KR100697234B1 - Ｎｏｘ4를 타겟으로 하는 신경세포 사멸 억제제 탐색법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Nox4 활성 억제제를 탐색함으로써 신경 세포사멸 억제제를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Nox4 특이적 간섭(RNA interference)을 유도하는 siRNA 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 벡터, 상기 siRNA 또는 벡터를 포함하는 세포사멸 억제용 조성물에 관한 것이다.

NADPH 옥시다제, Nox4, siRNA

Description

Ｎｏｘ4를 타겟으로 하는 신경세포 사멸 억제제 탐색법{Method for screening anti-apoptotic agents on Nox4 protein of neuronal cells}

도 1은 생쥐 hippocampus 유래 신경 세포주에 5 mM 글루타메이트 (glutamate)를 처리했을 때의 세포사멸을 나타낸 그림이다.

도 2는 DPI에 의한 NADPH 옥시다제 (NADPH oxidase) 활성저해가 세포막에 존재하는 NADPH 옥시다제의 활성과 관련이 있음을 증명하기 위하여 미토콘드리아의 NADPH 옥시다제 저해제인 로테논 (rotenone)을 비교군으로 글루타메이트를 처리했을 때의 세포생존에 대한 그림이다.

도 3은 DPI에 의해 세포사멸이 억제되었을 때, 글루타메이트 처리에 의한 신경 세포의 ROS의 증가를 DPI가 억제함으로써 나타난 결과임을 나타낸 그림이다.

도 4는 글루타메이트를 처리하였을 때 NADPH 옥시다제 활성을 매개하는 PI3K를, 효소활성 억제제인 LY294002나 워트마닌(Wortmannin)으로 저해했을 때 세포사멸이 억제됨을 보여준 그림이다.

도 5는 PI3K의 효소활성 억제제인 워트마닌을 처리하였을 때 글루타메이트에 의한 ROS의 생성이 억제됨을 나타낸 그림이다.

도 6은 글루타메이트에 의한 ROS의 증가 (B)를 처리하지 않은 세포와 (A), 및 글루타메이트와 동시에 PI3K 억제제인 워트마닌 (C), LY294002 (D), 그리고 NADPH 옥시다제 억제제인 DPI (F)를 처리했을 때와 비교한 그림이다.

도 7은 HT22 세포주에 발현되는 Nox 유전자를 규명하기 위하여 HT22 세포주에서 분리한 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 유전자들의 발현을 비교한 그림이다(lane 1, 2, 3, 4는 각각 Nox 1, 2, 3, 4 유전자임).

도 8은 Nox4 유전자에 대한 두 종류의 siRNA를 이용하여 세포사멸을 억제한 것이 (A)이고, (B)는 그 때 Nox4 유전자의 감소한 발현을 보여준 그림이다.

도 9는 Nox4 유전자의 발현을 siRNA-5로 억제하였을 때 세포주의 ROS 생성 정도를 나타낸 것이 (A)이고, (B)는 그 때 Nox4 유전자의 발현을 나타낸 그림이다.

본 발명은 신경 세포에서 Nox4 활성 억제제를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Nox4 특이적 간섭(RNA interference)를 유도하는 siRNA 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 벡터, 상기 siRNA 또는 벡터를 포함하는 세포사멸 억제용 조성물에 관한 것이다.

뇌졸중 질환에서 신경 세포는 과량의 뉴로트랜스미터 (neurotransmitter)인 글루타메이트 (glutamate)를 과량 분비하여 국부적인 세포사멸이 일어나는데, 세포 사멸은 글루타메이트의 자극에 의하여 세포내 활성산소족(ROS: reactive oxygen species)의 증가가 유도되는 것으로 알려져 있다.

과량의 글루타메이트를 처리하면 세포의 물질전달 통로인 시스틴-글루타메이트 안티포터 (cystine-glutamate antiporter)가 기능을 상실하여 시스틴의 세포내 이동이 저해되고, 이로 인하여 세포내에서 ROS의 제거 역할을 수행하는 글루타사이온 (glutathione)의 합성이 억제된다고 알려져 있다. 따라서, 모노아민 옥시다제 (monoamine oxidase)나 잔틴 옥시다제 (xanthine oxidase) (Tjen-A-Looi et al., J Physiol 2002 543.1: 327-336), 리포옥시게나제 (lipoxygenase) 및 마이토콘드리아 (Colell et al., FeEBS Lett 2004 560: 63-68) 등에 의한 ROS의 증가를 감소시키지 못하여 궁극적인 세포사멸이 유도된다고 알려져 있다.

NADPH 옥시다제는 외래 박테리아의 침입에 대항하여 인체 내 대식세포가 박테리아를 포식할 때 과량의 ROS를 분비하여 박테리아를 사멸시키는 것으로 알려져 있고, 외부자극에 의해 세포가 활성산소를 생산하여 신호전달의 활성산소를 이차적인 전달자로 이용하는 세포신호전달 체계의 중요한 구성 성분으로 최근 재평가되고 있다.

세포내 NADPH 옥시다제는 2 개의 막단백질 성분 (gp91^phox와 p22^phox)과 4 개의 세포질 성분 (p47^phox, p67^phox, p40^phox 및 Rac 단백질)으로 구성되는 복합체이다. 이 중에서 NADPH 옥시다제 활성에 필수적인 막단백질 gp91^phox는 Nox2로 알려져 있으며, 유사형 Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 및 Duox2가 존재하는 것으로 밝혀졌다 (Cheng et al., Gene, 269:131-140, 2001). 각 유사형은 세포 및 조직 특이적인 발현을 보이는데, Nox1은 직장에서 발현되어 세포성장과 신혈관 생성에 관여하며, Nox3과 Nox5는 각각 태아 조직과 이자에서 발현되고, Nox4는 신장과 췌장에서 발현되는 것으로 보고 되었다 (Shiose et al., J Biol. Chem. 276:1417-1423, 2001). 세포 및 조직 특이적으로 Nox 유사형 단백질이 발현되는 것으로 보아 이들 효소가 다른 세포에서 다른 기능을 수행하고 있음을 추측할 수 있다. 그러나 신경 세포에서의 Nox4 발현과 그 기능에 대해서는 보고 된 바가 없다.

본 발명자는 글루타메이트 자극에 의하여 NADPH 옥시다제, 보다 구체적으로는 Nox4 단백질이 뇌졸중, 뇌경색 등의 질환에서 ROS를 생성하여 국부적인 세포사멸을 유도하고, Nox4 특이적 간섭을 유도하는 siRNA 핵산 분자를 처리할 경우 글루타메이트 자극에 의한 ROS 생성과 세포사멸이 억제되는 것을 확인하고, 신경 세포에서 세포사멸을 저해하는 Nox4 활성 억제제를 검출하고자 하는 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신경 세포에서 세포사멸을 저해하는 Nox4 활성 억제제 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Nox4 특이적 RNA 간섭(RNA interference)를 유도하는 siRNA (small interfering RNA) 및 상기 siRNA를 포함하는 세포사멸 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 siRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포사멸 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 신경 세포를 배양하는 단계; 상기 세포로 Nox4 활성 억제제 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 세포의 세포사멸을 유도하는 단계; 및 상기 세포에서의 Nox4 활성을 측정하고 후보 물질을 처리하지 않은 대조구에서의 Nox4 활성과 비교하는 단계를 포함하는, 신경 세포에서 세포사멸을 저해하는 Nox4 활성 억제제 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명자는 신경 세포에서 Nox4가 특이적으로 발현되어 신경 세포사멸 기작에 관여하고 있음을 밝히고, Nox4가 신경 세포사멸을 조절할 수 있는 중요한 타겟으로 작용함을 알 수 있었다. 이에 신경 세포 특이적인 시스템에서의 Nox4에 작용하는 활성 억제제를 검출할 수 있는 효과적인 방법을 제공한다.

본 발명에서, “신경 세포”는 세포사멸 유도제에 의하여 ROS를 생성하는 Nox4가 발현되는 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원의 모든 세포를 포함하며, 일차세포, 이차세포, 불멸화된 세포 등이 있다.

신경 세포의 인위적인 세포사멸은 글루타메이트를 처리함으로써 유도할 수 있으나, 세포사멸을 유도하는 물질이나 방법은 특별한 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어, "후보 물질"이란 Nox4 활성 억제능을 가지는 것으로 의심되는 물질을 의미한다. 이러한 후보 물질에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 단백질, 탄수화물, 핵산분자(RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어, "처리"란 후보 물질이 신경 세포에 영향을 미치도록 하는 것을 의미하고, 세포내로 직접 흡수되는 것뿐만 아니라 물질이 세포막에 영향을 미치고 그 세포막으로부터 발생한 신호가 Nox4 활성을 억제하는 모든 경우를 포함한다. 따라서 본 발명에 있어서, 상기 후보 물질은 세포막 투과성인 물질 뿐만 아니라, 세포막에 불투과성인 물질도 포함한다. 그러나, 후보 물질이 Nox4의 활성을 억제하는 기작은 특별히 한정되지 않는다.

이 때, 후보 물질은 유효량의 범위내에서 처리하도록 한다. “유효량”이란 수혜, 위험 요소를 고려하여 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위내에서 억제능을 조사하도록 한다. 유효량의 범위내에서, Nox4 활성이 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상 억제할 때 유효 활성 억제제라고 할 수 있다.

Nox4의 활성을 억제하는 물질의 검출은 후보물질을 처리하지 않은 대조구에서의 Nox4 활성 정도와 Nox4의 활성을 직-간접적으로 억제하는 물질을 검출하도록 한다. 이러한 조건은 당업자라면 용이하게 적절하게 조절하여 사용할 수 있다. Nox4의 활성은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 바람직하게는, Nox4 유전자의 mRNA 또는 단백질 양으로 측정하거나, ROS 생성량으로 측정하거나, 세포사멸 정도 를 측정함으로서 할 수 있다.

mRNA 양을 측정하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

단백질 양은 Nox4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있고, 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

ROS 생성량을 측정하기 위한 분석 방법으로는 FACS, 형광현미경, 형광염색 측정법 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

세포사멸 정도를 측정하기 위한 분석 방법으로는 FACS, in situ DNA결합법, 전기영동에 의한 DNA단편물 확인법 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 방법으로 획득한 물질을 이용하여, 신경 세포에서 Nox4의 활성 조절로 신경 세포사멸을 억제할 수 있다. 따라서, Nox4 활성 억제제를 환자에게 투여할 경우, 신경 세포사멸을 억제하는 기작으로 뇌졸중, 뇌경색 등의 신경 세포에서 세포사멸을 유도하는 다양한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 방법으로 검출한 Nox4 활성 억제제 투여에 의해 신경 세포에서 세포사멸 유발이 억제되거나 지연되는 모든 행위을 의미하고 "치료"란 상기 방법으로 검출한 Nox4 활성 억제제 투여에 의해 신경 세포사멸 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 Nox4의 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥을 포함하는 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드인, Nox4 특이적 RNA 간섭(RNA interference)를 유도하는 siRNA (small interfering RNA)에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미하고, 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서, 용어 “특이적” 또는 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 Nox4 특이적이다.

본 발명은 Nox4 특이적으로 절단을 유도하는 siRNA에 관한 것으로, Nox4 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 일부 영역과 동일한 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 Nox4 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 일부 영역에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥이 이중가닥 RNA를 형성하게 된다. siRNA는 Nox4의 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있으면 서열과 길이는 특별히 제한되지 않는다. siRNA는 바람직하게는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 이에 상보적인 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 이에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA이다.

상기 siRNA를 세포에 처리할 경우, Nox4 유전자 발현이 siRNA를 처리하지 않은 대조구에 비하여 80% 이상 감소됨을 RT-PCR 결과를 통하여 확인할 수 있었다.

상기에서 “유전자 발현의 감소(Inhibition of gene expression)”란 목적 유전자에서 생성된 mRNA 및/또는 단백질의 수준이 제거 또는 감소된 것을 의미하고, 이는 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 일어나는 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상에 의한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트를 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 siRNA의 세포내 처리는 Nox4 유전자 발현을 특이적으로 감소시키고, 이로 인해 ROS 생성 감소로 인하여 신경 세포사멸이 60% 억제됨을 확인할 수 있었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 siRNA를 포함하는 세포사멸 억제용 조성물에 관한 것이다.

siRNA를 포함하는 조성물은 세포사멸을 억제하는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA 의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는, 리포좀 (미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수도 있다. siRNA를 복합체 형태로 체내 투여할 경우 유전자의 체내 체류시간 및 발현 지속시간이 네이키드 핵산에 비하여 현저히 증가하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

상기 세포사멸 억제용 조성물은 뇌졸중(cerebral apoplexy), 뇌경색(cerebral infarction) 뿐만 아니라 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 동맥경화증(arteriosclerosis), 타입 I 및 II 당뇨병의 심장혈관 합병증(cadiovascular complications of Type I and II diabetes), 내막 과형성(intimal hyperplasia), 관상 동맥 질환(coronary heart disease), 뇌, 심장 또는 동맥 혈관경련(cerebral, coronary or arterial vasospasm), 혈관내피세포 손상(endothelial dysfunction), 울혈성심부전(congetive heart failure)을 포함한 심부전(heart failure), 패혈증(sepsis), 말초동맥질환(peripheral artery disease), 기관 이식후 혈관 합병증(vascular complications after organ transplantation), 바이러스 및 박테리아 감염후 심장혈관 합병증(cardiovascular complications arising from viral and bacterial infections), 고혈압(hypertension), 혈소판 응집(platelet aggregations), 안기나(angina), 동맥류(aneurysm), 일과성뇌허혈증(transient ischemic attack), 폐색전(pulmonary embolus), 괴저(gangrene), 호흡기 질환(respiratory disease)(예를 들어, 천식(asthma), 기관지염(bronchitis), 알러지 비염 (allergic rhinits) 및 급성호흡곤란 증후군(ARDS: Acute Respiratory Distress Syndrome)), 피부질환(예를 들면, 건선(psoriasis), 습진(eczema) 및 피 부염(dermatitis)), 신부전(renal failure) 등의 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 보다 바람직하게는, 뇌졸중, 뇌경색, 아테롬성 동맥 경화증, 동맥경화증, 타입 I 및 II 당뇨병의 심장혈관 합병증, 관상 동맥 질환, 뇌, 심장 또는 동맥 혈관경련, 울혈성심부전, 말초동맥질환, 동맥류, 고혈압, 일과성뇌허혈증 또는 폐색전 등의 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 siRNA를 환자에게 투여하여, 상기 환자에게서 세포사멸을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, "환자"는 세포사멸 억제에 의해 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 동물과 인간 피검자를 의미한다. 이런 질환에는 상기에서 언급한 질환들이 있고, 본 발명의 siRNA를 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써, 세포사멸을 억제할 수 있고 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효양으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 siRNA를 포함하는 세포사멸 억제용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 siRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

벡터는 바람직하게는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 이에 상보적인 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 이에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에서 “벡터”란 목적 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단으로, 상기 벡터를 이용하여 세포 내에서 siRNA를 발현시킬 수 있다. 벡터의 종류는 특별히 제한되지 않고, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명의 벡터는 Nox4 mRNA의 어느 한 영역에 대하여 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

상기 안티센스 RNA 가닥과 센스 RNA 가닥은 동일한 벡터에서 발현될 수도 있 고, 다른 벡터에서 각각 발현되는 형태일 수도 있다. 동일한 벡터로부터 안티센스 RNA 가닥 및 센스 RNA 가닥을 발현시킬 경우, 프로모터에서 센스 RNA가 발현되는 발현 카세트와 프로모터에서 안티센스 RNA가 발현되는 별개의 발현 카세트를 각 구축하고 이들 카세트를 같은 방향 혹은 역방향으로 벡터에 삽입할 수 있다. 또한, 스템루프형 siRNA를 발현할 수 있는 시스템으로 안티센스 RNA 가닥과 센스 RNA 가닥을 코딩하는 뉴클렐오타이드 서열을 동일 DNA 사슬상에 역방향으로 배치하고, 이들 DNA 사이에 링커를 삽입하여 연결시킨 단위를 하나의 프로모터의 하위(downstream)에 위치하도록 할 수 있다. 이 때, 발현되는 순서는 제한되지 않는다. 즉, 안티센스 RNA 가닥을 코딩하는 DNA-링커-센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태와 센스 RNA 가닥을 코딩하는 DNA-링커-안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태일 수 있다. 그 결과, 생성되는 siRNA는 링커 부분을 루프로 하고, 그 양쪽의 센스 RNA 가닥과 안티센스 RNA 가닥이 짝을 이루게 되는 스템 루프형 구조를 가진다. 링커는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 링커로 다양한 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는 6 내지 12개의 뉴클레오타이드 길이를 가진다. 또한, Nox4에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 RNA 만을 발현시키는 벡터를 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 세포사멸 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 벡터를 포함하는 조성물은 세포사멸을 억제하는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 벡터의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다.

상기 세포사멸 억제용 조성물은 상기에서 언급한 질환들을 예방 또는 치료할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터를 환자에게 투여하여, 상기 환자에게서 세포사멸을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 벡터를 포함하는 조성물은 상기에서 언급한 질환들을 가지는 환자에게 투여함으로써, 세포사멸을 억제할 수 있고 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효양으로 목적 조직에 도달할 수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 글루타메이트 처리에 의한 생쥐 hippocampus 유래 신경 세포주의 사멸과 ROS 생성

1. 글루타메이트 처리에 의한 생쥐 hippocampus 유래 신경 세포주의 사멸

HT22 hippocampal 신경 세포는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies) 포함한 DMEM (Invitrogen Life Technologies)으로 3일에 한 번씩 100 mm 디쉬에 1 x 10⁵의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 배양하였다.

글루타메이트에 의한 세포사멸은 글루타메이트의 농도와 처리시간 및 세포의 접종 농도에 의해 달라지는데, 이미 보고 된 HT22 세포주에 대한 연구 (Tan et al., J Cell Biol., 141: 1423-1432, 1998)를 참조하여 결정하였다.

반복적인 처리를 수행하여 글루타메이트 처리에 의해 나타나는 세포사멸을 관찰하였는데, 5 x 10⁵ 세포 (100 mm dish)에 글루타메이트 5 mM을 처리하였을 때, 도 1에 나타낸 것과 같은 세포사멸곡선을 구하였으며, 처리 후 5시간까지는 약간의 변화에도 불구하고 세포수가 유지되나 5시간 후에는 급격한 사멸의 경로를 가게 된다.

2. DPI 처리에 의한 신경 세포의 세포사멸 억제

글루타메이트 처리에 의한 HT22 세포주의 사멸이 DPI(diphenyliodonium)에 의해 억제된다는 보고가 있었으나 (Maher and Davis, J Neuroscience, 16; 6394-6401, 1996), 이것이 세포막의 NADPH 옥시다제에 의한 결과인지 여부를 확인하기 위하여 미토콘드리아의 NADPH 옥시다제 활성을 저해하는 로테논(Rotenone)을 처리 하여 비교 관찰하였다.

HT22 세포주를 5 x 10⁵의 농도로 접종하여 24시간 배양하고 1 uM의 DPI (Sigma)와 1 uM의 로테논 (Sigma)을 30분간 각각 처리한 다음 5 mM의 글루타메이트를 처리하여 세포사멸을 유도하고 10시간 후에 세포를 수획하고, 트립판 블루(trypan blue)로 염색하여 죽는 세포를 배제한 다음 세포 수를 세어 살아 있는 세포 수를 비교하였다.

도 2에 표시한 바와 같이 DPI는 글루타메이트 처리 시에 세포사멸을 억제하였으며 로테논에 비해 2배 이상의 매우 높은 억제 효과를 보이는 것으로 보아 DPI가 미토콘드리아 보다는 세포막에 존재하는 NADPH 옥시다제의 활성을 저해하여 세포생존을 유지하는 것을 알 수 있었다.

3. 신경 세포에서의 ROS 생성과 세포사멸

글루타메이트에 의한 세포사멸 및 DPI에 의한 이의 저해가 ROS 생성 및 저해 때문인지를 확인하기 위하여, 직접적으로 세포내 ROS의 양을 FACS (Flow Cytometry Cell Sorting) 기술을 이용하여 측정하였다.

HT22 세포를 상기와 같이 접종하여 24시간 배양하고 1 uM의 DPI (Sigma)와 1 uM의 로테논 (Sigma)을 30분간 각각 처리한 다음 5 mM의 글루타메이트를 처리하여 세포사멸을 유도한 다음, 3시간 후에 세포를 수획하고 세척한 다음, ROS와 반응하여 형광을 띠는 DCF (2',7'-dichlorofluorescein)로 변환되는 DCF-DA (2',7'- dichlorofluorescein diacetate, Molecular probe, Cat#. D399) 10 uM과 2% FBS가 포함된 HBS 용액 (Hank's balanced salt solution)에 세포를 풀어 FACS를 이용하여 분석하였다.

DCF-DA로 염색된 각 세포들을 Becton Dickinson사 FACS Calibur (excitation: 488 nm, emission: 515-545 nm)를 이용하여 분석한 결과 도 3에서와 같이 DPI는 글루타메이트에 의해 증가되는 ROS의 양을 매우 낮게 유지한 반면, 로테논은 거의 글루타메이트에 의해 증가되는 ROS를 억제하지 못 하였다. 비교군은 억제제를 녹일 때 사용한 DMSO을 처리하였다.

이를 종합하여 보면, 글루타메이트에 의한 신경 세포의 세포사멸은 세포막에 존재하는 NADPH 옥시다제에 의한 것이며, 또한 NADPH 옥시다제의 ROS 생성이 그 주된 요인임을 알 수 있다.

실시예 2 - 글루타메이트에 의한 세포사멸 신호전달 경로

1. PI3K 활성 억제에 의한 세포사멸의 억제효과

글루타메이트에 의한 세포사멸의 효과가 전달되는 경로를 규명하기 위하여 HT22세포에 PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)의 활성을 억제하는 것으로 알려진 LY294002 (Calbiochem사 catalog number 681675)와 워트마닌(Wortmannin) (Calbiochem사 catalog number 440202)을 전처리하고 글루타메이트를 처리하여 세포사멸을 유도하였다.

상기와 같이 배양한 세포에 50 uM의 LY294002와 1 uM의 워트마닌을 30분간 처리한 후 5 mM 글루타메이트를 처리하고 10시간 후 세포를 수획하여 상기의 방법으로 살아 있는 세포 수를 비교한 결과, 도 4에서와 같이 글루타메이트는 30% 정도의 세포생존을 유도한 반면 글루타메이트와 더불어 처리하였을 때, LY294002는 66%, 워트마닌은 75% 정도의 세포생존을 보였다.

즉, PI3K 억제제로 잘 알려진 두 물질이 글루타메이트에 의해 유도되는 신경 세포의 사멸을 억제하는 것으로 보아 글루타메이트의 세포사멸 효과는 PI3K 단백질을 통하여 전달됨을 규명하였다.

2. PI3K 활성 억제에 의한 ROS 생성 억제효과

글루타메이트에 의한 세포사멸이 PI3K 활성 억제제에 의해 저해될 때 ROS의 생성이 저해되는 지를 규명하였다.

HT22 세포를 상기와 같이 접종하여 24시간 배양하고 1 uM의 워트마닌을 30분간 전처리한 다음 5 mM의 글루타메이트를 처리하여 세포사멸을 유도하고 3시간 후에 세포를 수획하고 세척한 다음, ROS와 반응하여 형광을 띠는 DCF-DA를 상기와 같이 처리하여 FACS를 이용하여 분석하였다.

DCF-DA 염색방법을 이용하여 분석한 결과 도 5에서와 같이 글루타메이트는 세포내 ROS 양의 증가를 보인 반면, PI3K의 활성 억제제로 알려진 워트마닌은 글루타메이트에 의한 ROS의 증가를 억제함을 알 수 있었다.

또한 형광 현미경을 사용하여, PI3K 활성 억제제인 LY294002를 처리하여 글루타메이트에 의한 ROS의 생성을 비교하였다. 6 웰 플레이트 (well plate) 용기에 멸균 coverslip (2 X 2 cm)을 넣고 세포를 접종하여 24시간 배양한 다음 5mM 글루타메이트를 처리하여 세포사멸을 유도하고 1시간 후, coverslip을 떼어 내어 5 uM DCF-DA를 처리한 후 형광현미경 (Carl Zeiss사, Zeiss Plau-NEOFLUARx10)으로 염색된 세포를 관찰하였다 (excitation: 488 nm, emission: 515-540 nm).

도 6의 (B) 와 같이 글루타메이트는 신경 세포의 처리하지 않은 세포에 비해 (A) ROS 생성을 유도하나, FACS 방법의 결과 (도 5)와 같이 워트마닌 (C)에 의해 그 생성이 매우 억제됨을 관찰할 수 있었으며, 또한 다른 PI3K 활성 억제제인 LY294002 (D)도 ROS의 생성을 억제하였으며, 워트마닌의 경우 DPI (E)에 의한 억제와 유사한 정도로 효과가 좋았다.

이상의 결과에서 PI3K는 글루타메이트에 의한 세포사멸과 ROS의 생성을 매개하는 역할로 확인되었으며 PI3K의 활성을 억제하는 물질에 의해, NADPH 옥시다제에 의한 ROS 생성과 이것으로 야기되는 세포사멸이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3 - 글루타메이트에 의한 세포사멸에 있어서의 Nox4 억제제에 의한 세포사멸 및 ROS 생성억제

1. Nox4 유전자의 발현 저해에 의한 세포사멸의 억제

세포막에 존재하는 NADPH 옥시다제는 두개의 막단백질과 4개의 세포질 단백질로 구성되었음이 보고 되었으며, 두 개의 막단백질이 기능에 매우 중요한 역할을 수행하며 그 중 gp97^phox로 알려진 Nox2는 그 외에도 6종 (Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1과 Duox2)의 이소타입(isotype)이 보고 되었다.

이 이소타입 단백질 중에서 HT22 신경 세포에서 발현되는 유전자를 규명하기 위하여 HT22 세포로부터 분리한 total RNA을 주형으로 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 수행하였다.

우선, Easy Blue (Intron사)를 사용하여 1 ug의 전체(total) RNA를 추출하여 역전사(reverse transcription)를 진행하였는데 M-MLV 역전사(Super-Bio사) 효소를 이용하고 oligo dT를 프라이머로 사용하여 37℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였으며, PCR은 Taq 폴리머라제(Solgent사)를 사용하여 95℃에서 5분간 변성한 후 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 40초의 조건으로 28 회 반복하여 산물을 얻을 수 있었으며, 각 유전자에 대한 프라이머 염기서열은 Nox1 forward; 5'-ctcacaattgttcccattct(서열번호 3), reverse; 5'-actggaaaacatcctcactg(서열번호 4), Nox2 forward; 5'-ctctgggtgtggtcaccttt(서열번호 5), reverse; 5'-tgaacaccaattctgccaaa(서열번호 6), Nox3 forward; 5'-gcatttgagtggtttgctga(서열번호 7), reverse; 5'-cctcggatccacagatgagt(서열번호 8), Nox4 forward; 5'-gtcccctgttcatgtgatcc(서열번호 9), reverse; 5'-gcccataggagggataggaa(서열번호 10) 등 이다.

도 7에서와 같이 Nox4 유전자의 발현(lane 4)이 매우 우세하였으며 Nox2 (lane2)의 발현도 매우 약하게 관찰되었는바, 매우 높은 유전자 발현을 보이는 Nox4를 대상으로 하여, 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 억제할 수 있는 RNA interference를 수행하고자 siRNA (small intefering RNA)를 제조하였다(siNox-3: 5'-ggccaacgaagggguuaaacaccuc(서열번호 1), siNox-5: 5'-ggauaaaagcaagacucuacacauc (서열번호 2)).

2 종 siRNA를 사용하여 유전자의 발현을 억제하고자 하였는 바, 6 웰 플레이트(well plate) 용기에 웰당 1 X 10⁵ 세포를 접종한 후 24시간 후에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies사) 2 ul와 합성된 Nox4 oligomer (Stealth RNA) 각 100 nM을 반응시켜 트랙스펙션하였으며 24시간 후에 세포를 수거하여 100 mm 용기로 옮기고 다시 24시간 배양한 다음 5 mM 글루타메이트를 처리하여 세포사멸을 유도하고 상기의 방법에 의해 살아 있는 세포 수를 관찰하였다.

도 8의 (A)에 나타난 바와 같이 두개의 합성 RNA oligomer는 Nox4 유전자의 발현을 저해하였는데 글루타메이트를 처리한 세포에서 siRNA-5가 siRNA-3보다 세포사멸을 억제하는데 매우 효과가 있었으며, siRNA를 처리하지 않은 경우에서 보다 약 2배의 세포가 살아남을 수 있었다.

각각의 siRNA를 처리하여 유전자의 발현을 억제하였을 때의 Nox4 유전자 발현을, 비교군을 처리한 경우와 함께 RT-PCR로 분석한 결과 (B), siRNA-3과 -5 모두 RNA의 발현은 억제되고 있음을 확인하였다.

2. Nox4 유전자의 발현 억제에 의한 ROS의 생성 저해

글루타메이트에 의한 세포사멸에서 nox4 유전자의 발현 억제가 세포사멸을 저해한 바, 그 효과가 ROS 생성의 저해에 기인하는지를 규명하기 위하여 도 8에서, Nox4 유전자의 발현을 억제하고 보다 효과적으로 세포사멸을 저해한 것으로 확인된 siRNA-5를 이용하여 유전자의 발현을 억제하고 ROS의 생성을 관찰하였다.

상기에서와 같이 배양하고 siRNA-5를 트랙스펙션한 세포를 5 mM 글루타메이트를 처리하고 형광현미경에서 관찰하였다.

도 9의 (A)에 나타난 것과 같이 비교군의 세포는 글루타메이트에 의해 ROS의 생성이 증가되었으며 siRNA-5가 도입된 세포에서는 글루타메이트의 처리에도 불구하고 ROS의 생성이 억제되고 있음을 관찰할 수 있었다.

예상한대로 siRNA-5에 의해 유전자의 발현이 억제되었음을 도 9의 (B)에서 RT-PCR 방법에 의해 확인할 수 있었다.

이상의 결과는 신경 세포에서 글루타메이트에 의한 세포사멸이 NADPH 옥시다제 복합체를 구성하는 특정 유전자인 Nox4의 발현제어에 의해 억제될 수 있으며, 그것은 복합체를 구성하는 Nox4 유전자를 통한 ROS의 생성을 억제함으로써 가능하다는 것을 보여주고 있다.

본 발명의 신경 세포에서 세포사멸을 저해하는 Nox4 활성 억제제를 검출하는 방법을 통하여 신경 세포의 세포사멸을 억제하는 신규 물질을 효과적으로 탐색할 수 있고, Nox4 특이적 RNA 간섭을 유도하는 siRNA을 이용하여 Nox4에 의한 신경 세포의 세포사멸을 방지할 수 있어 뇌졸중, 뇌경색 등의 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

1. 신경 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 Nox4 활성 억제제 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 세포의 세포사멸을 유도하는 단계; 및 상기 세포에서의 Nox4 활성을 측정하고 후보 억제제를 처리하지 않은 대조구에서의 Nox4 활성과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 물질의 스크리닝 방법.
2. 제1항에 있어서, Nox4 활성을 Nox4 유전자의 mRNA 또는 단백질 양으로 측정하는 방법.
3. 제1항에 있어서, Nox4 활성을 ROS 생성량으로 측정하는 방법.
4. 제1항에 있어서, Nox4 활성을 세포사멸 정도로 측정하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 Nox4 활성 억제제 후보 물질은 Nox4의 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥을 포함하는 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드로서, Nox4 특이적 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 siRNA (small interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 물질의 스크리닝 방법.
6. Nox4의 mRNA에 특이적인 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 이에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA.
7. Nox4의 mRNA에 특이적인 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 이에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA.
8. 제6항 또는 제7항의 siRNA를 포함하는 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 뇌졸중 또는 뇌경색인 것을 특징으로 하는 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
10. 제6항 또는 제7항의 siRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
11. 제10항의 벡터를 포함하는 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 뇌졸중 또는 뇌경색인 것을 특징으로 하는 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
13. 삭제

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