 각 반응 액을 1mL씩 취하여 2% 초산용액 5mL과 Griess 시약(30% 아세트산으로 조제한 1% 설파닐린산(sulfanilic acid)과 1% 나프틸아민을 1:1 비율로 혼합한 것, 사용 직전에 조제) 0.4mL을 가하여 잘 혼합하였다. 이 혼합액을 실 온에서 15분간 방치한 후 520nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산량을 구하였다. 블랭크(blank)는 Griess시약 대신 증류수 0.4mL를 가하여 동일하게 행하였다. 아질산염 소거작용은 시료를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 백분율로써 나타내었다.

[식 1]

N(%) =	1 -	A - C	×100
		B

N : 아질산염 소거능(nitrite scavenging ability)

A : 1시간 동안 정치 후 1mM NaNO₂ 첨가 시료의 흡광도

B : 1mM NaNO₂의 흡광도

C : 대조구의 흡광도

석류 씨 추출 오일의 아질산염 소거능을 측정한 결과, 석류 씨 추출 오일은 100ppm 농도에서 가장 낮은 소거능을 보였으나 500ppm 농도 이상에서는 그 소거능이 크게 증가하는 경향을 보였다. 또한 2,000ppm의 첨가 농도에서 석류 씨 추출 오일의 아질산염 소거능은 39.6%로서 석류 씨 추출 오일은 강한 아질산염 소거능을 보였다.

한편 아질산염 소거 효과가 있는 것으로 알려져 있는 아스콜빈산 및 BHT의 아질산염 소거능은 각각 93.8% 및 72.2%로 나타났다. 이 결과에서 석류씨 기름은 아스콜빈산의 42.2%, BHT의 54.8%의 아질산염 소거능을 갖고 있는 것으로 판명되었 다.

그 실험 결과를 도 3으로 첨부한다.

실시예 2: 화장료의 제조 - 제조예 1~6 및 비교예 1~4

실시예 1에서 얻은 석류 씨 추출 오일을 이용하여 미백 크림을 제조하였으며, 하기의 표 4 및 표 5에 제조예 1~6 및 비교예 1~4를 기재하였다

[표 4]

성 분	제조예 1	제조예 2	제조예 3	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4
제 A 상
쎄탄올	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
밀납	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
롤리소르베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
방부제	적 량	적 량	적 량	적량	적량	적량	적량
석류 씨 추출 오일	0.01	0.05	0.10	-	-	-	-
BHT	-	-	-	0.05	0.05	-	0.05
합성 α-토코페롤	-	-	-	-	-	0.05	0.05
리놀레인산	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
벤조페논	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
옥시벤존	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
제 B 상
정제수	합 100	합 100	합 100	합 100		합 100	합 100
히아루론산 나트륨	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
프로필렌 글리콜	5.0	5.0	5.0	5	5	5	5

[표 5]

성 분	제조예 4	제조예 5	제조예 6
제 A 상
쎄탄올	2.5	2.5	2.5
밀납	3.5	3.5	3.5
자기유화형 모노스테아린산글리세린	3.0	3.0	3.0
롤리소르베이트 60	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.5	0.5	0.5
방부제	적 량	적 량	적 량
석류 씨 추출 오일	0.15	0.30	0.50
BHT	-	-	-
합성 α-토코페롤	-	-	-
리놀레인산	10.0	10.0	10.0
벤조페논	0.1	0.1	0.1
옥시벤존	0.1	0.1	0.1
스쿠알란	3.0	3.0	3.0
제 B 상
정제수	합 100	합 100	합 100
히아루론산 나트륨	0.1	0.1	0.1
프로필렌 글리콜	5.0	5.0	5.0

상기한 배합비를 갖는 미백 크림의 제조는, A상과 B상을 각각 별도의 용기에서 75℃로 균일하게 용해시킨 후, B상에 A상을 첨가하고 호모믹서로 5분간 3500rpm, 패들 믹서로 15분간 25rpm으로 교반하여 유화하였다. 얻어진 혼합물을 다시 40℃로 냉각시키고 패들 믹서로 25rpm으로 교반한 후, 25℃까지 냉각하여 미백 크림을 제조하였다.

실험예 7: 피부 자극 측정 - 피부 1차 자극성 테스트

상기한 표 4의 제조예 3 및 비교예 2,3,4에 따라 제조된 화장료의 피부 자극성을 알아보기 위하여, 건강한 성인 남녀 30명을 대상으로 팔 하박부에 각 시료의 일정량(약 2.0g)을 첩보 시험용 핀챔버에 묻혀 48시간 첩보한 후, 핀챔버를 제거하고 4시간 경과 후 육안으로 피부 상태 변화를 판독하였으며, 그 결과를 하기의 표 6에 나타낸다.

[표 6]

	피 시험자수	판 정 결 과				자극도
	피 시험자수	A	B	C	D
제조예 3	30	28	2	-	-	0.06
비교예 2	30	22	7	1	-	0.29
비교예 3	30	25	5	-	-	0.17
비교예 4	30	20	8	2	-	0.37

A : 홍반이나 특이한 현상 없음

B : 주위보다 약간 붉어짐

C : 주위보다 현저히 붉어짐

D : 주위보다 심하게 붉어지고 부풀음

[식 2]

( B수 X 1 ) + ( C수 X 2 ) + ( D수 X 3 )

자극도 = ---------------------------------------------

( B수 X 1 ) + ( C수 X 2 ) + ( D수 X 3 ) + A수

상기한 피부 1차 자극성 시험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 석류 씨 추출 오일을 두 배 이상 함유하는 제조예 3은, 합성 α-토코페롤 및/또는 합성 디부틸하이드록시톨루엔(BHT)과 같은 항산화제를 함유한 비교예 2,3,4 보다 훨씬 낮은 자극도를 나타내는 것으로 확인되었다.

실험예 8: 미백 효과 측정

상기한 제조예 2 내지 6에서 얻은 화장료의 미백 효과를 비교하기 위하여 다음과 같이 시험하였다.

20~30대 여성 10명을 대상으로 왼쪽팔 상박부를 3 부분으로 나누어 자외선을 0.90/cm², 1일 2회 조사후 시료를 1일 2회, 30 일간 도포후 색차계(기기명: 미놀타CR 200 Chromameter)를 이용하여 도포 전과 후의 L값의 평균을 구해 미백 효과를 측정하였으며, 그 결과를 하기의 표 7에 나타낸다.

[식 3]

미백 효과 L(%) = [(도포전의 L값-도포후의 L 값)÷도포전의 L값]×100

[표 7]

미백 효과 L(%)

상기한 표 7에 나타낸 바와 같이, 석류 씨 추출 오일 함유 화장료를 4주간 사용시 미백 효과가 양호하다는 것을 확인하였고, 특히 그 첨가량을 증가시킴에 따라 미백 상승효과가 있는 것으로 판명되었다. 상기의 실험예를 통해 밝혀진 바와 같이, 석류 씨 추출 오일을 함유한 화장료는 노화 메커니즘에서 피부 노화의 원인이 되는 자유 라디칼 및 활성 산소의 생성 억제력이 합성 α-토코페롤이나 합성 BHT에 비하여 손색이 전혀 없을 뿐만 아니라, 실사용 결과 우수한 미백 효과가 있 음이 확인되었다.

실시예 3: 화장료의 제조 - 제조예 7,8 및 비교예 5,6

하기의 표 8에 나타낸 통상적인 화장료 에멀젼 조성물에, 실시예 1에서 얻은 석류 씨 추출 오일을 배합하여 제조예 7,8의 에멀젼 화장료를 제조하였고, 비교예 5,6에서는 동일한 화장료 에멀젼 조성물에, 각각 BHT와 α-토코페롤을 배합하여 제조하였다.

표 8에 나타낸 B상을 80℃까지 가온 용해하고, 상기한 B상에 D상을 투입, 교반하였다. A상도 정제수와 함께 80℃까지 가온 용해시키고 완전히 용해된 후, 상기한 B상에 상기한 A상을 투입하여 호모믹서로 잘 교반하면서 유화한 후, C상을 상기한 B상에 투입하여 중화시켰다. 이어서 45℃까지 냉각시켜 에멀젼 화장료 조성물을 제조하였다.

[표 8]

	원료명	제조예7	제조예8	비교예5	비교예6
A	모노스테아린산폴리옥시에칠렌소르비탄	1.2	1.2	1.2	1.2
	방부제	적량	적량	적량	적량
	세탄올	0.4	0.4	0.4	0.4
	모노스테아린산소르비탄	0.3	0.3	0.3	0.3
	세토스테아릴알코올	0.8	0.8	0.8	0.8
	스테아린산	0.5	0.5	0.5	0.5
	리놀레인산	3.0	3.0	3.0	3.0
	세틸옥타노에이트	3.0	3.0	3.0	3.0
	디아이 씨 12-13 알킬마레이트	2.0	2.0	2.0	2.0
	스쿠알란	2.0	2.0	2.0	2.0
B	농글리세린	6.0	6.0	6.0	6.0
	1,3-부틸렌글리콜	8.0	8.0	8.0	8.0
	카르복실비닐폴리머	0.06	0.06	0.06	0.06
C	트리에탄올아민	0.23	0.23	0.23	0.23
D	석류 씨 추출 오일	0.04	0.08	-	-
	BHT	-	-	0.02	-
	α-토코페롤	-	-	-	0.02
	정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
	계	100	100	100	100

상기한 제조예 7,8과 비교예 5,6에 따라 제조된 에멀젼 화장료의 수분 보유능, 미백 효과, 피부자극성, 실사용성, 시료 경시안정성에 관한 실험을 실시하였다.

실험예 9 - 수분 보유능 측정

본 발명에 따른 에멀젼 화장료의 수분 보유능을 확인하기 위해 제조예 7,8의 에멀젼 화장료를 시료로 이용하여 피부에 적용하고 수분 보유능을 평가하였다.

20-40세 연령의 피시험자 성인 남녀 20명을 30분 이상 항온항습실에서 휴식을 취하게 한 후, 팔하박부 안쪽에 4x4㎠의 구획을 설정한 후 시료를 2㎍/㎠의 두께로 도포하고 시간의 경과에 따라 피부수분 함유량을 수분보유능 측정장치 (corneometer CM 820, Courage + Khazaka electronic Gmbh사, Germany)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.

[표 9]

시료	도포전 측정평균값	SDS 처리후	도포 후 측정평균값
시료	도포전 측정평균값	SDS 처리후	1시간후	1일후	2일후	4일후	6일후
실시예1	9.18	15.81	14.56	12.54	11.96	11.43	10.56
실시예2	9.24	15.89	14.41	12.43	11.68	11.20	10.01
무처리군	9.07	15.73	15.68	14.97	14.61	14.23	13.89

상기 수분 보유능 측정 결과 석류 씨 추출 오일을 함유한 제조예 7 및 8은 무처리군과 비교하여 우수한 수분 보유능을 갖는 것으로 확인되었다.

실험예 10: 미백 효과 측정

상기한 실험예 8과 동일한 절차 및 방법에 따라 제조예 7,8과 비교예 5,6의 에멀젼 화장료에 대한 미백 효과를 비교하였으며, 그 결과를 하기의 표 10에 나타낸다.

[표 10]

미백 효과 L(%)

	제조예 7	제조예 8	비교예 5	비교예 6
사용전	0	0	0	0
1 주후	16	37	29	35
2 주후	52	78	67	76
4 주후	73	87	76	82

상기한 표 10에 나타낸 바와 같이, 석류 씨 추출 오일 함유 에멀젼 화장료를 4주간 사용시 미백 효과가 매우 우수함을 확인하였으며, 상기의 실험예를 통하여 석류 씨 추출 오일을 함유한 화장료는 합성 α-토코페롤이나 합성 BHT에 비하여 전혀 손색이 전혀 없을 뿐만 아니라, 상대적으로 다량 사용시에는 오히려 더욱 우수한 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 11 - 피부자극성 측정

상기한 제조예 7,8 및 비교예 5,6에 따라 제조된 시료들의 피부자극성을 알아보기 위하여, 건강한 성인 남녀 30명을 대상으로 팔하박부에 각 시료의 적당량(챔버에 넘치지 않을 정도)을 첩포 시험용 헤이즈 테스트 챔버(Haye's Test Chambers, Haye's Service B.V. The Netherland)에 묻혀 48시간 첩포한 후, 헤이즈 테스트 챔버를 제거하고 30분∼1시간 경과후 육안으로 피부상태 변화를 판독하여 이를 1차 판정, 제거하고 48시간 이후에 다시 판독하여 이를 2차 판정으로 하였으며, 그 결과를 하기의 표 11에 나타낸다.

[표 11]

제품	피시험자수	판정결과										자극도
		-		±		+		++		+++
		1차	2차	1차	2차	1차	2차	1차	2차	1차	2차
제조예 7	30	29	30	1								0.27
제조예 8	30	29	30	1								0.27
비교예 5	30	28	29	2	1							0.83
비교예 6	30	27	28	2	2							1.11

* 판정표

- : 반응없슴 (자극 정도 :0)

±: 의심되는 양성반응. 약간의 홍반 반응있음(자극 정도 :0.5)

+: 약간의 양성반응. 홍반, 구진, 확실한 인설반응(자극 정도 :1.0)

++: 심한 양성반응. 소포성 반응: 홍반, 구진, 침윤병소, 소포(자극 정도 :2.0)

+++: 격심한 양성반응(자극 정도 :3.0)

[식 4]

(±반응자수x 0.5)+(+반응자수x 1)+(++반응자수x 2)+(+++반응자수x 3)

*자극도=------------------------------------------------------------ x100x1/2

총시험자수 x 최대반응정도 (3)

상기한 피부자극성 시험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 석류 씨 추출 오일을 함유하는 제조예 7,8은 비교예 5,6의 자극 정도에 비하여 훨씬 낮은 자극도를 나타냈다.

실험예 12 - 실사용평가

상기한 제조예 7,8 및 비교예 5,6의 시료에 대하여 18-40세 연령의 건성 피부 또는 민감성 피부를 가진 성인 20명을 대상으로 실사용 평가를 하였다. 장시간 확보를 위해 사용 기간은 8주로 하였으며 매일 4회 도포하였다. 그 결과를 하기의 표 12에 나타낸다.

[표 12]

항목	제조예 7	제조예 8	비교예 5	비교예 6
피부가 촉촉해진다.	4.19	4.02	4.58	4.13
촉촉함이 오래간다.	4.22	3.58	4.49	3.55
피부가 부드러워진다.	3.85	3.87	3.96	3.70
가려움증이 없다.	4.47	3.25	4.53	3.82
수분이 적당하다.	4.06	4.03	4.27	4.01
흡수가 잘된다.	4.14	3.69	4.15	3.48
당김이 적다.	4.02	3.59	3.96	3.67
끈적임이 적다.	4.26	4.03	4.22	3.84
피부트러블이 없다.	4.27	4.15	4.31	4.26
평균	4.160	3.800	4.273	3.838

*배점: 5-매우 좋다. 4-좋다. 3-보통이다. 2-안좋다. 1-매우 좋지 않다.

상기한 표 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 제조예 7,8의 에멀젼 화장료는 피부 촉촉함, 보습 지속력, 가려움증 감소, 매끄러워짐, 끈적임, 흡수성 및 저자극성 등의 면에서 비교예 5,6의 에멀젼 화장료와 별 차이가 없는 대등한 정도의 사용성을 갖는 것으로 평가 되었다.

실험예 13: 시료 경시(經時) 안정성

하기한 표 13은 제조예 7,8 및 비교예 5,6의 경시 안정성을 알아보기 위한 실험으로 시료를 각각 투명한 샘플 용기에 담아 조건별 25℃(상온조건), 43℃(고온조건), 5℃(저온조건) 항온실과 내광 조건에서 보관 관찰한 결과이다.

[표 13]

시험조건		안정성
시험조건		제조예 7	제조예 8	비교예 5	비교예 6
25℃	3개월	◎	◎	◎	◎
25℃	6개월	○	○	△	○
43℃	3개월	○	○	△	○
43℃	6개월	△	△	×	△
5℃	3개월	◎	◎	◎	◎
5℃	6개월	◎	◎	○	◎
내광	3개월	○	○	○	○
내광	6개월	○	○	○	○

* ◎: 매우 양호 ○: 양호 △: 보통 ×: 불안정

상기한 표 13으로부터 알 수 있는 바와 같이, 제조예 7,8의 에멀젼 화장료의 경시 안정성은 비교예 6과는 대등한 정도이고 비교예 5 보다는 다소 우수한 것으로 판명되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따르면 천연 과실인 석류의 종자로부터 피부 자극성이 거의 없고 항산화 효과가 기존의 합성 항산화제에 비해 손색이 없는 매우 우수한 천연 추출 오일을 얻은 다음, 이를 유중유 또는 수중유 화장료에 적용하는 것으로 우수한 미백 효과 또는 흑색화 방지 효과와, 우수한 노화 방지 및 보습 효과를 갖는 매우 안전한 기능성 화장료를 얻을 수가 있다.

* 편차 : 、±0.5(사용전의 L값 - 사용후의 L값)

(A) 석류 씨를 80~150℃에서 1~15분간 볶는 단계;

(B) 160~240℃에서 압착하여 착유하는 단계;

(C) 압착 추출 오일에 수산화나트륨을 가하여 유리지방산을 제거한 다음, 탈검, 탈산, 탈색, 탈취하고, 진공상태에서 불활성 가스를 이용하여 이취를 제거한 다음, 농축하여 석류 씨 오일을 얻는 단계; 및

(D) 상기한 석류 씨 오일을 통상의 화장료 전 중량에 대하여 0.001~3중량%를 혼합하는 단계로 구성되며:

상기한 석류 씨 오일이 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량이 석류 씨 추출 오일 전 중량에 대하여 각각 3.7~4.3중량%및 1.5~2.1중량%이고; 지방산 조성 중 퓨니킨산(Punicic acid)이 45~75중량%이며; DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질)의 라디칼 소거능(전자 공여능)은 9.5~9.9%인 것을 특징으로 하는

석류 씨 추출 오일을 함유하는 화장료의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기한 화장료가 수중유(oil-in-water: O/W) 또는 유중유(oil-in-oil: O/O) 형태인 석류 씨 추출 오일을 함유하는 화장료의 제조방법.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 2,000ppm의 상기한 석류 씨 추출 오일의 아질산염 소거능이 39~42%인 석류 씨 추출 오일을 함유하는 화장료의 제조방법.
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