KR100543352B1

KR100543352B1 - 당뇨병 치료에 효능이 있는 혼합 생약재 추출물

Info

Publication number: KR100543352B1
Application number: KR1020030004339A
Authority: KR
Inventors: 김성호; 김철호; 문성권; 차병윤; 윤미자
Original assignee: 김성호; 김철호
Priority date: 2003-01-22
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2006-01-20
Also published as: KR20040067303A

Abstract

본 발명은 당뇨병 치료에 효과가 있는 혼합 생약재 추출물에 관한 것으로 관한 것으로 알록산 유발 실험적 당뇨마우스의 글루코키나제(Glucokinase)와 헥소키나제 (hexokinase)의 활성이 본 발명의 혼합 생약재 추출물 투여에 의하여 상승함으로써 당뇨병치료에 효과적인 혼합 생약재 추출물을 제공할 수 있다.

혼합 생약재, 글루코키나제(glucokinase), 헥소키나제(hexokinase), 알록산 (alloxan), 당뇨병

Description

당뇨병 치료에 효능이 있는 혼합 생약재 추출물{Herb extract efficacious against diabetes}

본 발명은 당뇨병 치료에 효과가 있는 혼합 생약재 추출물에 관한 것으로 관한 것으로 알록산 유발 실험적 당뇨마우스의 글루코키나제(Glucokinase)와 헥소키나제 (hexokinase)의 활성이 혼합 생약재 추출물 투여에 의하여 상승함으로써 당뇨병치료에 효과적인 혼합 생약재 추출물을 제공할 수 있다.

당뇨병은 당질(糖質)대사의 이상을 특징으로 하는 인슐린 작용 부전에 의해 고혈당을 나타내며 갈증, 다뇨(多尿), 다식(多食) 등의 증상을 주요 특징으로 하는 대표적인 성인병으로서 국내의 당뇨병 유병율(有病率)은 약 3%로 추정되고 있으며 고칼로리 식이 섭취, 진단 방법의 개선 및 평균 수명의 연장 등으로 점차 증가되고 있는 추세이다.

당대사와 인슐린 분비조절에 관여하는 효소인 글루코키나제(glucokinase)는 췌장의 β-세포(β-cell)에서 대사과정에 필요한 글루코스(glucose) 인산화 효소 로, 글루코스를 G-6-P(glucose-6-phosphate)로 인산화시켜 글리코겐(glycogen)을 합성시킴으로서 간에서의 포도당 합성에 관계한다. 또한, 췌장의 글루코키나제 (glucokinase)는 혈당에 의해 효소 활성이 변화하며, 헥소키나제(hexokinase)는 혈중 당을 조직 내로 흡수하여 G-6-P로 바꾸어 주어 일정한 동적평형 상태를 유지시켜 준다.

그리고, 알록산(alloxan)에 의해 유도된 당뇨병 동물 모델에서는 글루코키나제(glucokinase)의 불활성화가 글루코스를 초기에 인산화시키지 못해 결정적으로 당뇨병을 유도하게 된다고 보고하고 있다. 한편, 사이토킨(cytokine)의 일종인 인터루킨-1 (interleukin-1 , IL-1 )는 염증 질환시 췌장의 -세포에 손상을 주어 인슐린 의존형 당뇨병을 동시에 유발시키는데, IL-1 의 과잉 발현이 췌장에서의 글루코스 산화에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

현재까지 소갈(消渴)의 치료에 활용되는 약제와 처방에 대한 실험적 연구는 많이 보고되었으나 대부분 혈당, 인슐린 및 혈청 중 효소들의 변화 또는 췌장 β-셀의 조직학적인 변화를 살펴보았을 뿐 인슐린 분비를 자극할 수 있는 글루코스 인산화 효소에 대한 연구는 거의 없었다.

본 발명의 목적은 실험동물에 알록산(alloxan)으로 당뇨병을 유발시킨 후 혈당변동, 인슐린 생성 및 글루코키나제(glucokinase)와 헥소키나제(hexokinase)활성도에 미치는 영향을 관찰하여 당뇨병에 효과적인 혼합 생약재를 제공하는 것이다.

본 발명은 육계, 자완, 시호, 파두, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초로 구성되는 혼합 생약재로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료효능을 갖는 생약 추출물에 관한 것이며, 상기 생약은 각각 동량으로 사용할 수 있다. 다만, 독성이 알려져 있는 파두와 천오는 각각 0.001%(w/w) 미만으로 사용한다.

또한, 본 발명의 추출물은 상기 혼합 생약재를 물, 수용액 또는 완충용액으로 추출, 여과한 상등액인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 추출물은 글루코키나제와 헥소키나제의 활성을 증가시켜 당뇨병 치료의 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 추출물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 생약추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

혼합 생약재 추출물의 유효용량은 1~500㎎/㎏이며, 1㎎/㎏미만인 경우에는 효과가 미비하며, 500㎎/㎏ 초과시에는 사용량에 대한 기대효과에 있어서 경제적이지 못하다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

재료

혼합 생약재(육계, 자완, 시호, 파두, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초)은 명성사에서 정선한 재료를 사용하였다.

수컷 마우스(Male mice)는 생후 3주째에(체중 12-18g) 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터 실험동물 사업실에서 분양받았다. 모든 마우스들은 10마리씩 나누어 플라스틱 케이지에 수용하고 물과 식이를 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하였다. 실험기간 동안 사육 환경은 실온에서, 습도는 60%, 명암주기는 12시간 간격으로 유지하였다.

모든 일반적인 시약들은 주로 시그마사(Sigma Co.) 및 와코 퓨어 케미컬(Wako Pure Chemicals Co., Tokyo, Japan) 제품의 특급품을 구입하여 사용하였다. 면역 및 활성 시약은 일본의 다이찌사(Daiichi Co.)와 베린거만하임 바이오케미컬 사(Boehrinher Mannheim Biochemicals Co.)에서 구입하였다.

실시예 1: 검액제조 및 투여

혼합 생약재 500g을 증류수로 추출, 여과하여 그 용액을 동결 건조한 후 분말화시킨 뒤 필요에 따라 증류수에 녹여 검액으로 사용하였다.

실험 동물은 정상군, 알록산(Alloxan)처리 당뇨군(이하 대조군이라 함), 알록산 처리 당뇨유발 후 혼합 생약재 추출물 처리군으로 각 군에 20마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 대조군과 혼합 생약재 추출물 처리군은 5% 알록산 모노하이드라이트(Alloxan monohydrate, Sigma, St Louis, MO, USA)를 마우스 1.0 mg/10g씩 복강 내 3일간에 걸쳐 3회 주사하였다. 혼합 생약재 추출물 처리군은 알록산(Alloxan) 주사 후 혼합 생약재 추출물 농축액을 0.2mg/20g씩 1일 2회 2주간 경구로 투여하였으며, 대조군은 증류수를 2주간 경구 투여하였다.

시료 수집 및 전처리방법

반복적으로 혈당을 측정하고자 할 때는 헤파린(heparin)처리 모세관으로 안구하 정맥에서 혈액을 약 200㎕ 뽑아 사용하였다. 마우스들은 목을 베는(decapitation) 방법으로 희생시킨 후 혈액을 에펜도프 튜브(eppendorf tube)에 받아 30분간 세워둔 후 마이크로 원심분리기(microcentrifuge)로 10분간 15000rpm에서 원심분리하였다. 혈청은 바로 50㎕씩 분주하여 보관하였고 혈청 인슐린 분석시 사용하였다. 췌장 조직은 적출하여 차가운 식염수에 세척한 후 흡습지로 물기를 제거한 후 중량을 측정하였다. 췌장 조직은 곧바로 10배의 50mM 반응 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0)을 가하여 혼합기(Homogenizer)로 균질화하고 4℃, 100,000Xg에서 1시간 동안 초원심분리하여 시토졸(cytosol) 분획을 얻었다. 이 중 일부를 냉동 보관하거나 효소 활성 측정과 단백질 함량 분석에 이용하였다.

혈당은 글루코스 산화제(Glucose oxidase)법으로 측정하였고 인슐린은 마우스 인슐린 어세이 키트(mouse insulin assay kit, Daiichi radioisotope Labs, Tokyo, Japan, #20008)을 사용하여 측정하였다.

글루코키나제(glucokinase)와 헥소키나제(hexokinase) 활성 측정방법

글루코키나제(glucokinase)와 헥소키나제(hexokinase)의 활성 측정은 워커(Walker) 방법을 약간 수정하여 측정하였다. 반응완충용액 50mM 인산염 완충액(sodium phosphate, pH 7.0), 5mM MgCl₂, 5mM ATP. 0.2unit G-6-P(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 1.0ml에 (A) 100mM 글루코스, (B) 0.1mM 글루코스, (C) 100mM N-아세틸글루코스아민(N-acetylglucosamine) 100㎕씩과 조직추출물 100㎕, 증류수 300㎕를 각각 넣어 반응시켰다. 반응 후 분광 광도계를 사용하여 340nm에서 분당 흡광도 변화를 측정한 다음 (A)-(B)=글루코키나제(glucokinase) 활성, (B)-(C)=헥소키나제(hexokinase) 활성으로 계산하였다. 동시에 보다 정확하게 하기 위해서 D-[U-14C]글루코스(1900-1920 dpm/nmol)로부터 생성되는 D-[U-14C]글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate) 양을 측정하였다.

단백질의 정량은 로우리(Lowry)방법을 사용하였으며 비활성도 측정에 사용하였다. 한편, 실험 결과의 유의성 검정은 Student's t-test를 이용하여 상호비교하여 관찰하였으며, 검정시 P값이 0.05미만일 때를 통계적으로 유의하다고 보았다.

실시예 2: 혼합 생약재 추출물 처리가 실험적 당뇨병마우스의 체중, 혈당 및 인슐린분비에 미치는 영향

5% 알록산 모노하이드라이트(Alloxan monohydrate)를 마우스의 체중 10g당 1.0mg씩 복강 내 3일간, 3회에 걸쳐 주사한 후 1일, 7일, 14일 3회에 걸쳐 정상군, 대조군 및 혼합 생약재 추출물 처리군의 체중 변화를 관찰하였다. 그 결과 알록산만 주사한 대조군의 체중 증가가 가장 심하였으며 다음으로 혼합 생약재 추출물 처리군에서 증가가 인정되었다. 그 중 1주일 후의 체중 변화를 표 1에 나타냈다. 정상군의 체중이 13.4g인데 반하여 알록산만을 주사한 대조군은 22.1g을 나타내어 심한 체중 증가가 인정되었으며 알록산 주사 후 혼합 생약재 추출물 처리군은 17.4g으로 상당한 체중 감소 현상을 보였다(표 1, 표 2).

	정상군	대조군(알록산 처리)	혼합 생약재 추출물 처리한 당뇨병 쥐
Body weight(g)	13.4±1.4	22.1±3.2*	16.1±2.2
Diet intake(g/day)	2.5±0.52	3.6±1.2	3.0±0.6

상기 수치는 20마리에 대한 평균값 ±S.E이다.

* : t-test에서 P < 0.05 일때 정상군과는 상당히 다른 것

		정상군	대조군(알록산처리)	혼합 생약재 추출물 처리한 당뇨병 쥐
Serum glucose (mg/l)	feed	147.4±18.2	235.2±62.1	178.3±12.7
Serum glucose (mg/l)	fast	56.2±6.5	190.4±48.7*	134.5±17.5#

상기 수치는 20마리에 대한 평균값 ±S.E이다.

* : t-test에서 P < 0.05 일때 정상군과는 상당히 다른 것

# : t-test에서 P < 0.05 일때 대조군과는 상당히 다른 것

삭제

실시예 3: 혼합 생약재 추출물 처리가 실험적 당뇨병 마우스의 혈당과 인슐린의 분비에 미치는 효과

정상군, 대조군 및 혼합 생약재 추출물 처리군에 글루코스를 복강 내에 각 1g/ml 1회 주사한 후 10시간 동안의 혈당과 혈청 인슐린 분비 변화를 관찰하였다. 시간별 혈당의 변화를 살펴보면 정상군은 글루코스 주사 0.5시간 후 3.88 mM/l로 최고치를 나타내다 점차 감소하였으며, 대조군에서는 글루코스 주사 0.5시간 뒤에 8.42 mM/l로 정상군에 비하여 상당히 높은 혈당치를 보인 후 점차 감소하였다. 반면, 혼합 생약재 추출물 처리군에서는 시간이 경과함에 따라 전체적으로 정상군보다는 높지만 알록산만 주사한 대조군에 비해 월등히 그 수치가 낮게 감소하여 혼합 생약재의 양호한 효과를 시사하였다.

한편, 인슐린 분비는 정상군서는 글루코스 주사 후 0.5시간대에 인슐린 분비가 1892.6pM/l로 최고치를 나타내다 점차 감소하여 거의 정상으로 회복되었으나, 알록산을 주사한 대조군에서는 1.5시간 이후에서나 1841.4 pM/l로 최고치에 달하였으며 또한 10시간 후에도 기준치의 약 2배를 기록하여 인슐린 분비에 심한 손상이 있음을 시사하였다. 그러나, 혼합 생약재 추출물 처리군에서는 증가된 글루코스를 처리하기 위하여 주사 후 0.5시간대에 1586.3 pM/l로 최고치로 증가된 후 감소하여 10시간 후에는 거의 정상치에 도달하여, 당뇨병으로 증가된 혈중 글루코스를 정상으로 회복시키는 능력이 있음이 밝혀졌다.

본 발명의 혼합 생약재 추출물은 글루코스의 인산화 효소인 글루코키나제와 헥소키나제의 활성을 증가시켜 당뇨병 치료에 큰 효과가 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 당뇨병 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

육계, 자완, 시호, 파두, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초로 구성되되, 파두 및 천오는 혼합 생약재 전체의 0.001%(w/w) 미만인 혼합 생약재로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료효능을 갖는 혼합 생약재 추출물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 생약재는 육계, 자완, 시호, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초가 각각 동량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료효능을 갖는 혼합 생약재 추출물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 혼합 생약재를 물, 수용액 또는 완충용액으로 추출, 여과한 상등액인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료효능을 갖는 혼합 생약재 추출물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 생약재 추출물은 글루코키나제와 헥소키나제의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료효능을 갖는 혼합 생약재 추출물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 약제학적 조성물.