KR100533252B1

KR100533252B1 - 기능성농산물생산을 위한 키토산 올리고당에 은의킬레이팅방법

Info

Publication number: KR100533252B1
Application number: KR10-2003-0076905A
Authority: KR
Inventors: 이재창; 정기철; 강성철; 강남현
Original assignee: 이재창
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2005-12-02
Also published as: KR20030097729A

Abstract

본 발명은 기능성농산물생산을위한 키토산 올리고당에 은의 킬레이팅방법에 관한 발명으로, 일반적으로 알려진 키토산의 효능인 장내 환경을 개선하고, 숙변제거, 혈액의 청결작용, 간기능의 강화및 개선, 혈압의 조절작용 혈중콜레스테롤 농도제어,중금속 다이옥신등 오염물질배출,숙취해소및 각종 면역력강화등의 효능과,단세포살균효과에 유용한 은이 작물에 함유되도록 올리고당에 은의 킬레이팅방법을 제공하고자 하는 방법으로 산소전달과 광합성에서 중요한 역활을 하는것으로 리간드에 금속이온이 결합하는 원리에 근거하여 키토산 올리고당 리간드에 금속이온인 Ag^2＋를 결합시키는 것으로 키틴은 N-acetyl-D-glucosamine이 β-1,4 결합한 구조를 가지고 있으며, 이것을 탈아세틸화 하면 2-amino-2-deoxy-D-glucose가 β-1,4 결합한 구조를 가지게 킬레이팅시켜 효소처리하여 얻은 키토산 올리고당의 아민기(-NH2)에 Ag^2＋가 흡착되는 방법을 이용해 유용한 가치를 갖고 있는 키토산외에도 농약을 쓰지 않는 유기농법에 있어서, 특히 단세포살균효과에 유용한 은이 키토산과 더불어 기능성농산물의 생산에 이용되도록 하기 위한 발명인 것이다.

Description

기능성농산물생산을 위한 키토산 올리고당에 은의 킬레이팅방법{the silver chelating method to chitosance oligosaccharide for a skiled agricultural products}

본 발명은 기능성농산물생산을위한 키토산 올리고당에 은의 킬레이팅방법에 관한 발명인 것이다.

최근 산업화이후 농업생산을 극대화하기 위해, 시도된 화학비료와 농약의 과다사용은 일정부분 성공을 거두었으나, 성공의 이면에는 환경파괴와 건강에 대한 불안을 야기 시켰다.

농약과 비료의 과다 사용에 따른 불안으로 인한 소비량 감소는 농업의 경쟁력을 약화시키게 되었으며, 따라서 이러한 위협으로부터 탈피하기 위해서 시도 되는 것이 친환경농업과 농산물에 기능성을 부가하는 다양한 유기성 농자재의 개발이다.

이에 본 발명은 기능성농산물을 생산하기 위한 키토산 올리고당에 은을 킬레이팅(chelating) 하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

최근 농약의 해로움에 대한 인식이 커지면서 무농약이든지 유기농법이 붐을 이루고 있어, 농업 분야에 있어서도, 게 껍질에서 추출,정제한 키토산 용액을 식품에 살포해 발근,발육을 촉진하고,작물의 성장이 원할해지고 해충이 구제하는 방안이 소개된바 있다.

그외, 키토산이 인체에 미치는 일반적인 효능으로는 장내 환경을 개선하고, 숙변제거, 혈액의 청결작용, 간기능의 강화 및 개선, 혈압의 조절작용 혈중콜레스테롤 농도제어,중금속 다이옥신등 오염물질배출, 숙취해소 및 각종 면역력강화등에 효능이 있다고 여러 키토산 학자들에 의해 보고 되어지고 있다.

상기와 같이 최근 각광을 받고 있는 키토산은 물에 녹지 않는 고분자성 다당질이기 때문에 키토산을 물에 녹게 하려면 키토산에 염산, 초산, 젖산등을 붙여서 녹게하는 방법을 이용하고 있다.

일반적으로 가장 쉽게 키토산을 물에 용해되게 하는 방법은 키토산의 아미노기에 염산을 붙이는 방법이 있는데, 먼저, 키토산을 묽은 염산용액에 담그면 키토산 전체에 염산이 스며들고 일부의 아미노기에 염산이 붙기도 한다. 이 염산을 붙혀놓은 키토산을 메탄올이나 에탄올로 여분의 염산을 닦아낸다. 이것을 키토산 염산염이라하며 이것을 분쇄하여 분말화 하는 방법이 있다.

두번째 방법은 올리고당화 하여 물에 녹게 하는 방법이 있는데,키토산을 초산에 용해한 후 거기에 키토산을 분해하는 아미코젠이라는 효소를를 첨가하면 키토산의 연쇄 글리코시드결합이 끊어져 올리고당화 되는데, 이것은 분자량이 낮기 때문에 100% 물에 용해된다.

그외 키토산에 초산이나 젖산을 도입하여 제조하는 방법이 있는데, 키토산을 초산이나 젖산이 용해하여 초산염, 젖산염으로 제조하는 것이 일반적인 방법이다.

상기와 같은 유용한 키토산의 이용분야는 현재 식품,의약,농업,화장품,건강음료등에 다양히 적용되고 있음은 말할 나위 없는 실정이다.

본 발명에서는 이와같이 유용한 가치를 갖고 있는 키토산외에도 농약을 쓰지 않는 유기농법에 있어서, 특히 단세포살균효과에 유용한 은이 키토산과 더불어 기능성농산물의 생산에 이용되도록 하기 위함이다.

지금까지 알려진 은의 효능은 독과 반응하여 색깔이 변하여, 은수저나 은젖가락으로 많이 사용하였거, 고대로마에서는 은그릇에 음식을 보관하면, 신선하게 오래보관할수 있는 것을 발견하였고, 본초강목에서도 은을 몸에 지니고 있으면 오장이 편안하고, 심신이 안정되며, 사기를 내쫓고 몸을 가볍게 한다고 전해지고있다.

실제로 은은 실험결과 당세포 병원균의 소화나 흡수등 신진대사에 관여하는 촉매작용을 무력화시켜 병원균을 살균하는 것이 학설로 전해지고 있다.

은이 어떻게 이용하는 것이 인체에 가장 효과적인가에 대해 수많은 과학자들이 연구한 결과 이온(Ag⁺)상태로 콜로이드화 시켜서 사용하는 것이 가장 바람직한 것으로 밝혀졌는데, 직경이 0.005내지 0.015미크론크기의 콜로로이드상태의 미세한 은 입자는 세포속에 침투할수 있으며, 이 은입자가 세포속의 바이러스,박테리아,곰팡이균류들이 산소대사를 할때 필요한 효소의 기능을 정지시키는 촉매역활을 하여 병원균을 죽게 하는 작용을 한다.

일반 항생제가 많게는 12종류의 박테리아나 균류에 효력을 가지며, 내성이 생기는 반면 은 콜로로이드는 650여종의 각종 병원체에 대해 광범위한 살균효력이 있으며, 내성이 없는 것으로 나타났다.

본 발명에서는 이와같이 유용한 가치를 갖고 있는 키토산과 은을 이용해 농약을 쓰지 않는 유기농법에 적용함과 동시에 키토산과 은을 이용해 농작물의 성장에 도움을 주며, 특히 일반적으로 알려진 키토산의 효능인 장내 환경을 개선하고, 숙변제거, 혈액의 청결작용, 간기능의 강화및 개선, 혈압의 조절작용 혈중콜레스테롤 농도제어,중금속 다이옥신등 오염물질배출,숙취해소및 각종 면역력강화등의 효능과 단세포살균효과에 유용한 은이 작물에 함유되게 하는 기능성농산물의 생산에 이용되도록 기능성농산물생산을위한 키토산 올리고당에 은의 킬레이팅방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 개발원리는 상기와 같은 유익한 키토산과 은이 더불어 농산물에 흡수되어 농산물의 성장을 촉진케하며, 나아가서는 이를 흡수하는 인체에 까지 키토산이나 은의 유익한 효능이 미치도록 하고자 하는 기능성 농상물을 생산하기 위한 키토산올리고당에 은을 킬레이팅 하기 위한 방법을 제안하고자 한다.

킬레이트(chelating)는 산소전달과 광합성에서 중요한 역활을 하는것으로 리간드에 금속이온이 결합하는 것을 일컫는다.

이러한 원리에 근거하여 키토산 올리고당 리간드에 금속이온인 Ag^2＋를 결합시키는 것으로 도 1에 도시한바와 같이, 키틴은 N-acetyl-D-glucosamine이 β-1,4 결합한 구조를 가지고 있으며, 이것을 탈아세틸화 하면 2-amino-2-deoxy-D-glucose가 β-1,4 결합한 구조를 가지게 된다.

이것을 효소처리하여 얻은 키토산 올리고당의 아민기(-NH2)에 Ag^2＋가 흡착되는 것이다.

이하, 본 발명에 따른 키토산올리고당에 은을 킬레이팅하는 재료및 방법에 대해 알아보면 다음과 같다.

1. 재료 및 방법

(1) 효소 생산

키토산을 분해하는 능력이 우수하다고 알려진 일반적으로 입수할수 있는 미생물로 속명이 아스퍼길러스(Aspergillus), 종명이 푸미거터스(Fumigatus)을 선발하여 키토산 분해효소를 대량 생산하도록 하였다.

(2) 키토산 올리고당 제조

유기산으로 용해한 키토산을 효소처리하여 키토산 올리고당을 만든다.

(3) Ag^2＋의 흡착측정 방법

Ag^2＋의 흡착측정은 각각의 실험조건에서 반응시킨 후 반응액을 취하여 유도결합 플라즈마 분광기(Inductively Cuppled Plasma Spectrophotometer, PERKIN ELMER)로 분석하였다.

(4) 반응조건에 따른 Ag^2＋의 킬레이팅(chelating)

키토산 올리고당에 Ag^2＋를 흡착시키기 위해서 AgCl₂를 사용하였으며, Ag^2＋ 화합물을 100㎎/ℓ 농도로 탈이온수에 녹여 그 원액을 실험에 사용하였다.

① pH에 따른 킬레이팅(chelating)

삼각 플라스크에 AgCl₂용액(100㎎ Ag^2＋/ℓ)과 pH(3~10)으로 조정한 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ를 첨가하여, 교반기를 이용하여 상온(25℃)에서 1시간 교반시킨 후 반응액을 취하여 분광기로 pH에 따른 킬레이트(chelating)양을 측정하였다.

② 온도에 따른 킬레이팅(chelating)

삼각 플라스크에 AgCl₂용액(100㎎ Ag^2＋/ℓ )과 온도(20 ~80℃ )를 조정한 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ을 첨가하고, 각각의 온도에서 1시간 교반시킨 후 반응액을 취하여 분광기로 온도에 따른 킬레이트(chelating)양을 측정하였다.

③ 시간에 따른 킬레이팅(chelating)

삼각 플라스크에 AgCl₂용액(100㎎ Ag^2＋/ℓ)과 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ을 첨가하여 상온(25℃ )에서 교반하면서 시간별로 킬레이트(chelating)양을 측정하였다.

④ Ag^2＋의 최대 킬레이팅(chelating)

삼각 플라스크에 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ을 담고 AgCl₂용액(100㎎ Ag^2＋/ ℓ)을 첨가하면서 최대 킬레이트(chelating)양을 측정하였다.

2. 결과

(1) 효소 생산

도 2에 키토산의 전기영동도 도시와 같이, 키토산 효소를 생산하는 균주를 대량으로 액체배양 한 후, 유기용매를 이용하여 단백질을 침전시킨 후 단백질을 수거하여, 젤필터레이션(gel iltration)과 FPLC(Fast performance liquid chromatography)를 이용하여 순수한 효소를 얻었다.

참고로, 도 2의 수치 1은 사이즈 마크(size marker)이며, 2는 원추출물인 크루드-익스트랙(crude-extract), 수치 3∼9는 정제단백질인 퓨리파이드-프로테인 (purified protein)이다.

(2) 키토산 올리고당 조제

키토산을 키토산 분해효소로 처리해, 도 3의 도시와 같이, TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여 키토산 올리고당 생성유무를 확인 하였다.

(3) pH에 따른 킬레이트(chelating)양

pH에 따른 킬레이트(chelating)양은 아래 표 1과 같이 pH 5에서 10.2㎎을 나타내어 pH 7까지 거의 일정한 킬레이트(chelating)량을 보이다가 pH 8 이후에 급격하게 감소됨을 확인하였다.

(4) 온도에 따른 킬레이트(chelating)양

온도에 따른 킬레이트(chelating)양은 아래 표 2와 같이 50℃ 에서 10.1㎎을 나타내어 60~70℃ 까지 큰 차이를 보이지 않았으며, 70℃ 이후부터 급격히 감소됨을 확인하였다.

(5) 반응시간에 따른 킬레이트(chelating)양

반응시간에 따른 킬레이트(chelating)양은 아래 표 3과 같이 반응 후 30분에서 10.3㎎을 나타내어 그 뒤로는 더 이상 증가하지 않음을 확인하였다.

(6) Ag^2＋의 최대 킬레이트(chelating)양

Ag^2＋의 최대 킬레이트(chelating)양은 아래 표4와 같이 10.3㎎이었으며, 그 이상은 킬레이트(chelating)하지 않음을 확인하였다.

이상과 같이 기능성 농산물을 생산하기 위하여 키토산 올리고당에 은을 킬레이팅 하기 위한 최적조건은 pH, 온도, 반응시간, 킬레이팅양을 조사한 결과로 pH는 pH 4~7, 반응온도는 50~70℃ , 반응시간은 30분 이상이며, 은의 최대 킬레이팅양은 키토산 올리고당 g당 10.3㎎ 임을 알수 있었다.

상기와 같이 본 발명에 따른 키토산 올리고당에 은의 킬레이팅방법에 의한 키토은에 의한 기능성농산물로의 이용가능성을 검토하여 본 발명의 효과를 알아보기 위한 농산물의 재배실험 결과는 다음과 같다.

(1). 재료 및 방법

1) 재배시험장소

-오이(은성 배다다기)

-딸기(육보:나주시 노안면 안산리)

2) 공시작물

-오이(이죽) : 처리구 당 10주

-딸기(이름) : 처리면적 200평

(2). 재배기간

-오이: 2002년 3월 16일 ∼ 2002년 4월 6일

-딸기: 2002년 3월 23일 ∼ 2002년 4월 6일

(3). 처리용액의 공급방법

-오이의 성장상태를 조사하기 위하여 키토산 0.01%와 은 1ppm, 키토산 0.05%와 은 5ppm, 키토산 0.1%와 은 10ppm, 그리고 키토산 0.5%와 은 50ppm을 양액에 첨가하여 1일 2회 공급하였다.

-딸기에서의 은의 검출량을 조사하기 위해 0.05% 키토산과 은 5ppm을 딸기가 꽃이 필때 살포하기 시작하여 7일 간격으로 3회 살포하였다.

(4). 조사항목

오이는 키, 뿌리길이와 무게를 측정하였고, 딸기는 과실내의 은의 함량을 측정하였다.

(5). 결과

1)오이의 성장효과

본 발명에 따른 오이의 성장효과로 아래 표 5의 공시시료 처리가 오이의 성장에 미치는 효과와 같이 성장최적조건은 키토산 0.05%와 은 5ppm으로 재배했을 때 오이의 키는 65±0.48㎝, 뿌리길이 46±0.45㎝, 그리고 뿌리무게 38±41g 이였으며, 키토산 농도가 0.5%와 은의 농도가 50ppm일 때는 성장 장해가 나타났다.

^a ;Duncan 다중검정(SAS institute, 1988)을 통한 평균간 비교 결과로 서로 다른 문자는 통계적으로(제 1형오류 =0.05) 유의성 있게 차이가 나타난다는 것을 의미한다.

그리고 도 4와 같이 키토올리고 은용액이 작물의 생육에 미치는 영향으로 대조구와 실시구간의 작물재배 고찰사진과 같이 도 4-1은 대조구,4-2는 : 키토산 올리고당 0.01% ＋ 은 1ppm, 4-3은 : 키토산 올리고당 0.05% ＋ 은 5ppm,도 4-4는 : 키토산 올리고당 0.1% ＋ 은 10ppm, 4-5는 : 키토산 올리고당 0.5% ＋ 은 50ppm과 같이 키토산 올리고당 0.05% ＋ 은 5ppm의 시비가 작물의 성장에 가장 큰 효과가 있었다.

2)딸기의 은 검출여부

딸기에서 은의 검출량을 조사하기 위하여, 0.05% 키토산 올리고당과 5ppm의 은을 살포했을때 아래 표 6 딸기에 키토은 살포시 은 검출양과 같이 8.90ppm의 은이 검출되였다.

상기와 같이 딸기에서도 유익한 은이 8.90ppm 검출됨을 알았다.

도 1은 키토산 올리고당의 아민기(-NH₂)와 은(Ag²⁺)의 킬레이딩도식.

도 2는 키토산(chitosanase) 단백질 전기영동도.

도 3은 씬레이어크로마티(Thin layer chromatograpy;TLC)방법에 의한 키토산올리고당 확인도.

도 4는 키토 올리고 은용액이 작물의 생육에 미치는 영향을 나타낸 참고사진.

Claims

N-acetyl-D-glucosamine이 β-1,4 결합한 구조를 가지는 키틴을 탈아세틸화 시켜,2-amino-2-deoxy-D-glucose가 β-1,4 결합한 구조를 가지게 한후, 속명이 아스퍼길러스(Aspergillus), 종명이 푸미거터스(Fumigatus)인 미생물로 효소 처리하여 얻은 키토산 올리고당의 아민기(-NH₃)에 Ag^2＋가 흡착되게 함에 있어서,

키토산을 분해하는 능력이 우수하다고 알려진 일반적으로 입수할수 있는 미생물로 속명이 아스퍼질러스(Aspergillus), 종명이 푸미거터스(Fumigatus)을 선발하여 키토산 분해효소를 대량 생산하는 단계;

유기산으로 용해한 키토산을 효소처리하여 키토산 올리고당을 만드는 단계;

키토산 올리고당에 Ag^2＋를 흡착시키기 위해서 AgNO₃를 사용하여, Ag^2＋ 화합물을 100㎎/ℓ 농도로 탈이온수에 녹여 그 원액을 사용하는 단계를 거친 후,

삼각 플라스크에 AgNO₃용액(100㎎ Ag^2＋/ℓ)과 pH 4∼7으로 조정한 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ 를 첨가하여 킬레이팅 하는 단계나,

삼각 플라스크에 AgNO₃용액(100㎎ Ag^2＋/ℓ)과 온도 반응온도는 50∼70℃ 를 조정한 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ 을 첨가해, 1시간 교반시킨 후 반응액을 취해 킬레이팅(chelating)하는 단계 또는,

삼각 플라스크에 AgNO₃용액(100㎎ Ag^2＋/ℓ )과 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ 을 첨가하여 상온(25℃)에서 30분간 교반하여, 킬레이팅(chelating)하는 단계중

선택되는 어느 한 단계를 거쳐, 삼각 플라스크에 키토산 올리고당 1000㎎/ℓ을 담고 AgNO₃용액(100㎎ Ag^2＋/ℓ)을 첨가해 키토산 올리고당에 Ag^2＋이 10.3㎎ 킬레이팅(chelating)되게 함을 특징으로 하는 기능성농산물생산을 위한 키토산올리고당에 은을 킬레이팅하는방법.