KR100625759B1

KR100625759B1 - 멀티플렉스 ｐｃｒ을 이용한 메티실린-내성 황색포도상구균의 검출방법

Info

Publication number: KR100625759B1
Application number: KR1020040042545A
Authority: KR
Inventors: 김근성; 김영준; 조준일
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2004-06-10
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2006-09-26
Also published as: KR20050117281A

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 PCR을 이용한 메티실린-내성 황색 포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus)의 검출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 분석하고자 하는 핵산 시료를 femA 유전자, mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR 증폭하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 방법을 이용한 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 메티실린-내성 황색 포도상구균에 특이적인 세 종류의 유전자를 표적 유전자로 선정함으로써 고감도로 메티실린 내성 황색 포도상구균을 검출할 수 있는 효과가 있으며, 멀티플렉스 PCR 증폭을 2단계로 나누어 수행함으로써 증폭된 산물의 전기영동 후 생성된 밴드의 강도가 일정하게 나타나 여러 종류의 유전자를 동시에 증폭하는 종래의 방법에 비해 밴드의 불균형으로 인한 오류가 최소화할 수 있는 효과가 있다.

멀티플렉스 PCR, 메티실린-내성 황색 포도상구균

Description

멀티플렉스 ＰＣＲ을 이용한 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법{Method for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus by multiplex PCR}

도 1은 본 발명의 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법에 따라 PCR 증폭을 동시에 수행함으로써 수득된 PCR 증폭 산물과 PCR 증폭을 2단계로 나누어 수행함으로써 수득된 PCR 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타낸 것이다(M : 분자량 마커, 레인 1: PCR 증폭을 동시에 수행한 경우, 레인 2: PCR 증폭은 2단계로 나누어 수행한 경우).

도 2는 본 발명의 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법에 따라 PCR 증폭을 2단계로 나누어 수행한 멀티플렉스 방법에 의한 MRSA의 검출결과를 나타낸 것이다(M: 분자량 마커, 레인 1: MRSA 표준균주, 레인 2: MSSA 표준균주, 레인 3: 임상에서 분리된 MRSA 균주, 레인 4: 임상에서 분리된 MSSA 균주, 레인 5: 김밥에서 분리된 MSSA 균주).

황색 포도상구균(Stapylococcus aureus)은 마이크로코카세아에(Micrococcace ae)과에 속하는 그람 양성 구균으로서 자연계에 널리 분포하고 있으며 사람의 피부에 존재하는 균주로서 실생활과 매우 밀접한 관계가 있다.

그러나, 상기 황색 포도상구균은 적절한 환경 하에서 심각한 감염을 유발할 수 있는 기회 감염균(opportunist pathogen)으로서 화농성 감염과 치명적인 패혈증을 유발하고, 내독소(enterotoxin)를 분비하며, 식중독의 원인이 되기도 한다. 특히 임상에서 면역력이 저하된 환자가 황색 포도상구균에 의해 감염되면 여러 합병증을 유발할 수 있으므로 많은 주의가 요구되고 있는 실정이다. 황색 포도상구균에 의해 유발되는 감염증으로는 폐렴(pneumonia), 유선염(mastitis), 피부 감염증, 골수염(osteomyelitis), 심내막염(endocarditis) 및 균혈증(bacteremia) 등이 알려져 있다.

상기와 같은 황색 포도상구균의 감염증을 치료하기 위하여 페니실린G 및 β- 락탐(β-lactam)과 같은 여러 항생제가 개발된 바 있다(Barski, P., et al., Mol. Cell. Probes. 10(6):471-475, 1996; Chamers, Henry F. Clin. Microbiol. Rev. 10(4):781-791, 1997; Hussain, Z. et al., J. Clin. Microbiol. 38(6):2051-2054, 2000). 그러나, 상기 항생제에 대한 내성을 가진 균주가 출현하면서 새로운 항생제의 개발이 요구되었다. 이에 따라 메티실린(methicillin)이라는 항생제가 새롭게 개발되어 황색 포도상구균의 감염증을 치료하기 위한 주요 치료제로 1960년대 초반부터 사용되었다.

그러나, 임상에서 분리되는 황색 포도상구균 중에서 메티실린에 대하여서도 감수성을 상실하여 내성 혹은 매우 높은 수준의 저항성을 지니는 내성균주가 분리되기 시작하였다. 즉, 1961년 영국에서 메티실린-내성 황색 포도상구균(methicill in-resistant Staphylococcus aureus; 이하 MRSA라 함)이 처음 발견된 후 세계 각처에서 보고 되기 시작했고 현재 전체 황색 포도상구균 중 MRSA 분리빈도가 점점 높아지고 있는 실정이다(Weller T. M. A., J. Hosp. Infect., 44(3):160-172, 2000). 또한, 상기 MRSA는 메티실린 외에도 β-락탐(β-lactam) 계열의 항생제, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로리데스(macrolides)와 같은 여러 종류의 항생제에도 광범위하게 내성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기와 같이 MRSA가 여러 종류의 항생제에 내성을 나타낼 뿐 만 아니라 여러 가지 성장 조건에 영향을 받으며 매우 복잡한 유전적 배경을 가지고 있기 때문에 일반적인 항균제 내성 검사로는 상기 MRSA를 검출하기 어려운 실정이다.

또한, 주로 임상에서만 검출되었던 MRSA가 식품에서도 분리가 되는 것이 보 고 되고 있어(Jones, T. F. et al., Emer. Infect. Dis. 8(1):82-84, 2002) 임상에서 뿐 만 아니라 식품취급자 및 소비자에게 MRSA에 대한 감염발생 위험이 높아지고 있다. 따라서, MRSA에 대한 시급한 제어 및 역학조사가 요구된다.

최근 들어 상기 MRSA를 검출하기 위한 여러 가지 방법들이 개발되고 있다. 이 중에 항균제가 함유된 디스크를 균주가 도말된 고체 배지 표면에 부착시킨 다음 일정시간 배양한 후 균주의 생장 억제대를 측정하는 방법에 의해 상기 균주의 항생제에 대한 내성 여부를 판정하는 디스크 확산법이 널리 시행되고 있다. 그러나, 이 방법은 시간이 오래 걸리고 균주에 따라 배양온도 및 배양시간 등의 조건이 까다로워 잘못된 판정을 초래할 수 있는 등의 문제점을 가지고 있다.

또한, MRSA를 검출하기 위한 방법 중 하나로 균주 내 페니실린 결합 단백질 (penicillin binding protein)의 존재 여부를 측정하는 슬라이드 라텍스 응집법이 있다. 상기 슬라이드 라텍스 응집법은 항생물질인 페니실린과 친화성이 적은 세포벽합성단백질인 PBP2a를 검출함으로써 황색 포도상구균의 메티실린 내성 유무를 확인하는 방법이다. MRSA의 항생제 내성 기전은 선천적으로 황색 포도상구균이 염색체 내에 mecA 유전자를 획득하여 나타나는 것으로, 상기 유전자에 의해 생성된 PBP2a에 의하여 발현된다. 한편, 상기 슬라이드 라텍스 응집법은 검체 중의 MRSA의 비율이 낮거나 슬라이드 라텍스 응집법 검사 조건하에서 PBP2a의 생성이 아주 낮은 MRSA가 존재하는 경우에는 정확하게 MRSA를 검출하기 어려운 단점이 있다. 따라서, 슬라이드 라텍스 응집법 측정에서 음성으로 판정되어도 반드시 멀티플렉스 PCR 방법을 비롯한 다른 유전형에 의존하는 시험을 통하여 mecA 유전자의 존재유무 를 중복 확인해야만 한다.

최근에는 MRSA에 특이적인 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 증폭하여 MRSA를 동정하는 방법이 주목받고 있다. 상기 방법은 기존의 생화학적인 방법이나 PFGE(pulsed-field gel electrophoresis)와 리보타이핑(ribotyping)과 같은 방법에 비해 시간과 노동력을 절약하면서도 높은 수준으로 MRSA를 분리할 수 있는 장점이 있다(Olive, D. M. et al., J. Clin. Microbiol., 37:1661-1669, 1999). 특히, 단일 유전자만을 검색하는 PCR 방법에 비해 여러 종류의 유전자를 동시에 검색함으로써 보다 효율적으로 검사의 시간과 비용을 줄일 수 있는 멀티플렉스 PCR 방법이 사용되고 있다.

한편, 상기와 같은 여러 종류의 표적 유전자를 동시에 검출하는 멀티플렉스 PCR 방법은 단일 유전자를 검출하는 PCR 방법에 비해 각 단계별 PCR 조건을 표준화하기에 어려운 문제점이 있으며, 각각의 표적 유전자에 대한 감도가 떨어지는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 멀티플렉스 PCR 방법을 이용한 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법에 대해 연구하던 중 표적 유전자로서 메티실린-내성 황색포도상구균에 특이적인 세 종류의 유전자를 선정하고 상기 표적 유전자를 PCR 증폭하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 메티실린-내성 황색 포도상구균을 고감도로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 멀티플렉스 PCR을 이용한 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 멀티플렉스 PCR을 이용한 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출방법은 표적 유전자로 mecA 유전자, femA 유전자 및 nucA 유전자를 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 mecA 유전자는 황색 포도상구균이 메티실린을 포함한 페니실린 (penicillin) 계열의 항생제에 내성을 나타내는 주요 원인 유전자이다. 즉, 상기 mecA 유전자에 의해 페니실린 결합 단백질(penicillin binding proteins; PBP2a)이 생성되어 항생제의 작용이 억제된다고 알려져 있다(Ryffel C., et al., Antimicrob. Agents. Chemother., 36(1):25-31, 1992; Weller T. M. A., J. Hosp. Infect., 44(3):160-172, 2000). 반면, 메티실린에 내성이 없는 메티실린 감수성 황색 포도상구균(methicillin-sensitive S. aureus; 이하 MSSA라 함)은 상기 mecA 유전자가 존재하지 않는다. 따라서, 상기 황색 포도상구균에서 mecA 유전자의 존 재 여부를 검출함으로써 상기 황색 포도상구균이 MRSA인지 MSSA인지를 구분할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 상기 황색 포도상구균의 메티실린-내성에 직접적으로 관여하는 mecA 유전자와 함께 황색 포도상구균에 특이적인 femA 유전자(Hussain Z. et al., J. Clin. Microbiol., 38(6):2051-2054, 2000; Vannuffel, P. et al., J. Clin. Microbiol., 33(11):2864-2867, 1995; Weller, T. M. A., J. Hosp. Infect., 44(3):160-172, 2000) 및 nucA 유전자(Brakstad, O. G. et al., J. Clin. Microbiol., 30(7):1654-1660, 1992; Ryffel C., et al., Gene, 94(1):137-138, 1990)를 표적 유전자로 사용하였다.

상기 femA 유전자는 모든 황색 포도상구균에 존재하며 mecA 유전자와 함께 황색 포도상구균이 메티실린에 대한 내성을 갖도록 하는데 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 femA 유전자는 포도상구균 속에서 메티실린 내성을 발현하도록 하는 PBP2a의 생성에 필수적인 펜타 글리신(penta glycine)의 교차가교(cross bridge)를 형성하는데 필요한 유전자이다(Hussain Z. et al., J. Clin. Microbiol., 38(6):2051-2054, 2000; Weller T. M. A., J. Hosp. Infect., 44(3):160-172, 2000; Vannuffel, P. et al., J. Clin. Microbiol., 33(11):2864-2867, 1995).

또한, 상기 nucA 유전자는 모든 황색 포도상구균에 존재하며 열안정성 뉴클레아제(thermostable nuclease)를 생산하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명자들은 PBP2a를 생산하는데 직접적으로 관여하는 mecA 유전 자, 상기 PBP2a의 생성에 필요한 펜타 글리신 교차결합을 형성하는데 필수적인 femA 유전자 및 모든 황색 포도상구균에 존재하면서 열안정성 뉴클레아제를 생산하는 nucA 유전자를 모두 메티실린-내성 황색포도상구균의 검출을 위한 표적 유전자로 사용함으로써 상기에 기재된 한 종류 또는 두 종류의 유전자를 표적 유전자로 사용하는 경우에 비해 보다 고감도로 메티실린-내성 황색 포도상구균이 검출될 수 있도록 하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 MRSA 표준균주로부터 추출된 DNA 시료를 사용하여 femA 유전자, mecA 유전자 및 nucA 유전자를 동시에 PCR 증폭시키고 상기 증폭산물을 전기영동하였다. 그 결과, MRSA 표준균주에서 상기 세 종류의 유전자가 모두 검출되었다. 한편, 증폭된 femA 유전자의 밴드 강도가 mecA 유전자 또는 nucA 유전자에 비해 상대적으로 약하게 나타났다(도 1 참조).

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 표적 유전자의 PCR 증폭 단계를 2단계로 나누어 수행하였다. 즉, 밴드가 상대적으로 약하게 검출된 femA 유전자를 먼저 일부 증폭한 후 나머지 mecA 유전자 및 nucA 유전자의 증폭을 수행하였다. 그 결과, 전기영동 후 생성된 밴드간의 강도가 일정하게 나타나 서로 다른 유전자 산물간의 구별이 뚜렷함을 알 수 있었다(도 1 참조). 상기 실험 결과로부터 세 종류의 유전자를 동시에 증폭하는 경우에 비해 2단계로 나누어 증폭하는 경우 DNA 시료 내에 표적 유전자의 존재 여부를 보다 고감도로 용이하게 식별할 수 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 바람직하게는 본 발명에 따른 MRSA 검출방법은 상기에서 선정한 mecA 유전자, femA 유전자 및 nucA 유전자의 PCR 증폭 단계를 2단계로 나누어 수행한다. 즉, 본 발명의 MRSA 검출방법은 분석하고자 하는 핵산 시료의 PCR 증폭시 상기 핵산 시료를 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로 우선적으로 일부 증폭한 후 상기 증폭 혼합물에 mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 첨가하여 PCR 증폭하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로 본 발명의 MRSA 검출방법은

(a) 분석하고자 하는 핵산 시료를 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR 증폭하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 PCR 증폭 혼합물에 mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 첨가하고 PCR 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 PCR 증폭산물을 전기영동하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서 분석하고자 하는 핵산 시료는 동정하고자 하는 균주로부터 추출된 DNA 또는 RNA 시료 일 수 있다. 상기에서 RNA 시료일 경우에는 당분야에 공지된 방법으로 역전사하여 cDNA를 제조하고 이를 PCR 증폭에 사용할 수 있다.

균주로부터 핵산 시료를 추출하는 방법은 특별히 한정되지는 않으며, 당업계 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 페놀 처리, 단백질분해효소 첨가 및 열처리 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 시판되고 있는 DNA 또는 RNA 추출용 키 트를 사용할 수도 있다.

상기 (a) 단계에서 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로는 특별히 한정되지 않으며, 상기 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 공지된 황색 포도상구균의 femA 유전자 서열을 기초로 하여 공지된 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로서 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 사용하였다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계의 핵산 시료를 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로 일부 증폭함으로써 수득한 증폭 혼합물에 mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 첨가하여 mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭하고 이와 동시에 상기 (a) 단계에서 일부 증폭된 femA 유전자가 완전히 증폭되도록 한다.

상기 (b) 단계에서 mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로는 특별히 한정되지 않으며 상기 각 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 공지된 황색 포도상구균의 mecA 유전자 서열 또는 nucA 유전자 서열을 기초로 하여 공지된 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 mecA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 사용하였으며, 상기 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 사용하였다.

상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 PCR 증폭이 완료된 산물을 전기영동함으로써 (a) 단계의 핵산 시료 내에 femA, mecA 및 nucA 유전자의 존재 여부를 판정하는 단계이다. 즉, PCR 증폭산물을 전기영동하고 생성된 밴드를 분자량 마커와 비교함으로써 상기 유전자들의 존재 여부를 판정할 수 있다. 증폭산물 내에 femA, mecA 및 nucA 유전자가 모두 검출되는 경우에는 메티실린-내성 황색 포도상구균으로 판정할 수 있으며 femA 및 nucA 유전자가 검출되거나 또는 nucA 유전자만 검출되는 경우에는 메티실린-감수성 황색 포도상구균으로 판정할 수 있다.

나아가, 본 발명자들은 분석하고자 하는 핵산 시료 내에서 본 발명의 표적 유전자의 존재 여부를 용이하게 판정함으로써 고감도로 메티실린-내성 황색 포도상구균이 검출되도록 하기 위해 PCR 증폭시의 반응시간, 반응온도 및 프라이머의 농도와 같은 PCR 반응조건을 최적화하였다.

따라서, 가장 바람직하게는, 본 발명의 MRSA 검출방법은 (a) 동정하고자 하는 균주로부터 추출한 핵산 시료에 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 첨가한 후 94℃에서 1분간 전변성하는 단계, 94℃에서 30초간 변성하는 단계, 55℃에서 30초간 어닐링하는 단계, 72℃에서 1분간 신장하는 단계로 이루어진 사이클을 10회 반복하고 72℃로 온도를 5분간 유지하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 PCR 증폭 혼합물에 mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭 할 수 있는 프라이머를 첨가한 후 94℃에서 30초간 변성하는 단계, 55℃에서 30초간 어닐링하는 단계, 72℃에서 1분간 신장하는 단계로 이루어진 사이클을 20회 반복한 후 72℃에서 5분간 유지하는 단계 ; 및

상기 (a) 단계에서 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머는 0.6μM 농도로 첨가하는 것이 바람직하며, (b) 단계에서 mecA 유전자 및 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머는 각각 0.4μM 및 0.2μM의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서는 임상에서 분리된 균주, 김밥에서 분리된 균주, MRSA 표준균주 및 MSSA 표준균주로부터 추출한 DNA를 시료로 하여 본 발명의 방법에 따라 멀티플렉스 PCR을 2단계로 나누어 수행하여 femA, mecA 및 nucA 유전자의 존재 여부를 측정하였다. 그 결과, 임상에서 분리한 균주 중 44개의 균주에서 mecA 유전자가 검출되어 상기 44개의 균주들은 MRSA임을 확인할 수 있었다. 김밥에서 분리한 균주의 경우에는 femA와 nucA 유전자는 검출되었으나 mecA 유전자가 검출되지 않아 상기 균주들은 모두 MSSA로 판정되었다. MRSA 표준균주의 경우에는 femA 유전자, nucA 유전자 및 mecA 유전가 모두 검출되었고 MSSA 표준균주의 경우에는 femA 유전자 및 nucA 유전자만이 검출되었다(도 2 참조).

나아가, 본 발명자들은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 방법의 분리 능력과 민감도를 비교조사하기 위하여 종래에 알려진 방법을 이용하여 임상에서 분리된 황색 포도상구균, 김밥에서 분리된 황색 포도상구균, MRSA 표준균주 및 MSSA 표준균주에서 각 유전자들의 표현형(phenotype)을 조사하였다.

본 발명의 비교예에서는 nucA 유전자에 의해 생성되는 열안정성 뉴클레아제의 존재여부를 측정함으로써 각 균주의 표현형(phenotype)을 조사하였다. 그 결과, 모든 균주에서 열안정성 뉴클레아제가 존재함을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 균주들은 모두 nucA 유전자를 가지고 있을 것으로 추정되었다(비교예 1 참조).

또한, 본 발명의 다른 비교예에서는 슬라이드-라텍스 응집법을 이용하여 mecA 유전자에 의해 생성되는 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 존재 여부를 측정함으로써 상기 각 균주의 표현형(phenotype)을 조사하였다. 실험 결과, 임상에서 분리한 55개의 황색 포도상구균 중에서 42개의 균주가 PBP2a를 생산하는 MRSA 균주로 판정되었고 김밥에서 분리한 50개의 황색 포도상구균은 모두 PBP2a를 생산하지 않는 MSSA 균주로 판정되었다. 또한, MRSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 43300은 양성으로, MSSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 19095는 음성으로 판정되었다 (비교예 2 참조). 따라서, 상기 실험 결과로부터 PBP2a를 생산하는 것으로 측정된 균주들은 모두 mecA 유전자를 가지고 있을 것으로 추정되었다.

본 발명의 다른 비교예에서는 임상으로부터 분리한 균주와 김밥에서 분리한 균주를 이용하여 항생제 감수성 시험을 실시하였다. 그 결과, 임상에서 분리한 44개의 균주가 항생제 내성 균주로 판정되었으며, 김밥에서 분리한 균주는 모두 항생 제 감수성 균주로 판정되었다(비교예 3 참조).

상기 비교예의 실험 결과와 본 발명의 방법에 따른 실험 결과를 비교해 보면, 비교예 1에서 모든 균주가 열 안정성 뉴클레아제를 생성함을 확인한 결과와 일치하게 실시예 1-4)에서 모든 균주가 nucA 유전자를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 방법에 따른 실시예 1-4)의 결과와 비교예 2의 슬라이드-라텍스 응집법 및 비교예 3의 항생제 감수성 시험법에 의한 결과가 유사하게 나타났으나 임상에서 분리된 균주 중에서 슬라이드-라텍스 응집법 결과 PBP2a가 존재하지 않는 것으로 판정된 2개의 균주에서 mecA 유전자가 존재하는 것으로 나타났으며 항생제 감수성 시험 결과 항생제 감수성 균주로 판정된 1개의 균주에서 mecA 유전자가 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 실험 결과의 차이는 균주 내에 mecA 유전자가 존재하기는 하나 어떠한 원인으로 인해 발현되지 않았거나 생성된 PBP2a의 양이 아주 낮았기 때문이라 사료된다.

따라서, 본 발명에 따른 MRSA 검출방법은 고감도로 메티실린-내성 황색 포도상구균을 검출할 수 있으며 또한, 기존의 멀티플렉스 PCR에서 발생하는 밴드 강도의 불균형으로 인해 유발되는 오류를 최소화할 수 있는 장점이 있다.

<실시예 1>

본 발명의 멀티플렉스 PCR 방법에 따른 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출

1-1) DNA 시료의 준비

본 발명의 멀티플렉스 PCR 방법에 따라 메티실린-내성 황색 포도상구균을 검출하기 위해 임상에서 분리한 55개의 황색 포도상구균, 김밥에서 분리한 50개의 황색 포도상구균, MRSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 43300 및 MSSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 19095로부터 DNA를 추출하였다.

상기 임상에서 분리된 황색 포도상구균은 연세대학교 보건과학대학 임상병리학과 김종배 교수 연구팀에 의하여 병원 중에 입원중인 환자로부터 분리된 황색 포도상구균 55개를 제공받아 사용하였다. 식품에서 분리된 황색 포도상구균은 식품의약품 안전청에서 국내 5개 도시에서 유통 중인 김밥에서 분리된 균주 50개를 분양받아 사용하였다. MRSA 표준균주로는 황색 포도상구균 ATCC 43300을 사용하였으며, MSSA 표준균주로는 황색 포도상구균 ATCC 19095를 사용하였다.

상기 표준균주와 분리균주를 각각 5㎖의 LB(luria bertani) 브로스에 접종하여 37℃ 항온기에서 18시간에서 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 배양액을 15,000rpm으로 5분간 원심 분리하여 균체를 수확한 다음, 1㎖의 1M NaCl을 첨가하여 2회 세척하고 상기와 동일한 조건으로 원심분리하여 균체를 수확하였다. 상기 수확한 균체에 500㎕의 1×TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)를 첨가하여 현탁액을 제 조하였다. 상기 세포 현탁액에 1㎎/㎖의 10㎕ 리소스타핀(lysostaphin, Sigma, U.S.A.)과 10㎎/㎖의 30㎕의 RNase A(Qiagen, U.S.A.)를 첨가하고 37℃에서 20분간 방치하였다. 이때, 상기 리소스타핀으로 분해가 안됐을 경우 10%의 60㎕ SDS (Sigma, U.S.A.)를 첨가하였다. 상기 현탁액에 10㎎/㎖의 60㎕ 프로테나제 K(proteinase K, Sigma, U.S.A)를 가한 후 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그리고 상기 분해된 세포현탁액에 같은 양의 페놀을 가하여 혼합하고 15,000rpm으로 5분간 원심분리하여 수용액층을 얻어 동일한 과정을 1회 다시 반복하여 수득한 상등액에 동량의 클로로포름을 넣어서 혼합한 후 같은 조건으로 원심분리하여 상등액을 수득하였다. DNA를 침전시키기 위해 상등액의 2.5배 부피의 에탄올(absolute ethanol)을 넣어서 -70℃에 60분간 방치한 다음 15,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리하여 수득된 침전물을 건조시키고 여기에 50㎕의 1×TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)를 첨가하여 DNA를 용해하였다.

1-2) mecA 유전자, femA 유전자 및 nucA 유전자를 동시 증폭한 멀티플렉스 PCR

상기 실시예 1-1)의 MRSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 43300로부터 추출한 DNA를 시료로 하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

PCR 반응액으로는 1㎕ DNA 시료, 5㎕ 10×반응 완충액(100mM KCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% 글리세롤, 0.5% 트윈20, 0.5% 노니뎃-P40 및 20mM Tris-HCl, pH 8.0), 2mM MgCl₂, 0.2mM dNTPs(deoxyribonucleoside-5'-triphosphate, Bioneer, Korea)와 2unit의 Taq DNA 중합효소(Bioneer, Korea)의 혼합액을 사용하였다. 여기에 femA, mecA 및 nucA 유전자를 검출하기 위한 프라이머를 각각 0.6μM, 0.4μM, 0.2μM로 모두 첨가하였으며 멸균된 증류수를 사용하여 전체 반응액의 부피를 50㎕가 되게 하였다.

상기 세 가지 유전자를 검출하는데 사용한 프라이머(Bioneer, Korea)들은 표 1에 나타낸 바와 같다.

멀티플렉스 PCR에 사용된 프라이머

유전자	프라이머	염기서열	서열번호
femA	femA1	5'-CTT ACT TAC TGG CTG TAC CTG-3'	1
femA	femA2	5'-ATG TCG CTT GTT ATG TGC-3'	2
mecA	RSM2647	5'-AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C-3'	3
mecA	RSM2648	5'-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C-3'	4
nucA	nucA1	5'-GCG ATT GAT GGT GAT ACG GTT-3'	5
nucA	nucA2	5'-AGC CAA GCC TTG ACG AAC TAA AGC-3'	6

PCR 증폭은 92℃에서 3분간 전변성 단계, 92℃에서 1분간 변성 단계, 56℃에서 1분간 어닐링 단계, 72℃에서 1분간 신장 단계로 이루어진 사이클을 30회 반복하고 후신장 단계로서 72℃에서 3분간 유지시킨 후 PCR 반응을 종결하였다. 상기 멀티플렉스 PCR을 통하여 수득된 산물을 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동을 하였다.

실험 결과, 상기 MRSA 표준 균주의 경우 femA, mecA 및 nucA 유전자 밴드가 모두 검출됨을 확인할 수 있었다. 한편, 상기 세 종류의 유전자를 동시에 증폭하고 전기영동을 실시한 경우에는 증폭된 femA 유전자의 밴드 강도가 mecA 유전자 또는 nucA 유전자에 비해 상대적으로 약하게 나타났다(도 1참조).

1-3) mecA 유전자, femA 유전자 및 nucA 유전자를 2단계로 나누어 증폭한 멀티플렉스 PCR

상기 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 멀티플렉스 PCR을 수행하되 PCR 증폭단 계를 2단계로 나누어 수행하였다.

즉, 상기 실시예 1-1)의 MRSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 43300로부터 추출한 DNA를 시료로 하여 1-2)와 동일하게 PCR 증폭 혼합물을 제조한 후 첫 번째 단계로 femA 유전자만을 일부 먼저 증폭시키기 위해 femA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머(서열번호 1 및 서열번호 2)만을 첨가한 후 94℃에서 1분간 전-변성(pre-denaturation)단계, 94℃에서 30초간 변성(denaturation) 단계, 55℃에서 30초간 어닐링(annealing) 단계, 72℃에서 1분간 신장(extension) 단계로 이루어진 사이클을 10회 반복(PTC-100, MJ research, U.S.A.)하였고, 72℃에서 5분간 온도를 유지시킨 후에 두 번째 단계로서 mecA와 nucA 유전자를 증폭할 수 있는 두 쌍의 프라이머(서열번호 3 내지 서열번호 6)를 상기 femA 증폭 혼합물에 첨가한 다음, 94℃에 서 30초간 변성(denaturation) 단계, 55℃에서 30초간 어닐링(annealing)단계, 72℃에서 1분간 신장(extension) 단계로 이루어진 사이클(cycle)을 20회 반복한 후에 후-신장(post-extention) 단계를 5분간 유지하여 전체 PCR 반응을 종결하였다. 상기 멀티플렉스 PCR을 통하여 수득된 산물을 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동을 하였다.

실험 결과, MRSA 표준균주에서 femA 유전자, mecA 유전자 및 nucA 유전자가 모두 검출되었으며, 세 종류의 유전자의 밴드 강도가 모두 일정하게 나타남을 확인할 수 있었다(도 1).

1-4) 2단계 멀티플렉스 PCR을 이용한 MRSA의 검출

상기 1-1)의 임상에서 분리한 55개의 황색 포도상구균, 김밥에서 분리한 50개의 황색 포도상구균, MRSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 43300 및 MSSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 19095로부터 추출한 DNA를 시료로 하여 2단계 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

2단계 멀티플렉스 PCR은 상기 실시예 1-3)과 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과, femA, nucA 및 mecA 유전자가 모두 검출된 균주도 있었으며 fem A와 nucA 유전자만 검출된 균주도 있었다(도 2). 보다 구체적으로 임상에서 분리한 55개의 균주 모두에서 femA와 nucA 유전자가 검출되었다. 따라서, 상기 임상에서 분리한 균주가 황색 포도상구균임을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 55개의 분리균주들 중에서 44개 균주가 mecA 유전자가 존재하는 것으로 측정되어 상기 44개의 균주가 MRSA임이 밝혀졌고, 나머지 11개 균주는 mecA 유전자가 존재하지 않는MSSA로 밝혀졌다. 김밥에서 분리한 50개의 분리균주들에서 모두 femA와 nucA 유전자는 검출되었으나, mecA 유전자는 존재하지 않는 것으로 나타나 상기 김밥에서 분리한 균주들은 모두 MSSA로 판정되었다.

또한, MRSA 표준균주인 황색 포도상구균(ATCC 43300)으로부터 추출된 DNA 시료에서 femA 유전자, nucA 유전자 및 mecA 유전자가 모두 검출되어 MRSA로 확인되었고, MSSA 표준균주인 황색 포도상구균(ATCC 19095)으로부터 추출된 DNA 시료에서 femA 유전자 및 nucA 유전자가 검출되었으나 mecA 유전자는 검출되지 않아 MSSA 균주로 확인되었다.

<비교예 1>

황색 포도상구균의 열안정성 뉴클레아제 생성 여부 조사

황색 포도상구균에서 nucA 유전자에 의해 생성되는 열안정성 뉴클레아제 생성 여부를 조사하였다. 이를 위해 상기 실시예 1-1)의 임상에서 분리된 황색 포도상구균, 식품에서 분리된 황색 포도상구균, MRSA 표준균주 및 MSSA 표준균주를 사용하였다.

상기 황색 포도상구균에서 nucA 유전자에 의해 생성되는 열 안정성 뉴클레아제를 측정하기 위하여 톨루딘 블루 DNA 아가(toluidine blue DNA agar) 배지를 제조하였다. 상기 배지에 사용된 DNA는 스펌 뉴클레이 타입2(sperum nuclei type2, Sigma, USA)를 사용하였다. 상기 톨루딘 블루 DNA 아가를 굳기 전에 슬라이드 글라스 위에 약 3ml 정도 되도록 도포한 후 슬라이드 글라스 한개 당 약 2mm 지름의 웰을 10개 정도 만들었다. BHI(brain heart infusion, Difco, USA) 브로스에 상기 황색 포도상구균을 접종시킨 배양액을 200㎕씩 테스트튜브에 담아서 15분간 끓는 물에 중탕으로 가열한 후 실온으로 냉각시켰다. 실온으로 냉각한 배양액 중에서 10㎕를 취하여 상기에서 제조한 톨루딘 블루 DNA 아가의 웰에 넣었다. 상기 웰을 챔버(Moisture chamber)에서 35℃로 4시간 동안 배양한 후 웰 주위로 적어도 1mm 이상 푸른색에서 분홍색으로 변화가 일어난 균주에 대하여 양성으로 판정하였다.

실험 결과, 모든 균주에서 톨루딘 블루 DNA 아가의 웰 주위로 1∼5mm가 원래 배지색인 푸른색에서 분홍색으로 바뀐 것을 확인하였다.

상기 실험 결과로부터 모든 종류의 황색 포도상구균은 열안정성 뉴클레아제를 생산함을 확인할 수 있었다. 따라서, 열안정성 뉴클레아제를 생산하는 nucA 유전자를 가지고 있는 것으로 추정할 수 있었다.

<비교예 2>

슬라이드-라텍스 응집법을 이용한 황색 포도상구균에서 페니실린 결합 단백 질의 검출

슬라이드-라텍스 응집법(Slide-latex agglutination)을 이용하여 상기 실시예 1-1)의 임상으로부터 분리한 균주, 김밥으로부터 분리한 균주, MRSA 표준균주(황색 포도상구균 ATCC 43300) 및 MSSA 표준균주(황색 포도상구균 ATCC 19095)에서 mecA 유전자에 의해 생성되는 페니실린 결합 단백질(penicillin binding proteins; PBP2a)을 검출하였다.

상기 슬라이드-라텍스 응집법은 라텍스 응집 키트(latex agglutination kit, Oxoid, U.K.)를 구입하여 수행하였으며, 슬라이드-라텍스 응집법과 관련된 모든 절차는 옥속이드사(Oxoid)에서 제안한 지침서를 근거로 수행하였다. 먼저, 뮬러 힌톤 아가(Mueller Hinton agar, Difco, U.S.A.)에 상기 황색 포도상구균의 표준균주와 분리균주들을 각각 도말하고 각각의 배지에서 가장 많이 도말된 지역에 1㎍의 옥사실린(oxacillin)이 함유된 디스크(disc)를 올려놓고 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 디스크 주변에서 성장한 콜로니를 1 루프(loop) 정도 취하여 200㎕ 추출 완충액 1(extraction buffer 1)에 혼합하여 희석한 후 3분간 끓는 물에 중탕시켰다. 실온까지 냉각시킨 후 50㎕ 추출 완충액 2(extraction buffer 2)를 혼합한 후 3,000rpm으로 원심분리한 다음 상등액 50㎕을 취하였다. 상기 상등액에 대조군 라텍스(control latex)와 시험군 라텍스(test latex) 액을 한 방울 씩 가한 후 키트에 포함된 멸균막대를 이용하여 잘 혼합하였다. 이 후 응집이 관찰되는 균주는 PBP2a를 생산하는 MRSA 균주로, 응집반응이 일어나지 않는 균주는 PBP2a를 생산하 지 않는 MSSA 균주로 판정하였다.

실험 결과, 임상에서 분리한 55개의 황색 포도상구균 중에서 42개의 균주가 PBP2a를 생산하는 MRSA 균주로 판정되었으며 나머지 13개의 균주는 MSSA 균주로 판정되었다. 김밥에서 분리한 50개의 황색 포도상구균은 모두 PBP2a를 생산하지 않는 MSSA 균주로 판정되었다. 또한, MRSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 43300은 양성으로, MSSA 표준균주인 황색 포도상구균 ATCC 19095는 음성으로 판정되었다. 따라서, 상기에서 PBP2a를 생산하는 것으로 판정된 균주는 mecA 유전자를 가지고 있는 것으로 추정할 수 있었다.

<비교예 3>

황색 포도상구균의 항생제 감수성 시험

상기 실시예 1-1)의 임상으로부터 분리한 균주와 식품으로부터 분리한 균주를 이용하여 항생제인 옥사실린(oxacillin)에 대한 감수성 시험을 실시하였다.

항생제 감수성 시험은 키비-바우어(Kirby-Bauer)의 디스크 확산법(disk diffusion methods)에 따라서 실시하였다. 상기 분리균주를 뮬러 힌톤 브로쓰 (muller hinton broth; MHB)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 배양액을 ELISA 리더(Molecular Devies Co., CF., U.S.A.)로 600nm에서 흡광도를 측정하고 희석하여 OD값을 0.5로 조절하였다. 상기 OD값을 조절한 배양액을 멸균된 면 봉으로 뮬러 힌톤 플레이트(muller hinton plate; MHP)에 균일하게 도말하였다. 도말 후 5분간 평판배지를 건조시킨 다음 멸균된 핀셋으로 항생제 감수성 검사용 디스크를 20mm이상 거리를 유지하면서 평판배지 위에 고정시켰다. 고정된 평판배지를 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 생육 저지환의 직경을 측정하였다. 생육 저지환 직경에 따른 결과는 NCCLS(National Committe for Clinical Laboratory Standardization)에 준하여 감수성 여부를 판독하였다.

실험 결과, 임상으로부터 분리한 균주 55개 중에서 43개의 균주가 항생제 내성을 지니고 있는 것으로 나타났으며, 김밥에서 분리한 균주는 모두 항생제에 감수성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

<비교예 4>

본 발명의 멀티플렉스 PCR 방법에 따른 결과와 비교예의 방법에 따른 결과 비교

본 발명의 멀티플렉스 PCR 방법의 분리 능력과 민감도를 비교예 1 내지 비교예 3의 측정 결과를 비교하였다.

실시예 1-4)의 실험 결과와 비교예 1의 열 안정성 뉴클레아제 생성 여부를 조사한 결과를 비교해 보면 실시예 1-4)에서 모든 균주가 nucA 유전자를 가지고 있는 것으로 나타난 것과 일치하게 비교예 1에서도 모든 균주가 열 안정성 뉴클레아 제를 생성하는 것으로 나타났다(표 2).

실시예 1-4)의 실험 결과와 비교예 2의 라텍스 응집법의 결과를 비교해 보면, 김밥에서 분리된 균주의 경우에는 본 발명의 방법과 라텍스 응집법 측정 결과가 동일한 것으로 나타났으나, 임상에서 분리된 균주의 경우에는 2개의 균주가 본 발명의 방법과 라텍스 응집법 간에 일치되지 않은 결과를 나타냈다. 즉, 비교예 2에서 PBP2a를 생산하지 않는 것으로 판정된 2개의 균주가 본 발명의 방법에서는 mecA 유전자를 가지고 있는 것으로 판정되었다(표 2). 이러한 실험 결과의 차이는 상기 임상에서 분리된 2개의 균주 내에 mecA 유전자가 존재하기는 하나 어떠한 원인으로 인해 발현되지 않았거나 PBP2a의 생성이 아주 낮았기 때문이라 사료된다.

또한, 실시예 1-4)의 실험 결과와 비교예 3의 항생제 감수성 시험 결과를 비교해 보면, 김밥에서 분리된 균주의 경우에는 동일한 것으로 나타났으나, 임상에서 분리된 균주의 경우에는 차이가 있었다. 즉, 비교예 3에서 항생제 내성을 가지고 있는 것으로 판정되지 않은 1개의 균주가 본 발명의 방법에서는 mecA 유전자를 가지고 있는 것으로 판정되었다(표 2). 이러한 실험 결과의 차이는 상기 라텍스 응집법 측정법에서 차이가 나타난 경우와 같이 임상에서 분리된 균주 내에 mecA 유전자가 존재하기는 하나 발현되지 않았기 때문이라 사료된다.

본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 결과

		표현형						유전형
분리 균주	분리균주의 수	톨루딘 블루 DNA 아가 염색법		라텍스 응집법		항생제감수성 시험		멀티플렉스 PCR
		열안정성 뉴클레아제		PBP2a		옥사실린		nucA		mecA		femA
		+	-	+	-	S³⁾	R⁴⁾	+	-	+	-	+	-
WCH¹⁾	55	55		42	13	12	43	55		44	11	55
KB²⁾	50	50			50	50		50			50	50
총	105	105		42	63	62	43	105		44	61	105

1) WCH: 임상에서 분리된 균주

2) KB: 김밥에서 분리된 균주

3) S: 옥사실린에 대하여 감수성을 나타냄

4) R: 옥사실린에 대하여 내성을 나타냄

5) +: 양성반응, -: 음성반응

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(a) 분석하고자 하는 핵산 시료에 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트를 첨가한 후 94℃에서 1분간 전변성하는 단계, 94℃에서 30초간 변성하는 단계, 55℃에서 30초간 어닐링하는 단계, 72℃에서 1분간 신장하는 단계로 이루어진 사이클을 10회 반복하고 72℃에서 5분간 온도를 유지하여 PCR 증폭하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 PCR 증폭 혼합물에 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트와 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트를 첨가한 후 94℃에서 30초간 변성하는 단계, 55℃에서 30초간 어닐링하는 단계, 72℃에서 1분간 신장하는 단계로 이루어진 사이클을 20회 반복한 후 후신장 단계로 72℃에서 5분간 유지하여 PCR 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 PCR 증폭산물을 전기영동하는 단계를 포함하는 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트를 0.6μM 농도로 첨가하고 (b) 단계의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트와 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트를 각각 0.4μM 및 0.2μM의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 메티실린-내성 황색 포도상구균의 검출 방법.