KR100645259B1

KR100645259B1 - Type-specific Oligonucleotide Probes DNA Chip and Detection Kit for Diagnosing HPV Genotypes and Method of Manufacturing Thereof

Info

Publication number: KR100645259B1
Application number: KR1020040067493A
Authority: KR
Inventors: 이상화; 김연수; 최경진; 유강열; 김승조; 차광렬; 고정재
Original assignee: (주)차바이오메드
Priority date: 2004-08-26
Filing date: 2004-08-26
Publication date: 2006-11-15
Also published as: KR20060019042A

Abstract

본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, 이하 “HPV"라 함)의 DNA단편과 유형 특이적(type-specific)으로 결합할 수 있는 프로브 및 이를 이용한 HPV 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자궁경부암과 밀접하게 관련이 있는 HPV 유형 각각에 결합할 수 있는 신규한 39종류의 올리고뉴클레오티드 5′말단에 구아닌을 결합시킨 프로브와 상기 프로브를 이용하여 HPV 각 유형을 신속하게 검출, 진단할 수 있도록 마이크로어레이 기술을 이용한 HPV 유전형 분석용 DNA칩과 분석키트 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인유두종바이러스 유형 진단 키트를 사용하면 여성에 있어 자궁경부암의 생성 및 진행과 밀접한 관련이 있는 종양원성 HPV를 39종류 각 유형별로 정확하게 검출하여 자궁경부암 진행 여부를 신속하게 진단할 수 있다. The present invention relates to a probe capable of binding to a DNA fragment of human papillomavirus (hereinafter referred to as “HPV”) in a type-specific manner and a method for detecting HPV using the same. The new 39 types of oligonucleotides 5 ′ which are bound to each of the HPV types closely related to the guanine-binding probe and the microarray can be used to quickly detect and diagnose each type of HPV. The present invention relates to a DNA chip for analyzing HPV genotyping using a technology, an analysis kit, and a method for manufacturing the same. 39 types can be detected accurately for each type to quickly diagnose the progression of cervical cancer.

인유두종바이러스(HPV), 유형 특이적 프로브(type-specific probe), 마이크로어레이(microarray)Human Papillomavirus (HPV), type-specific probes, microarrays

Description

Type-specific Oligonucleotide Probes, DNA Chips and Detection Kits for Diagnosing HPV Genotypes and Method of Manufacturing Thereof}

도 1a 내지 도 1c는 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 39조의 프로브를 사용하여 HPV-16 감염 세포주(CaSki), HPV-18 감염 세포주(HeLa) 및 HPV 비감염 세포주(K562)를 대상으로 하여 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션(hybridization)을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다. 1A to 1C are each HPV-16 infected cell line (CaSki), HPV-18 infected cell line (HeLa) and HPV non-infected cell line (K562) using a total of 39 sets of probes synthesized in the present invention according to one embodiment of the present invention. ) Is a photograph subjected to DNA microarray hybridization and an analysis diagram thereof.

도 2a 내지 도 2h는 각각 본 발명의 다른 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 39조의 프로브를 사용하여 다양한 HPV 유형의 DNA 서열을 함유하는 HPV 플라스미드를 표적 DNA로 하여 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다. 2A to 2H show DNA microarray hybridization using HPV plasmids containing DNA sequences of various HPV types as target DNA, respectively, using a total of 39 sets of probes synthesized in the present invention according to another embodiment of the present invention. It is a photograph performed and the analysis drawing.

도 3a 내지 도 3y는 각각 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 39조의 프로브를 사용하여 자궁경부암과 관련 있는 것으로 확인된 인체로부터 수득 된 DNA 샘플을 대상으로 하여 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다. 3A to 3Y are DNA microarray hive for DNA samples obtained from a human body identified as being related to cervical cancer using a total of 39 sets of probes synthesized in the present invention, respectively, according to another embodiment of the present invention. It is a photograph which carried out redidation, and its analysis drawing.

도 4a 내지 도 4o는 각각 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 39조의 프로브를 사용하여 자궁경부암과 관련 없는 것으로 확인된 인체로부터 수득된 DNA 샘플을 대상으로 하여 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다. Figures 4a to 4o are DNA microarray hive for DNA samples obtained from the human body each identified as not related to cervical cancer using a total of 39 sets of probes synthesized in the present invention according to another embodiment of the present invention It is a photograph which carried out redidation, and its analysis drawing.

본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus:HPV)의 DNA단편과 유형 특이적(type-specific)으로 결합할 수 있는 프로브 및 이를 이용한 HPV 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자궁경부암과 밀접하게 관련이 있는 HPV 유형 각각에 결합할 수 있는 신규한 39종류의 올리고뉴클레오티드 5′말단에 구아닌을 결합시킨 프로브와 상기 프로브를 이용하여 HPV 각 유형을 신속하게 검출, 진단할 수 있도록 마이크로어레이 기술을 이용한 HPV 유전형 분석용 DNA칩과 분석키트 및 그 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a probe capable of binding to a DNA fragment of human papillomavirus (HPV) in a type-specific manner and a method for detecting HPV using the same, and more particularly, closely related to cervical cancer. HPV genotype using microarray technology to quickly detect and diagnose each type of HPV using guanine conjugated with 39 new oligonucleotides 5 ′ end capable of binding to each type of HPV The present invention relates to an analytical DNA chip, an analysis kit, and a manufacturing method thereof.

자궁경부암(cervical cancer)은 자궁경부에서 발생하는 악성종양으로 전체 자궁암 발생빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전 세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 해마다 약 44만 건 정도가 신규로 보고 되고 있으며, 개발도상국에서는 가장 흔한 여성 암으로 연간 약 30만 명이 자궁경부암으로 사망한다. 우리나라의 경우 2000년도 보건복지부 암 등록 조사통계를 보면 1년에 약 5,000여명의 새로운 환자들이 발생하는 것으로 보고 되고 있다. 이는 여성의 경우 자궁경부암(10.6%)은 3803건으로 10대 암의 장기별 발생 빈도 상 위암(15.8%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있으며 특히 최근엔 20-30대 젊은 여성의 감염율이 크게 늘어 전체 환자의 32%를 차지하는 등 국민보건 상 심각한 문제로 대두되고 있다. Cervical cancer is a malignant tumor occurring in the cervix, accounting for more than 95% of all uterine cancers, and the highest incidence of cancer among women in the world after breast cancer. About 440,000 new cases are reported each year. The most common female cancer in developing countries, about 300,000 people die of cervical cancer each year. In Korea, the Ministry of Health and Welfare's Cancer Registration Survey in 2000 reports that about 5,000 new patients occur every year. For women, cervical cancer (10.6%) was 3803 cases, which ranked third after gastric cancer (15.8%) and breast cancer (15.1%) in the long-term incidence of teenage cancers, especially recently among young women in their 20s and 30s. The number has risen sharply, accounting for 32% of all patients, making it a serious health problem.

자궁경부암은 일반적으로 HPV가 자궁경부 상피 기저 세포에 감염한 후 저급 상피 이형성증(low squamous intraepithelial lesion, LSIL), 고급 상피 이형성증(high squamous intraepithelial lesion, HSIL) 및 상피내암 등의 오랜 전구 단계를 거쳐 최종 침윤암으로 발전하게 되는데, 이처럼 암으로 발생하기 전 단계인 전암 단계 병변이 존재하기 때문에, 조기에 이들 병변을 조기에 효과적으로 진단, 치료함으로써, 자궁경부암을 예방할 수 있다. Cervical cancer usually develops after HPV infections of cervical epithelial basal cells, followed by prolonged prognostic stages such as low squamous intraepithelial lesions (LSIL), high squamous intraepithelial lesions (HSIL), and epithelial cancer. It develops into invasive cancer, and since there are precancerous stages before the cancer develops, cervical cancer can be prevented by early diagnosis and treatment of these lesions early and effectively.

현재까지의 연구에 따르면, 자궁경부암의 발병원은 성 접촉으로 인해 감염되는 HPV(약 8kb의 이중쇄 환상 DNA 바이러스)가 주요 인자인 것으로 밝혀지고 있다. HPV의 게놈에는 숙주세포에 감염한 후 초기 과정에 관여하는 E1 ~ E7 유전자와 후 기 과정에 관여하는 L1, L2 유전자가 존재하며, 특히 HPV의 바이러스성 발암유전자 산물인 E6와 E7 단백질이 각각 세포내의 종양억제 단백질인 p53과 pRb와 결합하여 이들 종양억제 단백질의 기능을 폐기함으로써, 암을 유발시키는 것으로 확인되고 있다. To date, studies of cervical cancer have revealed that HPV (about 8 kb of double-stranded circular DNA virus), which is infected by sexual contact, is a major factor. In the genome of HPV, there are E1 to E7 genes involved in the initial process after infection with the host cell, and L1 and L2 genes involved in the later process, and in particular, the E6 and E7 proteins, the product of the viral carcinogenic gene of HPV, respectively. It is confirmed that cancer is caused by binding the tumor suppressor proteins p53 and pRb to discard the functions of these tumor suppressor proteins.

HPV 게놈 염기서열 중 E6, E7 및 L1 유전자의 열린 해독틀(open reading frame)의 차이를 근거로 하여 현재까지 120 가지 이상의 다른 유형이 발견되었다. 이들 HPV 유형 가운데 생식기(Genital)에 감염하는 HPV 유형으로는 HPV-16, -31, -33, -35, -52, -58, -67, -40, -43, -7, -32, -42, -6, -11, -74, -44, -55, -13, -61, -72, -62, -2, -27, -57, -3, -28, -29, -10, -54, -18, -39, -45, -59, -68, -70, -26, -69, -51, -30, -53, -56, -66, -34, -64 및 -73등의 45 유형으로 이 가운데 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 HPV 유형으로는 고위험군(high-risk group)에 속하는 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -57, -58, -59, -61, -67, -68, -70 및 -73, -74의 22 유형과 저위험군(low-risk group)에 속하는 HPV-2a, -3, -6, -10, -11, -32, -34, -40, -42, -43, -44. -54, -55, -66 및 -69의 15유형 등이 자궁경부암으로의 진행과 밀접한 관련이 있다.More than 120 different types have been discovered to date based on differences in the open reading frame of the E6, E7 and L1 genes in the HPV genome sequences. Among these HPV types, HPV types that infect the genitals include HPV-16, -31, -33, -35, -52, -58, -67, -40, -43, -7, -32,- 42, -6, -11, -74, -44, -55, -13, -61, -72, -62, -2, -27, -57, -3, -28, -29, -10, -54, -18, -39, -45, -59, -68, -70, -26, -69, -51, -30, -53, -56, -66, -34, -64 and -73 Among these, HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35,-belonging to the high-risk group are among the HPV types that are closely related to cervical cancer. 22 types of low risk groups (39, -45, -51, -52, -53, -56, -57, -58, -59, -61, -67, -68, -70, and -73, -74) low-risk group), HPV-2a, -3, -6, -10, -11, -32, -34, -40, -42, -43, -44. Types 15 of -54, -55, -66 and -69 are closely related to the progression of cervical cancer.

이와 같이, 감염된 HPV 유형의 종류에 따라 암의 향후 진행에 막대한 영향을 초래할 수 있으므로 샘플 내에서 HPV의 존재 여부 및 존재하는 HPV 유형을 정확하게 동정함으로서, 자궁경부암 환자의 예후 및 진단에 중요한 의미를 가질 수 있다.As such, the type of infected HPV may have a significant impact on the future progression of cancer, and thus, by accurately identifying the presence and type of HPV in the sample, it may have important significance in the prognosis and diagnosis of cervical cancer patients. Can be.

종래에, 자궁경부암과 전구 병변의 일차 선별을 위해 자궁경부 세포진의 세포학적 형태에 근거하는 세포진 검사(Papanicolaou(Pap) smear)가 1940년대부터 표준 검사법으로 시행되어 자궁경부암으로 인한 사망률을 크게 감소시키는데 일익을 담당해 왔으나 여전히 30~40%의 높은 위음성율을 나타내는 것으로 보고 되고 있다. Conventionally, a pap smear based on the cytological form of cervical papules (Papanicolaou (Pap) smear) for the primary screening of cervical cancer and progenitor lesions has been performed as a standard test since the 1940s to significantly reduce mortality from cervical cancer. Although it has played a part, it still reports high false negative rate of 30 ~ 40%.

또한, 분자 생물학적인 수단을 통하여 HPV의 존재 및 유형을 분석하기 위한 방법으로는 크게 HPV DNA의 직접확인법과 HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법으로나눌 수 있다. 상기 HPV DNA의 직접확인법으로는 리퀴드 하이브리디제이션(liquid hybridization,Hybrid Captureby Digene Diagnostics,Silver Spring,MD), HPV 타입-특이 프로브(type-specific probe)를 이용한 서던블롯(Southern blot)및 도트블롯(Dot blot), 필터 인 시튜 하이브리디제이션(Filter in situ hybridization,FISH)등이 있다. 그리고, HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법으로서는, 타입-특이 PCR(type-specific polymerase chain reaction)과 제너럴-프라이머 PCR(general-primer PCR)등이 있다. 제너럴 프라이머 세트(General primer set)를 이용하여 증폭된 HPV DNA는 도트 블롯 하이브리디제이션(dot blot hybridization), 마이크로티터 플레이트 하이브리디제이션(microtiter plate hybridization) 또는 라인 프로브 어세이(line probe assay)등의 방법을 통해 유전형을 검색할 수 있다. In addition, methods for analyzing the presence and type of HPV through molecular biological means can be largely divided into direct identification of HPV DNA and amplification of HPV DNA. Direct identification of the HPV DNA includes liquid hybridization (Hybrid Captureby Digene Diagnostics, Silver Spring, MD), Southern blot and dot blot (using HPV type-specific probe). Dot blots and Filter in situ hybridization (FISH). As a method of using amplification of HPV DNA, there are a type-specific polymerase chain reaction (PCR) and a general-primer PCR (general-primer PCR). HPV DNA amplified using a general primer set, such as dot blot hybridization, microtiter plate hybridization or line probe assay The method can detect genotypes.

상기 라인 프로브 어세이는 니트로셀루로오즈막(nitrocellulose membrane)에 올리 고뉴클레오티드 프로브를 고정하여 20여가지의 타입을 검색하는 방법인데, 탐지감도와 데이타해석상 여러 문제점이 있다. 또한, 자궁경부 세포진의 HPV DNA와 RNA 탐침(probe) 사이의 액상 상보 결합을 항체 효소 발색에 의하여 검출하는 검사법으로 HPV 하이브리드 캡처 Ⅱ(HPV hybrid capture Ⅱ) 방법이 1994년 개발되었다. 하이브리드 캡처 Ⅱ는 개발 이래로 자궁경부암과 그 전구병변의 보조적 선별 또는 추적 검사의 한 방법으로 활용되고 있으며 최근 미 식품의약품 안전청(FDA)로부터 일차 선별을 위한 사용 승인까지 받은 상태이다. 하이브리드 캡처 Ⅱ법은 기존의 HPV DNA 진단 방법과 비교하여 정확성이 높고 고위험군/저위험군(high risk/low risk) HPV를 진단할 수 있는 장점이 있으나, 다양한 HPV 유형을 유형에 따라 정확히 구분할 수 없을 뿐 아니라, 많은 양의 DNA 시료를 필요로 하기 때문에 시료 채취가 미흡할 경우에는 검출 한계를 나타내고 불안정한 RNA 탐침을 사용하고 있어 안정성이 낮은 단점을 가지고 있다. 따라서 자궁경부암 및 그 전구병변의 포괄적 초기 검색이 불가능하고 특히 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 특정 HPV 유형을 신속하게 동정하기 위한 방법의 필요성은 여전히 높은 것이 현실이다.The line probe assay is a method of retrieving about 20 types by immobilizing a high-nucleotide probe on a nitrocellulose membrane, and has various problems in detection sensitivity and data analysis. In addition, the HPV hybrid capture II method was developed in 1994 as a test for detecting the liquid complementarity binding between the HPV DNA and the RNA probe of the cervical cytogene by antibody enzyme coloration. Hybrid Capture II has been used as a method of assisted screening or follow-up of cervical cancer and its prognostic lesions since its development and has recently been approved for use in primary screening by the US Food and Drug Administration (FDA). Hybrid Capture II has the advantage of high accuracy and high risk / low risk HPV diagnosis compared to the existing HPV DNA diagnosis method, but it is not possible to accurately distinguish various types of HPV by type. In addition, since a large amount of DNA samples are required, when sampling is insufficient, the detection limit is limited and an unstable RNA probe is used. Therefore, there is still a high need for a method for the rapid identification of cervical cancer and its prognostic lesions, and in particular for the rapid identification of certain types of HPV that are closely related to cervical cancer.

근래에는, 분자생물학과 전자공학 기술의 접목을 통해 한 장의 현미경용 슬라이드 위에서 수십에서 수만 종류의 유전자를 동시에 검사할 수 있는 유전자 칩(DNA chip, DNA microarray)이 개발되었다. 이러한 DNA 칩은 유전자 발현 해석, 유전자 진단, 유전자 돌연변이, 의약품 스크린 및 질환 진단용 등에 널리 응용될 수 있는 새로운 차원의 분석 시스템이다. 따라서 이를 이용한 HPV 유형 동정은 자궁경부암 과 관련된 HPV 유형을 신속하게 검출할 수 있는 HPV DNA 칩의 개발을 가능하게 하였다. In recent years, the integration of molecular biology and electronics technology has led to the development of DNA chips (DNA chips, DNA microarrays) that can simultaneously test tens to tens of thousands of genes on a single microscope slide. This DNA chip is a new level of analysis system that can be widely applied for gene expression analysis, gene diagnosis, gene mutation, pharmaceutical screen and disease diagnosis. Therefore, HPV type identification using this technology enables the development of HPV DNA chip that can quickly detect HPV type related to cervical cancer.

DNA칩 제조기술을 이용하여 HPV 감염여부를 신속하게 검출하기 위한 종래 선행기술로 대한민국 공개특허 2001-0091450호는 ‘인유두종바이러스의 유전형 진단키트 및 그 제조방법’에 관하여 기재하고 있다. 상기 특허에서 사용된 프로브는 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 6, 11, 58에 관한 프로브로 상기 프로브의 DNA 염기서열은 종래부터 널리 알려진 올리고뉴클레오티드 시퀀스를 그대로 이용하여 단지 DNA 칩으로 제조한 것이다. 상기 특허에 의한 경우, 자궁경부암과 밀접한 관련이있는 36종류의 HPV 유형중 단지 12가지의 HPV 유형만을 검출할 수 있고, 종래부터 널리 알려진 시퀀스를 그대로 이용함으로서 HPV 각 유형에 대한 민감도와 정확성이 떨어져 궁극적으로는 자궁경부암의 감염여부를 판단하는데 부정확성을 보이는 문제점을 가지고 있다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2001-0091450 discloses a genotyping kit for human papillomavirus and its manufacturing method as a conventional prior art for rapidly detecting HPV infection using DNA chip manufacturing technology. The probe used in this patent is a probe for HPV type 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 6, 11, 58. The DNA sequence of the probe is a well known oligonucleotide sequence. Using just as prepared as a DNA chip. According to the patent, only 12 HPV types can be detected among 36 HPV types that are closely related to cervical cancer, and the sensitivity and accuracy of each type of HPV are inferior due to the use of conventionally known sequences. It has a problem of inaccuracy in determining whether cervical cancer is infected.

이와 더불어, 대한민국 공개특허 2003-0027178호(이하 '기존 특허'라 함)는 ‘인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트’에 관한 것이다. 상기 기존 특허에서는 HPV를 검출하기 위한 염기서열로 50가지를 기재하고 있으나, 이중에서 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 고위험군과 저위험군에 속하는 HPV 유형으로 상기 기존 특허에 따른 효과를 보이는 HPV 유형은 HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69(고위험군)와 HPV-6, 11, 34, 40, 42, 43, 44( 저위험군)에 관한 것에 한하는 것으로 나타나 있다. 상기 기존 특허는 여러가지 HPV 유형에 대한 프로브를 기재하고는 있으나, 실제로 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 고위험군에 속하면서 기존 특허에 따른 효과를 보이는 HPV 유형은 고위험군에 속하는 것으로 전체 22유형중 15유형과 저위험군에 속하는 것으로 전체 15유형중 7유형에 한한다. 따라서 상기 유형에 속하지 않는 HPV 유형에 대해서는 민감도와 정확도가 부족하여 HPV를 검출하기 위한 프로브로서 사용할 수 없는 문제점이 존재하고, 상기에 기재된 유형에 속하는 HPV 유형일지라도 그 효과가 미약하여 HPV를 검출해내지 못하는 경우가 발생하는등 자궁경부암에 걸린 환자에 대해서 그 진단이 잘못되는 문제점을 안고 있다. 나아가 상기 기존 특허에 따른 유전형 진단키트는 프로브를 아민기로 변형시키고 글래스 위에 알데히드기를 유도시킴으로서, 프로브와 알데히드기에 의한 시프염기반응(Schiff base reaction)으로 글래스에 프로브를 고정시키는 것을 특징으로 하지만, 이 또한 절차가 복잡하여 에러가 발생하고 비용이 증가하는 등의 문제점을 안고 있다. In addition, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2003-0027178 (hereinafter referred to as 'existing patent') relates to 'genotyping kit for diagnosing infection of human papilloma virus'. Although the existing patent describes 50 types of base sequences for detecting HPV, HPV types belonging to the high risk group and the low risk group which are closely related to cervical cancer are HPV types that show the effect according to the existing patent. 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69 (high risk) and HPV-6, 11, 34, 40, 42, 43, 44 (low Risk groups). Although the existing patent describes probes for various types of HPV, the HPV type that is effective in the high risk group that is closely related to cervical cancer and according to the existing patent belongs to the high risk group. Belonging to only 7 of the 15 types Therefore, there is a problem that cannot be used as a probe for detecting HPV due to lack of sensitivity and accuracy for HPV types that do not belong to the above-mentioned types, and even if the HPV types belonging to the above-described types are less effective, they cannot detect HPV. There is a problem that the diagnosis is wrong for patients with cervical cancer, such as failure to occur. Furthermore, the genotyping diagnostic kit according to the existing patent is characterized by immobilizing the probe on the glass by a Schiff base reaction by the probe and the aldehyde group by modifying the probe with an amine group and inducing an aldehyde group on the glass. The complexity of the procedure leads to problems such as errors and increased costs.

이와 같이, 현재까지 개발된 HPV 검출용 DNA 칩은 여러가지 HPV 유형군 중에서 극히 일부만을 대상으로 검출할 수 있는 것이였다. 이는 120 여개가 넘는 다양한 유형으로 존재하는 HPV 유형을 각 유형별로 결정하는 과정이 없이 포괄하여 한번에 검출할 수는 있으나, 상기한 것과 같이 HPV는 그 유형에 따라 자궁경부암과의 관련성에서 큰 차이가 있다는 점을 고려할 때, 자궁경부암의 효율적 예방이라는 측면에서는 바람직하지 못하다. 따라서 HPV 존재를 동시에 검출하면서 자궁경부암과 관 련성에 따라 각 유형별로 결정할 수 있는 HPV 검출용 DNA 칩 및 진단키트가 절실하게 요구되고 있는 실정이다. 따라서, 다양한 유형의 HPV를 각 유형별로 정확하게 검출하기 위해서는 사용되는 올리고뉴클레오티드의 종류와 배열에 따라 HPV에 대한 민감도와 특이도가 높은 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로브를 제작하는 것이 필요하다. As described above, the HPV detection DNA chip developed so far can detect only a part of various HPV types. It is possible to detect more than 120 different types of HPV types at once without the process of determining each type. However, as mentioned above, there are significant differences in the relationship between HPV and cervical cancer. In view of this, it is not preferable in terms of effective prevention of cervical cancer. Therefore, there is an urgent need for a DNA chip for detecting HPV and a diagnostic kit that can be determined for each type according to cervical cancer and relevance while simultaneously detecting the presence of HPV. Therefore, in order to accurately detect various types of HPV for each type, it is necessary to prepare a probe using oligonucleotides having high sensitivity and specificity for HPV according to the type and arrangement of oligonucleotides used.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 자궁경부암과 밀접하게 관련이 있는 HPV 유형 각각에 유형 특이적으로 결합될 수 있는 신규한 39종류의 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조하고, 상기 프로브를 이용하여 HPV 각 유형을 신속하게 검출, 진단할 수 있도록 마이크로어레이 기술을 이용한 HPV 유전형 분석용 DNA칩 및 분석키트를 제조하는 것이다.
The present invention has been proposed to solve the above problems, and an object of the present invention is to prepare a novel 39 kinds of oligonucleotide probes that can be type-specifically bound to each type of HPV closely related to cervical cancer In addition, using the probe to produce a DNA chip and analysis kit for HPV genotyping using microarray technology to quickly detect and diagnose each type of HPV.

더불어, 프로브와 슬라이드 글래스의 결합 및 결합과정을 개선함으로서 제조공정을 단축하고 에러발생을 줄임으로서 HPV 존재여부를 정확하게 검출하여 자궁경부암과의 관련성을 신속하게 예측하고자 함이다.
In addition, by improving the coupling and bonding process of the probe and the slide glass to shorten the manufacturing process and reduce the occurrence of errors by accurately detecting the presence of HPV to quickly predict the relationship with cervical cancer.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 39로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택되어 인유두종바이러스(HPV)와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 발명의 기술적 특징으로 한다. 여기서, 서열번호 1 내지 39로 표시된 염기서열은 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 39종류의 HPV 유형 각각 대응되는 것을 특징으로 하는 것이다. 더욱 상세하게, 상기 39종류의 HPV 유형은 HPV-16, 18, 26, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 61, 66, 67, 68, 70, 73, 82, 3, 6, 7, 10, 11, 13, 32, 34, 40, 42, 44, 54, 55, 57, 72, 74, 90으로 자궁경부암과 밀접한 관련을 가지고 고위험군에 속하는 HPV 유형 22종류를 전부 포함하고, 저위험군에 속하는 HPV 유형 15종류중 12종류를 포함하며, 여기에 추가로 5종류를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브이다. In order to achieve the above object, the present invention provides a probe capable of complementarily binding to human papillomavirus (HPV) is selected from the group consisting of oligonucleotides having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 39 It is technical feature. Here, the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 39 are characterized in that each of the 39 types of HPV types that are closely related to cervical cancer correspond. More specifically, the 39 types of HPV types are HPV-16, 18, 26, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 61, 66, 67, 68 70, 73, 82, 3, 6, 7, 10, 11, 13, 32, 34, 40, 42, 44, 54, 55, 57, 72, 74, 90 A probe comprising all 22 types of HPV types belonging to it, 12 kinds of 15 types of HPV types belonging to a low risk group, and 5 more types.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 39로 표시된 염기서열의 5' 말단에 구아닌 염기가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 프로브이다. 프로브 말단에 9개의 구아닌 염기를 결합시킴으로 해서 표면의 글라스와의 반응성을 향상 시키고 에러발생을 줄이고자 함이다.In addition, the present invention is a probe, characterized in that the guanine base is contained at the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 39. By incorporating nine guanine bases into the probe ends, it is intended to improve the reactivity with the glass on the surface and reduce the occurrence of errors.

본 발명에 따른 다른 특징으로는 위와 같이 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 제조된 프로브를 포함하여 HPV의 유전형을 분석하는 DNA칩을 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 DNA칩에는 프로브의 위치를 알려주는 파지티브 컨트롤(Positive Control) 또는 프로브와 시료 DNA의 하이브리디제이션(hybridization) 반응을 탐지하는 표지수단이 더 포함될 수 있는 HPV 유전형 분석용 DNA칩에 관한 것이다. 또 한, 본 발명의 바람직한 실시예로서 상기 프로브의 농도는 50 ~ 150 ㎍/㎖인 것이 바람직하다.Another feature according to the present invention is characterized by providing a DNA chip for analyzing the genotype of HPV, including a probe prepared according to a preferred embodiment of the present invention as described above. The DNA chip relates to a DNA chip for HPV genotyping, which may further include a positive control indicating a position of the probe or a labeling means for detecting a hybridization reaction between the probe and the sample DNA. In addition, as a preferred embodiment of the present invention, the concentration of the probe is preferably 50 ~ 150 ㎍ / ㎖.

본 발명의 또 다른 특징은 상기 HPV 유전형 분석용 DNA칩에 시료 DNA를 증폭시킬 수 있는 증폭수단, 프로브의 위치를 알려주는 파지티브 컨트롤(Positive Control) 또는 프로브와 시료 DNA의 하이브리디제이션(hybridization) 반응을 탐지하는 표지수단을 더 포함하여, HPV의 유전형을 분석할 수 있는 일체의 키트로 제공될 수 있는 것을 특징으로 한다.Another feature of the present invention is an amplification means capable of amplifying a sample DNA on the HPV genotyping DNA chip, a positive control (Positive Control) to inform the position of the probe or hybridization of the probe and the sample DNA (hybridization) It further comprises a label means for detecting the reaction, characterized in that it can be provided as a kit to analyze the genotype of HPV.

또한, 본 발명에 따라 제조되는 다른 바람직한 실시예는 상기 서열번호 1 내지 39로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택되어 HPV와 상보적으로 결합하는 프로브의 5' 말단에 구아닌 염기를 결합시키는 단계와 상기 구아닌 염기가 결합된 프로브를 글라스 상에 고정시켜 HPV 유전형 분석용 DNA칩을 제조하는 단계를 포함하는 HPV 유전형 분석키트를 제조하는 방법에 관한 것이다. In addition, another preferred embodiment prepared according to the present invention is one or more selected from the group consisting of oligonucleotides having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 1 to 39 and guanine at the 5 'end of the probe complementarily binds to HPV The present invention relates to a method of manufacturing a HPV genotyping kit, comprising: binding a base and a guanine base-coupled probe onto a glass to prepare a DNA chip for HPV genotyping.

여기서, 본 발명에 따라 사용되는 서열번호 1 내지 39로 표시된 염기서열은 HPV와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 점에서, 서열번호 1 내지 39로 표시된 염기서열과 동일한 HPV를 검출하기 위하여 서열번호 1 내지 39와 상보적인 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있음은 이 분야의 기술분야에서 보통의 지식을 가지는 당업자에게는 명백한 사실이다.Here, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 39 used in accordance with the present invention is characterized in that it binds complementarily with HPV, SEQ ID NO for detecting the same HPV as the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 39 It is apparent to those skilled in the art that oligonucleotides having base sequences complementary to 1 to 39 can be included.

본 발명자들은 간단한 방법으로 환자의 유전형을 분석하여 HPV의 감염여부를 진단하고, 감염된 HPV의 종류를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구노력한 결과, HPV의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브 및 이를 포함하는 DNA 칩을 개발하였다. 또한, HPV의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩과 시료로 부터 채취한 DNA를 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 및 상기 DNA 칩과 하이브리디제이션 되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 HPV 유전형 분석키트를 제작하였고, 상기 분석키트를 사용하여 환자의 시료에서 채취한 DNA의 유전형을 분석함으로써, HPV의 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 HPV의 종류를 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to establish a method of diagnosing HPV infection by analyzing a patient's genotype by a simple method, and to establish a method for accurately determining the type of infected HPV. As a result, a probe capable of complementarily binding to DNA of HPV And a DNA chip including the same. In addition, a DNA chip comprising a probe capable of complementarily binding to the DNA of HPV and a primer for amplifying the DNA taken from the sample and amplified DNA hybridized with the DNA chip. An HPV genotyping kit including a labeling means was prepared, and by analyzing the genotype of DNA collected from a patient's sample using the analysis kit, it was possible to quickly and accurately diagnose the infection of HPV, It was confirmed that the type can be determined to complete the present invention.

HPV는 현재까지 120여개의 유형이 밝혀졌으며, 특히 자궁경부암의 관련성에 따라서 고위험군 HPV 유형과 저위험군 HPV 유형으로 구분된다. 고위험군 HPV 유형으로는 HPV -16, -18, -26, -30, -31, -33, -34, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, -73, -74 등이 있으며, 저위험군 HPV 유형으로는 HPV -2, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -40, -42, -43, -44, -55, -54 및 -57 등이 있다.More than 120 types of HPV have been identified to date, and are classified into high-risk HPV type and low-risk HPV type according to the relevance of cervical cancer. High-risk HPV types include HPV -16, -18, -26, -30, -31, -33, -34, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, and -58 , -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, -73, -74, etc. Low risk HPV types include HPV -2, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -40, -42, -43, -44, -55, -54 and -57.

우선, 본 발명에서는 자궁경부암과 관련이 있는 다양한 HPV 유형을 탐지할 수 있는 프로브를 설계하고, 상기 프로브를 이용하여 자궁경부 내 존재하고 있는 다수의 HPV 유형을 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위하여 본 발명에서는 총 72가지 HPV 유형의 전 서열 중 자궁경부암과 관련이 높은 HPV DNA 서열을 기준으로 유형 특이적 프로브를 설계하였다. 이와 같이 설계된 프로브는 다양한 HPV 유형에 대한 결합능을 확인한 후 최종적으로 39조의 프로브를 선별하게 되었다. First, in the present invention, a probe capable of detecting various types of HPV associated with cervical cancer was designed, and the probe was used to detect a plurality of HPV types existing in the cervix. To this end, in the present invention, a type-specific probe was designed based on HPV DNA sequences highly related to cervical cancer among a total of 72 HPV types. Probes designed in this way, after confirming the binding capacity for a variety of HPV types were finally selected for the set of 39 probes.

또한, 이와 같이 합성된 총 39조의 프로브의 5‘말단에 다수의 구아닌 염기를 추가하는 변형을 실시하여 상기 프로브가 DNA 칩의 표면에 형성된 글라스 슬라이드에 자발적으로 고정될 수 있도록 하였다. 이와 관련하여 상기 DNA 프로브는 바람직하게는 50 ~ 150 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 약 100 pmol/㎕의 농도로 첨가된다. In addition, modifications were made to add a plurality of guanine bases at 5 ′ ends of the total of 39 trillion probes synthesized so that the probes could be spontaneously fixed to a glass slide formed on the surface of the DNA chip. In this regard, the DNA probe may preferably be included at a concentration of 50 to 150 μg / ml, more preferably at a concentration of about 100 pmol / μl.

기존의 HPV DNA 칩은 프로브의 말단을 아민기로 변형시킨 뒤 글라스 상의 알데히드와의 시프염기반응에 따라 고정된 것을 특징으로 하고 있는데 비해 본 발명의 HPV DNA 칩은 다른 작용기 없이 때문에 9개의 구아닌 염기를 포함한 시료 DNA가 녹아있는 용액을 칩의 글라스 위에 도포하면 구아닌 염기가 자발적으로 칩 위에 고정화되는 것을 특징으로 한다. Conventional HPV DNA chip is characterized in that the end of the probe is modified by the amine group and then fixed by the base reaction with the aldehyde on the glass, whereas the HPV DNA chip of the present invention contains nine guanine bases because there is no other functional group When the solution in which the sample DNA is dissolved is coated on the glass of the chip, the guanine base is spontaneously immobilized on the chip.

본 발명에 따라 아민기와 알데히드기의 쉬프염기반응을 이용하지 않고, 프로브의 5 ‘말단에 구아닌 염기를 결합시키는 경우, 본 발명에 따른 HPV DNA 칩은 구아닌을 인식하여 프로브를 표면에 고정화 하기 때문에 DNA칩 글라스 위에 다른 작용기를 결합시키지 않고 저 비용으로 프로브와 칩을 제조할 수 있다. 또한, 종래의 DNA 칩에 비해 2시간 정도의 짧은 하이브리디제이션(hybridization) 시간과 간단한 세척과정만 필요하기 때문에 30단계에 이르는 단염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism:SNP) 판별과정을 5단계로 조정할 수 있는 장점이 있다. 나아가, 종래의 칩에서는 결합과 세척과정에서 정해진 온도를 1℃정도만 벗어나도 염기서열이 맞지 않는 DNA는 잘 떨어지지 않아 에러가 발생하는데 비해, 본 발명에 따른 HPV DNA칩은 5℃ 이상의 온도차에서도 하나의 염기서열의 차이를 쉽게 확인 할 수 있는 특성이 있다. 더불어서, 종래의 칩에서는 결과의 판독을 위해 수십 ng/ml이상의 cDNA를 사용하여 왔지만, 본 발명에 따른 구아닌 칩에서는 수십 pg/ml~수십 ng/ml의 cDNA 농도에서도 단염기다형성(SNP) 판독을 가능하게 할 수 있다. 마지막으로, 측정점 주변에 배경 형광이 많이 존재하면 판독에 많은 문제가 있지만 본 발명에 따른 구아닌 칩은 cDNA가 표면에 부착될 수 없게 하여 배경 형광을 최대한 제거하기 때문에 선명한 측정점의 형광만을 관찰할 수 있는 것이다.According to the present invention, when a guanine base is bound to the 5 'end of a probe without using a Schiff base reaction of an amine group and an aldehyde group, the HPV DNA chip according to the present invention recognizes guanine and immobilizes the probe on the surface. Probes and chips can be manufactured at low cost without combining other functional groups on the glass. In addition, compared to the conventional DNA chip, a short hybridization time of about 2 hours and a simple washing process are required, and thus, 30 steps of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) determination process can be adjusted in 5 steps. There is an advantage. Furthermore, in the conventional chip, the DNA that does not fit the base sequence does not fall well even when the temperature is separated by only 1 ° C. during the bonding and washing process, but an error occurs, whereas the HPV DNA chip according to the present invention has a temperature difference of 5 ° C. or more. There is a characteristic that can easily identify the difference between the base sequence. In addition, while conventional chips have used cDNAs of several tens of ng / ml or more for reading the results, guanine chips according to the present invention perform monobasic polymorphism (SNP) readings even at cDNA concentrations of tens of pg / ml to several tens of ng / ml. You can do that. Finally, if there is a lot of background fluorescence around the measurement point, there are many problems in reading, but the guanine chip according to the present invention can only observe the fluorescence of the clear measurement point because the cDNA cannot be attached to the surface to remove the background fluorescence as much as possible. will be.

상기와 같이 변형된 HPV 유형 특이적 프로브가 고정된 DNA 칩에 HPV 감염 여부를 검출할 수 있도록 상기 프로브와 하이브리디제이션 반응할 수 있는 총괄 프라이머(general primer)에 의하여 증폭된 HPV PCR 산물에 적절한 물질이 표지되어 있는 표지수단을 더욱 포함하는 구성을 취할 수 있다. 본 발명과 관련하여 HPV DNA 증폭 산물에 부착되는 표지 물질은 바람직하게는 형광 물질로서 Cy3가 사용될 수 있다. A substance suitable for the HPV PCR product amplified by a general primer capable of hybridizing with the probe to detect the HPV infection on the immobilized DNA chip is modified HPV type specific probe as described above It is possible to take the configuration further including the labeled means labeled. As the labeling substance attached to the HPV DNA amplification product in connection with the present invention, Cy3 may be preferably used as the fluorescent substance.

상기와 같이 구성되는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 진단 키트를 이용하여 우선 대표적인 HPV 감염세포주인 HPV-16(CaSki)과 HPV-18(HeLa) 및 HPV 비감염세포주 (K562) DNA를 표적 DNA로 하여 본 발명에서 사용된 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 후 본 발명에서 확인한 39조의 HPV 유형 특이적 프로브와의 하이브리디제이션 실험을 실시하였다.Using the diagnostic kit using the DNA microarray technology configured as described above, the present invention uses HPV-16 (CaSki), HPV-18 (HeLa) and HPV uninfected cell line (K562) DNA, which are representative HPV infected cell lines, as target DNA. After PCR using the primers used in the hybridization experiment with 39 sets of HPV type specific probes were confirmed in the present invention.

한편, 본 발명에서 합성한 39조의 HPV 유형 특이적 프로브를 사용하여 다양한 유형의 HPV 플라스미드 DNA를 표적으로 하여 하이브리디제이션을 수행한 결과 모두 이에 상응하는 특정 유형의 HPV DNA와 선택적으로 결합한다는 사실을 확인하였다. Meanwhile, as a result of performing hybridization by targeting the various types of HPV plasmid DNA using the set of 39 HPV type specific probes synthesized in the present invention, all of them selectively bind to the corresponding specific types of HPV DNA. Confirmed.

나아가, 본 발명에서 확인된 프로브를 사용하여 인체에서 수득한 샘플을 대상으로 PCR 증폭 후 DNA 칩 분석을 통해 HPV 감염 여부 및 유형을 신속하게 동정할 수 있다. 본 발명에서는 해당 임상의의 책임 하에 자궁경부 촬영진(cervicography), 조직생검(biopsy) 및 세포진도말(Pap- smear) 검사 등의 전문적 검진을 통하여 자궁경부암 관련 비정상 환자[(미세침윤암(SCC), 고급 상피 이형성증(HSIL), 저급상피 이형성증(LSIL)] 25명과 자궁경부암과 관련이 없는 것으로 판명된 정상인 15명을 대상으로 상용화되어 널리 알여진 HPV DNA 칩(기존 특허)과 비교하여 DNA 칩 실험 을 수행하였다. 그 결과 본 발명에서 확인된 프로브를 이용하여 DNA 칩 실험을 수행하면 기존 특허에 의한 HPV DNA 칩보다 훨씬 정확하게 HPV 유형을 동정할 수 있게 되었다. In addition, it is possible to quickly identify whether HPV infection and type through DNA chip analysis after PCR amplification on a sample obtained from the human body using the probe confirmed in the present invention. In the present invention, cervical cancer-related abnormal patients [(microscopic invasive cancer (SCC)) through professional examinations such as cervicography, biopsy and Pap smear examination under the responsibility of the clinician. , Advanced epithelial dysplasia (HSIL), low epithelial dysplasia (LSIL)] and DNA chip experiments compared to the well-known HPV DNA chip (formerly patented), which was commercialized in 25 healthy individuals who were found to be unrelated to cervical cancer. As a result, by performing DNA chip experiments using the probes identified in the present invention, HPV types can be identified more accurately than HPV DNA chips according to the existing patent.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are only examples for demonstrating the constitution and effects of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1 : HPV 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩의 제작Example 1 Preparation of HPV Oligonucleotide DNA Chips

본 발명에 따른 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩 또는 마이크로어레이는 올리고 뉴클레오티드 프로브의 합성과 상기 프로브를 슬라이드 상에 고정하는 단계로 구성된다. The oligonucleotide DNA chip or microarray according to the present invention consists of the synthesis of oligonucleotide probes and the fixing of the probes on a slide.

(1) HPV 올리고 뉴클레오티드 프로브의 설계(1) Design of HPV Oligonucleotide Probes

자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성(oncogenic) HPV DNA에 선택적으로 결합될 수 있는 유형 특이적 프로브로 사용될 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 설계하였다. 우선, 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)와 미국립 로스 알라모스 HPV 데이터베이스로부터 HPV-1a, -2a, -3, -4, -5, -6b, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -63, -65, -66, -67, -68, -70, -72, -73, -74, -76, -77, -80 의 총 72가지 HPV 유형의 전 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 가지고 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하여 각 그룹별 유형 특이적 염기서열을 선별한 다음, 프라이머를 선택해서 유형 특이적 프로브를 설계하였다. 이때 프로브의 길이는 30 ±3 및 40 ±2의 올리고 뉴클레오티드로 설정하여 100조의 유형 특이적 프로브를 설계하였다. Oligonucleotides have been designed that can be used as type specific probes that can selectively bind to oncogenic HPV DNA closely related to cervical cancer. First, HPV-1a, -2a, -3, -4, -5, -6b, -7, -8, -9, -10 from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the US Los Angeles Alamos HPV database. , -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26,- 27, -28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61 A total of 72 HPV types were obtained: -63, -65, -66, -67, -68, -70, -72, -73, -74, -76, -77, and -80. . Using the obtained DNA sequence, a Phylogenetic tree was prepared to select type-specific nucleotide sequences of each group, and then primers were selected to design type-specific probes. The length of the probe was set to 30 ± 3 and 40 ± 2 oligonucleotides to design 100 trillion type specific probes.

(2) 설계한 프로브의 하이브리디제이션 및 프로브 선별(2) Hybridization and Probe Selection of Designed Probes

상기 과정에서 설계한 총 100조의 프로브를 대상으로 설계 과정에서 이미 확보한 총 72가지의 다른 HPV 유형을 대상으로 가상 결합능을 분석하였다. 본 실시예에서는 자궁경부암과 관련된 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -70, -73, -82, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -34, -40, -42, -44, -54, -55, -57, -72, -74 및 -90의 종양원성 HPV 유형과 특이적으로 결합할 수 있는 것에 우선순위를 두고 선택하였으며 프로브의 명칭과 서열번호 및 유형은 하기 표 1에 제시하였다. 설명의 편의를 위하여 본 발명에서 사용되는 총 39조의 프로브는 각각 HCP-1 내지 HCP-39로 명명하였으며, 이들 프로브는 서열번호 1 내지 서열번호 39로 구성된다. A total of 72 sets of probes designed in the above process were analyzed for a total of 72 different HPV types already acquired during the design process. In this embodiment, HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58 associated with cervical cancer -59, -61, -66, -67, -68, -70, -73, -82, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -34,- The priority was given to specific binding to oncogenic HPV types of 40, -42, -44, -54, -55, -57, -72, -74 and -90, and the name and sequence of the probe The numbers and types are shown in Table 1 below. For convenience of explanation, a total of 39 sets of probes used in the present invention were named HCP-1 to HCP-39, respectively, and these probes consisted of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 39.

[표 1 : 다양한 유형의 HPV DNA와 결합할 수 있는 유형 특이적 프로브]Table 1: Type specific probes capable of binding various types of HPV DNA

(3) 선별된 유형 특이적 프로브 합성(3) Selected Type Specific Probe Synthesis

상기 과정에서 선별된 39조의 유형 특이적 프로브들은 5` 말단에 9개의 구아닌기를 포함하여 하기와 같은 과정을 통하여 합성되었다. 우선, 프로브의 합성반응은 올리고뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오티드를 고정시킨 컬럼에서 수행하였으며, 기본적으로 디트리틸레이션(detritylation), 커플링(coupling), 캡핑(capping) 및 산화(oxidation) 반응을 반복주기로 하여 선별된 프라이머의 올리고뉴클레오티드 중합반응을 행하였다. 합성 종료 후 30% 암모니아수를 컬럼에 가하여 상기 올리고머를 격리시킨 다음 55℃에서 12시간 이상 탈보호(deprotection)시켜 고속진공(Speed Vac.)으로 농축 건조하였으며 다시 역상액체크로마토그래피 및 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 순수 정제하였다. 최종 정제된 올리고머는 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.Thirty-nine type-specific probes selected in the above process were synthesized through the following process including nine guanine groups at the 5 ′ end. First, the synthesis of the probe was carried out on a column immobilized with nucleotides located at the 3 'end of the oligonucleotide, and basically detritylation, coupling, capping, and oxidation reactions were performed. Oligonucleotide polymerization of the selected primers was performed in a repetitive cycle. After completion of the synthesis, 30% ammonia water was added to the column to isolate the oligomer, followed by deprotection at 55 ° C. for at least 12 hours, concentrated to dryness with Speed Vac., And reverse phase liquid chromatography and anion exchange chromatography. Pure water purification. The final purified oligomer was quantified by measuring absorbance at 260 nm.

(4) HPV 올리고뉴클레오티드의 고정(4) fixation of HPV oligonucleotides

상기에서 합성된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기의 방법을 이용하여 DNA 칩 상에 고정하였다. 우선, 5‘ 말단이 다수의 구아닌 염기로 변형된 채로 합성된 올리고 뉴클레오티드 프로브를 2X SSC(0.05M sodium citrate, 0.45M NaCl)에 100pmol/ul이 되도록 녹인 후 5’ 말단에 첨가된 구아닌 염기와 반응되는 DNA 칩의 글라스 상에 1ul (54ug/ml)씩 스포팅(spotting)하였다.The oligonucleotide probe synthesized above was immobilized on a DNA chip using the following method. First, the oligonucleotide probe synthesized with the 5 'end modified with a plurality of guanine bases was dissolved in 2X SSC (0.05 M sodium citrate, 0.45 M NaCl) to 100 pmol / ul and then reacted with the guanine base added at the 5' end. 1 ul (54 ug / ml) was spotted on the glass of the DNA chip.

한편, 본 실시예에서는 상기 프로브와 대상 DNA의 증폭 산물과의 위치를 확인할 수 있도록 포지티브 컨트롤(positive control)로서, 서열번호 40(5‘-TTTACACC TAGTGGCTCTATGGTGTCCTCT-3')으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드를 기술한 것과 같이 5’ 말단에 구아닌 염기를 첨가하여 변형시킨 후에 동일한 절차에 따라 글라스 상에 스포팅 하였다. Meanwhile, in the present embodiment, as a positive control, the oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 40 (5'-TTTACACC TAGTGGCTCTATGGTGTCCTCT-3 ') is described as a positive control so as to identify the position of the probe and the amplification product of the target DNA. As modified by the addition of guanine base at the 5 'end as spotted on the glass following the same procedure.

이어서, 상기 스포팅한 것을 습식 반응용기 (humid chamber)에 넣고 상온에서 2시간동안 반응시켜 고정하였다. 반응 종료 후 슬라이드를 0.2% 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에서 1분간 힘차게 세척한 후 3차 증류수로 옮겨 1분간 세척하고 NaBH₄ 용액(0.1g NaBH4, 30ml phosphate buffered saline (PBS), 10ml ethanol)에서 5분간 환원시킨 후 다시 3차 증류수에 1분간 세척하고 공기 건조 후 사용할 때까지 상온의 암실에 보관하였다. Then, the spotted was placed in a wet chamber (humid chamber) and the reaction was fixed at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the slides were washed vigorously in 0.2% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution for 1 minute, transferred to tertiary distilled water for 1 minute, and washed with NaBH ₄ solution (0.1 g NaBH4, 30ml phosphate buffered saline (PBS)). , 10ml ethanol) was reduced for 5 minutes, washed again with distilled water for 1 minute, and air-dried and stored in the dark at room temperature until use.

실시예 2Example 2

본 발명의 실시예2에서는 상기 실시예 1에서 제조된 키트를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 CaSki(ATCC CRL-1550), HPV-18 감염 세포주인 HeLa(ATCC CCL-2) 및 HPV 비감염 세포주인 K562(KCLB-10243, Korean Cell Line Bank)를 대상으로 하이브리디제이션 여부를 실시하였다. In Example 2 of the present invention, the HPV-16 infected cell line CaSki (ATCC CRL-1550), HPV-18 infected cell line HeLa (ATCC CCL-2), and HPV non-infected cell line were prepared using the kit prepared in Example 1. K562 (KCLB-10243, Korean Cell Line Bank) was tested for hybridization.

(1) 세포주 정제(1) cell line purification

HPV-16 감염 세포주(CaSki)와 HPV-18 감염 세포주인(HeLa)를 배양하고 이들 을 1회 세척한 후, 현미경상에서 세포수를 계측한 다음 2 × 10⁶ 만큼의 세포를 원심분리기에서 12,000 rpm으로 2분간 회전시켜 샘플을 침전시켰다. 침전된 세포에 적당량의 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 가한 후 60 ℃에서 10분간 배양한 후 6M 염화나트륨(NaCl)을 첨가하고 12,000 rpm에서 다시 2분간 원심분리한 후 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 옮겨진 상층액에 통상의 방법에 따라 약 2.5 배의 에탄올을 첨가하여 섞은 후 12,000 rpm에서 재차 2분간 원심분리하여 펠렛을 회수한 후 적량의 70% 에탄올을 가하여 세척하였다. 최종적으로 200 ㎕의 증류수에 녹여 주형 DNA 용액으로 활용하였다. After culturing the HPV-16 infected cell line (CaSki) and HPV-18 infected cell line (HeLa) and washing them once, the number of cells was measured under a microscope and 2 × 10 ⁶ cells were centrifuged at 12,000 rpm. The sample was precipitated by rotating for 2 minutes. After appropriate amount of cell lysis buffer was added to the precipitated cells, the cells were incubated at 60 ° C for 10 minutes, 6M sodium chloride (NaCl) was added, centrifuged again at 12,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube. . About 2.5 times of ethanol was added to the transferred supernatant according to a conventional method, the mixture was mixed, centrifuged again at 12,000 rpm for 2 minutes to recover the pellet, and then washed with an appropriate amount of 70% ethanol. Finally, it was dissolved in 200 μl of distilled water and used as template DNA solution.

(2) 중합효소연쇄반응(2) polymerase chain reaction

HPV 감염 여부를 검출하기 위한 PCR 반응 용액의 조성은 10 ×버퍼 2.5 ㎕, 10 mM MgCl₂ 3.75 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, Taq 중합효소 0.5 ㎕(1 unti)를 사용하였으며, 사용되는 프라이머는 Cy3가 결합되어 있는 GP4F(5'-Cy3-GATGGTGATATGGTAGATACAGGATTTGG-3')와 GP4R(5'-Cy3-GCGT CAGAGGTTACCATAGAGCCACTAGG-3')이 각각 1 ㎕(40 pmoles), 증류수 5.2 ㎕ 및 상기에서 정제된 CaSki, HeLa 및 K562 세포주의 주형 DNA 각각 8.0 ㎕로 구성된 반응액을 총 50 ㎕로 조정하였다. PCR reaction solution for detecting HPV infection was used 10 × buffer 2.5 μl, 10 mM MgCl ₂ 3.75 μl, 10 mM dNTP 0.5 μl, Taq polymerase 0.5 μl (1 unti), the primer used was Cy3 Is combined with GP4F (5'-Cy3-GATGGTGATATGGTAGATACAGGATTTGG-3 ') and GP4R (5'-Cy3-GCGT CAGAGGTTACCATAGAGCCACTAGG-3'), respectively, 1 μl (40 pmoles), 5.2 μl of distilled water and CaSki And a reaction solution consisting of 8.0 μl each of the template DNA of the K562 cell line was adjusted to 50 μl in total.

PCR 사이클은 최초 94 ℃에서 5분간 예비 가열한 후 94 ℃에서 1분, 50 ℃에서 1 분, 그리고 72 ℃에서 1분간의 사이클을 총 40회 반복한 후 최종적으로 72 ℃에서 5분간 가열한 후 종료하였으며, 최종 반응액 5 ㎕를 DNA 사이즈 스탠더드 마커와 합게 2% 아가로스 겔에 부과하여 전기영동하였다.The PCR cycle was preheated for 5 minutes at 94 ° C, followed by 40 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 50 ° C, and 1 minute at 72 ° C, followed by heating at 72 ° C for 5 minutes. 5 μl of the final reaction solution was added to a 2% agarose gel in combination with a DNA size standard marker, followed by electrophoresis.

(3) 하이브리디제이션(Hybridization)(3) Hybridization

본 발명의 실시예에서 사용된 세포주 DNA와 합성된 총 39조의 올리고 뉴클레오티드 프로브를 고정시킨 슬라이드 기판에 PCR에 의하여 증폭된 PCR 증폭 산물을 이용하여 하이브리디제이션반응을 실시하였다. 하이브리디제이션 반응실(Hybridization reaction chamber)은 100 ㎕ 용량의 커버슬립(GRACE Bio-Labs, USA)을 사용하였다. 상기에서 얻어진 5 ㎕의 증폭산물을 95 ℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 얼음에 3분간 방치한 다음 하이브리디제이션 반응 용액으로 20 ×SSC 18 ㎕, 90% 글리세롤 50 ㎕, 50 mM 인산 버퍼 15.65 ㎕, 0.1% SDS 1.35 ㎕를 첨가하여 최종 용량을 90 ㎕로 조정한 후에 51 ℃에서 슬라이드 상에 고정된 프로브와 10분간 반응시켰다. 하이브리디제이션반응 종료 후 칩을 2 ×SSC/0.1% SDS 용액에 담근 후 30℃에서 2분간 세척한 후 4 ×SSC 용액으로 상온에서 1분간 세척한 다음 플레이트 웰을 제거하고 상온에서 짧게 세척한 다음 0.1X SSC 용액으로 한번 더 세척 후 건조시켰다. 건조된 슬라이드는 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GMS 418 Array Scanner TaKaRa)를 이용하여 형광신호를 분석하였다.A hybridization reaction was performed using PCR amplified products amplified by PCR on a slide substrate on which a total of 39 sets of oligonucleotide probes synthesized with the cell line DNA used in the embodiment of the present invention were immobilized. The hybridization reaction chamber (hybridization reaction chamber) used a 100 μl coverslip (GRACE Bio-Labs, USA). 5 μl of the amplified product obtained above was denatured at 95 ° C. for 5 minutes and immediately left on ice for 3 minutes, followed by 20 × SSC 18 μl, 90 μl of 90% glycerol, 15.65 μl of 50 mM phosphate buffer, using a hybridization reaction solution. The final dose was adjusted to 90 μl by addition of 1.35 μl of 0.1% SDS, followed by reaction for 10 minutes with the probe immobilized on the slide at 51 ° C. After completion of the hybridization reaction, the chips were immersed in 2 × SSC / 0.1% SDS solution, washed for 2 minutes at 30 ° C, washed for 1 minute at room temperature with 4 × SSC solution, the plate wells were removed, and briefly washed at room temperature. Washed once more with 0.1X SSC solution and dried. The dried slides were analyzed for fluorescent signals using a confocal laser scanner (GMS 418 Array Scanner TaKaRa).

도 1a 내지 도 1c는 각각 본 실시예에 따라 HPV-16 감염 세포주인 CaSki, HPV-18 감염 세포주인 HeLa 및 HPV 비감염 세포주인 K562를 대상으로 본 발명에서 합성된 총 39조의 프로브를 이용하여 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 원은 프로브의 종류에 따른 위치를 나타내며, 각각의 숫자는 본 발명에서 사용된 5‘말단에 구아닌 염기가 추가된 프로브의 종류에 따라 증폭되는 HPV 유형을 표시한 것이다. 즉, 16은 HCP-1 프로브, 18은 HCP-2 프로브, 26은 HCP-3 프로브, 30은 HCP-4 프로브, 31은 HCP-5 프로브, 33은 HCP-6 프로브, 35는 HCP-7 프로브, 39는 HCP-8 프로브, 45는 HCP-9 프로브, 51은 HCP-10 프로브의 각 5' 말단을 구아닌으로 변형시킨 프로브를 사용하였음을 표시한 것이다. 한편, PC는 각각의 변형된 프로브의 위치를 확인하기 위하여 사용된 포지티브 컨트롤(positive control)이다. 1A to 1C show DNA microorganisms using a total of 39 trillion probes synthesized in the present invention for CaSki, HPV-16 infected cell line, HeLa, HPV-18 infected cell line, and K562 non-infected HPV cell line according to the present embodiment. It is the photograph which performed array hybridization and the analysis result. In each figure, circles indicate positions according to the types of probes, and each number indicates the type of HPV amplified according to the type of probe to which the guanine base was added at the 5 'end used in the present invention. That is, 16 is HCP-1 probe, 18 is HCP-2 probe, 26 is HCP-3 probe, 30 is HCP-4 probe, 31 is HCP-5 probe, 33 is HCP-6 probe, 35 is HCP-7 probe , 39 is an HCP-8 probe, 45 is an HCP-9 probe, and 51 is a probe in which each 5 'end of the HCP-10 probe is modified with guanine. On the other hand, the PC is a positive control used to confirm the position of each modified probe.

도면에서 알 수 있는 바와 같이, HPV-16 감염 세포주인 CaSki를 표적 DNA로 사용하면 본 발명에서 합성된 HCP-1 프로브가 스포팅 된 영역에서만 특이적으로 교차-하이브리디제이션 반응이 일어났고(도 1a), HPV-18 감염 세포주인 HeLa를 표적 DNA로 사용하면 본 발명에서 합성된 HCP-2 프로브가 스포팅 된 영역에 대해서만 특이적으로 교차-하이브리디제이션 반응이 일어났으며(도 1b), HPV 비감염 세포주인 K-562에 대해서는 본 발명에서 합성된 프로브와 아무런 교차-하이브리디제이션 반응이 일어나지 않았음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드에 구아닌을 결합시켜 제조한 프로브는 각각 HPV-16 감염 세포주와 HPV-18 감염 세포주에 대해서만 특이적으로 결합하여 하이브리디제이션 반응을 일 으키는 것으로 확인되었다. As can be seen in the figure, using the HPV-16 infected cell line CaSki as the target DNA, the specific cross-hybridization reaction occurred only in the region where the HCP-1 probe synthesized in the present invention was spotted (FIG. 1A). Using HeLa, the HPV-18 infected cell line, as the target DNA, a cross-hybridization reaction occurred specifically for the spotted region of the HCP-2 probe synthesized in the present invention (FIG. 1B). For the cell line K-562, it was confirmed that no cross-hybridization reaction occurred with the probe synthesized in the present invention. That is, probes prepared by binding guanine to oligonucleotides consisting of nucleotide sequences according to the present invention were confirmed to specifically bind only to HPV-16 infected cell lines and HPV-18 infected cell lines, resulting in hybridization reactions. It became.

실시예 3Example 3

본 발명의 실시예3에서는 상기 실시예 2를 통하여 확인된 HPV 특이적 프로브가 고정된 진단 키트를 사용하여 보다 다양한 유형의 HPV 세포주를 대상으로 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. 즉, 실시예3에서는 종양원성 HPV 유형의 플라스미드를 포함하고 있는 E.coli 균주는 물론이고 비종양원성 HPV 유형의 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 E.coli 균주를 대상으로 DNA 칩을 이용한 키트에서의 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. In Example 3 of the present invention, using a diagnostic kit in which the HPV-specific probe identified in Example 2 was immobilized, it was confirmed whether hybridization was performed on more various types of HPV cell lines. That is, in Example 3, a hive in a kit using a DNA chip was applied to E. coli strains containing non-tumorogenic HPV type plasmid DNA as well as E. coli strains containing oncogenic HPV type plasmids. It was checked whether or not re-edification.

본 실시예에서 사용된 E.coli 균주는 다음과 같다. E. coli strains used in this example are as follows.

HPV-6b (ATCC 45150);HPV-6b (ATCC 45150);

HPV-11 (ATCC 45151);HPV-11 (ATCC 45151);

HPV-16 (ATCC 45113);HPV-16 (ATCC 45113);

HPV-18 (ATCC 45152);HPV-18 (ATCC 45152);

HPV-31 (ATCC 65446);HPV-31 (ATCC 65446);

HPV-35 (ATCC 40331);HPV-35 (ATCC 40331);

HPV-44 (ATCC 40353);HPV-44 (ATCC 40353);

HPV-56 (ATCC 40549)HPV-56 (ATCC 40549)

각각의 E.coli 균주는 37 ℃ LB 액체 배지에서 16 시간 동안 진탕 배양한 후 Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정하여 주형 DNA 용액으로 활용하였다. 이어서, 상기 실시예2에서와 동일한 절차에 따라 본 실시예에서 사용된 균주의 DNA를 PCR 증폭한 뒤, 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. Each E. coli strain was incubated for 16 hours in 37 ° C. LB liquid medium, separated and purified by Qiafilter Plasmid Maxi Kit (Cat. No. 12263, QIAGEN), and adjusted to 10 ng / μl. Utilized. Subsequently, PCR amplification of the DNA of the strain used in this example was carried out according to the same procedure as in Example 2, and then hybridization was confirmed.

도 2a 내지 도 2h는 각각 본 실시예에서 사용된 HPV 감염 플라스미드 DNA를 주형 DNA를 대상으로 본 발명에서 합성한 39조의 변형된 프로브를 사용하여 하이브리디제이션 반응을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 원은 프로브의 종류에 따른 위치를 나타내며, 각각의 숫자는 본 발명에서 사용된 5‘ 말단에 구아닌 염기가 추가된 프로브의 종류에 따라 증폭되는 HPV 유형을 표시한 것이고, PC는 변형된 프로브의 위치를 확인하기 위하여 사용된 포지티브 컨트롤(positive control)이다. 2A to 2H are photographs of hybridization reaction using HPV-infected plasmid DNA used in this example using a set of 39 modified probes synthesized according to the present invention on template DNA, and an analysis result thereof. In each figure, the circle indicates the position according to the type of probe, and each number indicates the type of HPV amplified according to the type of probe to which the guanine base is added at the 5 'end used in the present invention, and the PC is modified. Positive control used to identify the position of the probe.

도 2a는 HPV-16 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45113 균주, 도 2b는 HPV-18 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45152 균주, 도 2c는 HPV-31 DNA를 함유하고 있는 ATCC 65446 균주, 도 2d는 HPV-35 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40331 균주, 도 2e는 HPV-44 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40353 균주, 도 2f는 HPV-56 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40549 균주, 도 2g는 HPV-6b DNA를 함유하고 있는 ATCC 45150 균주, 도 2h는 HPV 11 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45151 균주로부터 얻어진 DNA를 대상 DNA로 한 것이다. Figure 2a shows the ATCC 45113 strain containing HPV-16 DNA, Figure 2b shows the ATCC 45152 strain containing HPV-18 DNA, Figure 2c shows the ATCC 65446 strain containing HPV-31 DNA, Figure 2d shows the HPV- ATCC 40331 strain containing 35 DNA, FIG. 2E shows ATCC 40353 strain containing HPV-44 DNA, FIG. 2F shows ATCC 40549 strain containing HPV-56 DNA, FIG. 2G contains HPV-6b DNA ATCC 45150 strain, FIG. 2H shows DNAs obtained from ATCC 45151 strains containing HPV 11 DNA as target DNA.

상기 도면에서 분명히 알 수 있는 것과 같이, HPV-16 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45113 균주에 대해서는 HPV-16 DNA와 특이적으로 결합하는 HCP-1 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2a), HPV-18 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45152 균주에 대해서는 HPV-18 DNA와 특이적으로 결합하는 HCP-2 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2b), HPV-31 DNA를 함유하고 있는 ATCC 65446 균주에 대해서는 HPV-31 DNA와 특이적으로 결합하는 HCP-5 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2c), HPV-35 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40331 균주에 대해서는 HPV-35 DNA와 특이적으로 결합하는 ALP-7 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2d), HPV-44 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40353 균주에 대해서는 HPV-44 DNA와 특이적으로 결합하는 HCP-33 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2f), HPV-56 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40549 균주에 대해서는 HPV-56 DNA와 특이적으로 결합하는 HCP-13 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션 반응이 일어났으며(도 2g), HPV-6b DNA를 함유하고 있는 ATCC 45150 균주에 대해서는 HPV-6 DNA와 특이적으로 결합하는 HCP-24 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션 반응이 일어났고(도 2h), HPV-11 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45151 균주에 대해서는 HPV-11 DNA와 특이적으로 결합하는 HCP-27 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션이 일어났다(도 2i). As can be clearly seen in the figure, hybridization occurred only in the region where the HCP-1 probe specifically bound to HPV-16 DNA was spotted on the ATCC 45113 strain containing HPV-16 DNA ( FIG. 2 a), hybridization occurred only in the region where the HCP-2 probe specifically bound to HPV-18 DNA was spotted on the ATCC 45152 strain containing HPV-18 DNA (FIG. 2B), and HPV- For ATCC 65446 strain containing 31 DNA, hybridization occurred only in the region where the HCP-5 probe that specifically binds HPV-31 DNA was spotted (FIG. 2C), and HPV-35 DNA was contained. For the ATCC 40331 strain hybridization occurred only in the region spotted with the ALP-7 probe that specifically binds to the HPV-35 DNA (FIG. 2D), and for the ATCC 40353 strain containing the HPV-44 DNA. With HPV-44 DNA Hybridization occurred only in the region to which the binding HCP-33 probe was quantitatively bound (FIG. 2F), and HCP specifically binding to HPV-56 DNA for the ATCC 40549 strain containing HPV-56 DNA. The hybridization reaction occurred only in the region where the -13 probe was spotted (FIG. 2g), and for the ATCC 45150 strain containing HPV-6b DNA, an HCP-24 probe that specifically binds to HPV-6 DNA was detected. Hybridization reactions occurred only in the spotted regions (FIG. 2H), and in the ATCC 45151 strain containing HPV-11 DNA only in the region to which the HCP-27 probe that specifically binds HPV-11 DNA was spotted Hybridization took place (FIG. 2I).

이러한 결과는 상기 실시예 1에 제시된 표 1의 결과와 일치하는 것임을 확인할 수 있었으며, 본 실시예에서 확인하지 못한 다른 많은 종양원성 HPV 유형에 대해서도 표 1에서와 동일한 결과가 도출될 수 있을 것으로 기대되었다. This result was confirmed to be in agreement with the results of Table 1 presented in Example 1, it was expected that the same results as in Table 1 can be derived for many other oncogenic HPV types not confirmed in this Example .

비교예 1Comparative Example 1

본 비교예에서는 종래의 세포학적 방법에 따라 인체로부터 수득된 시료의 HPV 감염여부를 확인하였다. 포천중문의과대학 차병원 부인암센터 외래 진료소를 내원한 여성들을 대상으로 담당 임상의의 책임하에 질확대경진(colposcopy) 검사, 자궁경부 촬영진(cervicography), 조직생검(biopsy), 세포진 도말(pap-smear) 등의 세포학적 방법에 따른 전문적 검진을 실시하였다. 본 비교예에서는 총 40명의 환자를 대상으로 검진을 하였으며, 세포 검사를 통한 검진 결과는 하기 표 2에 표시되어 있다. In this comparative example, HPV infection of the sample obtained from the human body was confirmed according to a conventional cytological method. For women who visited the outpatient clinic of the Women's Cancer Center of the Pocheon College of Medicine, Korea, under the responsibility of a clinician, colposcopy, cervicography, biopsy, and pap-smear smears Specialized examinations were performed according to cytological methods such as). In this comparative example, a total of 40 patients were examined, and the results of the examination through the cell test are shown in Table 2 below.

표 2에 표시되어 있는 것과 같이 자궁경부암과 관련되어 있는 비정상 환자는 저급 상피 이형성증(LSIL)으로 판정된 피검자 6, 7, 18, 19, 21, 24 및 25와 고급 상피 이형성증(HSIL)으로 판정된 피검자 2, 3, 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14 및 23과 미세침윤암(SCC)으로 판정된 피검자 1, 4, 9, 15, 16, 17, 20 및 22가 포함되었고 나머지 피검자 26 ~ 40은 자궁경부암과 관련이 없는 정상인으로 판정되었다. As shown in Table 2, abnormal patients associated with cervical cancer were identified as subjects 6, 7, 18, 19, 21, 24, and 25 and advanced epithelial dysplasia (HSIL). Subjects 2, 3, 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, and 23 and subjects 1, 4, 9, 15, 16, 17, 20, and 22, which were determined to be microinvasive cancers (SCCs), Subjects 26 to 40 were determined to be normal subjects not associated with cervical cancer.

[표 2 : 세포 검사법에 따른 임상 시험 결과]Table 2: Clinical Trial Results by Cytometry

HSIL^* : 고급 상피 이형성증(High Squamous Intraepithelial lesion)HSIL ^* : High Squamous Intraepithelial Lesions

SCC^** : 미세침윤암(Squamous Cell Carcinoma)SCC ^** : Squamous Cell Carcinoma

LSIL^*** : 저급 상피 이형성증(Low Squamous Intraepithelial lesion)LSIL ^*** : Low Squamous Intraepithelial Lesions

비교예 2Comparative Example 2

본 비교예2에서는 상기 비교예1의 검사 결과, 자궁경부암 관련 비정상 환자 25명과 자궁경부암과 관련 없는 정상인으로부터 얻은 시료를 대상으로 종래의 DNA칩(기존 특허)으로 검사를 수행하였다. 본 비교예에 따른 DNA 칩 검사에 의한 검진 결과는 하기 표 3의 기존 특허에 표시하였다. In Comparative Example 2, as a result of the test of Comparative Example 1, a sample obtained from 25 patients with cervical cancer-related abnormalities and a normal person not associated with cervical cancer was tested with a conventional DNA chip (existing patent). Examination results by DNA chip test according to the comparative example is shown in the existing patent of Table 3.

표 3에 표시한 것과 같이, 비교예 1에서 자궁경부암과 관련이 있는 것으로 판정된 총 25명의 환자 중 피검자 1은 HPV-26에, 피검자 2는 HPV-51에, 피검자 3은 HPV-52에, 피검자 4는 HPV-68에, 피검자 5는 HPV-16,56에, 피검자 6은 HPV-59에, 피검자 7은 HPV-56,59,70에, 피검자 8은 HPV-53에, 피검자 9는 HPV-33에, 피검자 10은 HPV-90, 피검자 11은 HPV-70, 피검자 12은 HPV-16, 피검자 13은 HPV-18, 피검자 14은 HPV-16, 피검자 15은 HPV-31, 피검자 16은 HPV-35, 피검자 17은 HPV-56, 피검자 18은 HPV-6b, 피검자 19은 HPV-11, 피검자 20은 HPV-44, 피검자 21은 HPV-54, 피검자 22는 HPV-16,59, 피검자 23은 HPV-31,35, 피검자 24는 HPV-13,82, 피검자 25는 HPV-59,73에 각각 감염된 것으로 검진되었다. As shown in Table 3, out of a total of 25 patients determined to be related to cervical cancer in Comparative Example 1, Subject 1 was HPV-26, Subject 2 was HPV-51, Subject 3 was HPV-52, Subject 4 to HPV-68, Subject 5 to HPV-16,56, Subject 6 to HPV-59, Subject 7 to HPV-56,59,70, Subject 8 to HPV-53, Subject 9 to HPV -33, subject 10 is HPV-90, subject 11 is HPV-70, subject 12 is HPV-16, subject 13 is HPV-18, subject 14 is HPV-16, subject 15 is HPV-31, subject 16 is HPV -35, Subject 17 HPV-56, Subject 18 HPV-6b, Subject 19 HPV-11, Subject 20 HPV-44, Subject 21 HPV-54, Subject 22 HPV-16,59, Subject 23 HPV-31,35 and Subject 24 were tested for HPV-13,82 and Subject 25 were infected with HPV-59 and 73, respectively.

한편, 비교예 1에서 자궁경부암과 관련이 없는 것으로 판정된 피검자 26 내지 40으로부터 수득한 시료에 대해서는 HPV에 감염되지 않은 것으로 판명되었다. On the other hand, in Comparative Example 1, it was found that the samples obtained from the subjects 26 to 40 that were not related to cervical cancer were not infected with HPV.

[표 3 : 기존 특허와 본원발명에 따른 DNA 칩을 통한 HPV 유형 검진 결과][Table 3: HPV type screening result through DNA chip according to the existing patent and the present invention]

-* : No Typing-*: No Typing

- : No Typing-: No Typing

실시예 4Example 4

본 실시예4에서는 상기 비교예 1의 세포학적 검진 결과 자궁경부암과 관련이 있는 것으로 검진된 피검자로부터 얻은 시료를 대상으로 본 발명에서 제조된 진단 키트를 사용하여 마이크로어레이를 이용한 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. 여기서, 본 발명의 일실시예에 따른 DNA칩 검사에 의한 검진 결과는 상기 표 3의 본원발명에 표시하였다. In Example 4, whether or not hybridization using a microarray was performed using a diagnostic kit prepared in the present invention on a sample obtained from a subject who was found to be related to cervical cancer as a result of the cytological examination of Comparative Example 1. It was. Here, the results of the examination by the DNA chip test according to an embodiment of the present invention are shown in the present invention of Table 3 above.

실험은 상기 비교예1에서 자궁경부암과 관련이 있는 것으로 판정된 피검자 1 내지 피검자 25의 자궁경부에서 샘플을 채취한 후 원심분리기에서 12,000 rpm으로 2분간 회전시켜 샘플을 침전시켰다. 침전된 세포에 적당량의 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 가한 후 60℃에서 10분간 배양한 후 6M 염화나트륨(NaCl)을 첨가하고 12,000 rpm에서 다시 2분간 원심분리한 후 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 옮겨진 상층액에 통상의 방법에 따라 약 2.5 배의 에탄올을 첨가하여 섞은 후 12,000 rpm에서 재차 2분간 원심분리하여 펠렛을 회수한 후 적량의 70% 에탄올을 가하여 세척하였다. 최종적으로 200 ㎕의 증류수에 녹여 주형 DNA 용액으로 활용하였다. 이어서 상기 실시예 2 및 상기 실시예 3과 동일한 절차에 따라 피검자로부터 얻은 DNA 시료를 PCR 과정을 통하여 증폭한 뒤, 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. In the experiment, the sample was taken from the cervix of Subjects 1 to 25 determined to be related to cervical cancer in Comparative Example 1, and the sample was precipitated by rotating at 12,000 rpm for 2 minutes in a centrifuge. After appropriate amount of cell lysis buffer was added to the precipitated cells, the cells were incubated at 60 ° C for 10 minutes, 6M sodium chloride (NaCl) was added, centrifuged again at 12,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube. . About 2.5 times of ethanol was added to the transferred supernatant according to a conventional method, the mixture was mixed, centrifuged again at 12,000 rpm for 2 minutes to recover the pellet, and then washed with an appropriate amount of 70% ethanol. Finally, it was dissolved in 200 μl of distilled water and used as template DNA solution. Subsequently, DNA samples obtained from the subjects were amplified by a PCR process according to the same procedure as in Example 2 and Example 3, and then hybridization was confirmed.

도 3a 내지 도 3j는 각각 본 실시예에 따라 자궁경부암과 관련 있는 것으로 판정된 피검자로부터 얻은 시료를 대상으로 본 발명에서 합성된 총 39조의 프로브를 이용한 진단 키트를 사용하여 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 원은 프로브의 종류에 따른 위치를 나 타내며, 각각의 숫자는 본 발명에서 사용된 5‘ 말단에 구아닌 염기가 추가된 프로브의 종류에 따라 증폭되는 HPV 유형을 표시한 것이고, PC는 프로브의 위치를 알려주는 포지티브 컨트롤이다. 3A to 3J show DNA microarray hybridization using a diagnostic kit using a total of 39 sets of probes synthesized in the present invention for samples obtained from subjects determined to be related to cervical cancer according to the present embodiment. It is a photograph performed and the analysis result. Circles in each figure indicate the position according to the type of probe, and each number indicates the type of HPV amplified according to the type of probe to which the guanine base is added at the 5 'end used in the present invention. Is a positive control that tells you where the probe is.

도 3a는 피검자 1, 도 3b는 피검자 2, 도 3c는 피검자 3, 도 3d는 피검자 4, 도 3e는 피검자 5, 도 3f는 피검자 6, 도 3g는 피검자 7, 도 3h는 피검자 8, 도 3i는 피검자 9, 도 3j는 피검자 10, 도 3k는 피검자 11, 도 3l은 피검자 12, 도 3m은 피검자 13, 도 3n은 피검자 14, 도 3o는 피검자 15, 도 3p는 피검자 16, 도 3q은 피검자 17, 도 3r은 피검자 18, 도 3s는 피검자 19, 도 3t는 피검자 20, 도 3u는 피검자 21, 도 3v는 피검자 22, 도3w는 피검자 23, 도 3x는 피검자 24, 도 3y는 피검자 25로부터 수득된 DNA 샘플을 대상으로 한 것이다. FIG. 3A shows a subject 1, FIG. 3B shows a subject 2, FIG. 3C shows a subject 3, FIG. 3D shows a subject 4, FIG. 3E shows a subject 5, FIG. 3F shows a subject 6, FIG. 3G shows a subject 7, FIG. 3H shows a subject 8, and FIG. 3I. Figure 3j is a subject 10, Figure 3k is a subject 11, Figure 3l is a subject 12, Figure 3m is a subject 13, Figure 3n is a subject 14, Figure 3o is a subject 15, Figure 3p is a subject 16, Figure 3q is a subject 17, FIG. 3R shows the subject 18, FIG. 3S shows the subject 19, FIG. 3T shows the subject 20, FIG. 3U shows the subject 21, FIG. 3V shows the subject 22, FIG. 3W shows the subject 23, FIG. 3x shows the subject 24, and FIG. 3Y shows the subject 25. The DNA samples obtained were subjected to.

도면에서 알 수 있는 것과 같이, 피검자 1은 HPV-26 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-3 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3a), 피검자 2는 HPV-51 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-10 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3b), 피검자 3은 HPV-52 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-11 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3c), 피검자 4는 HPV-68 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-19 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3d), 피검자 5는 HPV-16,56 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-1,13 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3e), 피검자 6은 HPV-59 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-15 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3f), 피검자 7은 HPV-56,59,70 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-13,15,20 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3g), 피검자 8은 HPV-53 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-12 프로브가 스포팅된 영역(도 3h), 피검자 9는 HPV-33 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-6 프로브가 스포팅된 영역(도 3i), 피검자 10은 HPV-90 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-39 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3j), 피검자 11은 HPV-70 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-20 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3k), 피검자 12는 HPV-16 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-01 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3l), 피검자 13은 HPV-18 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-02 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3m), 피검자 14는 HPV-16 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-01 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3n), 피검자 15는 HPV-31 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-05 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3o), 피검자 16은 HPV-35 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-07 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3p), 피검자 17은 HPV-56 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-13 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3q), 피검자 18은 HPV-06 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-23 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3r), 피검자 19는 HPV-11 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-27 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3s), 피검자 20은 HPV-44 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-36 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3t), 피검자 21은 HPV-54 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-37 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3u), 피검자 22는 HPV-16,59 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-01,25 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3v), 피검자 23은 HPV-31,35 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-05,07 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3w), 피검자 24는 HPV-13,82 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-22,28 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3x), 피검자 25는 HPV-59,73 DNA에 특이적으로 결합하는 HCP-15,27 프로브가 스포팅된 영역에 대해서(도 3y) 각각 특이적인 교차-하이브리디제이션이 일어났음을 알 수 있다. As can be seen in the figure, subject 1 has an HCP-3 probe that specifically binds to HPV-26 DNA (FIG. 3A), and subject 2 has an HCP that specifically binds to HPV-51 DNA. For the region where the -10 probe was spotted (FIG. 3B), subject 3 was for the region where the HCP-11 probe was specifically bound to HPV-52 DNA (FIG. 3C), and subject 4 was for the HPV-68 DNA. For regions where the HCP-19 probe that specifically binds was spotted (FIG. 3D), and subject 5 was spotted against the region where the HCP-1,13 probe that specifically binds to HPV-16,56 DNA (FIG. 3E). ), Subject 6 had a spotted region of the HCP-15 probe that specifically binds to HPV-59 DNA (FIG. 3F), and subject 7 had a HCP-13 that specifically bound to HPV-56,59,70 DNA. For regions where the 15,20 probe was spotted (FIG. 3G), subject 8 was spotted with an HCP-12 probe spotted specifically for binding to HPV-53 DNA. 3h), subject 9 is spotted with an HCP-6 probe that specifically binds to HPV-33 DNA (FIG. 3I), and subject 10 is spotted with an HCP-39 probe that specifically binds to HPV-90 DNA (FIG. 3J), subject 11 had an area where the HCP-20 probe specifically bound to HPV-70 DNA was spotted (FIG. 3K), and subject 12 had a HCP- that specifically bound to HPV-16 DNA. For the region where the 01 probe was spotted (FIG. 3L), subject 13 was for the region where the HCP-02 probe was specifically bound to HPV-18 DNA (FIG. 3M), and subject 14 was specific for the HPV-16 DNA. For the region to which the HCP-01 probe that binds specifically binds (FIG. 3N), subject 15 compared to the region to which the HCP-05 probe specifically bound to HPV-31 DNA (FIG. 3O), and subject 16 For regions spotted with HCP-07 probes that specifically bind to HPV-35 DNA (FIG. 3P), Subject 17 is specific for HPV-56 DNA For the region spotted with HCP-13 probe that binds to (FIG. 3Q), subject 18 for the region spotted with HCP-23 probe that specifically binds to HPV-06 DNA (FIG. 3R), and subject 19 for HPV For the region spotted with HCP-27 probe that specifically binds to -11 DNA (FIG. 3S), subject 20 is for the spotted region with HCP-36 probe that specifically binds to HPV-44 DNA (FIG. 3T). ), Subject 21 was directed to the area spotted with the HCP-37 probe that specifically binds to HPV-54 DNA (FIG. 3u), and subject 22 was HCP-01,25 that specifically binds to HPV-16,59 DNA. For areas where the probes were spotted (FIG. 3v), subject 23 was for the regions where the HCP-05,07 probes specifically bound to HPV-31,35 DNA (FIG. 3w), and subjects 24 were HPV-13 For the region spotted with the HCP-22,28 probe that specifically binds to, 82 DNA (FIG. 3x), subject 25 specifically identified HPV-59,73 DNA. HCP-15,27 probe with respect to the spotting region (Fig. 3y) each specific cross-hybridization can be seen that the hive taken place piperidinyl happened.

이와 같은 결과를 정리하면 상기 표 3에서 보는바와 같이, 피검자1은 종래의 세포학적 방법에 따라 미세침윤암(SCC)을 가지고 있지만 기존 특허에 따른 DNA칩으로는 이를 검출해내지 못한 것에 비하여 본원발명에 따른 DNA칩에 의하면 HPV-26을 가지고 있는 것으로 확인 되었고, 피검자8은 종래의 세포학적 방법에 따라 고급 상피 이형성증(HSIL)을 가지고 있지만 기존 특허에 따른 DNA칩으로는 이를 검출해내지 못한 것에 비하여 본원발명에 따른 DNA칩에 의하면 HPV-53을 가지고 있는 것으로 확인 되었고, 피검자10은 종래의 세포학적 방법에 따라 고급 상피 이형성증(HSIL)을 가지고 있지만 기존 특허에 따른 DNA칩으로는 이를 검출해내지 못한 것에 비하여 본원발명에 따른 DNA칩에 의하면 HPV-90을 가지고 있는 것으로 확인 되었고, 피검자11은 종래의 세포학적 방법에 따라 고급 상피 이형성증(HSIL)을 가지고 있지만 기존 특허에 따른 DNA칩으로는 이를 검출해내지 못한 것에 비하여 본원발명에 따른 DNA칩에 의하면 HPV-70을 가지고 있는 것으로 확인 되었고, 피검자21은 종래의 세포학적 방법에 따라 저급 상피 이형성증(LSIL)을 가지고 있지만 기존 특허에 따른 DNA칩으로는 이를 검출해내지 못한 것에 비하여 본원발명에 따른 DNA칩에 의하면 HPV-54을 가지고 있는 것으로 확인 되었고, 피검자24는 종래의 세포학적 방 법에 따라 저급 상피 이형성증(LSIL)을 가지고 있지만 기존 특허에 따른 DNA칩으로는 이를 검출해내지 못한 것에 비하여 본원발명에 따른 DNA칩에 의하면 HPV-13,82를 가지고 있는 것으로 확인 되었다. In summary, as shown in Table 3, Subject 1 has a microinvasive cancer (SCC) according to a conventional cytological method, but the present invention compared to the DNA chip according to the existing patent has not detected this According to the DNA chip according to the confirmed that it has HPV-26, Subject 8 has advanced epithelial dysplasia (HSIL) according to the conventional cytological method, but the DNA chip according to the existing patent did not detect this compared to DNA chip according to the present invention was confirmed to have HPV-53, Subject 10 has advanced epithelial dysplasia (HSIL) according to the conventional cytological method, but DNA chip according to the existing patent did not detect this Compared to the DNA chip according to the present invention, HPV-90 was found. D. Although it has advanced epithelial dysplasia (HSIL), the DNA chip according to the present invention was found to have HPV-70, whereas the DNA chip according to the present invention did not detect it. According to the method, the patient has low epithelial dysplasia (LSIL), but the DNA chip according to the present invention was found to have HPV-54, whereas the DNA chip according to the present invention was detected. According to the cytological method, it has low epithelial dysplasia (LSIL), but the DNA chip according to the present invention was found to have HPV-13,82 compared to the DNA chip according to the existing patent.

이와 같이, 본 발명에 따른 프로브는 기존 특허에 비해서 높은 특이도와 민감도를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 본 발명에 따른 프로브는 자궁경부암과 밀접한 관련을 가지고 고위험군에 속하는 HPV 유형 22종류를 전부 포함하고, 저위험군에 속하는 HPV 유형 15종류중 13종류를 포함하며, 여기에 추가로 4종류를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브이다. 따라서 본 발명에 따라 서열번호 1 내지 39의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드는 39종류의 HPV 유형에 대하여 기존 특허에 비해 민감도와 정확도가 현저하게 우수한 프로브에 관한 것이다. As such, the probe according to the present invention was confirmed to have high specificity and sensitivity compared to the existing patent. The probe according to the present invention is closely related to cervical cancer and includes all 22 types of HPV types belonging to the high risk group, and includes 13 types of 15 types of HPV types belonging to the low risk group, further including four more types. It is a probe characterized by. Therefore, the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 39 according to the present invention relates to a probe with remarkably superior sensitivity and accuracy compared to the existing patents for 39 types of HPV.

실시예 5Example 5

본 실시예5에서는 상기 비교예 1의 세포학적 검진 결과 자궁경부암과 관련이 없는 것으로 검진된 피검자로부터 얻은 시료를 대상으로 본 발명에서 제조된 진단 키트를 사용하여 마이크로어레이를 이용한 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. In Example 5, whether the hybridization using a microarray was confirmed using a diagnostic kit prepared in the present invention for a sample obtained from a subject who was determined to be not related to cervical cancer as a result of the cytological examination of Comparative Example 1. It was.

본 실시예에서는 상기 실시예 4와 동일한 절차에 따라 자궁경부암과 관련이 없는 피검자로부터 수득한 DNA 시료를 PCR 과정을 통하여 증폭한 뒤, 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. In the present embodiment, according to the same procedure as in Example 4, DNA samples obtained from the subjects not related to cervical cancer were amplified through a PCR process, and then hybridization was confirmed.

도 4a 내지 도 4o는 각각 본 실시예에 따라 자궁경부암과 관련이 없는 피검자로부터 수득된 DNA 시료를 대상으로 본 발명에서 합성된 총 39조의 프로브를 이용하여 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 원은 프로브의 종류에 따른 위치를 나타내며, 각각의 숫자는 본 발명에서 사용된 5‘ 말단에 구아닌 염기가 추가된 프로브의 종류에 따라 증폭되는 HPV 유형을 표시한 것이고, PC는 프로브의 위치를 알려주는 포지티브 컨트롤이다. Figures 4a to 4o are DNA microarray hybridization using a total of 39 sets of probes synthesized in the present invention for DNA samples obtained from a subject not associated with cervical cancer according to the present embodiment and its The result of the analysis. In each figure, the circle indicates the position according to the type of probe, and each number indicates the type of HPV amplified according to the type of the probe to which the guanine base is added at the 5 'end used in the present invention, and the PC is a probe. Positive control that tells the location of the.

도 4a는 피검자 26, 도 4b는 피검자 27, 도 4c는 피검자 28, 도 4d는 피검자 29, 도 4e는 피검자 30, 도 4f는 피검자 31, 도 4g는 피검자 32, 도 4h는 피검자 33, 도 4i는 피검자 34, 도 4j는 피검자 35, 도 4k는 피검자 36, 도 4l은 피검자 37, 도 4m은 피검자 38, 도 4n은 피검자 39, 도 4o는 피검자 40으로부터 수득된 DNA 시료를 대상 DNA로 한 것이다. 4A is a subject 26, FIG. 4B is a subject 27, FIG. 4C is a subject 28, FIG. 4D is a subject 29, FIG. 4E is a subject 30, FIG. 4F is a subject 31, FIG. 4G is a subject 32, FIG. 4H is a subject 33, FIG. 4I. 4A is a subject 35, FIG. 4K is a subject 36, FIG. 4L is a subject 37, FIG. 4M is a subject 38, FIG. 4N is a subject 39, and FIG. 4O is a DNA sample obtained from a subject 40. .

도면에서 확인할 수 있는 것과 같이 세포학적 검진에 의하여 자궁경부암과 관련이 없는 것으로 판정된 피검자로부터 얻은 DNA 시료에 대해서는 아무런 교차-하이브리디제이션 반응이 일어나지 않았으며, 이는 종래의 DNA 칩 검진결과와 일치하는 것임을 확인하였다. As can be seen in the figure, no cross-hybridization reaction occurred for DNA samples obtained from the subjects determined to be unrelated to cervical cancer by cytological examination, which is consistent with the conventional DNA chip examination. It was confirmed that.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다. In the above description of the preferred embodiment of the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that various modifications and changes can be made without departing from the spirit of the present invention. It will also be apparent from the appended claims that such modifications and variations are all within the scope of the present invention.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 자궁경부암과 밀접하게 관련이 있는 HPV 유형 각각에 유형 특이적으로 결합될 수 있는 신규한 39종류의 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 프로브를 이용한 HPV 유전형 분석용 DNA칩 및 분석키트를 이용하여 39종류의 HPV 각 유형을 현저히 우수한 정확도로 검출하여 자궁경부암 진행 여부를 신속하게 다량으로 진단할 수 있는 효과가 있다.
As described above, the present invention provides a novel 39 kinds of oligonucleotide probes that can be type-specifically bound to each of HPV types closely related to cervical cancer, and DNA chips and analysis for HPV genotyping using the probes. By using the kit, each type of 39 types of HPV can be detected with remarkably high accuracy, which can rapidly diagnose a large amount of cervical cancer.

더불어, 프로브와 슬라이드 글래스의 결합 및 결합과정을 개선함하여 제조공정을 단축하고 에러발생을 줄임으로서 HPV 존재여부를 정확하게 검출하고 자궁경부암과의 관련성을 신속하게 예측하여 진단할 수 있는 효과가 있다.

In addition, by improving the coupling and bonding process of the probe and the slide glass, it is possible to shorten the manufacturing process and reduce the occurrence of errors to accurately detect the presence of HPV and to quickly predict and diagnose the relationship with cervical cancer.

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Claims

Probe characterized in that at least one selected from the group consisting of oligonucleotides having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 39 and complementarily binds to human papillomavirus (HPV).

According to claim 1, wherein the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 39 is HPV-16, 18, 26, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, respectively , 59, 61, 66, 67, 68, 70, 73, 82, 3, 6, 7, 10, 11, 13, 32, 34, 40, 42, 44, 54, 55, 57, 72, 74, 90 A probe characterized by being able to combine with a type of HPV.

(delete)

According to claim 1, wherein the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 36 are respectively HPV-16, 18, 26, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52 belonging to a high risk group , 53, 56, 57, 58, 59, 61, 67, 68, 70, 73, 74 and the above SEQ ID NO: 17, 23, 24, 26, 27, 29 and SEQ ID NO: 30 to The base sequence represented by number 35 can be combined with HPV-3, 6, 7, 10, 11, 32, 34, 40, 42, 44, 54, 55, 66 types belonging to the low risk group, respectively. .

HPV genotyping DNA chip comprising a probe according to any one of claims 1 to 4.

The HPV genotyping assay of claim 5, further comprising oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 40 (5'-TTTACACC TAGTGGCTCTATGGTGTCCTCT-3 ') as a positive control for identifying the position of the probe. DNA chip.

The DNA chip for HPV genotyping according to claim 5, wherein the concentration of the probe is 50 to 150 µg / ml.

As a positive control for identifying the position of the DNA chip for HPV genotyping and the probe according to claim 5, the oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 40 (5'-TTTACACC TAGTGGCTCTATGGTGTCCTCT-3 ') is further included. HPV genotyping kit.

At least one selected from the group consisting of oligonucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 39, binding the guanine base to the 5 'end of the probe complementarily binding to human papillomavirus (HPV);

The method of manufacturing a HPV genotyping kit comprising the step of fixing the guanine base-coupled probe on a glass to prepare a DNA chip for HPV genotyping.