KR100667143B1 - 가용성 측쇄 에스테르와 효소 아실라제를 사용하는 β-락탐 항균 물질의 합성법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소 아실라제의 존재하에서 가용성 측쇄 에스테르를 사용하여 β-락탐 항균 물질을 합성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 있어 반응물로서 유용한 신규 에스테르에 관한 것이다.

Description

가용성 측쇄 에스테르와 효소 아실라제를 사용하는 β-락탐 항균 물질의 합성법{Synthesis of B-Lactam Antibacterials Using Soluble Side Chain Esters and Enzyme Acylase}
본 출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 인용되는, 1996년 7월 26자로 출원된 미국 가출원 제60/022,622호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 효소인 아실라제와, 아실원으로서의 가용성 에스테르의 존재하에서 항균성 β-락탐, 즉 페니실린(penicillin) 및 세팔로스포린(cephalosporin)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 반응물로서 유용한 신규 에스테르에 관한 것이다.
일본 특허 출원 공개 제47-25388호, 제47-29588호, 제48-26985호, 제48-35090호, 제48-99393호, 제49-14687호, 제49-36890호, 제49-48892호, 제49-75787호, 제49-134893호 및 제52-110896호에는, 도입될 아실 잔기의 메틸 또는 에틸 에스테르를 6-아미노페니실란산 또는 7-아미노세팔로스포란산 또는 그의 유도체와 반응시킴으로써 페니실린 또는 세팔로스포린을 제조하는 방법을 교시하고 있다. 이러한 문헌에서의 아실원은 저급 알킬 에스테르, 특히 메틸 에스테르이다. 1982년 7월 20일에 허여된 콘도(Eiji Kondo) 등의 미국 특허 제4,340,672호에는, 페니실린 또는 세팔로스포린 핵 아민 및 아실원으로서의 하기 화학식 I의 에스테르에 아실라제를 작용시킴으로써, 항균성 β-락탐, 즉 페니실린 및 세팔로스포린을 제조하는 방법을 개시하고 있다.
Figure 111999502702646-pct00001
(상기 식 중에서, RCO는 페니실린 또는 세팔로스포린의 측쇄 아실기이고, X는 수소 원자, 저급 알킬기 또는 히드록시 저급 알킬기이고, Y는 수소 원자 또는 저급 알킬기이고, n은 1 내지 20의 정수이다). 상기 방법은 저용해도를 갖는 공지의 아실원, 예를 들어 메틸 에스테르와 비교하여 물과 용이하게 혼화되는 (폴리)에틸렌글리콜 에스테르를 아실원으로서 사용한다.
노보 노르디스크 (Novo Nordisk)사에 양도된, 1992년 1월 23자로 공개된 국제 특허 공개 제92/01061호는 아미드 함유 모 아미노 β-락탐의, 아실화제로서 효소에 의한 아실화에 의해 β-락탐 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 페니실린 또는 세팔로스포린 핵 아민 및 아실원으로서 하기 화학식 II의 에스테르에 대한 아실라제의 작용에 의한, 항균성 β-락탐, 즉 페니실린 및 세팔로스포린의 신규 제조 방법을 제공한다.
Figure 111999502702646-pct00002
(상기 식 중에서, RCO는 페니실린 또는 세팔로스포린 측쇄 아실기이고, R'은 H이거 나, CH2X 또는 CHXY이고, R"는 H이거나, CH2Y 또는 CHXY이고, X 및 Y는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 저급 알킬 또는 히드록시-저급 알킬이다).
본 명세서에 사용한 바의 RCO로 표시되는 아실기는, 명백하게 또는 문맥 전후에 달리 표기하지 않는 한, 천연 또는 합성 페니실린 또는 세팔로스포린의 아실기이다. 저급 알킬은 탄소원자수 1 내지 4의 알킬을 포함한다.
본 발명의 한 측면은, 화학식 II의 에스테르를, 수성 매질 중에서 아실라제의 존재하에, 화학식 III의 아미노아제티디논 카르복실산과 반응시킴으로써 화학식 IV의 β-락탐 항균 물질을 제조하는, β-락탐 항균 물질의 제조 방법을 제공한다.
Figure 111999502702646-pct00010
상기 반응식 중에서, RCO는 아실기이고, NH2-Q는 아미노원이고, 아실라제는 세균 또는 진균 유래의 효소이거나 재조합법으로 수득된 것이다. 치환체 R' 및 R"은 상기 정의한 바와 같다. 아실기 RCO는 직쇄, 분지쇄, 시클릭 또는 일부 시클릭 저급 알카노일 또는 저급 알케노일; 모노시클릭 저급 아르알카노일, 모노시클릭 아릴옥시저급 알카노일, (O, N 또는 S)-헤테로시클릭-저급 알카노일, (O, N 또는 S)-헤테로시클릭 티오-저급 알카노일, 시아노아세틸, 시아노메틸-티오아세틸, 모노시클릭 아릴글리실, 모노시클릭 시클로알케닐글리실, 모노시클릭아릴글리콜릴, N-아실-아릴글리실, 모노시클릭아릴말로닐 또는 아릴술포알카노일일 수 있으며, 상기 모두가 치환체로서 저급 알킬, 아미노메틸, 할로겐, 히드록시, 저급 알카노일옥시 또는 저급 알콕시를 임의로 가질 수 있고, 바람직하게는 탄소원자수 1 내지 15이다.
바람직한 RCO기는 세팔렉신(cephalexin) 및 아목시실린(amoxicillin)과 같은 항균 물질의 측쇄로 잘 알려진 D-페닐글리실 및 4-히드록시-D-페닐글리실이다.
아미노원 NH2-Q는 공지된 세팔로스포린 또는 페니실린 항균 물질의 7-아미노기 또는 6-아미노기 상의 치환체를 말하고, Q는 화학식 VI
Figure 111999502702646-pct00011
(여기서, Z는 수소, 할로겐, 탄소원자 1 내지 3의 저급 알킬, 탄소원자 1 내지 3의 할로알킬, 탄소원자 2 내지 4의 알케닐, 친핵기, 또는 친핵기로 치환된 탄소 원자 1 내지 3의 저급 알킬임)을 갖는다. 할로겐 원자는 염소, 브롬 또는 요오드이고, 대표적인 친핵기는 일본 특허 출원 공개 제49-81381호에 개시되어 있다.
효소 아실라제는 식물, 동물, 진균 또는 세균으로부터 유래하거나 재조합법으로 얻을 수 있다. 세균 또는 진균의 아실라제가 생산성, 효능, 비용 및 안정성에 관한 한, 특히 중요하다.
아실라제원으로의 대표적인 세균 또는 진균은, 예를 들면 아세토박터속 (Acetobacter), 아크로모박터속(Achromobacter), 에로모나스속(Aeromonas), 알칼리제니즈속(Alkaligenes), 아르트로박터속(Arthrobacter), 브레비박테륨속 (Brevibacterium), 베넥케아속(Beneckea), 바실러스속(Bacillus), 코리네박테륨속 (Corynebacterium), 에쉐리키아속(Escherichia), 플라보박테륨속(Flavobacterium), 글루코노박터속(Gluconobacter), 클리베라속(Kluyvera), 마이크로박테륨속 (Microbacterium), 마이크로코커스속(Micrococcus), 노카르디아속(Nocardia), 프로테우스속(Proteus), 슈도모나스속(Pseudomonas), 로돕슈도모나스속 (Rhodopseudomonas), 스피릴룸속(Spirillum), 스타필로코커스속(Staphylococcus), 잔토모나스속(Xanthomonas), 아파노클라듐속(Aphanocladium) 또는 세팔로스포륨속 (Cephalosporium)에 속하는 미생물주, 또는 본 발명의 반응을 위한 아실라제를 생성할 수 있는 천연 또는 인공 돌연변이 균주 또는 그의 변이균을 포함한다. 이러한 균주는, 예를 들면, 문헌 [Advances in Applied Microbiology, Volume 20, 217 쪽 (1976)]에 기재된 것, 또는 본 발명의 반응에 쓸 수 있는 그의 천연 또는 인공 돌연변이 균주를 포함한다. 특히 유용한 효소는 이. 콜라이(Escherichia coli)로부터 당 업계에 공지된 방법으로 얻을 수 있는 페니실린 G 아미다제이다. 이는 또한 당 업계에 공지된 방법에 의한 tac 프로모터와 함께 페니실린 G 아미다제 유전자를 함유하는 재조합 이. 콜라이를 사용하여 얻을 수 있다. 제조 공정에 적합한 다량의 효소를 사용할 수 있으므로, 이 방법이 바람직하다.
화학식 III의 아미노아제티디논 카르복실산은 나트륨, 리튬 및 칼륨과 같은 수용성 알칼리 금속염, 또는 메탄술포닐에틸 에스테르 또는 아세토닐 에스테르와 같은 에스테르로서 사용될 수 있다. 화학식 III의 아미노아제티디논 및 그의 염 또는 에스테르는 공지된 화합물이며, 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
화학식 II의 에스테르는 공지된 방법, 즉, 화학식 V
Figure 111999502702646-pct00012
(여기서, RCO, R' 및 R"은 상기 정의한 바와 같음)의 디올 또는 트리올 또는 폴리올과 산 RCOOH의 반응으로 제조할 수 있다. 에스테르화 반응은 산 촉매 조건 하에서 탈수에 의한 또는 산 할라이드에 의한 또는 에스테르 교환 반응으로 인한 것일 수 있다. RCOOH 및 디올, 트리올 또는 폴리올은 공지된 화합물이거나 또는 당 업계에 공지된 방법으로 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로는 에스테르 R-COO-CH2-CH2-OH (여기서, R은 D-페닐글리실 또는 4-히드록시-D-페닐글리실임)을 제공한다. 이러한 에스테르는 최종 생성물을 90 % 이상의 수율로 제공하므로 본 발명의 방법에 있어서 신규하며 중요한 반응물이다. 이러한 에스테르는 공지된 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 바람직한 실시 형태는 하기 화학식 VII의 페니실린 또는 세팔로스포린 아민 및 화학식 VIII의 에스테르에 대한 페니실린 G 아미다제의 작용에 의한, 항균성 β-락탐, 즉, 세프로질(cefprozil), 세파드록실(cefadroxil) 및 아목시실린(amoxicillin)의 제조 방법이다.
Figure 111999502702646-pct00006
[여기서, Z는 (7-ADCA 중의) 메틸 또는 (세프로질 핵인 7-PACA 중의) 1-프로페닐임]
R-COO-CH2-CH2-OH
(여기서, R은 4-히드록시-D-페닐글리실임).
화학식 VII의 페니실린 또는 세팔로스포린 아민은 공지된 화합물이고 당 업계에 공지된 방법으로 얻을 수 있다. 화학식 VIII의 에스테르는 에틸렌 글리콜과 RCOOH (여기서, R은 상기 정의한 바와 같음)을 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 화합물 RCOOH 및 에틸렌 글리콜은 시판되고 있다.
본 발명의 방법은 에스테르, 세팔로스포린 또는 페니실린 아민 및 효소를 함유하는 용액을 완충제 없이 실온에서 제조함으로써 수행할 수 있다. 이 용액은 물에 에스테르를 용해시키고 pH가 7.5에 도달할 때 까지 수산화 암모늄을 첨가함으로써 제조한다. 그 다음, 페니실린 또는 세팔로스포린 아민을 에스테르 용액에 첨가하고, 수산화 암모늄으로 pH를 다시 7.5로 조정한다. 그 다음, 이 혼합물을 5 내지 15 ℃로 냉각시키고, 고체 효소를 첨가한다. 이 시간 동안, pH는 약 0.6 유닛이 강하하여 7.5에서 유지되지 못한다. 그 다음, 이 반응 혼합물을, 예를 들면, C18 역상 칼럼 (5㎝×4.6㎜, 5㎛ 스페로솔브 ODS2) 상에서, 고압 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 최종 생성물을 90 내지 99 %의 수율로 얻었다.
본 발명의 방법은 최종 항균성 β-락탐을 보통 90 % 이상, 때때로 95 % 이상으로, 가끔씩은 99 % 이상의 수율로 제공한다. 메틸과 같은 단순한 알킬 에스테르에 의해 얻어지는 수율은 통상적으로 70 내지 90 % 범위이다. 본 발명의 방법으로 최종 항균 물질이 고수율로 얻어지기 때문에, 이 방법은 페니실린 또는 세팔로스포린 항균 물질의 제조에 매우 유용하다.
통상적인 반응 혼합물은 화학식 VIII의 아실원 5 내지 35 % (바람직하게는 8 내지 12 %) 및 화학식 VII의 아미노원 2 내지 20 % (바람직하게는 2 내지 5 %)를 함유한다. 효소는 가용성 또는 불용성 형태로 존재할 수 있으나, 바람직하게는, 효소는 불용성 고정 제제의 형태로 존재한다. 이 제제는 효소의 안정성 향상과 항생 물질의 분리에 있어 첫 번째 단계로서, 고정된 효소를 반응 혼합물로부터 상대적으로 제거하기가 용이하다는 등의 장점을 갖는다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하는 것이며, 어떤 식으로든 이에 국한되는 것은 아니다.
<실시예 1>
효소로서의 고정된 재조합 페니실린 G 아미다제 및 산 촉매 반응에 의해 제조된 아실원으로서의 4-히드록시-D-페닐글리신의 히드록시에틸 에스테르를 사용한, 화학식 VII의 화합물로부터 세프로질의 합성
4-히드록시-D-페닐글리신 (10 g), 에틸렌 글리콜 (15 ㎖) 및 농황산 (5 ㎖)의혼합물을 무수 상태하 55 ℃에서 18 시간 동안 교반하였다. 이 용액을 냉각시킨 다음, 얼음 (10 g)을 첨가하고, 10N-NH4OH (4.5 ㎖)로 pH를 1.0으로 맞추어 히드록시에틸 에스테르 용액 40 ㎖를 얻었다.
에스테르 10 %, 화학식 VII의 화합물 4 %, 및 효소 8 % (효소 32 IU/㎖와 동등량)의 효소 혼합물 20 ㎖를 하기와 같이 완충제 없이 제조하였다.
상기 제조한 에스테르 용액 (6.9 ㎖)를 물 (2 ㎖)와 혼합하고, 10N NH4OH로 pH를 7.5로 조정하였다. 그 다음, 화학식 VII의 화합물 (0.8 g)을 첨가하고, 1N NH4OH로 pH를 7.5에 맞추고 부피를 18.4 ㎖로 만들었다. 그 다음, 이 혼합물을 5 내지 15 ℃로 냉각시키고, 고체 효소 (1.6 g, 640 IU)를 첨가하였다. pH는 반응 중에 7.5에서 유지되지 않았고, 약 0.6 유닛이 강하하였다. 반응 혼합물을 C18 역상 칼럼 (5㎝×4.6㎜, 5㎛ 스페로솔브 ODS2) 상에서 HPLC로 분석하였다. 이동상은 2 ㎖/분의 10 % 아세토니트릴/0.3 % H3PO4이었고 215 ㎚에서 검출하였다. 세프로질의 이성질체는 2.9 분에 (시스) 및 5.1 분에 (트랜스) 나타났다. 최종 생성물을 92 내지 96 %의 최고 수율로 수득하였다. 전체 실험은 25 내지 50분에 완결되었다.
<실시예 2>
효소로서의 고정된 재조합 페니실린 G 아미다제 및 아실원으로서의 4-히드록시-D-페닐글리신의 정제된 히드록시에틸 에스테르를 사용한, 화학식 VII의 화합물로부터 세프로질의 합성
정제된 에스테르를 브로모에탄올과 4-히드록시-D-페닐글리신의 단(Dane)염 반응으로 제조하여, 순수한 결정성 히드로클로라이드염으로서 얻었다.
에스테르 12.5 %, 화학식 VII의 화합물 4 %, 및 효소 8 % (효소 24 IU/㎖와 동등량)의 반응 혼합물 20 ㎖를 하기와 같이 제조하였다.
상기와 같이 제조한 정제된 에스테르 (2.5 g)을 물 (9 ㎖)와 혼합하고, 농 NH4OH로 pH를 8.0로 조정하여 용액을 얻었다. 화학식 VII의 화합물 (0.8 g)을 용액에 첨가하고, 용액의 pH를 2M-H2SO4로 6.76으로 조정하고 부피를 18.4 ㎖로 만들었 다. 그 다음, 이 용액을 15 ℃로 냉각시키고, 고체 효소 (1.6 g, 480 IU)를 첨가하였다. pH는 반응 중에 유지되지 않았고 약 0.6 유닛이 강하하였다. 최종 생성물을 99 %의 최고 수율로 수득하였다. 비반응한 화학식 VII의 화합물의 영역 %는 0.7 %로 강하하였다. 이 실험은 25분에 완결되었다.
<실시예 3>
효소로서의 뵈링거 (Boehringer) 페니실린 G 아미다제 및 산 촉매 반응에 의해 제조된 아실원으로서의 4-히드록시-D-페닐글리신의 히드록시에틸 에스테르를 사용한, 7-ADCA로부터 세파드록실의 합성
실시예 1에서와 같이 에스테르를 제조하였다. 15 ℃에서 1.6 g의 뵈링거 효소를 사용하는 것을 제외하고 실시예 1과 같이 실험을 반복하였다. 이동상으로서 10 % 아세토니트릴/1% NH4H2PO4를 1.3 ㎖/분으로 이동시켜 280 ㎚에서 검출하고, 머크 (Merck) 칼럼, 250-4, 리크로솝 (LiChrosorb) RP-18 (10 ㎛) 상에서 HPLC로 이 반응 혼합물을 분석하였다. 최종 생성물을 95 %에 이르는 최고 수율로 수득하였다. 이 실험은 35분에 완결되었다.
<실시예 4>
효소로서의 뵈링거 페니실린 G 아미다제 및 산 촉매 반응에 의해 제조된 아실원으로서의 4-히드록시-D-페닐글리신의 히드록시에틸 에스테르를 사용한, 6-APA로부터 아목시실린의 합성
에스테르 12 %, 6-APA 3 %, 및 효소 8 %를 함유하는 혼합물 20 ㎖의 부피를 하기와 같이 제조하였다.
에스테르의 용액 (실시예 1과 같이 제조함, 8.3 ㎖)을 물 (2 ㎖)와 혼합하고, 10N-NH4OH로 pH를 7.5로 조정하였다. 그 다음, 화합물 6-APA (0.6 g)을 용액에 첨가하고, pH를 1N 수산화 암모늄으로 7.0에 가깝게 조정하고 부피를 18.4 ㎖로 만들었다. 그 다음, 이 용액을 20 ℃로 냉각시키고, 뵈링거 효소 (1.6 g)을 첨가하였다. 이 용액을 C18 역상 칼럼 (5㎝×4.6㎜, 5㎛ 스페로솔브 ODS2) 상에서 HPLC로 분석하였다. 이동상은 2.5 % 아세토니트릴/0.025M NaH2PO4이었고 H3PO4로 pH 3.5로 조정하였고 1 ㎖/분으로 이동시켜 215 ㎚에서 검출하였다. 최종 생성물을 160분에 90 내지 95 %의 수율로 수득하였다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 효소인 페니실린 G 아미다제의 존재하에서, 하기 화학식 VII의 화합물을 화학식 VIII의 에스테르와 반응시켜 세프로질(cefprozil), 세파드록실(cefadroxil) 또는 아목시실린(amoxicillin)을 제조하는 것을 포함하는, 세프로질, 세파드록실 또는 아목시실린의 제조 방법.
    <화학식 VII>
    Figure 112006078610855-pct00009
    (여기서, Z는 메틸 또는 1-프로페닐기임)
    <화학식 VIII>
    R-COO-CH2-CH2-OH
    (여기서, R은 4-히드록시-D-페닐글리실임)
  5. 제4항에 있어서, 효소가 고정된 재조합 페니실린 G 아미다제인 방법.
  6. 화학식 R-COO-CH2-CH2-OH (여기서, R이 D-페닐글리실 또는 4-히드록시-D-페닐글리실임)의 화합물.
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