KR100575198B1 - 카사바 유래 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 프로모터 - Google Patents

카사바 유래 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismuatse, SOD) 유전자 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로는 카사바(Manihot esculenta) 식물체에서 분리한 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(MSOD1) 게놈 유전자 프로모터에 관한 것이다. 본 발명의 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 프로모터는 CaMV 35S 프로모터에 비해 높은 활성을 나타내고 각종 환경 스트레스를 인식하는 영역을 여러 부위 포함하고 있으므로 환경 스트레스에 대한 내성 식물체 개발과 유용성분을 대량으로 생산할 수 있는 형질전환 생물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
카사바, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 프로모터

Description

카사바 유래 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 프로모터 {superoxide dismutase promoter derived from Manihot esculenta}
도 1a 및 도 1b(도 1a의 연속)는 본 발명의 카사바 유래 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismuatse, SOD) 유전자 프로모터, SOD 단백질을 코딩하는 게놈 유전자 일부의 염기서열 및 이로부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸 모식도이고(이때, 마이너스(-)로 표시한 염기서열 부분은 프로모터 유전자이고, 5'리더(leader) 염기서열 중에서 -835부터 -876 사이에 대문자 알파벳으로 표시된 부분과 번역 개시점의 하류(downstream)에서 대문자 알파벳으로 표시된 부분은 엑손 부분이며, 소문자 알파벳으로 표시된 부분은 인트론 부분이다),
도 2a는 SOD 유전자 프로모터 영역의 일부가 결실된 다양한 결실 돌연변이 유전자의 제조과정을 나타내는 모식도이고(이때, E1, E2, E3는 엑손 부분을, I1, I2는 인트론 부분을 나타낸다),
도 2b는 pBI221 벡터의 유전자 맵을 나타낸 모식도이고,
도 3은 도 2a에 기재된 p2444 및 다양한 프로모터 유전자 부위가 결실된 돌연변이체 (p1809, p1568, p1343, p1032, p466)의 GUS 활성을 측정하여 나타낸 프로모터 활성 분석 결과이다(이때, CaMV 35S 프로모터의 활성을 대조군으로 나타냄)
본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismuatse, SOD) 유전자 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로는 카사바(Manihot esculenta) 식물체에서 분리한 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 프로모터 및 상기 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트(construct)에 관한 것이다.
식물을 포함한 대부분의 생물은 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스뿐만 아니라 지구 환경 악화에 따라 생기는 각종 환경 스트레스를 받게 되면 생명유지에 필요한 필수 원소이지만 반응성이 높은 산소가 심각한 생리적인 장해 등을 유발하는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O2 -), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 수산화 라디칼(hydroxyl radical, ㆍOH ) 등의 활성 산소종(reactive oxyzen species; ROS)으로 변하게 된다. 따라서, 생체 내에는 이러한 활성 산소를 제거하는 시스템으로 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD: EC 1.15.1.1), 퍼옥시다제(peroxidase, 이하 "POD"라 약칭함), 카탈라제(catalase, CAT) 등의 고분자 항산화 효소와 비타민 C, 비타민 E, 글루타치온(glutathion) 등의 항산화 물질 등이 많이 존재하게 된다.
SOD(EC 1.15.1.1)는 산소를 소비하는 생물에 존재하며 산소 분자가 환원(2O2 + 2e- →2ㆍO2 -)되어 생기는 ㆍO2 -을 제거하는 효소이다. SOD 작용에 의해 생성된 H2O2는 POD 또는 CAT에 의해 독성이 없는 물로 변환된다. ㆍO2 -과 H2O2는 철 존재 하에서 가장 독성이 높은 활성 산소종인 ㆍOH을 생성한다. 따라서, SOD는 ㆍO2 -의 제거와 함께 ㆍOH의 생성을 예방하는 생체방어 기능을 지닌 중요한 항산화 효소이다. SOD는 함유하고 있는 금속 보조인자(metal cofactor)에 따라 CuZnSOD, MnSOD, FeSOD의 3종이 있으며 CuZnSOD는 세포질 및 엽록체에, MnSOD는 미토콘드리아에, FeSOD는 엽록체에 존재한다. SOD가 지닌 효소학적 특성을 이용하여 류마티스 관절염 치료 등 각종 퇴행성 질병 치료제 또는 노화방지 화장품의 효소로 개발되고 있다. 또한, 자외선에 상해를 입은 피부에 SOD를 바르면 SOD가 피부의 표피 속으로 침투되어 손상된 피부가 회복(보호)된다는 보고도 있다(Filipe et al., Exp. Dermatol., 6, 116-121, 1997). 현재까지 SOD를 도입한 형질전환 식물체가 개발되어 제초제(methyl viologen 등), 오존, 저온 등 산화 스트레스를 유발하는 환경 스트레스에 대한 내성 특이성이 보고되고 있으나(Allen, Plant Physiol., 107, 1049-1054, 1995), 아직까지 실용적인 식물체 개발에는 이르지 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 카사바 배양 세포로부터 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 mSOD1(GeneBank Accession No. AF170297)을 분리하여 그 염기서열을 밝힌 바 있다. 이에 의하면, mSOD1 유전자는 152개의 아미노산을 코딩하는 801 bp 크기의 염기서열을 갖고 있으며, 분비 펩티드(signal peptide)가 존재하지 않았다. mSOD1에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 다른 식물체의 CuZnSOD의 아미노산 서열과 비교한 결과 다섯 군데(서열번호 12 내지 서열번호 16)의 아미노산 서열이 잘 보존되어 있었으며, 특히 잠정적 구리 결합부위(Cu binding site)로 알려진 서열번호 17로 기재되는 부위가 존재하였다. 또한, mSOD1에 의하여 코딩되는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)는 His-45, His-47, His-62, His-79, Asp-82, 및 His-119 위치에 구리(copper)와 아연(zinc) 결합 부위로 알려진 부위가 잘 보존되어 있었다. mSOD1에 의해 코딩되는 발현되는 성숙 SOD는 등전점(isoelectric point) 5.8, 분자량 15,346 Da이었다. mSOD1의 mRNA는 3'-말단 비번역 영역(untranslated region)에는 전형적인 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)인 AATAAA와 폴리(A)-꼬리 (poly(A)-tail)가 존재하였다.
또한, mSOD1가 카사바의 게놈 내에 존재하는 유전자임을 확인하고자, 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)을 실시한 결과, 서로 다른 크기의 단일 밴드가 확인됨으로써, 카사바의 경우 mSOD1 유전자가 각 염색체에 한 개씩 존재함을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 mSOD1 유전자의 발현 양상을 밝혔다. 즉, mSOD1은 캘러스에서 가장 우세적으로 발현하였으며, 식물체의 줄기와 괴근에서 강하게 발현하였고 잎과 엽병에서는 약하게 발현하였지만 뿌리에서는 발현되지 않았다. 세포 생장에 따른 mSOD1의 발현 양상은 총 SOD 활성과는 상관 관계가 없었으며, 현탁배양의 배양 초기인 계대배양 5일 째부터 mSOD1 유전자가 발현되었으며, 대수증식기가 시작되는 10일 째에는 약하게 발현되었다. 정지기인 25-30일 사이에는 상기 유전자가 강하게 발현을 하였으나, 이후 배양이 진행됨에 따라 아주 약하게 발현하였다. 또한, 카사바 식물체 잎에 스트레스를 처리하였을 때, mSOD1 유전자의 발현이 유도되었다. 고온(37℃) 처리를 하였을 때 2시간째와 5시간째에 강하게 발현하였다가 10시간째에 급격하게 발현이 감소되어 24시간째에는 거의 발현되지 않았지만, 저온(4℃) 스트레스를 처리하였을 때는 10시간째까지는 발현되지 않다가, 24 시간째에 이르러서 발현되었다.
또한, 카사바 식물체 잎을 100 mM의 NaCl, 100 μM의 ABA, 100 μM의 에테폰(ethephon) 또는 200 mM의 수크로스(sucrose)를 처리하였을 때, mSOD1 유전자가 높게 발현하였으며, 이중 수크로스 처리구에서 가장 높게 유도되었다. 아울러, 10 mM의 메틸 바이올로겐(methyl viologen)을 카사바 식물체의 잎에 처리하였을 경우, 6시간째부터 발현이 유도되었으며, 30시간째에 가장 강하게 발현되었고, 54시간 후부터 점차 감소하는 경향을 나타내었다. 상기 결과는 mSOD1 유전자가 스트레스 관련 화합물 등에 의한 산화적 스트레스에 의해 발현이 유도됨을 시사해 주는 것이라 할 수 있다(Lee et al., Mol. Gen. Genet., 262, 807-814, 1999).
이에, 본 발명자들은 SOD 프로모터가 환경 스트레스에 의하여 강하게 발현되는 특성을 가질 것으로 판단하고, 카사바로부터 SOD 프로모터를 분리하여 이로부터 다양한 돌연변이 유전자를 제조하여 GUS 활성을 측정함으로써 상기 프로모터의 산업적 이용 가치가 높음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 카사바에서 유래된 수퍼옥사이드 디스뮤타제의 프로모터 활성을 가지는 DNA 염기서열을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 프로모터, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사종결자(terminator) 유전자의 순서로 이루어진 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismuatse, MSOD1)유전자 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 프로모터, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사종결자(terminator) 유전자의 순서로 이루어진 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트(construct)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 프로모터, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사 종결자 유전자의 순서로 이루어진 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
이하, 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다. 본 발명에서 "염기서열의 변이체"는 생물학적 활성을 유지하면서 SOD 프로모터의 염기서열에서 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 염기서열을 의미한다.
"MSOD1 프로모터"는 서열번호 1의 염기서열을 포함하며, 작동가능하게 연결된 유전자에 적절한 조건하에서 전사활성을 부여하는 염기서열을 의미한다.
"MSOD1 프로모터의 활성단편"은 도 1a 및 도 1b에서 -2444번 내지 -1번 위치의 염기서열 중 일부를 포함하며, 작동가능하게 연결된 유전자에 MSOD1 프로모터 활성을 부여하는 염기서열을 의미한다.
"환경 스트레스"는 대상 생물에 스트레스로 작용하는 생물적 또는 비생물적 스트레스를 의미하며, 예를 들어 상처, 활성 산소종, 열, 수분, 온도, 염, 대기오.염, 자외선, 중금속 등에 의한 스트레스를 의미한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismuatse, MSOD1) 유전자 프로모터를 제공한다. 이때, 상기 프로모터 유전자는 서열번호 1 내지 서열번호 6 및 서열 번호 18로 기재되는 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 프로모터 유전자는 ABA(abscisic acid), 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 상처, 건조, 활성 산소종 및 열로 구성된 군으로부터 선택된 환경 스트레스에 의하여 발현되는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열은 카사바로부터 유래한 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 게놈 유전자 프로모터의 일부분이다.
본 발명에서 MSOD1 프로모터는 바람직하게는 도 1a 및 도 1b의 -1 내지 -2444번의 염기서열의 일부로 이루어지며, 서열번호 1로 기재되는 프로모터 유전자 만으로도 뛰어난 활성을 나타낸다.
상기 MSOD1은 카사바 게놈 DNA로부터 게놈워커 키트(GenomeWalker kit) 및 중합효소연쇄반응(PCR) 방법으로 mSOD1 cDNA와 개방번역틀(ORF, Open Reading Frame)이 동일한 게놈 클론으로 선별되었으며 이를 천연 MSOD1라 명명하였다(도 1a 및 1b 참조).
천연 MSOD1는 3개의 엑손과 2개의 인트론 및 프로모터 영역으로 이루어져 있는데, 상기 엑손의 염기서열은 mSOD1 cDNA(GeneBank Accession No. AF170297)의 염기서열과 완전히 일치하였다. 카사바 유래의 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 게놈 클론은 총 길이 2,654 bp로 1568 bp의 프로모터 유전자, 3개의 엑손(42 bp, 91 bp, 및 49 bp 크기), 2개의 인트론(821 bp, 83 bp 크기)으로 구성되어 있다. 특이하게도 MSOD1 프로모터는 1568 bp이외에 42 bp 엑손과 821 bp 인트론으로 이루어진 5' 리더(leader) 염기서열을 포함하였다. 각각의 인트론은 5'쪽이 GT로 시작하고 3'쪽이 AG로 끝나는 GT-AG의 법칙을 따르고 있다.
천연 MSOD1의 프로모터는 번역 개시점의 상류로부터 -2,444 bp까지의 영역에 해당하는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 구성된다. 상기 MSOD1 프로모터의 염기서열 상의 특성을 조사하기 위하여, MSOD1 프로모터 부위와 5'-UTR 부분인 ２.4 kb 염기서열을 http://www.dna.affrc.go.jp/ｈtdocs/PLACE/signalscan.html 프로그램으로 분석하였다. 염기서열 분석 결과, MSOD1 프로모터는 전사개시를 위한 TATA box가 3군데(-654, -1222, -1254) 존재하였으며, CAAT box가 다수 존재하였다. 전사조절 단백질의 부착부위로서 건조와 노화에 관련된 ABRE(ACGTG)가 -1366에, 옥신(auxin)과 살리실산(salicylic acid)에 반응하는 ARFAT(TGTCTC)는 -281에, 저온에 반응하는 LTRE(CCGAA)는 -1341에 위치하였으며, heat shock element HSE(CCAAT), G-box(CACGTG), 및 W-box(TTGAC) 등과 같은 스트레스와 관련된 여러 개의 영역(motif)이 -597, -1367, 및 -41, -2286 각각 존재하였다(표 1 참조). 또한, -1101 bp와 -635 bp 사이에는 빛 조절에 관여하는 모티브가 존재하며 특히, 많은 식물 프로모터에 나타나는 GATA 모티브(I box)는 -1415과 -1791에 존재하였다. 또한 5' 인트론에는 상처와 관련된 W-box가 존재하였다(도 1a 및 도 1b 참조).
본 발명의 MSOD1 프로모터는 스트레스에 의해 유전자의 발현을 효과적으로 유도할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 프로모터는 ABA, 메틸 자스모네이트, 상처, 건조, 활성 산소종, 열 등에 의한 스트레스를 인식하는 인자들을 포함하고 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 서열번호 18로 기재되는 카사바 MSOD1 게놈 유전자로부터 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 기재되는 프로모터 서열을 제조하고, 이를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 그리고, 이렇게 제조된 발현벡터를 담배 현탁 세포에 형질도입시킴으로써 다양한 길이의 프로모터를 포함하는 형질전환 담배 세포를 제조하였다. 상기 담배 세포의 원형질체를 이용하여 프로모터 활성 분석을 수행한 결과, 서열번호 1 내지 서열번호 6로 기재되는 다양한 길이의 결실 프로모터 단편은 대조군인 CaMV 35S 프로모터의 활성보다 1.5배 내지 3배 이하의 높은 프로모터 활성을 나타냄을 확인하였다(도 3 참조).
따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 기재되는 프로모터 서열은 프로모터 활성이 기존의 프로모터에 비해 높을 뿐만 아니라 스트레스에 의해 프로모터의 활성이 강하게 유도됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 프로모터 서열은 환경 스트레스 저항성 식물체의 개발과 형질전환 식물세포를 이용한 유용물질 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 프로모터, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사종결자(terminator)유전자의 순서로 이루어지는 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공한다.
상기 유전자 컨스트럭트는 상기 프로모터와 이것과 작동가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자 및 전사종결자로 이루어지는 구조를 갖는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다. 상기 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 다양한 환경 스트레스하에서 MSOD1 프로모터의 조절에 의해 목적 단백질을 발현하므로 유용물질 생산을 위한 형질전환체의 제조에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 다양한 환경 스트레스에 대해 내성을 나타내는 유전자를 목적 단백질의 구조 유전자로 사용하게 되면 외부적인 스트레스가 가해질 경우 이에 대해 내성을 가지는 형질전환체의 제조에도 이용될 수 있다. 상기 유전자 컨스트럭트는 아그로박테리움 등을 이용한 형질전환 방법으로 식물 염색체내에 전이(transferred)되어 식물 세포에서 안정하게 발현될 수 있다.
본 발명의 프로모터는 식물체 뿐 아니라 형질전환 미생물, 형질전환 동물세포를 얻는데도 사용가능 하지만, 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하는데 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 수퍼옥사이드 디스뮤타제(MSOD1) 프로모터 및 게놈 유전자의 분리 및 염기서열 분석
본 발명의 수퍼옥사이드 디스뮤타제(MSOD1)의 프로모터 유전자 및 게놈 유전자는 게놈워커 키트(GenomeWalker kit; Clontech Laboratories, Inc.)를 이용하여 분리하였다.
구체적으로, 카사바(Manihot esculenta) 식물체 잎으로부터 분리한 게놈 DNA 2.5 ㎍을 제한효소 EcoRV, DraI, PvuⅡ, SspI 등으로 절단한 후, 페놀/클로로포름/에탄올을 이용하여 절단한 게놈 DNA를 정제하였다. 이렇게 정제된 게놈 DNA에 키트의 공급자가 제공하는 어댑터(adaptor)를 리가아제(ligase)를 이용하여 결합시켜 게놈워커(GenomeWalker) DNA 라이브러리(library)를 제조하였다.
상기 DNA 라이브러리를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 mSOD1의 게놈 DNA를 확보하였는데, 먼저 mSOD1 cDNA의 5'-말단의 염기서열 정보를 바탕으로 제조한 서열번호 19로 기재되는 프라이머(primer GSP1)와 키트의 공급자가 제공하는 서열번호 20으로 기재되는 어댑터 프라이머(adaptor primer AP1)를 이용하여 제조한 라이브러리(library)의 DNA 절편을 주형으로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 94℃에서 25초 및 72℃에서 4분으로 7회, 94℃에서 25초 및 67℃에서 4분으로 32회 반복한 후, 반응물의 일부를 전기영동하여 확인하였으며, 1차 PCR의 반응물을 50배 희석한 후, 서열번호 19로 기재되는 GSP1 프라이머와 키트의 공급자가 제공하는 서열번호 21로 기재되는 어댑터 프라이머(adaptor primer)를 이용하여 PCR을 반복 수행하였으며, 이 때 PCR 조건은 다음과 같다. 94℃에서 25초 및 72℃에서 4분으로 5회, 94℃에서 25초 및 67℃에서 4분으로 22회 반복한 후, 반응물의 일부를 전기영동하여 반응 산물을 확인하였다. PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI)에 클로닝하고, 염기서열을 결정하였다.
증폭된 PCR 산물은 mSOD1와 개방번역틀(ORF; Open Reading Frame)이 동일한 게놈 클론으로 선별되었으며, 이를 천연 MSOD1라 명명하였다(도 1a 및 1b). 천연 MSOD1는 3개의 엑손과 2개의 인트론 및 프로모터 영역으로 이루어져 있는데, 상기 엑손의 염기서열은 mSOD1 cDNA(GeneBank Accession No. AF170297)의 염기서열과 완전히 일치하였다. 카사바 수퍼옥사이드 디스뮤타제 게놈 클론은 총 길이 2,654 bp로 1568 bp 프로모터 부분, 3개의 엑손(42 bp, 91 bp, 및 49 bp), 2개의 인트론(821 bp, 83 bp)으로 구성되어 있다. 그러나, 특이하게도 MSOD1 프로모터는 1568 bp 이외에 42 bp 엑손과 821 bp 인트론으로 이루어진 5' 리더 염기서열을 포함하였다. 각각의 인트론은 5'쪽이 GT로 시작하고, 3'쪽이 AG로 끝나는 GT-AG의 법칙을 따르고 있다.
<실시예 2> 수퍼옥사이드 디스뮤타제 게놈 DNA MSOD1의 프로모터 분석
천연 MSOD1의 프로모터는 번역 개시점의 상류로부터 -2,444 bp까지의 영역에 해당하는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 구성된다. 상기 MSOD1 프로모터의 염기서열 상의 특성을 조사하기 위하여, MSOD1 프로모터 부위와 5'-UTR 부분인 ２.4 kb 염기서열을 http://www.dna.affrc.go.jp/ｈtdocs/PLACE/ signalscan. html 프로그램으로 분석하였다.
그 결과, MSOD1 프로모터는 전사개시를 위한 TATA 박스가 -654, -1222, -1254 위치에 3군데 존재하였으며, CAAT 박스가 다수 존재하였다. 전사조절 단백질 의 부착부위로서 건조와 노화에 관련된 ABRE(ACGTG)는 -1366에, 옥신(auxin)과 살리실산(salicylic acid)에 반응하는 ARFAT(TGTCTC) 영역(motif)은 -281에, 저온에 반응하는 LTRE(CCGAA)는 -1341에, 열충격에 반응하는 HSE(heat shock element, CCAAT)은 -597에 위치하였으며, G-box(CACGTG), W-box(TTGAC) 등과 같은 스트레스와 관련된 여러 개의 영역이 존재하였다(표 1). -635 bp와 -1101 사이에는 빛 조절에 관여하는 모티브가 있으며 특히, GATA 모티브(I box)가 발견되었다. 또한 5' 인트론에는 상처와 관련된 W-box가 존재하였다.
Figure 112004009986112-pat00001
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 MSOD1 프로모터는 활성 산소종을 비롯한 다양한 스트레스를 인식하는 인자들을 많이 포함하고 있어 환경 스트레스에 대해 내성을 가지는 내성 식물체 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
<실시예 3> MSOD1 프로모터의 결실 돌연변이체 (deletion mutant) 제조
본 발명의 MSOD1 프로모터의 결실 돌연변이체는 5'-리더(leader) 염기서열(엑손과 인트론)을 포함한 2,444 bp 염기서열 영역에서 3개, 5'-리더 염기서열을 제외한 1,568 bp의 프로모터 영역에서 3개, 총 6개를 Ex Taq 중합효소(Takara사)와 MSOD1 서열 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. MSOD1 서열특이적 프라이머는 2,444 bp 영역에서 제작된 결실 돌연변이체는 서열번호 7 내지 9로 기재되는 상류쪽 프라이머와 서열번호 10, 11로 기재되는 하류쪽 프라이머를 제조하였으며, 상기 상류쪽 프라이머는 모두 HindⅢ 제한효소 부위를 포함하고 있으며 하류쪽 프라이머는 BamHI 제한효소 부위를 포함하도록 제조하였다. 상기 프라이머 쌍의 PCR 반응에 의한 결실 크기는 각각 인트론을 포함한 부분에서 2444 bp(서열번호 7과 서열번호 10), 1809 bp(서열번호 8과 서열번호 10), 및 1343 bp(서열번호 9와 서열번호 10), 인트론을 제외한 부분으로부터 1568 bp(서열번호 7과 서열번호 11), 1032 bp(서열번호 8과 서열번호 11), 및 466 bp(서열번호 9와 서열번호 11)로 증폭시켰다. 이로부터 얻은 PCR 산물을 제한효소 HindⅢ/BamHI으로 절단한 후 동일한 제한효소로 절단한 pBI221 플라스미드 벡터(Clontech, CaMV 35S 프로모터, GUS 코딩 부분 및 NOS 전사종결자(terminator)를 포함)에 상기 DNA 단편을 서브클로닝하였다. 이로부터 -2444, -1809, -1343, -1568, -1032 및 -466 결실구조(deletion construction)를 포함하는 MSOD1 프로모터의 결실 돌연변이 플라스미드 벡터 p2444, p1809, p1343, p1568, p1032 및 p466을 제조하고(도 2), 이를 이용하여 트랜짓 에세이(transit assay)를 실시하였다.
<실시예 4> 담배 원형질체를 이용한 MSOD1 프로모터의 트랜짓 에세이
MSOD1 프로모터의 결실 돌연변이체를 이용한 트랜짓 에세이를 하기와 같이 수행하였다.
우선, 담배 현탁배양 세포 BY-2(Nicotiana tabacum L. cv. Bright yellow 2)를 이용하여 계대배양한지 3일된 세포를 2% 셀룰라제(celluase) R-10과 0.5% 마세로자임(macerozyme)을 함유하는 효소액에 3시간 동안 처리하여 원형질체를 분리하였다. 여기에 상기 실시예 3에서 제조된 결실 돌연변이체 플라스미드 벡터를 가하여 폴리에틸렌글리콜(PEG) 방법을 이용하여 플라스미드 벡터를 세포 내로 도입시킨 후 25℃, 암상태에서 16시간 동안 배양하였다. 결실 돌연변이체 플라스미드 벡터를 포함하는 원형질체의 형광을 제퍼슨 등의 방법(Jefferson et al., Plant Mol. Biol. Ref., 5, 387-405, 1987)으로 측정함으로써, 프로모터의 활성을 GUS 단백질이 생산된 양으로써 계산하였다.
트랜짓 에세이 결과, 인트론을 포함한 p2444가 CaMV 35S 프로모터에 비해 약 2.5배 높았으며, p1809는 약 2.7배 높았다. 그러나, p1343의 경우 GUS 활성이 급격히 감소하였다. 또한, 인트론을 제외한 p1568는 CaMV35S 프로모터에 비해 2배 정도 높은 활성을 나타냈지만, 인트론을 가지고 있는 결실 돌연변이체의 GUS 활성보다 낮게 나타났다. p466는 p1343과 비슷한 수준의 GUS 활성을 나타냈다(도 3).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 카사바 유래의 수퍼옥사이드 디스뮤타제 MSOD1 프로모터를 제공한다. 본 발명의 MSOD1 프로모터는 각종 환경 스트레스를 인식하는 영역을 여러 부위 포함하고 있으며, CaMV 35S 프로모터에 비해 높은 활성을 나타내므로 상기 프로모터의 전체 또는 일부를 세포, 식물체, 미생물 및 박테리아 등의 형질전환체 개발에 이용하면 환경 스트레스에 대해 내성을 가지는 내성식물체 개발과 유용성분을 대량으로 생산할 수 있는 형질전환 생물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A superoxide dismutase promoter derived from Manihot esculenta <130> 4p-03-01 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 466 <212> DNA <213> Manihot esculenta <220> <221> promoter <222> (1)..(466) <223> -466 deletion mutant of promoter derived from Manihot esculenta <400> 1 ccgaaacgga taaaacccat aattttaatc gtaaaatttt acgtttaaat tttaatataa 60 tgaaacaaaa taataaaaat tttcatttta tttattttta aaaaaattaa aatttattat 120 tatttttcaa ttttttttta tgtttttaat taaaattttt aattaataaa ataaatataa 180 aattaaattt tgaaacattc ctcaaaacgt taagaaaaaa ttttattgtt gggcttggat 240 gagcgttcgt ggcccacatg agactaatat taggagtgag gcaaactgta aatctgcaaa 300 cttacagcag tcatttttaa ttaccatatt tcatttgcgg ggcagcgggg taggtgaggg 360 taaatactag aaatttctgg agattttgtt ttgtgaatca caattctcta tattatcagt 420 caaaaatcac aaccgcatga cacacacact ctctgtctac tgttct 466 <210> 2 <211> 1032 <212> DNA <213> Manihot esculenta <400> 2 aaaactattg taatgcataa tcaataaatt cgaattggca 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Manihot esculenta <400> 15 Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu Leu Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Manihot esculenta <400> 16 Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Manihot esculenta <400> 17 His Gly Phe His Val His 1 5 <210> 18 <211> 2654 <212> DNA <213> Manihot esculenta <400> 18 gccctttcac tataaacaat aaccatgcaa aataataaaa aaacttaaaa gatattactt 60 aaaaaaaagc taatttataa cattttcaat ttaaaataac cacaaagcca ttatcaagaa 120 catcccgacg tcgagttttc accaactctt tgcatcattg acaaaatcaa cgctccgaca 180 atattccatt gcagaataac ataaaaattc actaaataaa taagaataac ccaaaaaatt 240 aactgtgatt tccattgttt cacacattct ttcacttcct atgtttttct cttttaagta 300 atctactaat ttaagaagct aattggattg aaaagtaaaa gaaattgaaa ggtttactaa 360 atcactcaac ataccttgca attagtgaca taacaaacat aaatcaattt accaaacaaa 420 caaaacaaat aaatgttcat catccaccct caaacttcaa taaagaaaat caatgtcaac 480 caagggtgaa gctaagaaag cctaattttt caataattaa gtttacttaa aaaaaaaaac 540 tattgtaatg cataatcaat aaattcgaat tggcactaaa ataagaatgg gcatttaata 600 ggtatataaa ttcaaattga tatattatag aaaaccactc ataaaattta atgataaaat 660 aagtcattat gaatacaata tgagtatgaa tctacacgat atataattgt cggtttaaat 720 ttactgaatg gaattaattt aattttagat ttcatttatt ttatgaatat tttttaacat 780 ttaaaatgtt ttaaaaaatt aattaataaa aaatattttt taattaaaaa gttattttaa 840 agagtaagtt tgcattttga tttgaaacct ctagatatat agagagagag gtttcataaa 900 tatatatatg gaggtttaaa aaaaatactt ttcataaaaa atatttttta caaaaactaa 960 atgtttaaat gttggaaaat ataaaaatat tttcgtgata tagatggagg gagggttagt 1020 gtgaaaaaga taatcggtaa atgcagttaa agttaaaaac aaaaatggca taaacatcac 1080 gtgactgagt tggtggcacc aaccgaaacg gataaaaccc ataattttaa tcgtaaaatt 1140 ttacgtttaa attttaatat aatgaaacaa aataataaaa attttcattt tatttatttt 1200 taaaaaaatt aaaatttatt attatttttc aatttttttt tatgttttta attaaaattt 1260 ttaattaata aaataaatat aaaattaaat tttgaaacat tcctcaaaac gttaagaaaa 1320 aattttattg ttgggcttgg atgagcgttc gtggcccaca tgagactaat attaggagtg 1380 aggcaaactg taaatctgca aacttacagc agtcattttt aattaccata 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tgaattctat 2280 tggaattgag atttacagct gtttttaggc taatgtctag gaaatatatg agctagcctt 2340 ttttcacttt agatttggcc ttttcagttc gttttacctc tgggaagtgt taatatgcaa 2400 cttttgactt ttggcctttt atcttttcta gatcacgtaa aacaatggtg aaggctgttg 2460 ctgttcttac cagtagtgag ggggttagcg gaacaatctt ctttacccaa gaaggagatg 2520 gtgtttctgc actcttacca gttggactcg gaatttggat tgctaaattc cctttgtgga 2580 taaccctttt catatttttc tatcaggtcc taccactgta actggaaaca tttctggcct 2640 taagccaggg cttc 2654 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GSP1 <400> 19 ctgccccgca aatgaaatat ggtaatt 27 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor primer AP1 <400> 20 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor primer <400> 21 actatagggc acgcgtggt 19

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 MSOD1 유전자 프로모터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1 내지 서열번호 6 및 서열번호 18로 기재되는 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 ABA(abscisic acid), 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 상처, 건조, 활성 산소종 및 열로 구성된 군으로부터 선택된 환경 스트레스에 의하여 작동가능하게 연결된 구조 유전자의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  4. 제 1항 또는 제 2항의 프로모터와 구조유전자 및 전사종결자로 이루어지는 유전자 컨스트럭트(construct).
  5. 제 4항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제 4항의 유전자 컨스트럭트가 숙주 염색체로 전이된(transferred) 형질전환 식물세포.
  7. 1) 서열번호 1 내지 서열번호 6 및 서열번호 18로 기재되는 염기서열로 구성된 군으로부터 선택한 프로모터 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사 종결자 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환 식물세포를 제조하는 단계를 포함하는 형질전환 식물세포의 제조방법.
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