KR20020096663A - Methods for Dectecting Human Papillomavirus and Detection Kit Thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 자궁경부암의 원인 균인 인간 유두종바이러스(Human Papillomavirus:HPV) 유전자형(genotype) 검사방법 및 그에 사용되는 키트에 대한 발명으로, 특히 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction:PCR)방법과 올리고염기 칩(Oligonucleotide Chip)을 이용한 HPV 유전자형을 검사방법과 그에 사용되는 키트에 관한 발명이다.The present invention relates to a human papillomavirus (HPV) genotype testing method and a kit used therein, in particular, a polymerase chain reaction (PCR) method and an oligobase chip. The invention relates to a method for testing HPV genotype using an oligonucleotide chip and a kit used therefor.
즉 본 발명은 HPV가 감염된 환자의 자궁경부로부터 채취된 시료에서 HPV의 검출과 유전자형을 검사 할 수 있는 방법 및 검사를 위한 시약을 포함한다.That is, the present invention includes a method for detecting HPV and a test for genotype in a sample collected from the cervix of a patient infected with HPV, and a reagent for testing.
자궁경부암 검사는 주로 세포 도말(PAP semear)과 현미경을 이용하여 자궁경부 세포의 이형성 여부로 검사하고 있다. 그렇지만 이 방법은 사람의 시각에 의존하고 있어 위 양성 및 위 음성의 결과가 생기는 경우가 많다. 또한 세포 도말법은 세포의 이형성을 구별 할 수 있는 고도의 숙달된 인력이 필요하기 때문에 자궁경부암을 정확하고 쉽게 검사 할 수 있는 방법이 필요하다. 최근 분자생물학적 방법을 통하여 자궁경부암의 원인이 인간 유두종바이러스(Human Papillomavirus:HPV)임이 규명되어 HPV 유전자 검사가 세포 도말 검사법보다 효과적이라는 보고가 있다. HPV는 약 8,000개의 염기쌍으로 이루어진 환상의 이중 나선 DNA 바이러스로써 지금까지 약 80여 종류의 서로 다른 유전자형의 HPV가 알려져 있으며 자궁경부암의 원인에 따라 크게 저 위험군(HPV-6,-11,-42,-43,-44,-55형)과 고 위험군(HPV -16,-18.-31.-33.-35,-39,-45,-51,-52,-56,-58,-59형)유전자형으로 분류되어 있다.(참고문헌: Schiffiman MM;J Natl Cancer Inst1992; 84:394-398, IARC working Group, IRAC, Lyon; 1995, Bosch FX et al.,J Natl Cancer Inst1995; 87; 796-802, Ferenczy A,Int J Gynecol Cancer1994; 4; 73-78, Kataja V, et al., 1992; Sex Transm Dis; 19; 154) 따라서 HPV 유전자형 검사는 자궁경부암의 진단과 예방에 매우 중요한 검사이다. 지금까지 HPV 유전자형을 검사하는 분자생물학적 방법은 써던 블롯팅 교잡(Southern blotting hybridization)법, 중합효소 연쇄반응-제한효소 분절길이 다형성(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism), DNA-RNA교잡법을 이용한 하이브리드 켑쳐법(Hybride Capture, Digene사, 미국)등을 이용하고 있다.(참고문헌:Smith HL, et al.,J Gen Virol,1992; 73;3236-3268, Lungnu OX, et al.,JAMA1989; 267; 2493-2496, Manos MM, et al.,Cancer Cell1989; 7; 209-214, Lorincz AT,J Obstet Genaecol Res,1996; 22; 629-639) 그렇지만 이들 방법들은 방사선 동위원소와 암 유발성 유전자 염색 시약 등의 사용으로 인한 위험성, 검체 처리과정의 어려움, 많은 시간과 노력의 소요 등의 문제점들은 일상적 검사 법으로 사용하는데 어려움이 있다. 최근 많은 검사실에서 사용되고 있는 미국의 Digene사의 Hybride Capture HPV 검사 키트는 HPV 유전자형을 고 위험군과 저 위험군으로만 분류 검사하고 각 유전자형을 검사 할 수 없으며 소요 비용도 고가이다. 따라서 HPV 유전자형을 대량의 검체로부터 상기의 문제점들이 없이 일상적으로 누구나 편리하게 사용 할 수 있는 HPV 유전자형 검사 법이 필요하다. 최근 한 장의 현미경용 유리판 위에서 수십에서 수만 종류의 유전자를 동시에 검사 할 수 있는 유전자 칩(DNA Chip)이 개발 되었다.(참고문헌:Schena M, et al.,Science1995; 270; 467-470, Ramsay G,Nat Biotechnol. 1998; 16; 40-44, Joos BAnal Biochem1997; 247; 96-101) 이를 이용하여 수십 종류의 HPV 유전자형을 동시에 검사 할 수 있는 HPV 유전자 칩의 개발을 가능하게 하였다.Cervical cancer screening is mainly screened for cervical cell dysplasia by using a plasma smear and a microscope. However, this method relies on human vision and often results in stomach positive and negative. In addition, cell smearing requires a highly skilled workforce to distinguish cell dysplasia, and therefore, a method for accurate and easy screening of cervical cancer is needed. Recently, the molecular biological method has revealed that the cause of cervical cancer is human papillomavirus (HPV), and there is a report that the HPV genetic test is more effective than the cell smear test. HPV is a cyclic double-stranded DNA virus of about 8,000 base pairs, with about 80 different genotypes of HPV known to date, and low risk groups (HPV-6, -11, -42,) depending on the cause of cervical cancer. -43, -44, -55 type and high risk group (HPV -16, -18.-31.-33.-35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59) (Ref .: Schiffiman MM; J Natl Cancer Inst 1992; 84: 394-398, IARC working Group, IRAC, Lyon; 1995, Bosch FX et al., J Natl Cancer Inst 1995; 87 796-802, Ferenczy A, Int J Gynecol Cancer 1994; 4; 73-78, Kataja V, et al., 1992; Sex Transm Dis; 19; 154) Therefore, HPV genotyping is very useful for the diagnosis and prevention of cervical cancer. It is an important test. Molecular biological methods for testing HPV genotypes have been based on Southern blotting hybridization, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism, and DNA-RNA hybridization. Hybrid capture method (Hybride Capture, Digene, USA) is used. (Ref .: Smith HL, et al., J Gen Virol, 1992; 73; 3236-3268, Lungnu OX, et al., JAMA 1989 267; 2493-2496, Manos MM, et al., Cancer Cell 1989; 7; 209-214, Lorincz AT, J Obstet Genaecol Res , 1996; 22; 629-639). Risks due to the use of sex gene staining reagents, difficulties in sample processing, and a lot of time and effort are difficult to use for routine testing. Digene's Hybride Capture HPV test kit, recently used in many laboratories, classifies HPV genotypes into high- and low-risk groups, cannot test each genotype, and is expensive. Therefore, there is a need for HPV genotyping that can be conveniently used by anyone in the daily routine without the above problems from a large number of specimens. Recently, a DNA chip has been developed that can simultaneously test tens to tens of thousands of genes on a single glass plate for microscopy (Schena M, et al., Science 1995; 270; 467-470, Ramsay). G, Nat Biotechnol . 1998; 16; 40-44, Joos B Anal Biochem 1997; 247; 96-101), which enabled the development of HPV gene chips capable of simultaneously testing dozens of HPV genotypes.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 수십 종류의 HPV 유전자형을 동시에 검사 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.The present invention solves the above problems, and the object of the present invention is to provide a method capable of simultaneously testing dozens of types of HPV genotype.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 HPV 유전자 칩을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit comprising the HPV gene chip for use in the method.
도 1은 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 나타낸 사진.Figure 1 is a photograph showing the HPV genotyping oligobase chip.
도 2는 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 키트를 구성하고 있는 성분을 나타내고 있는 사진.Figure 2 is a photograph showing the components constituting the oligobase chip kit for HPV genotyping.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자궁경부로부터 세포를 채취하는 단계, 상기 세포로부터 DNA를 추출하는 단계, 상기 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하는 단계, 증폭된 HPV유전자를 HPV 올리고칩에 교잡반응을 시키는 단계 및 상기 반응에서 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 검사방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of extracting cells from the cervix, extracting DNA from the cells, amplifying the DNA using PCR, hybridizing the amplified HPV gene to HPV oligochip It provides a HPV genotyping method comprising the step of reacting and identifying the HPV genotype specifically bound in the reaction.
본 발명에 있어서, 상기의 DNA추출에 사용되는 시약은 단백질분해효소를 포함하고, 상기의 PCR에 사용되는 HPV유전자 PCR 프라이머의 서열은 서열정보 1∼2에 기재된 서열이고, 상기의 올리고칩에 붙어 있는 유전자형 탐침은 서열정보 3∼21인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the reagent used for DNA extraction includes a protease, and the sequence of the HPV gene PCR primer used for the PCR is the sequence described in SEQ ID NOS: 1 to 2, and is attached to the oligochip. Genotype probes are characterized in that the sequence information 3 to 21.
또, 본 발명은 a) 자궁경부검체 채취기구 및 DNA 추출 시약, b) HPV-PCR용 시약, 및In addition, the present invention is a) cervical sample collection device and DNA extraction reagent, b) HPV-PCR reagents, and
c) HPV 유전자형검사용 올리고 칩을 포함하는 HPV 유전자형 검사용 키트를 제공한다.c) provides an HPV genotyping kit comprising an oligo chip for HPV genotyping.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 구성은 3개 부분으로 나룰 수 있는데 첫째는 자궁경부로부터 세포를 채취하여 DNA를 오염 없이 손쉽게 추출하는 과정과, 둘째는 추출된 DNA로부터 PCR을 이용하여 HPV 유전자들을 특이적으로 증폭하는 과정, 그리고 셋째는 증폭된 HPV 유전자의 유전자형을 분석하기 위해 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 제작하고 검사하는 방법으로 이루어져 있다.The composition of the present invention can be divided into three parts: firstly, the process of extracting DNA from the cervix and extracting DNA easily without contamination; and secondly, specifically amplifying HPV genes using PCR from the extracted DNA. And third, HPV genotyping oligobase chips are constructed and tested to analyze the genotypes of the amplified HPV genomes.
또한 각 과정에서 필요한 시약과 기구들을 편리하게 사용 할 수 있게하여HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 검사 키트를 개발하였다.In addition, we have developed an oligobase chip test kit for HPV genotyping by enabling convenient use of reagents and instruments required for each process.
본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 검사 방법은 하기와 같은 기술로 구성된다.The HPV genotyping oligobase chip test method of the present invention comprises the following techniques.
1) 자궁경부로부터 세포를 채취하고 보관하기 위해 세포 채취용 솔(PAP-brush)를 이용하여 세포를 채취하고 세포 보존액이 담겨진 튜브에 보존하고,1) In order to collect and store cells from the cervix, collect them using a PAP-brush and store them in a tube containing cell preservatives.
2) 원심분리하여 세포만 모은 다음 DNA을 추출하기 위해 세포 용해액으로 세포를 용해하여 DNA을 얻고,2) Centrifuge to collect only the cells and then lyse the cells with cell lysate to extract DNA to obtain DNA.
3) 이것의 일부를 HPV 유전자에 특이적인 프라이머(primer)인 GP+5와 5 말단에 Cy3 형광 물질이 붙어 있는 GP+6(Cy3-GP+6)프라이머와 PCR 시약을 사용하여 PCR과정으로 HPV 유전자를 증폭 한 후,3) Part of this is HPV by PCR using GP + 5, a primer specific for HPV gene, GP + 6 (Cy3-GP + 6) primer with Cy3 fluorescent material attached to 5 terminal, and PCR reagent. After amplifying the gene,
4) 증폭된 HPV 유전자의 유전자형을 분석하기 위한 올리고염기 칩 제작은 19종류의 HPV 유전자에 특이적으로 결합하는 19종의 HPV 탐침(Probe)올리고염기 들을 약 30개의 염기(nucleotide)크기로 5 말단에 아민기(-NH2)가 붙어 있도록 합성하여 제작 한 후,4) The fabrication of oligobase chip to analyze genotype of amplified HPV gene consists of 19 HPV probe oligobases that specifically bind to 19 types of HPV genes. After synthesized and prepared so that the amine group (-NH2) attached to,
5) 마이크로어레이어(Microarray)장치를 이용하여 각 탐침을 일정한 간격과 배열로 칩 제작용 유리판 위에 붙인뒤 세척하여 고착시키고,5) Using a microarray device, attach each probe to the glass plate for chip manufacturing at regular intervals and arrangement, and then wash and fix it.
6) 여기에 3)의 HPV 유전자 PCR 산물을 일정한 온도에서 교잡반응(Hybridization)시킨 다음 세척하여 비 특이적으로 결합된 것들을 저거한 후,6) Here, hybridization of the HPV gene PCR product of 3) at a constant temperature, followed by washing to remove non-specifically bound ones,
7) 칩 스캐너(Scanner)에서 HPV 탐침에 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을확인하는 과정의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 검사 방법이다.7) Oligobase chip test method for HPV genotyping in the process of identifying HPV genotype specifically bound to HPV probe in chip scanner.
상기의 HPV 유전자의 PCR에 사용되는 프라이머인 GP+5와 Cy3-GP+6의 염기서열 구조는 표 1에, 19종류의 HPV 유전자형에 특이적인 탐침 19종의 염기서열 구조는 표 2에 기재되어 있다.The base sequence structures of GP + 5 and Cy3-GP + 6, which are primers used for PCR of the HPV gene, are shown in Table 1, and the base sequence structures of 19 kinds of probes specific to 19 types of HPV genotypes are shown in Table 2. have.
본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 검사 키트를 제작하기 위해 하기와 같은 시약, 기구 및 장치로 구성하였다.To prepare the HPV genotyping oligobase chip test kit of the present invention, it was composed of the following reagents, instruments and devices.
1) 자궁경부에서의 세포 채취와 세포 보존을 위하여,1) To collect and preserve cells in the cervix,
① 자궁경부 세포 채취용 솔(PAP-brush, 상아메디컬, 한국)① Cervical cell collection brush (PAP-brush, ivory medical, Korea)
② 세포 보존액과 보존액 튜브② Cell Preservation and Preservation Tube
2) 세포로부터 DNA추출하기 위하여,2) to extract DNA from cells,
① 단백질 분해효소(proteinase K)와 세포용해 완충용액① Proteinase K and cell lysis buffer
3) HPV 유전자의 PCR을 위하여,3) for PCR of the HPV gene,
① HPV PCR 프라이머 GP+5와 Cy3-GP+6 각 20p㏖/㎕① 20 mmol / μl of HPV PCR primer GP + 5 and Cy3-GP + 6
② 10XPCR 완충용액② 10XPCR buffer solution
③ Taq DNA polymerae 250unit(Amplitaq, PE, 미국)③ Taq DNA polymerae 250unit (Amplitaq, PE, USA)
4) HPV 유전자형을 검사하기 위한 올리고염기 칩 제작을 위하여,4) To fabricate an oligobase chip for testing HPV genotype,
① 5 말단에 아민기를 붙인 19종류의 HPV 유전자 올리고 탐침들, 농도 50p㏖/㎕① 19 types of HPV gene oligo probes with an amine group at the 5 terminal, concentration 50 mmol / μl
② 표면에 알데하이드(aldehyde)기로 코팅된 현미경용 유리슬라이드② Microscopic glass slide coated with aldehyde group on the surface
③ 마이크로어레이어 장치(Bio-Robotics, UK)③ Microarray device (Bio-Robotics, UK)
④ 유리슬라이드를 8구역으로 분활하기 위한 교잡반응 챔버(Multiwell hybridization chamber, Sigma, 미국)④ Hybridization reaction chamber to divide glass slide into 8 zones (Multiwell hybridization chamber, Sigma, USA)
⑤ 0.2%SDS 용액, NaBH4(Sigma, 미국), PBS용액, 100% 에탄올⑤ 0.2% SDS solution, NaBH4 (Sigma, USA), PBS solution, 100% ethanol
5) HPV 올리고염기 칩에 HPV 유전자 PCR 산물 교잡반응을 위하여,5) For HPV gene PCR product hybridization reaction on HPV oligobase chip,
① 4)에서 제작된 8구역으로 분활된 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩① HPV genotyping oligobase chip divided into 8 zones produced in 4)
② 12XSSPE 교잡반응 완충용액② 12XSSPE Hybridization Buffer
③ 3N NaOH③ 3N NaOH
④ 3N HCl④ 3N HCl
⑤ 1M Tris-HCl(pH 7.2)⑤ 1M Tris-HCl (pH 7.2)
⑥ 10% SDS⑥ 10% SDS
6) 교잡반응이 끝난 올리고염기 침 세척을 위하여,6) For washing oligobase saliva after hybridization reaction,
① 3XSSPE 용액, 1XSSPE 용액① 3XSSPE solution, 1XSSPE solution
7) HPV 올리고염기 칩 판독을 위하여,7) For reading HPV oligobase chip,
① 마이크로어레이어 스캐너(GSI Lumonics, USA)등으로 구성되어 있다.① It is composed of microarray scanner (GSI Lumonics, USA).
상기 시약, 기구 및 장비들로 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩을 제작하여 자궁경부에서 채취된 검체로부터 HPV유전자형을 할 수 있으며 이를 바탕으로 하기와 같은 구성으로 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 검사를 키트화 하였다.The oligobase chip for HPV genotyping using the reagents, instruments, and equipment can be used to perform HPV genotyping from specimens obtained from the cervix. Based on this, the oligobase chip test for HPV genotyping can be performed. Kited.
1) 자궁경부에서 세포채취와 보존을 위한,1) for the collection and preservation of cells in the cervix,
① 자궁경부 세포 채취용 솔(PAP-brush)① Cervical cell collection brush (PAP-brush)
② PBS 세포보존액이 담겨져 있는 15㎖ 튜브② 15ml tube containing PBS cell preservative
2) 세포로부터 DNA 추출을 위한,2) for DNA extraction from cells,
① 단백질 분해효소(proteinase K, Sigma, 미국)가 담겨진 1.5㎖ 튜브① 1.5ml tube containing proteinase K, Sigma, USA
3) HPV 유전자 PCR을 위한,3) for HPV gene PCR,
① GP+5와 Cy3-GP+6 프라이머가 각 각 20p㏖/㎕ 농도의 1.5㎖ 튜브① 1.5 ml tube with GP + 5 and Cy3-GP + 6 primers at 20 mmol / μl concentration
② 10XPCR 완충용액의 1.5㎖튜브② 1.5ml tube of 10XPCR buffer solution
③ Taq DNA polymerase 250unit(Ampli Tag., PE, 미국)의 1.5㎖튜브③ 1.5ml tube of Taq DNA polymerase 250unit (Ampli Tag., PE, USA)
4) HPV 유전자 PCR 산물의 HPV 유전자형 검사를 위한,4) for HPV genotyping of HPV gene PCR products,
① HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩① HPV genotyping oligobase chip
② 8 well 교잡반응 챔버(Multiwell hybridization chamber, sigma, 미국)② 8 well hybridization chamber (Multiwell hybridization chamber, sigma, USA)
상기의 키트를 사용하여 자궁경부로부터 세포를 채취된 세포에서 DNA를 간편히 추출하고 HPV 유전자를 PCR로 증폭 한후 HPV 유전자형을 HPV 올리고염기 칩으로 검사하는데 약 8시간이 소요된다. 또한 한 장의 HPV 올리고염기 칩에서 8검체를 동시에 검사 할 수 있다.Using the kit described above, it is easy to extract DNA from cells obtained from the cervix, and amplify the HPV gene by PCR, and then it takes about 8 hours to test the HPV genotype with the HPV oligobase chip. In addition, eight samples can be tested simultaneously on one HPV oligobase chip.
본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 키트를 이용하여 HPV 유전자형 검사를 일상적 검사 방법으로 사용 될 수 있으며 현재 HPV 유전자 검사를 위해 수입되고 있는 HPV 검사 키트 (Hybride Capture, Digene, 미국)를 대체 할 수 있는 산업적으로 매우 유용한 발명이다.The HPV genotyping oligobase chip kit of the present invention can be used as a routine testing method for HPV genotyping and can replace the HPV testing kit (Hybride Capture, Digene, USA) currently imported for HPV gene testing. It is an industrially useful invention.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to non-limiting examples.
실시예 1 : 자궁경부로부터 세포의 채취와 보존Example 1 Collection and Preservation of Cells from the Cervical Part
자궁경부세포 채취 솔을 이용하여 자궁경부로부터 세포를 채취하여 5㎖ PBS 보존액이 담겨져 있는 15㎖튜브에 넣고 솔의 끝 부분을 절단 한 후 마개를 닫고 4℃ 에 보관하였다.Cells were collected from the cervix using a cervical cell harvesting brush and placed in a 15 ml tube containing 5 ml PBS preservative. The tip of the brush was cut and the cap was closed and stored at 4 ° C.
실시예2 : 세포로부터 DNA 추출 방법Example 2 DNA Extraction from Cells
실시예1의 튜브를 2분 동안 강력하게 교반하여 솔에 붙어 있는 세포가 보존액으로 떨어져 나오도록 하였다. 원심분리기에서 3,000g로 10분간 원심분리하여 세포를 침전 시키고 상층액을 제거하였다. 세포는 혈청 분리관(메디랜드, 한국)을 사용하여 1.5㎖ 원심분리 튜브로 옮긴 후, 여기에 100ul 세포 용해완충용액(10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.5% Tween20, 200㎍/㎕ proteinase K, pH8.3)을 첨가하여 55℃ 항온조에서 2시간 동안 가온 한 후 95℃ 에서 10분간 더 가온하여 proteinase K의 활성도를 제거하였다.The tube of Example 1 was vigorously stirred for 2 minutes to allow cells attached to the brush to fall out of the preservative. The cells were precipitated by centrifugation at 3,000 g for 10 minutes in a centrifuge and the supernatant was removed. Cells were transferred to a 1.5 ml centrifuge tube using a serum separation tube (Mediland, Korea), followed by 100ul cell lysis buffer solution (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 0.5% Tween20, 200 ㎍). / Μl proteinase K, pH8.3) was added, and then warmed in a 55 ° C. incubator for 2 hours and then further warmed at 95 ° C. for 10 minutes to remove proteinase K activity.
이상은 자궁경부로부터 채취된 세포에서 HPV유전자의 PCR과정에 사용하기 위한 DNA 추출 방법으로 수십개의 검체를 2시간30분 정도로 신속하고 편리하게 처리 할 수 있으며 검체 상호간에 오염을 방지하여 위 양성의 결과가 없었다. 또한 기존의 추출 방법에서 사용하는 유기용매를 사용하지 않기 때문에 환경오염의 위험성과 불편함을 제거 할 수 있었다.The above is a DNA extraction method for the PCR process of HPV genes from cells collected from the cervix, which can process dozens of samples quickly and conveniently for about 2 hours and 30 minutes and prevents contamination between samples. There was no. In addition, the organic solvents used in the existing extraction methods were not used, which eliminated the risks and inconveniences of environmental pollution.
실시예 3 : PCR에 의한 HPV 유전자의 증폭 방법.Example 3: Amplification method of HPV gene by PCR.
500ul PCR 튜브에 실시예2의 추출된 DNA 5㎕를 GP+5, Cy3-GP+6 프라이머 각각 20p㏖씩, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 200㎕ 씩, 그리고 Tag DNA polymerase ℃ 2.5unit가 포한된 1XPCR 완충용액(50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH8.4, 1,5mM MgCl2, 0.1% TritonX-100)에 첨가 한 후 증류수로 총 부피가 50㎕되게 하였다. 간단한 혼합과 원심분리하여 자동온도 조절 장치(9600 thermal cycler, PE, 미국)에서 95℃ 4분 동안 가온 한 다음 95℃ 50초, 55℃ 20초, 72℃ 20초의 반복되는 과정을 42회 실시하고 마지막회는 72℃ 에서 7분 동안 더 가온하여 4℃에 보관하였다. 이때의 소요되는 시간은 2시간30분 정도이다.5 μl of the extracted DNA of Example 2 in a 500ul PCR tube containing 20 mmol of GP + 5 and Cy3-GP + 6 primers, 200 μl of dATP, dGTP, dCTP, dTTP, and 2.5 units of Tag DNA polymerase ℃ 1XPCR buffer solution (50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH8.4, 1,5mM MgCl 2 , 0.1% TritonX-100) was added and the total volume was 50 μl with distilled water. After simple mixing and centrifugation, warm up at 95 ℃ for 4 minutes in a thermostat (9600 thermal cycler, PE, USA) and repeat 42 times of 95 ℃ 50 seconds, 55 ℃ 20 seconds, 72 ℃ 20 seconds. The last round was further warmed at 72 ° C. for 7 minutes and stored at 4 ° C. The time required is about 2 hours 30 minutes.
[표 1] HPV 유전자 PCR 프라이머 염기서열 구조[Table 1] HPV gene PCR primer sequence structure
실시예 4 : HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 제작 방법.Example 4 HPV Genotyping Oligobase Chip Fabrication Method
가) 마이크로어레이어 장치에서 상기의 시약, 기구 및 장비항에서 준비된 현미경용 유리 슬라이더를 8개 구역으로 분활하여 50p㏖/㎕농도로 맞춰진 19종류의 HPV 유전자형 탐침(염기서열 구조는 표2에 기재함)을 각 구역 마다 19종류의 탐침을 동일하게 붙여 주었다.A) 19 kinds of HPV genotype probes set at 50 mmol / μl concentration by dividing the microscope glass sliders prepared in the above reagent, instrument and equipment sections in a microarray apparatus (base sequence structure is shown in Table 2). 19 types of probes are affixed to each zone.
나) 상기 가)의 탐침이 붙어 있는 유리 슬라이더를 500㎖ 0.2% SDS 용액에서2분 동안 2번씩 세척하고 증류수로 2번 세척 한 후 1.3g NaBH4와 375㎖ PBS 그리고 125㎖ 에탄올이 혼합된 용액에 넣고 5분 동안 격렬히 교반하여 준 후, 다시 0.2% SDS 용액에서 1분 씩 3번의 세척과 증류수로 1분씩 2번 세척 한 후 물기를 제거하여 건조 후 밀봉된 상자에 보관하여 사용하였다.B) The glass slider with the probe of a) is washed twice in 500 ml 0.2% SDS solution for 2 minutes and washed twice with distilled water and then mixed with 1.3 g NaBH4, 375 ml PBS and 125 ml ethanol. After the mixture was stirred vigorously for 5 minutes, washed again three times with 0.2% SDS solution and three times with distilled water and then with two minutes of distilled water, and then dried and stored in a sealed box.
[표 2] HPV 유전자형 탐침의 염기서열 구조(5'- 3' )[Table 2] Sequence structure of HPV genotype probe (5'-3 ')
실시예 5 : HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 이용한 HPV 유전자 PCR산물의 유전자형 검사 방법.Example 5 HPV Genotyping Test Method for genotyping of HPV gene PCR products using oligobase chips.
가) HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 준비 방법.A) HPV genotyping oligobase chip preparation method.
실시예4에서 제작된 HPV 올리고염기 칩에 시약 및 기구 항에서 준비된 8well 교잡반응 챔버를 단단히 부착시켜 8개 구역으로 분활된 올리고염기 칩을 준비하였다.The 8 well hybridization chamber prepared in the reagent and instrument section was firmly attached to the HPV oligobase chip prepared in Example 4, thereby preparing an oligobasic chip divided into 8 zones.
제1도.Figure 1.
나) HPV 유전자 PCR 산물과 올리고염기 칩의 교잡반응 방법.B) Hybridization method of HPV gene PCR product and oligobase chip.
500㎕ PCR 튜브에 PCR 산물 20㎕, 증류수 30㎕ 그리고 3N NaOH 5㎕를 첨가 한 후 상온에서 5분 동안 방치하여 HPV 유전자 PCR 산물를 단일 염기가닥(single strand DNA)으로 변성(denaturation)시킨 다음 1M Tris-HCl(pH7.2) 완충용액 2.5㎕와 3N HCl 5㎕를 첨가하여 얼음 위에서 5분간 방치하여 중화시킨 후, 여기에 12XSSPE 교잡반응 완충용액 50㎕와 10% SDS 용액 0.5㎕를 첨가하여 최종 농도가 6XSSPE으로 되게하고 총 부피가 100㎕된 교잡반응 물을 가)에서 준비된 올리고염기 칩의 각 well의 구멍에 1 well당 1검체씩 조심스럽게 주입하였다. well의 구멍은 테이프로 밀봉하여 증발을 방지 한 후 42℃ 항온 Oven에서 2시간 동안 30회/분의 속도로 회전하였다.20 μl of PCR product, 30 μl of distilled water and 5 μl of 3N NaOH were added to a 500 μl PCR tube, and left at room temperature for 5 minutes to denature the HPV gene PCR product into single strand DNA, followed by 1M Tris 2.5 μl of HCl (pH 7.2) buffer and 5 μl of 3N HCl were added and neutralized for 5 minutes on ice, followed by 50 μl of 12XSSPE hybridization buffer solution and 0.5 μl of 10% SDS solution. Was 6XSSPE and carefully mixed with 1 specimen per well into the hole of each well of the oligobase chip prepared in (a). The hole of the well was sealed with tape to prevent evaporation, and then rotated at a rate of 30 times / min for 2 hours in a constant temperature oven at 42 ° C.
다) 교잡반응 후 올리고염기 칩의 세척 방법.C) Method of washing oligobase chip after hybridization reaction.
3XSSPE 세척 완충용액 200㎖에서 2분간, 1XSSPE 세척 완충용액 200㎖에서 2분간 씩 50회/분으로 흔들어 주면서 세척 한 후 물기를 조심스럽게 제거하여 빛이 차단된 곳에 보관하였다.After shaking for 2 minutes in 200 ml of 3XSSPE washing buffer and shaking 50 times per minute for 2 minutes in 200 ml of 1XSSPE washing buffer, water was carefully removed and stored in a light-blocked environment.
라) 세척 후 올리고염기 칩의 HPV 유전자형 확인 방법.D) HPV genotyping of oligobase chips after washing.
칩 스켄너를 550㎖의 여기 파장과 570㎚의 방출 파장을 검출 할 수 있도록 설정한 후 다)에서 세척된 올리고염기 칩을 넣고 HPV 유전자형의 탐침에 HPV 유전자 산물이 결합하여 발색된 탐침의 위치를 판독함으로서 HPV 유전자형을 확인하였다(표 3).After setting the chip scanner to detect the excitation wavelength of 550 ml and the emission wavelength of 570 nm, add the oligobase chip washed in c) and read the position of the developed probe by binding the HPV gene product to the HPV genotype probe. HPV genotype was confirmed (Table 3).
[표 3] HPV 유전자형 검사 올리고 칩에 의해 확인된 HPV 유전자형 및 위치Table 3 HPV genotype and location identified by HPV genotyping oligo chip
HPV 코인펙션HPV Coinfection
실시예 6 : HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 이용한 자궁경부 세포 검체의 검사Example 6 HPV Genotyping Tests of Cervical Cell Specimens Using Oligobase Chips
가) 실시예4에서 제작된 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 실시예5의 검사 방법에 따라 자궁경부로부터 채취된 세포 검체들 중에서 세포 도말법으로 상피 이형증으로 판명된 149개의 검체를 대상으로 HPV 유전자형을 검사하였다.(표 4)A) HPV genotyping test prepared in Example 4 The HPV genotype was tested on 149 specimens of the cell specimens obtained from the cervix according to the test method of Example 5 and found to be epithelial dysplasia by cell smearing. It was examined (Table 4).
[표 4] HPV 올리고염기 칩 검사에 의한 자궁경부 세포 검체의 HPV 유전자형Table 4 HPV genotypes of cervical cell samples by HPV oligobase chip test
이상의 자궁경부의 세포 검체는 삼성 제일병원의 산부인과에 내원한 환자들로부터 채취하여 검사한 결과이다.The above cervical cell samples were obtained from patients who visited the department of gynecology at Samsung Cheil Hospital.
더욱이, 본 발명의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩과 시약들을 키트화 하면 다량의 검체에 대한 HPV 유전자형 검사를 시간과 노력을 줄이며 손쉽게 할 수 있는 바, 본 발명의 보호 범위에는 검사 방법 및 검사 키트 역시 포함되는 것으로, 키트화하는 방법을 하기 실시예 7에 기재한다.Moreover, kitting oligobase chips and reagents for HPV genotyping of the present invention can reduce the time and effort for HPV genotyping for large amounts of samples, and the protection scope of the present invention includes test methods and test kits. Also included is a method of kitting described in Example 7 below.
실시예 7:Example 7:
HPV 유전자형 검사를 위한 검사 방법과 올리고염기 칩의 검사 키트화 방법.Test method for HPV genotyping and test kitization of oligobase chips.
본 발명의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩의 검사 키트는 자궁경부로부터 세포를 채취하여 DNA를 추출하는 기구와 시약을 키트화 한 부분과, HPV 유전자를 PCR하는 과정의 시약을 키트화 한 부분, 그리고 HPV 유전자 PCR산물의 유전자형을 확인하기 위한 HPV 유전자 올리고 칩의 3부분으로 구성된다. (도 3)The test kit of the oligobase chip for HPV genotyping of the present invention comprises a kit kit for retrieving cells from the cervix and a DNA extraction kit, a kit kit for reagents for PCR of the HPV gene, And it consists of three parts of the HPV gene oligo chip to identify the genotype of the HPV gene PCR product. (Figure 3)
가) 자궁경부로부터 세포 채취와 DNA 추출 방법의 키트화A) Kitization of cell collection and DNA extraction methods from the cervix
실시예 1과 2에서 기재 한바에 따라 제조된 기구와 시약을 키트화 하는데, 그 구성은 ①.자궁경부 채취 솔과 ②.5ml PBS용액이 담겨진 15ml 튜브, ③.단백질 분해효소(protienase K, Sigma, 미국)가 20mg/ml 농도로 담겨진 1.5ml 튜브로 구성되어 있는데 ①.은 실온에 보관하고 ②.는 4℃에 그리고 ③.은 -20℃에 보관한다. 이 키트는 50개의 자궁경부 세포 검체를 처리 할 수 있는 분량이며 처리 조작 및사용 방법은 실시예1 및 2에서와 동일하다.Kits were prepared for the instruments and reagents prepared as described in Examples 1 and 2, which consist of a 15 ml tube containing ①.cervical sampling brush and ②.5 ml PBS solution, and ③ a protein protease (protienase K, Sigma). , USA) consists of 1.5ml tube containing 20mg / ml concentration. ①. Is stored at room temperature, ②. Is stored at 4 ℃ and ③. Is stored at -20 ℃. The kit is capable of processing 50 cervical cell specimens and the processing operations and use methods are the same as in Examples 1 and 2.
나) HPV 중합효소연쇄반응(PCR)을 위해 구성된 시약의 키트화B) kit the reagents configured for HPV polymerase chain reaction (PCR);
실시예 3에 기재 한 바에 따라 HPV 유전자의 HPV 유전자의 PCR을 위해 사용되는 시약을 키트화 하였다. 그 구성은 ①. HPV 유전자 PCR 프라이머 인 GP+5와 Cy3-GP+6 프라이머 가 각 각 20pmol/l, 50ul 부피로 담겨진 1.5ml 튜브, ②. 10X PCR 완충용액 1ml가 포함된 1.5ml 튜브, ③. 10mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP들의 혼합 용액)용액 100ul가 포함된 1.5ml튜브, ④. Taq. DNA중합효소(Amplitaq, PE, 미국)가 200unit 포함된 1.5ml 튜브로 구성되어 있다. 이들 모두는 -20℃ 냉동고에 보관하고 사용 방법은 실시예 3에서와 동일하다.Reagents used for PCR of the HPV gene of the HPV gene were kitted as described in Example 3. The composition is ①. 1.5ml tube containing HPp gene PCR primers GP + 5 and Cy3-GP + 6 primers in 20 pmol / l and 50ul volume, respectively. 1.5 ml tube containing 1 ml of 10 × PCR buffer, ③. 1.5 ml tube containing 100ul of 10mM dNTP (mixed solution of dATP, dGTP, dCTP, dTTP) solution, ④. Taq. It consists of a 1.5 ml tube containing 200 units of DNA polymerase (Amplitaq, PE, USA). All of these were stored in a -20 ° C. freezer and the method of use was the same as in Example 3.
다) HPV 유전자 올리고염기 칩 키트화C) HPV gene oligobase chip kit
실시예 4의 제작 방법에 따라 제작 한 HPV 올리고염기 칩은 1장으로 8개의 검체를 처리 할 수 있는 올리고염기 칩 10장으로 구성하였고 사용 방법은 실시예 5에서와 동일하다.The HPV oligobase chip prepared according to the fabrication method of Example 4 was composed of 10 oligobase chips capable of processing eight specimens in one sheet, and the method of use was the same as in Example 5.
이상의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 키트는 50개의 자궁경부 세포 검체를 처리 할 수 있도록 구성하였다(도 2).Oligobase chip kit for the HPV genotype test was configured to process 50 cervical cell samples (Fig. 2).
본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩에 의한 HPV 유전자형 검사 결과 표 3과 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이 자궁경부 세포에 존재하는 19종류의 HPV 유전자형을 특이도(specificity)높게 검사 할 수 있으며 기존의 검사 방법으로는 확인 할 수 없는 HPV가 중복 감염된 경우도 검사 할 수 있었다. 또한 자궁경부 세포 검체로부터 DNA를 추출하여 올리고염기 칩에 의한 HPV 유전자형을 확인하기까지 약 8시간 내로 신속하게 검사 할 수 있는 산업적으로 매우 유용한 HPV 유전자형 검사 방법임을 알 수 있다.HPV genotyping test results of the HPV genotyping test oligobase chip of the present invention as shown in Table 3 and Table 4 can be tested with high specificity of 19 kinds of HPV genotypes present in cervical cells HPV could also be tested for duplicate infections that could not be identified using the test method. In addition, it can be seen that it is an industrially useful HPV genotyping method that can be quickly tested within about 8 hours to extract the DNA from cervical cell samples and confirm the HPV genotype by the oligobase chip.
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