KR100668260B1

KR100668260B1 - 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법

Info

Publication number: KR100668260B1
Application number: KR1020050083354A
Authority: KR
Inventors: 양재경; 임부국; 한상우; 정강원
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2005-09-07
Filing date: 2005-09-07
Publication date: 2007-01-16

Abstract

본 발명은 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법에 관한 것으로, 특히, 참나무 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 증류수를 첨가한 다음 유리필터로 여과하여 여과액을 수집하는 단계; 상기 여과액을 농축시킨뒤 상기 농축된 여과액보다 3배 많은 에탄올과 반응시킨후 원심분리하고, 상기 원심분리 상층부에 있는 에탄올 가용부를 수집하여 농축시킴으로써 페놀성 화합물을 분리하는 단계; 상기 분리된 페놀성 화합물을 헥산, 아세트산에틸, 포름산으로 이루어진 혼합용제에 녹인후, 용제 가용부를 실리카겔 컬럼을 이용하여 페루릭산(ferulic acid)이 포함된 분류물로 분취하는 단계;를 거치어 페루릭산을 추출하는 경우, 일반적인 곡물류가 아닌 참나무 목재로부터 페루릭산을 추출할 수 있고, 종래의 곡류외피 또는 전곡립 또는 발아된 곡류를 압출해서 가수분해로 페루릭산을 추출하는 것보다 현저하게 많은 양을 용이하게 얻을 수 있는 효과가 있는 것이다.

참나무, 페루릭산, 페놀성 화합물

Description

참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법{Method of Extracting Frulic Acid From Oak}

도 1은 본 발명에 따른 페놀성 화합물로부터 분취된 각 분류물의 UV 흡광도 측정 결과를 나타내는 그래프이고,

도 2는 종래의 일반적인 페놀성 화합물(바닐린, 바닐린산, 페루릭산, 시나믹산) 표준품에 대한 TLC(Thin Layer Chromatography)를 나타내는 사진이고,

도 3은 본 발명에 따른 페놀성 화합물의 UV 흡광도 측정 결과에 따른 각 분류물 집단의 TLC 결과를 나타내는 사진이고,

도 4는 종래의 일반적인 바닐린, 바닐린산, 페루릭산 및 시나믹산의 혼합물질에 대한 HPLC(High Performance Liquid Chromatograph) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 참나무로부터 페루릭산을 용이하고 효과적으로 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 참나무 칩을 고압수증기로 처리 한 다음, 증류수를 첨가하여 120℃의 온도에서 원료를 반응시키고, 이를 여과하여 농축시킨뒤 유기용매와 반응시키며, 원심분리후 상층부에 존재하는 용매 가용부만을 다시 농축시켜 페루릭산 혼합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

참나무라는 것은 참나무목 참나무과 참나무속의 총칭이다. 참나무는 낙엽 또는 상록교목이며 때로는 관목도 있고, 참나무속에 딸린 식물의 총칭으로 쓰지만, 상수리나무를 뜻하는 때도 있다. 잎은 어긋나고 대부분 가장자리에 톱니가 있으며, 꽃은 4∼5월에 피고 수꽃이삭은 새가지 밑부분에서 밑으로 처지며 암꽃이삭은 윗부분의 잎겨드랑이에서 곧추서는 것이 특징이다. 한국에서는 잡종을 제외한 낙엽수종 6종과 상록수종 5종이 자라고 있는데, 상록수종은 남부에 국한되어 있지만 낙엽수종은 전국 각지에 분포하며 많은 양원잡종(兩原雜種)과 삼원잡종(三原雜種)을 만든다. 갈참나무는 긴 잎자루가, 졸참나무는 작은 잎과 안으로 굽어진 톱니가, 신갈나무와 떡갈나무는 짧은 잎자루와 잎밑이 귀 모양인 것이 특색인데, 특히 신갈나무는 잎 뒷면의 잎맥에 털이 있을 때가 있지만 떡갈나무와 굴참나무의 잎에는 성모(星毛)가 빽빽이 난다. 속명인 퀘르쿠스 Quercus란 켈트어의 좋은 목재라는 뜻이며 참나무 역시 진짜 나무라는 뜻이다. 북반구의 온대와 폴리네시아에서 200∼250종이 자란다.

낙엽수 중에서 갈참나무·졸참나무·떡갈나무·신갈나무는 꽃이 핀 해에, 상수리나 무·굴참나무는 2년 만에 열매가 성숙한다. 한편 굴참나무에서는 코르크를 채취하며, 난대지역에서는 지중해산인 코르크참나무를 재배한다. 도토리라고 불리는 참나무의 견과(堅果)는 타원형이나 구형으로, 그 녹말을 이용하여 묵을 만드는 데 쓰인다. 재목이 단단하여 쓸모가 많으며 술통·연장자루로 쓰인다. 중요한 활엽수 용재이며 식용녹말과 타닌을 생산하고 때로는 산누에를 치는 데에 잎이 이용되기도 한다. 나무껍질에는 타닌이 많이 함유되어 있어 바닷가에서 어망을 물들이는 재료로 쓰인다. 참나무 열매는 열매는 구황식물로 이용하기도 하였고 도토리묵을 쑤어 먹는다. 줄기는 목탄의 재료로 이용하고 있다. 참나무 잎은 지혈작용이 뛰어나 피를 토하거나 코피가 날때 치질로 인한 출혈에도 효과가 있다는 보고가 있다.

그러나, 상기한 보고들은 한방치료적인 측면에서 참나무 잎이 지혈작용에 효과가 있다는 사실을 규명했을뿐 참나무의 어떤 부분이, 또는 구체적으로 참나무의 어떤 성분이 이러한 약리적 효과와 직접적인 관련을 가지는지에 대해서는 지금까지 연구된 바가 없다.

이에 본 발명자는 페루릭산이 유방암, 대장암 및 폐암 발생 억제에 효과가 있다는 사실을 알고, 식물의 종자나 잎에 주로 함유되어 있는 페루릭산을 추출하기 위하여 수십가지의 천연 약재를 대상으로 실험을 하던 중 많은 양의 페루릭산을 참나무로부터 용이하게 추출할 수 있는 방법을 지득하게 되었다.

한편, 페루릭산(ferulic acid)은 하기의 구조식으로 나타낸 바와 같이 분자식은 C₁₀H₁₀O₄ 로 표기되는 애시드(acid)이다.

이러한 페루릭산은 시금치나 올리브 등의 식물에 흔하게 존재하는 페놀 계통 화합물의 하나로서, 페닐알라닌, 타이로신의 대사로 생성되어 자체로서 또는 세포벽의 리그닌(lignin)이나 생체 고분자에 붙어 존재하는데, 매우 다양한 생리활성-항산화제 활성, 강력한 항암작용, 항에이즈바이러스 활성, 항염작용, 항알러지 작용 등을 나타내는 것으로 알려져 있다.

페루릭산은 바이오바닐린의 생합성의 주 원료가 되는 유기산으로 수요성이며, 인체 흡수가 빠르다. 최근에는 인간의 면역시스템에 상당한 도움을 줄 수 있는 화합물로 알려져 있다. 특히, 영국약리학회 공식 학술지인 영국약리학저널(British Journal of Pharmacology)에 의하면 페루릭산은 뇌 속 치매 유발물질을 효과적으로 차단하는 기능이 있다는 내용을 소개한바 있다. 또한 페루릭산은 유방암, 대장암, 폐암 발생 억제 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 페루릭산은 식물의 종자나 식물의 잎에서 주로 함유되어 있으며, 밀, 쌀과 같은 곡류의 껍질에도 많이 함유되 어 있다.

종래의 곡류외피 또는 전곡립 또는 발아된 곡류로부터 페루릭산을 추출하는 경우, 일반적으로 곡류의 가공공정으로서 사용되고 있는 건조, 분쇄공정 등은 공정특성상 곡류내에 강하게 결합된 형태의 페루릭산, 폴리페놀류, 아라비노자일란 등의 기능성 생리활성 물질을 다른 세포벽 구성성분으로부터 분리하는 것이 실질적으로 매우 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 이러한 원료들의 대부분은 수확계절이나 생산량, 구입단가, 구입경로 및 보관 등에 있어서, 많은 문제점을 가지고 있다. 지금까지 곡류의 외피 또는 전곡립 자체가 아니라 식용작물의 줄기로부터 페루릭산과 같은 생리활성 성분을 분리하는 시도는 이루어진 바가 없다. 본 발명자들은 이러한 원료들의 대체원료로서 국내에 널리 식재되어 있으며 수확 후 폐기되고 있는 참나무를 사용하여 페루릭산의 생산을 시도하게 된 것이다.

이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 참나무 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 증류수를 첨가한 다음 유리필터로 여과하여 여과액을 수집하는 단계; 상기 여과액을 농축시킨뒤 상기 농축된 여과액보다 3배 많은 에탄올과 반응시킨후 원심분리하고, 상기 원심분리 상층부에 있는 에탄올 가용부를 수집하여 농축시킴으로써 페놀성 화합물을 분리하는 단계; 상기 분리된 페놀성 화합물을 헥산, 아세트산에틸, 포름산으로 이루어진 혼합용제에 녹인후, 용제 가용부를 실리카겔 컬럼을 이용하여 페루릭산(ferulic acid)이 포함된 분류물로 분취하는 단계;를 포함하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법을 제공하고자 한 것이다.

이와 같은 본 발명에 따라 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 경우, 일반적인 곡물류가 아닌 참나무 목재로부터 페루릭산을 추출할 수 있고, 종래의 페루릭산 추출방법, 특히 곡류외피 또는 전곡립 또는 발아된 곡류를 압출해서 가수분해로 페루릭산을 추출하는 것보다 현저하게 많은 양의 페루릭산을 용이하게 얻고자 하는 것을 본 발명의 목적으로 한다.

본 발명은 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법에 관한 것으로, 특히, 참나무 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 증류수를 첨가한 다음 유리필터로 여과하여 여과액을 수집하는 단계; 상기 여과액을 농축시킨뒤 상기 농축된 여과액보다 3배 많은 에탄올과 반응시킨후 원심분리하고, 상기 원심분리 상층부에 있는 에탄올 가용부를 수집하여 농축시킴으로써 페놀성 화합물을 분리하는 단계; 상기 분리된 페놀성 화합물을 헥산, 아세트산에틸, 포름산으로 이루어진 혼합용제에 녹인후, 용제 가용부를 실리카겔 컬럼을 이용하여 페루릭산(ferulic acid)이 포함된 분류물로 분취하는 단계;를 거치어 페루릭산을 추출하는 방법이다.

참나무로부터 효율적으로 페루릭산을 추출, 분리하는 본 발명은 전체적으로 3가지 단계로 구분될 수 있다. 1단계 공정으로 시료를 준비하고 전처리 과정을 거치는 것과, 2단계 공정으로 폐놀성 화합물을 분리하는 공정, 3단계 공정으로는 페놀성 화합물로부터 페루릭산을 추출하는 공정이다. 보다 상세하게는 고압의 수증기로 처리된 참나무 칩을 준비한 뒤 증류수와 반응시키고, 2단계 공정에서는 이를 여과하여 농축시킨뒤 유기용매와 반응시키며, 원심분리후 상층부에 존재하는 용매 가용부만을 다시 농축시켜 페루릭산 혼합물을 분리하는 과정을 거친다. 3단계 공정에서는 분리된 페루릭산 혼합물로부터 실리카겔 컬럼, TLC(Thin layer chromatography) 또는 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 최종적인 페루릭산을 확인하고 추출하는 것이다.

지금까지 목재로부터 단 한번의 처리만으로 페루릭산을 선택적으로 추출하는 방법은 알려진 바가 전혀 없다. 왜냐하면 페루릭산은 목질자원의 주요성분인 리그닌(lignin, 페놀성 화합물)의 부분적인 구조이고, 이러한 리그닌은 거대한 망상구조로서 참나무에 존재하기 때문이다. 본 발명에서는 이를 분해 혹은 변환하기 위해 화학적 전처리 과정을 반드시 거치는 것을 특징으로 한다. 페루릭산을 추출, 분리하기 위해서는 먼저 참나무를 화학적으로 전처리 하고, 이로부터 획득된 수용성 물질군에 있어서 페놀성 화합물을 획득하고 이들로부터 페루릭산을 분리하는 것이 바람직하다.

먼저, 본 발명은 참나무에서 페루릭산을 추출하는 방법에 관한 것이므로, 기본적으로 참나무로부터 시료를 준비하는 과정이 포함된다. 구체적으로 상기 참나무 시료를 준비하는 단계는 참나무를 칩(chip) 상태로 조제하고 고압의 용기에서 스팀처리 한 후, 20~60 메쉬(mesh) 크기로 분쇄하여 시료를 준비하는 것이 가능하다. 참나무 자체로는 증류수와 반응시켜 원하는 특정 성분을 분리하는 것이 부적합하므로, 고압에서 스팀처리를 거친 후 미세한 크기로 분리시키는 것이다. 단단한 목재로부터 특별한 화학적 성분을 추출해내기 위해서는 스팀처리를 고압에서 진행 시킴으로써 리그닌 망상구조를 변형시키는 것이 바람직하고, 이후 전처리 과정에서 반응하는 증류수와의 접촉을 위해 크기는 20~60 메쉬(mesh) 크기로 일정한 것만을 선별하였다.

이어서, 상기 시료에 증류수를 첨가한 뒤 120℃의 온도에서 일정시간 반응 시킨 다음, 유리필터로 여과하여 여과액을 수집하는 단계를 거친다. 시료를 증류수와 같은 수성용매와 반응시키는 것은 참나무내부에 강하게 결합되어 있는 페루릭산을 포함하는 페놀성 화합물들을 용이하게 분리시키기 위한 것으로, 본 발명에서는 증류수를 사용하였지만 여기에 제한되지 않고 물, 수돗물 같은 다른 수성용매도 사용이 가능하다. 바람직하게는 상기 시료 2g(전건중량)에 증류수를 50 ml 비율로 첨가하여 반응시키는 것이 적절하다.

이러한 시료와 증류수의 반응은 120℃의 오토클레이브에서 30분간 수행하는 것이 증류수로 하여금 참나무 내부에 있는 페놀성 화합물을 분리시키는데 유리하다. 이렇게 상기 시료와 증류수를 반응시킨 후에는 페놀성 화합물을 분리시키기 위한 다음 공정에 들어가기 전에 불순물을 제거하는 과정이 필요하다. 종래와 같이 원심분리기를 이용하여 불순물을 제거하는 것도 본 발명에 의해 제한되는 것은 아니나, 본 발명에서는 불순물을 제거하기 위해 특별히 유리필터(glass filter)를 사용하였으며, 구체적으로는 상기 반응후 2G3 유리필터로 여과해서 여과된 액을 수집하는 단계를 거치었다.

다음으로, 상기 여과액을 농축시킨뒤 상기 농축된 여과액보다 3배 많은 에탄올과 반응시킨후 원심분리하고, 상기 원심분리 상층부에 있는 에탄올 가용부를 수집하여 농축시킴으로써 페놀성 화합물을 분리하는 단계를 거친다. 본 발명에서 에탄올과 반응시킨후 원심분리를 하는 것은 참나무 내부에 포함된 수십가지의 화학성분 중에서도 페루릭산을 비롯한 페놀성 화합물만을 분리하고, 특히 페루릭산과 성질이 유사한 몇가지 성분만을 선별하여 간추리기 위한 것이다.

본 발명에서는 이전 단계에서 수집된 여과액을 특별히 에탄올과 반응시키기 전에 농축시키는 과정을 선행하여 수행하였고, 에탄올과 반응시킨 뒤에도 원심분리를 한번 거친후 재차 농축시키는 과정을 수행하였다. 본 발명에 따른 상기 페놀성 화합물을 분리하는 단계에 있어서, 상기 농축하는 방법은 40~45℃의 온욕조에서 회전진공농축기(Rotary evaporator)를 이용하는 것이 바람직하고, 상기 수집된 여과액을 에탄올과 반응시킨 이후에 농축하는 과정에 있어서는 원심분리 후 상층부에 존재하는 에탄올 가용부만을 선택적으로 농축한 것을 본 발명의 다른 특징으로 하는 것이다.

본 발명에서는 농축된 여과액을 에탄올과 반응시키었지만 여기에 제한되지 않고 알코올류를 비롯한 다른 유기용매를 사용하는 것도 본 발명의 범주에 속할 수 있음은 자명하다. 또한, 상기 농축된 여과액이 반응하는 에탄올의 양은 상기 여과액의 양보다 많은 2배 내지 5배가 바람직하고, 상기 농축된 여과액의 3배로 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 이와 같이, 수집된 여과액을 에탄올과 반응시키기 전, 후로 농축하는 것은 페루릭산을 비롯한 페놀성 화합물만을 순도높게 정제시켜 분리하고자 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 상기 여과액을 농축시킨뒤 상기 농축된 여과액보다 3배 많은 에탄올과 반응시킨후 원심분리하고, 상기 원심분리 상층부에 있는 에탄올 가용부를 수집하여 농축시키는 경우, 페놀성 화합물 중에서도 페루릭산과 성질이 유사한 몇가지 성분만을 선별하여 분리할 수 있는 것이다.

이렇게 페놀성 화합물을 분리하는 단계를 거친 이후에는 상기 분리된 페놀성 화합물을 헥산, 아세트산에틸, 포름산으로 이루어진 혼합용제에 녹인후, 용제 가용부를 실리카겔 컬럼을 이용하여 페루릭산(ferulic acid)이 포함된 분류물로 분취하는 단계를 수행한다. 이렇게 분리된 페놀성 화합물을 혼합용제에 녹이고, 실리카겔 컬럼을 이용하여 분취하는 단계는 페놀성 화합물로부터 구체적으로 페루릭산이 포함된 분류물을 구분하기 위함이다. 상기 실리카겔 컬럼으로 일정한 양의 분류물을 분취함으로써 분리된 페놀성 화합물로부터 페루릭산이 포함된 분류물을 선별할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 분류물 분취 단계에 있어서 분류물로 분취하기 전에 상기 분리된 페놀성 화합물을 헥산, 아세트산에틸, 포름산으로 이루어진 혼합용제에 녹이는 과정을 거친다. 이렇게 혼합용제에 녹인후, 상기 혼합용제에 녹은 용제 가용부만을 분리하여 분류물로 분취하는 것은 본 발명의 또 다른 특징일 수 있다. 상기 혼합용제는 헥산, 아세트산에틸, 포름산의 부피비가 100:50:0.5인 것이 바람직하고, 이는 실리카겔 컬럼을 이용하여 대량으로 분취시키기는데 적절하다. 이와 같이, 상기 분리된 페놀성 화합물을 혼합용제에 녹인후, 용제 가용부만을 실리카겔 컬럼을 이용하여 분류물로 분취하는 단계를 거침으로써, 페놀성 화합물에 포함된 페루릭산을 더욱 정확하게 많은 양을 추출해 낼 수 있는 것이다.

본 발명은 이상에서 서술한 바와 같이, 참나무 시료를 준비하는 단계; 여과액을 수집하는 단계; 페놀성 화합물을 분리하는 단계; 페루릭산이 포함된 분류물로 분취하는 단계를 필수적 구성요소로 하지만, 여기에는 UV 흡광도 또는 Rf값을 이용하여 페루릭산을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 페루릭산이 포함된 분류물(fraction)을 분취하는 단계 이후에 UV 흡광도 또는 Rf값을 이용하여 페루릭산을 확인하는 단계는 분취된 분류물 중 페루릭산이 포함된 분류물을 UV 분광광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 UV 흡광도를 측정하거나 박층크로마토그래피(TLC)를 이용하여 Rf값을 측정함으로써 페루릭산이 포함된 분류물을 확인할 수 있는 것이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명은 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 페루릭산 추출 단계를 거치기 전에, 실제로 참나무에 페루릭산이 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위하여 전처리한 참나무와 참나무 추출물에 존재하는 페놀성 화합물 및 페루릭산 등을 대상으로 수율을 확인하였다.

실험예 1: 참나무 전처리 후 추출물 수율 확인

스팀처리된 참나무 시료에 증류수만을 투입하여 120℃에서 15분, 30분, 60분 반응시켰을 때, 추출물 수율을 아래 표 1 에 나타냈다. 목질원료의 전처리 조건과 추출물 수율 간에는 유의성이 인정되었지만, 반응시간과 추출물 수율 간에는 일정한 경향이 없이 거의 유사한 값을 나타냈다. 스팀처리된 참나무는 반응시간 60분, 반응온도 120℃의 조건에서 207 mg의 최대 추출물 수율을 얻을 수 있었다.

실험예 2: 참나무 추출물에 존재하는 페놀성 화합물 함량

스팀처리된 참나무로부터 증류수를 이용하여 120℃에서 추출했을 때 페놀성 화합물의 수율을 아래 표 2에 나타내었다. 스팀처리된 참나무에서 스팀처리시간과 페놀성 화합물 함량 간에는 유의성이 나타났지만, 반응시간과 페놀성 화합물 함량 간에는 일정한 경향이 나타나지 않았다. 반응온도 120℃, 반응시간 60분의 반응 조건에서 49 mg의 최대 페놀성 화합물를 얻을 수 있었다.

실험예 3: 참나무 추출물에 존재하는 페루릭산 등의 함량

스팀처리된 참나무 시료에 증류수만을 투입하여 120℃에서 반응했을 때, 추출물중에 존재하는 페루릭산 함량을 아래 표 3에 나타내었다. 반응시간과 페루릭산 수율사이에는 일정한 경향이 나타나지 않았다. 표 3에서 나타난 바와 같이 최대의 페놀성 화합물 함량을 얻을 수 있는 반응조건과 페루릭산 수율과는 동일한 경향을 나타내지 않았다. 스팀처리된 참나무는 반응온도 120℃, 반응시간 15분에서 0.6 mg의 페루릭산이 존재하였다.

상기와 같은 실험예 1 내지 실험예 3에서 알 수 있는 바와 같이, 전처리한 참나무와 참나무 추출물에는 페루릭산을 포함하는 페놀성 화합물이 존재함을 확인하였다. 이에 본 발명은 참나무로부터 페루릭산을 추출하기 위한 여러가지 방안을 강구하였으며, 그 결과로써 이하 실시예와 같은 본 발명을 완성하게 된 것이다.

실시예 1: 참나무 시료를 준비하는 단계

먼저, 참나무로부터 시료를 준비하였다. 제재소로부터 구입한 참나무(Quercus mongolica) 각재는 칩퍼(chipper)를 이용하여 칩(chip) 상태(2cm × 3cm × 0.5cm)로 조제한 다음, 고압의 용기 속에 투입하고, 25 kg/cm²의 수증기 압력 하에서 10분간 스팀처리 한 다음, 처리종료 후 시료를 분쇄기로 분쇄하여 20~60 메쉬(mesh) 크기의 시료를 분별 수집하였다.

실시예 2: 여과액을 수집하는 단계

이어서, 실시예 1에서 수집된 참나무 시료와 증류수를 반응시킨 후 유리필터로 여과하여 여과된 액을 수집하였다. 즉, 시료 2g(전건중량기준)을 250 mL 플라스크에 투입하고 증류수 50 mL 를 첨가하여 120℃의 오토클레이브(autoclave)에서 30분간 반응시키고, 반응 후 2G3 유리필터(glass filter)로 여과 한 다음, 여과된 액을 수집하였다.

실시예 3: 페놀성 화합물을 분리하는 단계

이렇게 수집된 여과액을 농축시키고 에탄올과 반응시킴으로써 페놀성 화합물을 분리한다. 실시예 2에서 획득된 여과액은 40℃의 온욕조에서 회전진공농축기 (rotary evaporator)를 이용하여 여과액 총액이 5 mL 될때 까지 농축한다. 농축된 시료를 분액여두에 투입하고 여기에 15 mL(시료의 약 3배 양)의 에탄올을 첨가한후, 충분히 흔들어주고(shaking), 이를 원심분리 튜브에 옮긴 다음, 원심분리를 실시하였다. 이때 원심분리기의 운전조건은 5000 rpm, 25분 이었다. 원심분리 후 상층부(에탄올 가용부)를 수집하고 40℃의 온욕조에서 회전진공농축기를 이용하여 겔(gel) 상이 될 때 까지 농축하여 페놀성 화합물을 획득하였다.

실시예 4: 페루릭산이 포함된 분류물을 분취하는 단계

다음으로, 실시예 3에서 획득된 페놀성 화합물은 혼합용제에 녹여진 후 페루릭산이 포함된 분류물을 분취하는 단계를 거친다. 획득된 페놀성 화합물 시료를 5 mL의 노르말-헥산/아세트산에틸/포름산(n-hexane/ethyl acetate/formic acid)이 100/50/0.5 부피비로 혼합된 용제에 녹인 다음, 용제 가용부를 분리하여 길이 21cm × 직경 3cm의 실리카겔(silica gel 60, Merck) 컬럼에 로딩하여 동일용제를 사용하여 분취하였다. 이때 분취량은 20 mL로 하였다. 분취 후 각 분류물(fraction) 시료는 UV 회전진공농축기(specterophotometer)(U-3000, Hitachi, 일본)를 사용하여 흡광도를 구하였으며, 이때 비색파장은 280nm 및 325 nm로 고정하였다. 분취된 각 분류물의 UV 흡수 특성은 도 1에 나타난 바와 같다. 도 1은 본 발명에 따른 페놀성 화합물의 UV 흡광도 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 도시된 바와 같이, 46개 분류물은 크게 4가지 분류물 집단으로 구분되는 UV 흡광 특성을 나타낸다. 이러한 분류물 집단은 그래프 앞에서 시작되는 순서대로 분류물 집단 I 내지 분류 물 집단 IV로 나타내기로 한다.

이와 동시에 분류물의 일부를 채취하여 40℃ 이하에서 농축한 다음, TLC(Thin layer chromatography)를 실시하여 표준물질과의 Rf값을 산출하였다. 이때 사용된 플레이트(plate)는 가로 2 cm × 세로 4 cm 크기의 실리카겔 (F254 ,Merck, 독일) TLC 플레이트를 사용하였으며, 전개 용매로는 노르말-헥산/아세트산에틸/포름산(n-hexane/ethyl acetate/formic acid)이 100/50/0.5 부피비로 혼합된 용매를 사용하였다. 물질 전개 후 플레이트는 UV 방출기를 사용하여 365nm에서 물질을 확인하고 Rf값을 산출하였다.

이때 확인된 페놀성 화합물(바닐린, 바닐린산, 페루릭산, 시나믹산) 표준품의 Rf 값은 도 2와 하기의 표 4에 나타난 바와 같다. 도 2는 종래의 일반적인 페놀성 화합물(바닐린, 바닐린산, 페루릭산, 시나믹산) 표준품에 대한 박층크로마토그래피(TLC) 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 "Mixed"는 상기 확인된 페놀성 화합물(Vnillin+cinnamic acid+vanillic acid+ ferulic acid) 표준품을 나타내고, "FA"는페루릭산(Ferulic acid), "V"는 바닐린(Vanillin), "VA"는 바닐린산(Vanillic acid), "CA"는 시나믹산(Cinnamic acid)을 의미하는 것이다. 도 2에 나타난 크로마토그래피의 결과를 하기 표 4에서 정리하여 나타내었다.

[표 4: 페놀성 화합물의 Rf값]

Compound	R_f
바닐린(Vanillin)	0.43
시나믹산(Cinnamic acid)	0.39
바닐리산(Vanillic acid)	0.31
페루릭산(Ferulic acid)	0.27

상술한 바와 같은 UV 흡광도 측정에 의해 구분된 분류물 집단 I 내지 분류물 집단 IV에 대해서 TLC(Thin Layer Chromatography)를 실시하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3은 본 발명에 따른 페놀성 화합물의 UV 흡광도 측정 결과에 따른 각 분류물 집단의 TLC 결과를 나타내는 사진이다. 도 3에서 "Stn"는 본 발명에 따라 바닐린, 바닐린산, 페루릭산, 시나믹산이 혼합된 페놀성 화합물(Vnillin+cinnamic acid+vanillic acid+ ferulic acid)을 나타내고, "I"은 분류물 집단 I, "II"는 분류물 집단 II, "III"는 분류물 집단 III를 의미한다.

따라서, 도 3에 나타나 있는 "Stn"을 기준으로 각 분류물 집단의 결과를 도 2와 비교해 보면 본 발명에 따른 분류물 집단 I 내지 분류물 집단 IV에 포함된 화학적 성분을 분석할 수 있다. 최종적으로 UV 흡광도와 Rf값을 기초로 하여 페루릭산이 함유된 분류물을 분리 확인 하였다. 즉, 도 3의 분류물 집단 I은 가장 멀리까지 이동한 것으로 바닐린을 포함하고(도 2의 V), 분류물 집단 II에는 멀리, 그리고 중간 까지 이동한 것으로 보아 바닐린산과 시나믹산을 포함하며(도 2의 VA, CA), 분류물 집단 III은 가장 적게 이동한 것으로 페루릭산을 포함하고(도 2의 FA) 있음을 알 수 있다.

실시예 5: 페루릭산 분류물 확인

페루릭산이 함유된 분류물을 분리한 후에는 페루릭산의 정확한 분리 및 순수 확인을 위하여 HPLC(고속액체크로마토그래피)를 사용하여 페루릭산 분류물을 분석하였다. HPLC 시스템은 Gilson사의 operating system, UV 3000검출기 및 unipoine software를 사용하였다. 분석컬럼은 TSK gel ODS-80 (4.6 mm × 250 mm, Tosho)을 사용하였다. 분석시료는 시료주입기를 이용하여 10㎕를 주입하였다. 이동상은 acetic acid/water(5/95, v/v) 혼합액을 이동상 A, 메탄올을 이동상 B로 사용하여 유속 0.8 ㎖/min로 하였으며, 검출기의 파장은 280 nm로 하였다.

도 4는 종래의 일반적인 바닐린, 바닐린산, 페루릭산 및 시나믹산의 혼합물질에 대한 HPLC(High Performance Liquid Chromatograph) 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 여기서, "1"은 바닐린, "2"는 바닐린산, "3"은 페루릭산, "4"는 시나믹산의 HPLC 분석 모델이다. 바닐린, 바닐린산, 페루릭산 및 시나믹산의 혼합물질에 대한 HPLC 분석의 경우 바닐린(vanillin)은 20.59분, 바닐린산(vanillic acid)은 22.37분, 페루릭산(ferulic acid)은 24.32분, 시나믹산(cinnamic acid)은 28.93분에 나타났으며, 본 발명에 따른 페놀성 화합물에 대해서도 이와 동일성 있는 결과를 나타내었음을 확인하였다.

도 1에 제시된 각 분류물 집단은 각 성분의 동정 및 정량 분석을 위해 HPLC로 분석하였으며, 그 분석결과는 하기 표 5에 나타내었다.

표 5의 결과로부터 분류물 집단 III은 페루릭산만이 존재하는 분류물 임을 확인할 수 있다. 또한, 참나무 1g 으로부터 본 발명에 따른 추출방법으로 분리, 정제 할 수 있는 페루릭산은 0.217mg 인 것으로 확인되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 참나무로부터 페루릭산을 추출하기 위하여, 참나무 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 증류수를 첨가한 다음 유리필터로 여과하여 여과액을 수집하는 단계; 상기 여과액을 농축시킨뒤 상기 농축된 여과액보다 3배 많은 에탄올과 반응시킨후 원심분리하고, 상기 원심분리 상층부에 있는 에탄올 가용부를 수집하여 농축시킴으로써 페놀성 화합물을 분리하는 단계; 상기 분리된 페놀성 화합물을 헥산, 아세트산에틸, 포름산으로 이루어진 혼합용제에 녹인후, 용 제 가용부를 실리카겔 컬럼을 이용하여 페루릭산(ferulic acid)이 포함된 분류물로 분취하는 단계;를 포함하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법을 제공하였다.

이와 같은 본 발명에 따라 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 경우, 일반적인 곡물류가 아닌 참나무 목재로부터 페루릭산을 추출할 수 있고, 종래의 페루릭산 추출방법, 특히 곡류외피 또는 전곡립 또는 발아된 곡류를 압출해서 가수분해로 페루릭산을 추출하는 것보다 현저하게 많은 양의 페루릭산을 용이하게 얻을 수 있는 효과가 있는 것이다.

Claims

참나무 시료를 준비하는 단계;

상기 시료에 증류수를 첨가한 다음 유리필터로 여과하여 여과액을 수집하는 단계;

상기 여과액을 농축시킨뒤 상기 농축된 여과액보다 3배 많은 에탄올과 반응시킨후 원심분리하고, 상기 원심분리 상층부에 있는 에탄올 가용부를 수집하여 농축시킴으로써 페놀성 화합물을 분리하는 단계;

상기 분리된 페놀성 화합물을 헥산, 아세트산에틸, 포름산으로 이루어진 혼합용제에 녹인후, 용제 가용부를 실리카겔 컬럼을 이용하여 페루릭산(ferulic acid)이 포함된 분류물로 분취하는 단계;를 포함하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 참나무 시료를 준비하는 단계는 참나무를 칩(chip) 상태로 조제하고 고압의 용기에서 스팀처리 한 후, 20~60 메쉬(mesh) 크기로 분쇄하여 시료를 준비하는 것을 특징으로 하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 여과액을 수집하는 단계는 상기 시료 2g(전건중량)에 증류수를 50 ml 비율로 첨가하는 것을 특징으로 하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 페놀성 화합물을 분리하는 단계는 상기 농축하는 방법이 40~45℃의 온욕조에서 회전진공농축기(Rotary evaporator)를 이용하는 것을 특징으로 하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 페루릭산이 포함된 분류물을 분취하는 단계는 상기 혼합용제의 헥산, 아세트산에틸, 포름산의 부피비가 100:50:0.5인 것을 특징으로 하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페루릭산이 포함된 분류물(fraction)을 분취하는 단계 이후에 UV 흡광도 또는 Rf값을 이용하여 페루릭산을 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 참나무로부터 페루릭산을 추출하는 방법.