KR100654329B1

KR100654329B1 - 생리 활성 물질이 결합된 조직 재생용 다공성 생분해성고분자 지지체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100654329B1
Application number: KR1020050116036A
Authority: KR
Inventors: 한동근; 안광덕; 정현정
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2006-12-08

Abstract

본 발명은 세포 친화성을 증가시킬 수 있는 리간드 펩타이드 또는 성장 인자 등의 생리 활성 물질이 결합된 조직 재생용 다공성 고분자 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조직 재생용 다공성 고분자 지지체의 제조 방법은 생분해성 고분자, 탄산염 및 유기산으로 이루어진 비등 혼합물과 용매로부터 고분자 시편을 얻는 단계, 상기 고분자 시편을 물과 알콜 혼합 수용액에 넣고 발포시켜 다공성 고분자 지지체를 제조하는 단계, 플라즈마 처리를 이용하여 아크릴산 결합으로 표면을 친수화하는 단계 및 세포 친화성을 증가시키기 위한 리간드 펩타이드 또는 성장 인자를 결합시켜 고기능성의 다공성 고분자 지지체를 얻는 단계를 포함한다.

조직 공학, 고분자 지지체, 비등 혼합물, 세포 친화성, 다공성, 생분해성, 생리 활성 물질

Description

생리 활성 물질이 결합된 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체 및 이의 제조방법{BIODEGRADABLE POROUS POLYMER SCAFFOLDS COUPLED WITH BIOACTIVE MATERIALS FOR TISSUE REGENERATION AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 생리 활성 물질이 결합된 조직 재생용 다공성 고분자 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

조직 공학(tissue engineering)은 과학의 발달과 함께 등장한 새로운 분야의 하나로서, 생명과학, 공학, 의학 등의 기본 개념과 과학 기술을 통합 응용하는 다학제간 학문이며, 생체 조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 나아가 손상된 조직이나 장기를 정상 조직으로 대체하거나 재생시키기 위하여 체내에 이식이 가능한 인공 조직을 만들어 인체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 응용 학문이다.

대표적인 조직 공학 기법을 요약하면 다음과 같다. 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고, 그 조직편으로부터 세포를 분리한 다음, 분리된 세포를 배양하여 필요한 양만큼 증식시키고, 이를 다공성 생분해성 고분자 지지체에 심어 일정 기간 동안 체외 배양하여 하이브리드형 세포/고분자 구조물을 얻고, 이를 다시 인체 내 에 이식한다. 이식 후 세포들은 대부분의 조직이나 장기의 경우 신생 혈관이 형성되기 이전에는 체액의 확산에 의하여 산소와 영양분을 공급받다가 인체 내에 혈관이 자라서 들어와 혈액의 공급이 이루어지면 세포들이 증식, 분화하여 새로운 조직 및 장기를 형성하고, 고분자 지지체는 그동안 분해되어 없어지게 되는 기법을 응용하는 것이다.

따라서, 이러한 조직 공학 연구를 위해서는 생체 조직과 유사한 생분해성 고분자 지지체를 제조하는 일이 중요하다. 인체 조직의 재생을 위해 사용되는 지지체 재료는 조직 세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 충분히 세포 친화성이어야 하고, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 중간 장벽으로서의 역할도 할 수 있어야 한다. 이는 무독성, 즉 이식 후 혈액 응고나 염증 반응이 일어나지 않는 생체 적합성을 가져야 한다는 점을 의미한다.

또한, 이식된 세포가 조직으로서 충분한 제 기능과 역할을 한 이후에, 원하는 시간이 지나면 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성도 역시 지녀야 한다. 현재 널리 사용되고 있는 생분해성 고분자로는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르 및 이들의 공중합체 등이 있다. 그러나, 현재까지는 PGA, PLA, PLGA 등만이 미국 식품의약청(FDA)으로부터 인체에 대하여 사용 가능한 생분해성 고분자로 승인되어 인체 조직의 체내 재생을 위한 다공성 고분자 지지체 재료로서 사용되고 있다.

또한, 최근 여러 연구자들에 의해서 고분자를 표면 개질을 통하여 세포 친화 성을 향상시키는 여러 방법들이 시도되고 있는데, 대표적인 방법으로는, 예를 들면, 고분자 디스크를 열분해시켜서 펩타이드를 고정하는 방법 (M. Gumuderelioglu 등, Biomaterials, 23, 3927, 2002), 고분자 마이크로스피어(microsphere)를 표면 활성화시킨 후 효소를 고정화하는 방법 (N. Hasirci 등, Biotech., 60, 37, 1998), 고분자 필름을 수산화나트륨 용액 내에서 활성화한 후 펩타이드를 고정하는 방법 (T. Yamaoka 등, Int. Biol. Macromol., 25, 265, 1999), 성장 인자를 이용하여 세포를 활성화하는 방법 (T. Motoki 등, Cell and Tissue Research, 285, 205, 1996) 등이 있다.

그러나, 상기 방법들은 지지체 표면 기공의 막힘 현상이 야기되고, 제조 과정이 복잡한 편이며, 고분자 열분해 등을 통하여 표면을 개질할 때 분자량이 낮은 고분자의 경우 다공성 지지체의 형태가 변하기도 한다. 또한, 이러한 방법으로 제조되는 다공성 지지체는 세포의 증식이나 분화를 유도할 수 있는 기능이 거의 없어서 조직 재생시 세포 친화성이 떨어지는 단점을 가지고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 기공 크기의 조절이 용이하면서도 다공도가 높고, 기공간 개방(open) 구조를 가지며, 그 표면에 세포의 증식이나 분화를 유도할 수 있는 생리 활성 물질을 결합시켜 세포 친화성을 향상시킨 다공성 고분자 지지체 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 상기 목적을 달성하기 위하여 일정 범위의 기공 크기, 높은 단위 부피당 표면적 및 높은 다공도를 가지며, 친수성 단량체로 표면 개질되어 있고, 표면에 생리 활성 물질이 결합된, 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체 및 그 제조 방법이 제공된다.

따라서, 본 발명의 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체는

(a) 5 ㎛ 내지 500 ㎛의 기공의 크기, 10 ~ 20 cm³/g의 단위 부피당 표면적 및 85 ~ 98%의 다공도를 가지며, 친수성 단량체로 표면 개질된 다공성 생분해성 고분자 지지체 및

(b) 상기 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 다공성 생분해성 고분자 지지체 1 g에 대하여 0.04~6 나노몰(nmol)의 양으로 결합되어 있는 생리 활성 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 생분해성 고분자로는 생체 내에서 분해될 수 있는 무독성 고분자라면 모두 사용 가능한데, 예를 들면 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 및 이들의 유도체 및 공중합체 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 미국 식품의약청(FDA)으로부터 인체에 사용 가능한 생분해성 고분자로 승인되어 사용되고 있는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산(PLGA) 공중합체 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 생분해성 고분자는 중량 평균 분자량이 5,000 내지 2,000,000, 보다 바람직하게는 10,000 내지 700,000 범위인 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면 개질에 사용되는 친수성 단량체로는 아크릴산 (acrylic acid), 말레산 (maleic acid), 이타코닉산 (itaconic acid), 아코니틱산 (aconitic acid) 등과 같이 말단기에 불포화기를 갖는 카르복실산 및 이들 혼합물을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 결합되어 있는 생리 활성 물질은 세포 친화성 리간드 펩타이드 또는 생체 내에서 특정 세포로의 분화를 유도하는 성장 인자이다.

상기 세포 친화성 리간드 펩타이드로는 Arg-Gly-Asp (RGD), Arg-Glu-Asp-Val (REDV), Leu-Asp-Val (LDV), Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR), Pro-Asp-Ser-Gly-Arg (PDSGR), Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), Arg-Asn-Ile-Ala-Glu-Ile-Ile-Lys-Asp-Ala (RNIAEIIKDA) 등이 사용될 수 있다. 이들 중에서 RGD와 PDSGR은 거의 모든 세포에 대한 점착성을 향상시키며, REDV와 LDV는 혈관 내피 세포의 증식을, YIGSR은 혈관 세포의 증식을, IKVAV와 RNIAEIIKDA는 신경 세포의 증식을 각각 증가시킨다.

상기 성장 인자의 예로는 변이성 성장 인자 (TGF-β), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 표피 성장 인자 (EGF), 신경 세포 성장 인자 (NGF), 혈관내피세포 성장 인자 (VEGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 혈소판유래 성장 인자 (PDGF) 등을 들 수 있다.

다음으로는 본 발명에 따른 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법에 대하여 설명한다.

본 발명에 따른 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법은

(1) 생분해성 고분자, 비등 혼합물 및 적합한 용매를 사용하여 고분자 시편을 얻는 단계,

(2) 상기 단계 (1)에서 얻어지는 고분자 시편을 알콜 수용액 중에서 발포시켜 건조시켜 다공성 생분해성 고분자 지지체를 생성시키는 단계,

(3) 단계 (2)에서 얻어지는 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면을 카르복실기를 갖는 친수성 단량체로 개질하는 단계,

(4) 단계 (3)에서 얻어지는 표면 개질된 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 생리 활성 물질을 결합시키는 단계를 포함한다.

상기 단계 (1)에서는 생분해성 고분자를 적당한 용매에 용해시켜 얻어지는 고분자 용액에 비등 혼합물을 비등 혼합물/고분자가 중량비로 5/1 - 20/1이 되는 비율로 첨가하고, 균일하게 혼합한 다음, -196℃ 내지 상온의 온도에서 방치하여 용매가 증발되도록 함으로써 디스크 형태의 고분자 시편을 얻는다.

상기 단계 (1)에서 고분자 용액을 제조함에 있어서 용매로는 생분해성 고분자를 용해시키는 용매를 단독으로 사용하거나, 또는 생분해성 고분자를 용해시키는 적당한 용매와 고분자는 용해시키지 않으나 상기 용매와는 섞이는 비용매를 혼합하여 용매/비용매 혼합 용액을 사용할 수 있다. 상기 용매로는 고분자의 종류에 따라 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤, 디옥산 또는 테트라히드로퓨란 등을 사용할 수 있고, 상기 비용매로는 물, 에탄올, 메탄올 또는 아세톤 등을 사용할 수 있다. 용매/비용매 혼합 용액의 경우 용매와 비용매의 부피비로 80:20 내지 95:5인 것이 바람직한데, 이러한 비율 범위로 혼합하는 경우에 비용매는 용매와는 섞이지만 생분해성 고분자는 녹이지 않는다.

기공을 형성시키기 위하여 사용되는 것인 상기 비등 혼합물은 탄산염과 유기산이 3:1 내지 1:1 몰비로 혼합되어 있는 혼합물로서, 일반 약물에 사용할 수 있는 인체에 무해한 물질이면서 물에 쉽게 용해되는 일정한 입자 크기를 갖는 고체이다.

탄산염의 예로는 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소암모늄, 탄산암모늄, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘 등과 같이 이산화탄소를 발생시키는 탄산염을 들 수 있다. 유기산의 예로는 구연산 (citric acid), 주석산 (tartaric acid), 숙신산 (succinic acid), 말레산 (maleic acid), 퓨마닉산 (fumanic acid), 말론산 (malonic acid), 말산 (malic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 뮤식산 (mucic acid), 아미노산 등을 들 수 있다.

상기 단계 (2)에서는 단계 (1)에서 얻어지는 디스크 형태의 고분자 시편을 물과 알콜이 5:95 내지 95:5의 부피비로 혼합되어 있는 알콜 수용액에 넣고, 예를 들면, 교반기로 교반하는 것과 같은 물리적인 방법을 병행하여 CO₂ 가스를 발생시켜 비등(발포)시킨 다음, 시편을 꺼내어 건조시킨다. 이와 같은 방법으로 다공성 생분해성 고분자 지지체를 비등시킴으로써 본 발명에서는 디스크 표면에도 높은 다공성을 갖는 고분자 지지체를 얻는다. 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 단계 (1) 및 (2)에 있어서, 생분해성 고분자를 용매/비용매 혼합 용액 에 용해시키고, 비등 혼합물을 첨가하여 균일하게 혼합한 다음, 알콜 수용액 중에서 발포하거나, 또는 생분해성 고분자를 용해시키는 용매에 용해시킨 고분자 용액에 비등 혼합물을 그 입자 크기를 달리하여 첨가하고 균일하게 혼합한 다음, 알콜 수용액에서 발포함으로써, 50 ~ 500 ㎛ 크기의 큰 기공과 5 ~ 40 ㎛ 크기의 작은 기공을 함께 갖는 이중 기공 다공성 생분해성 고분자 지지체를 얻을 수도 있다.

본 발명에 있어서 "단일 기공"이라는 용어는 균일한 크기의 기공 (50 ~ 500 ㎛)들이 고분자 지지체 전체에 분포되어 있고, 다공도는 85 ~ 93% 범위인 것을 의미하는 것이다. 한편, "이중 기공"이라는 용어는 100 ~ 500 ㎛ 크기의 기공들이 고분자 지지체 전체에 분포되어 있고, 그 기공들을 연결하는 벽 부분에 5 ~ 40 ㎛ 크기의 작은 기공들이 분포되어 있으며, 다공도는 93 ~ 98%인 것을 의미하는 것이다. 이중 기공 다공성 생분해성 고분자 지지체는 세포 배양 시에 세포가 점착할 수 있는 표면적이 크므로, 조직이나 장기 재생에 더욱 효과적일 수 있다.

상기 단계 (1) 및 (2)의 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 단계는 염침출법, 상분리법, 냉동법, 유화냉동건조법 등과 같은 종래의 방법에 비하여 생분해성 고분자 지지체를 보다 간단하게 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 기공 크기의 조절이 용이하고, 표면적과 다공도가 높은 기공간 개방 구조를 형성시킬 수 있으며, 특히, 제조되는 지지체 표면의 기공 막힘 현상 및 유해 물질의 분비 및 잔존 현상을 해결할 수 있어서 지지체의 효용성을 크게 높일 수 있다.

상기 단계 (2)가 완결된 후에 얻어지는 다공성 생분해성 고분자 지지체는 5 내지 500 ㎛ 범위의 기공 크기, 10 ~ 20 cm³/g의 높은 단위 부피당 표면적 및 85~98%의 높은 기공도를 가진다.

상기 단계 (3)에서는 단계 (2)에서 얻어지는 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 50 ~ 200 watt에서 산소 또는 아르곤 기체로 플라즈마 처리하고, 카르복실기를 갖는 친수성 단량체를 그라프트 중합시켜 상기 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 카르복실기를 유도함으로써, 상기 표면을 친수성으로 개질한다.

친수성 단량체로서 아크릴산을 사용하는 경우에는 플라즈마 챔버 내에서 직접 그라프트 중합을 실시하는 것이 바람직하고, 그 밖의 친수성 단량체를 사용하는 경우에는 플라즈마 처리하여 먼저 라디칼을 형성시키고, 이를 공기 중에서 안정화한 다음, 수용액 중에서 그라프트 중합을 실시하는 것이 좋다.

상기 단계 (4)에서는 고분자 지지체 0.1 g에 대하여 1-에틸렌-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 또는 1-사이클로헥실-3-(2-모폴리노에틸)카보디이미드 메토-p-톨루엔설포네이트(CMC)의 카르보디이미드 10~150 mg을 2-모폴리노에탄설폰산(MES) 완충 용액 (pH 4.7) 10 ml에 용해시키고, 이 용액에 단계 (3)에서 얻어지는 표면 개질된 다공성 생분해성 고분자 지지체를 침지시켜 고분자 지지체의 카르복실기를 활성화한다. 2 시간 경과 후, 고분자 지지체 0.1 g에 대하여 리간드 펩타이드 또는 성장 인자를 인산염 완충 식염수(PBS) 용액 (pH 7.4) 10 ml에 10^-3~10^-4 몰 농도로 용해시킨 용액을 첨가하고, 상온에서 1 내지 6시간 동안 반응시켜 생리 활성 물질이 결합된 다공성 고분자 지지체를 얻는다.

위와 같은 방법에 따라 본 발명에서는 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면을 카르복실기를 갖는 친수성 단량체를 이용하여 표면 개질하고, 상기 카르복실기를 이용하여 지지체의 표면에 세포 친화성을 갖는 생리 활성 물질을 결합시킴으로써 세포 친화성을 갖는 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체는 조직 공학적으로 조직이나 장기를 재생하는 데에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예에서 제조된 본 발명에 따른 조직 재생용 다공성 고분자 지지체의 세포 친화성을, 분화된 조직 세포(연골 세포, 혈관 세포, 신경 세포, 혈관 내피 세포 등) 또는 줄기 세포(지방 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 재대혈 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 배아 줄기 세포 등)를 배양한 후 세포의 증식 및 분화를 관찰함으로써 평가하였다.

실시예 1:

중량 평균 분자량이 약 130,000이고 중량비가 90:10인 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 85:15의 부피비로 혼합된 디옥산과 물에 녹인 후 8 중량% 농도로 만들고, 여기에 탄산수소나트륨과 구연산이 3:1의 몰비로 혼합된 비등 혼합물 (입자 크기 200-300 ㎛)을 첨가하여 균일하게 혼합한 다음, 알콜 수용액(물/알콜 부피 비가 70/30) 중에서 발포시켜 생분해성 이중 기공 고분자 지지체를 제조하였다. 큰 기공의 크기는 사용한 비등 혼합물의 입자 크기 (200 ~ 300 ㎛)와 비슷하였고, 물에 의하여 만들어진 작은 기공의 크기는 5 ~ 20 ㎛ 이었다.

이렇게 만들어진 이중 기공 고분자 지지체의 소수성 표면을 친수성으로 개질하기 위하여 아르곤과 친수성 단량체인 아크릴산(0.1 ml)을 이용하여 50 watt로 2분 동안 플라즈마 처리하였다.

EDC 10 mg을 MES 완충 용액(10 ml)에 녹이고, 카르복실기를 2시간 동안 활성화한 다음, 리간드 펩타이드인 RGD가 PBS 용액에 10^-3몰의 농도로 용해되어 있는 용액을 가하고 1시간 동안 고정화하여, 리간드 펩티드 RGD가 결합된 생분해성 이중 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

여기서 얻어진 리간드 펩티드 RGD가 결합된 생분해성 이중 기공 고분자 지지체의 외부 표면과 내부 단면의 다공성의 형태 및 분포는 거의 동일하였고, 전체 다공도는 98%를 나타내었으며, 펩타이드 함량은 4 nmole/g이었다. 연골 세포 점착 실험 결과, RGD 펩타이드가 고정된 PLGA 이중 기공 고분자 지지체는 미처리 PLGA 대조 물질에 비하여 100% 향상된 세포 점착 거동을 나타내었다.

실시예 2:

중량평균 분자량이 약 700,000인 폴리L-락트산 (PLLA)을 디클로로메탄에 용해시켜 13 중량% 농도의 PLLA 용액을 얻고, 얻어진 PLLA 용액에, 비등 혼합물/PLLA의 중량비가 5/1이 되도록 1:1 몰비로 혼합된 탄산나트륨과 구연산의 비등 혼합물 (200-300 ㎛ 크기)을 첨가하고 잘 혼합한 다음, 알콜 수용액(물/알콜 혼합 부피비는 50/50) 중에서 발포시켜 단일 기공 생분해성 고분자 지지체를 제조하였다.

여기서 얻어진 단일 기공 생분해성 고분자 지지체를 산소를 이용하여 플라즈마 처리하고, 친수성 단량체로서 아코니틱산(10 ml)을 수용액 상에서 상기 지지체의 표면에 그라프트 중합시켰다. 계속해서 CMC 50 mg을 MES 완충 용액 (10 ml)에 용해시키고, 여기에 아코니틱산이 그라프트 중합된 단일 기공 생분해성 고분자 지지체의 표면에 존재하는 카르복실기를 2시간 동안 활성화한 다음, 혈관 내피 세포의 점착 거동을 유도하는 REDV를 PBS 용액(10 ml)에 10^-4몰 농도로 제조하여 첨가한 다음 4시간 동안 고정시킴으로써, 리간드가 결합된 단일 기공 생분해성 고분자 지지체를 제조하였다.

이렇게 제조된 지지체의 다공질 크기는 사용한 비등 혼합물의 크기(200-300 ㎛)와 비슷하였으며, 지지체의 전체적인 다공도는 약 93%를 나타내었고, 펩타이드의 함량은 4.7 nmol/g이었다. 혈관 내피 세포의 점착 실험 결과, REDV 펩타이드가 고정된 PLLA 단일 기공 고분자 지지체가 미처리 PLLA 대조 물질에 비하여 90% 향상된 세포 점착 거동을 나타내었다.

실시예 3:

중량 평균 분자량이 약 20,000이고 중량비가 50:50인 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 아세톤에 용해시켜 8 중량% 농도의 PLGA 용액을 얻고, 탄산수소암모늄과 주석산이 2:1의 몰비로 혼합된 비등 혼합물을 비등 혼합물/PLGA의 중량비 가 20/1이 되도록 첨가하되, 2가지 크기의 비등 혼합물(입자 크기 400-500 ㎛ 및 10-40 ㎛)을 함께 사용하여 생분해성 이중 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

아르곤을 이용하여 플라즈마 처리한 다음 친수성 단량체인 이타코닉산(10 ml)을 수용액상에서 그라프트 중합시켰다. 계속해서 EDC 100 mg을 MES 완충 용액(10 ml)에 녹인 후 2시간 동안 활성화하고, 그 후에 TGF-β를 PBS 용액(10 ml)에 10^- ³몰 농도로 제조하여 첨가한 다음 6시간 고정시킴으로써 성장 인자가 결합된 조직 재생용 이중 기공 생분해성 고분자 지지체를 제조하였다.

제조된 지지체의 전체적인 다공도는 약 93%를 나타냈다. 다공질의 크기는 사용한 비등 혼합물의 크기와 같이 큰 기공은 그 크기가 400-500 ㎛이고 작은 기공은 그 크기가 10-40 ㎛이었으며 성장 인자의 함량은 0.04 nmol/g이었다. 골수 줄기 세포의 분화 실험 결과, 성장 인자가 고정된 PLGA 이중 기공 고분자 지지체는 PLGA 대조 물질에 비하여 90% 향상된 연골 세포로의 분화 거동을 나타내었다.

실시예 4:

중량 평균 분자량이 약 250,000이고 중량비가 85:15인 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 클로로포름에 용해시켜 10 중량% 농도의 PLGA 용액을 얻고, 탄산수소나트륨과 주석산이 몰비 1:1로 혼합된 비등 혼합물 (400-500 ㎛ 크기)을 비등 혼합물/PLGA의 중량비가 10/1이 되도록 첨가하고, 잘 혼합한 다음, 알콜 수용액 중에서(물/알콜 혼합비는 5/95) 발포시켜 생분해성 단일 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

그 다음, 아르곤을 이용하여 플라즈마 처리하고, 친수성 단량체인 말레산(10 ml)을 수용액상에서 그라프트 중합시켰다. 계속해서 CMC 150 mg을 MES 완충 용액(10 ml)에 녹인 후 2시간 동안 활성화시키고, 그 후에 VEGF를 PBS 용액(10 ml)에 10^-3몰 농도로 제조하여 첨가한 다음 3시간 동안 고정시킴으로써 성장 인자를 표면에 결합시켰다.

제조된 성장 인자가 결합된 단일 기공 고분자 지지체의 외부 표면을 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과, 기공의 크기는 사용한 비등 혼합물의 크기(400-500 ㎛)와 거의 동일함을 알 수 있었으며, 지지체의 전체적인 다공도는 약 85%이었고 성장 인자의 함량은 0.05 nmole/g이었다. 지방줄기세포의 분화 실험 결과, 성장 인자가 고정된 PLGA 단일 기공 고분자 지지체가 PLGA 대조 물질에 비하여 90% 향상된 혈관 내피 세포로의 분화 거동을 나타내었다.

실시예 5:

중량 평균 분자량이 약 17,500인 폴리D,L-락트산(PDLLA)을 클로로포름에 용해시켜 8 중량% 농도의 PDLLA 용액을 얻고, 탄산암모늄과 숙신산이 몰비 3:1로 혼합된 비등 혼합물(300-400 ㎛ 크기)을 비등 혼합물/PDLLA의 중량비가 15/1이 되도록 첨가하고, 발포 용액으로서 부피비 95:5의 물과 에탄올의 혼합 용액을 사용하여 발포시켜 생분해성 단일 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

그 후, 소수성인 고분자 표면을 아르곤과 아크릴산(0.1 ml)을 사용하여 플라즈마 처리과정을 통해 친수성으로 유도하였다. 계속하여, EDC 50 mg을 MES 완충 용 액(10 ml)에 녹인 후 2시간 동안 활성화시키고, 그 후에 리간드 펩타이드인 RNIAEIIKDA를 PBS 용액(10 ml)에 10^-3몰 농도로 제조하여 첨가한 다음 4시간 동안 고정시켰다.

이렇게 제조된 지지체의 다공질 크기는 사용한 비등 혼합물의 크기(300-400 ㎛)와 비슷하였으며, 지지체의 전체적인 다공도는 약 88%를 나타내었고, 펩타이드의 함량은 5 nmol/g이었다. 신경 세포의 점착 실험 결과, RNIAEIIKDA 펩타이드가 고정된 PDLLA 단일 기공 고분자 지지체가 PDLLA 대조 물질에 비하여 95% 향상된 세포 점착 거동을 나타내었다.

실시예 6:

중량평균 분자량이 약 100,000인 폴리-ε-카프로락톤을 테트라하이드로퓨란에 용해시켜 7 중량% 농도의 폴리-ε-카프로락톤 용액을 얻고, 탄산수소칼륨과 말레산(50-100 ㎛ 크기)이 몰비 2:1로 혼합된 비등 혼합물을 비등 혼합물/폴리-ε-카프로락톤의 중량비가 5/1이 되도록 첨가하고, 발포 용액으로서 부피비 85:15의 물과 에탄올 혼합 용액을 사용하여, 생분해성 단일 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

그 후, 소수성인 고분자 표면을 아르곤과 아크릴산(0.1 ml)을 이용하여 플라즈마 처리 과정을 통해 친수성으로 유도한 다음, CMC 50 mg을 MES 완충 용액(10 ml)에 녹인 후 2시간 동안 활성화하고, FGF를 PBS 용액(10 ml)에 10^-3몰 농도로 제조하여 첨가한 다음 3시간 동안 고정시켰다.

이렇게 제조된 지지체의 다공질 크기는 사용한 비등 혼합물의 크기(100-200 ㎛)와 비슷하였으며, 지지체의 전체적인 다공도는 약 90%를 나타내었고 성장 인자의 함량은 0.1 nmol/g이었다. 재대혈 줄기 세포의 분화 실험 결과, 성장 인자가 고정된 PCL 단일 기공 고분자 지지체가 PCL 대조 물질에 비하여 80% 향상된 연골 세포로의 분화 거동을 나타내었다.

실시예 7:

중량비 50:50의 글리콜산과 ε-카프로락톤 공중합체의 중량평균 분자량이 약 230,000인 것을 부피비 80:20의 디옥산과 메탄올의 혼합물에 15 중량%로 용해시킨 다음, 탄산칼륨과 뮤식산이 몰비 1:1로 혼합되어 있는 비등 혼합물 (100-200 ㎛ 크기)을 비등 혼합물/글리콜산과 ε-카프로락톤 공중합체의 중량비가 15/1이 되도록 첨가하고, 발포 용액으로서 부피비 50:50의 물과 메탄올 혼합용액을 사용하여, 생분해성 이중 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

그 다음, 산소를 이용하여 플라즈마 처리하고, 친수성 단량체인 아코니틱산(10 ml)을 수용액상에서 그라프트 중합시켰다. 혈관 세포의 점착 거동을 유도하는 YIGSR를 PBS 용액(10 ml)에 10^-4 몰 농도로 제조하여 첨가한 다음 4시간 동안 고정시킴으로써 리간드가 결합된 이중 기공 생분해성 고분자 지지체를 제조하였다.

지지체의 전체적인 다공도는 약 97%를 나타내었고, 펩타이드의 함량은 6 nmol/g이었다. 혈관 세포의 점착 실험 결과, YIGSR 펩타이드가 고정된 이중 기공 고분자 지지체가 글리콜산과 ε-카프로락톤 공중합체 대조 물질에 비하여 85% 향상 된 세포 점착 거동을 나타내었다.

실시예 8:

중량 평균 분자량이 약 180,000인 폴리오르쏘에스테르를 클로로포름에 용해시켜 11 중량% 농도의 폴리오르쏘에스테르 용액을 얻고, 탄산칼슘과 아스파틱산이 3:1의 몰비로 혼합되어 있는 비등 혼합물(100-200 ㎛ 크기)을 비등 혼합물/폴리오르쏘에스테르의 중량비가 5/1이 되도록 첨가하고, 발포 용액으로서 부피비 50:50의 물과 메탄올 혼합 용액을 사용하여 생분해성 단일 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

여기서 얻어진 단일 기공 생분해성 고분자 지지체를 아르곤을 이용하여 플라즈마 처리하고, 친수성 단량체로서 아코니틱산(10 ml)을 수용액 상에서 상기 지지체의 표면에 그라프트 중합시켰다. 계속해서 CMC 50 mg을 MES 완충 용액 (10 ml)에 용해시키고, 여기에 아코닉산이 그라프트 중합된 단일 기공 생분해성 고분자 지지체의 표면에 존재하는 카르복실기를 2시간 동안 활성화한 다음, PDGF를 PBS 용액(10 ml)에 10^-3 몰 농도로 제조하여 첨가한 다음, 4시간 동안 고정시킴으로써, 성장 인자가 결합된 단일 기공 생분해성 고분자 지지체를 제조하였다.

이렇게 제조된 고분자 지지체의 다공도는 약 90%를 나타내었고 성장 인자의 함량은 0.05 nmol/g이었다. 배아 줄기 세포의 분화 실험 결과, 성장 인자가 고정된 폴리오르쏘에스테르 단일 기공 고분자 지지체가 폴리오르쏘에스테르 대조 물질에 비하여 85% 향상된 뼈세포로의 분화거동을 나타내었다.

실시예 9:

중량 평균 분자량이 약 110,000인 폴리안하이드라이드를 사용하고, 비등 혼합물로서 탄산수소나트륨과 글루타믹산의 혼합물을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 동일한 공정을 수행하여 LDV 펩타이드가 결합된 이중 기공 고분자 지지체를 제조하였다.

펩타이드의 함량은 4.8 nmol/g이었으며, 혈관 내피 세포의 점착 실험 결과, LDV 펩타이드가 고정된 폴리안하이드라이드 고분자 지지체가 폴리안하이드라이드 대조 물질에 비하여 80% 향상월된 세포 점착 거동을 나타내었다.

본 발명에 따라 표면에 리간드 펩타이드 또는 성장 인자가 결합된 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체 및 그 제조 방법이 제공되었다. 본 발명에 따른 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체는 우수한 세포 친화성, 즉 세포 점착성과 세포 분화능을 나타내었다. 따라서 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 기존의 다공성 고분자 지지체에 비하여 세포 친화성이 월등하게 뛰어나기 때문에 신체의 거의 모든 조직이나 장기를 조직 공학적으로 재생하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

(a) 5 ㎛ 내지 500 ㎛의 기공의 크기, 10 ~ 20 cm³/g의 단위 부피당 표면적 및 85 ~ 98%의 다공도를 가지며, 친수성 단량체로 표면 개질되어 있는 다공성 생분해성 고분자 지지체와, (b) 상기 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 생리 활성 물질을 포함하는 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 생리 활성 물질은 다공성 생분해성 고분자 지지체 1 g에 대하여 0.04 ~ 6 나노몰(nmol)의 양으로 결합되어 있는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 기공은 단일 기공 또는 이중 기공인 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 친수성 단량체는 아크릴산, 말레산, 이타코닉산, 아코니틱산 등의 일부 불포화 카르복실산 및 이들 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 생리 활성 물질은 리간드 펩타이드 또는 성장 인자인 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
제6항에 있어서, 상기 리간드 펩티드는 RGD, REDV, LDV, YIGSR, PDSGR, IKVAV 및 RNIAEIIKDA로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
제6항에 있어서, 상기 성장 인자는 EGF, FGF, VEGF, NGF, HGF, TGF-β, IGF 및 PDGF로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체.
(1) 생분해성 고분자, 비등 혼합물 및 적합한 용매를 사용하여 고분자 시편을 얻는 단계,

(2) 상기 단계 (1)에서 얻어지는 고분자 시편을 알콜 수용액 중에서 발포시켜 건조시켜 다공성 생분해성 고분자 지지체를 생성시키는 단계,

(3) 단계 (2)에서 얻어지는 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면을 카르복 실기를 갖는 친수성 단량체로 개질하는 단계,

(4) 단계 (3)에서 얻어지는 표면 개질된 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 생리 활성 물질을 결합시키는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 용매는 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤, 디옥산, 테트라히드로퓨란 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 단계 (1)은 생분해성 고분자, 비등 혼합물 및 용매로 이루어진 고분자 용액을 -196℃ 내지 상온에서 방치하여 용매를 증발시켜 고분자 시편을 얻는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 단계 (1)은 생분해성 고분자를, 생분해성 고분자를 용해시키는 용매, 또는 고분자를 용해시키는 용매와 상기 생분해성 고분자는 용해시키지 않으나 상기 용매와는 섞이는 비용매가 80:20 내지 95:5의 부피비로 혼합되어 있는 혼합 용매에 용해시켜 고분자 용액을 얻고, 이로부터 고분자 시편을 얻는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 용매는 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디클로로메 탄, 디옥산, 테트라히드로퓨란 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것이고, 상기 비용매는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 비등 혼합물은 탄산염과 유기산이 3:1 내지 1:1 몰비로 혼합되어 있는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 탄산염은 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소암모늄, 탄산암모늄, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨 및 탄산칼슘으로 구성되는 군에서 선택된 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 유기산은 구연산, 주석산, 숙신산, 말레산, 퓨마닉산, 말론산, 말산, 글루콘산, 뮤식산 및 아미노산으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 알콜 수용액은 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 및 이들의 혼합물과 물이 5:95 내지 95:5 부피비로 혼합되어 있는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 입자 크기가 상이한 2가지 이상의 비등 혼합물을 사용함으로써, 단계 (2)에서 이중 기공 생분해성 다공성 고분자 지지체가 얻어지는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 단계 (3)은 단계 (2)에서 얻어지는 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면을 산소 또는 아르곤 플라즈마 처리하고, 카르복실기를 갖는 친수성 단량체를 그라프트 중합시키는 것을 포함하는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 카르복실기를 갖는 친수성 단량체는 아크릴산, 말레산, 이타코닉산 및 아코니틱산으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 단계 (4)는 단계 (3)에서 얻어지는 표면 개질된 다공성 생분해성 고분자 지지체를 1-에틸렌-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 또는 1-사이클로헥실-3-(2-모폴리노에틸)카보디이미드 메토-p-톨루엔설포네이트의 카 르보디이미드의 수용액에 침지시켜 상기 표면 개질된 다공성 생분해성 고분자 지지체의 표면에 존재하는 카르복실기를 활성화한 다음, 활성화된 카르복실기를 통하여 생리 활성 물질을 결합시키는 것을 포함하는 것인, 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (2)에서 얻어지는 다공성 생분해성 고분자 지지체의 다공도가 85-98%인 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제9항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생리 활성 물질은 리간드 펩타이드 또는 성장 인자인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제24항에 있어서, 상기 리간드 펩티드는 RGD, REDV, LDV, YIGSR, PDSGR, IKVAV 및 RNIAEIIKDA로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.
제24항에 있어서, 상기 성장 인자는 EGF, FGF, VEGF, NGF, HGF, TGF-β, IGF 및 PDGF로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조직 재생용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법.