KR100511655B1 - 아미노펩티다제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그것을 코드화하는 핵산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 서열을 포함하고 있는 핵산 구성물, 벡터, 및 숙주 세포 뿐만 아니라 폴리펩티드의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

아미노펩티다제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그것을 코드화하는 핵산{POLYPEPTIDES HAVING AMINOPEPTIDASE ACTIVITY AND NUCLEIC ACIDS ENCODING SAME}

본 발명은 아미노제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 서열을 포함하고 있는 핵산 구성물, 벡터, 및 숙주 세포 뿐만 아니라 폴리펩티드를 제조하는 방법 및 사용하는 방법에도 관한 것이다.

다양한 식품 제품, 예컨대 수프, 소스 및 조미료는 단백질 함유 물질의 가수분해에 의해 얻어지는 풍미제를 함유하고 있다. 이 가수분해는 보통 강한 염산을 사용하여 이루어지고, 다음 단계로 수산화 나트륨을 사용한 중성화가 이어진다. 그러나, 그러한 화학적인 가수분해는 가수분해중에 얻어진 아미노산의 심각한 분해와, 또한 이런 화학적 반응의 경로중에 형성된 해로운 부산물을 유도한다. 화학적 가수분해에 의해 얻어진 풍미제의 사용에 관한 관심이 증가함으로써, 효소적 가수분해 공정의 개발이 유도되었다.

단백질 함유 물질의 효소적 가수분해는 고도의 가수분해 (DH)를 얻는 것을 보조하고, 이것은 통상 비특이적으로 작용하는 단백질 분해 효소들의 복합체 (즉 비특이적으로 작용하는 엔도- 및 엑소-펩티다제)를 사용하여 이루어진다. 예를 들어, WO 94/25580 에는 아스페르길루스 오리자에로부터 얻어진 비특이적으로 작용하는 효소 제제를 사용함으로써 단백질을 가수분해하는 방법이 기재되어 있다. 특이적으로 작용하는 단백질 가수분해 효소는 이런 효소들이 단지 부적절한 정도의 가수분해만을 유도하기 때문에 상기 목적으로는 사용되어 오지 않았다.

아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드는 펩티드, 폴리펩티드, 및 단백질의 N-말단으로부터 하나 또는 둘 이상의 아미노산 잔기의 제거를 촉매한다. 그러한 폴리펩티드들은 인터내셔날 유니온 오브 바이오케미스트리 앤드 몰리큘라 바이올로지 (국제 생화학 및 분자 생물학 협회)의 효소 분류 번호 E.C. 3.4.11. 에 분류된다.

WO 96/28542 에는 35 kDa 의 분자량을 가지는 아미노펩티다제가 개시되어 있다. JP-7-5034631 (Noda)에는 아스페르길루스 오리자에를 포함하는, 황색 코지 곰팡이로부터 얻어진 로이신 아미노펩티다제가 개시되어 있다. JP-7-4021798 (Jaidan Hojin Noda Sangyo)에는 아스페르길루스 오리자에 스트레인 460 (ATCC 20386) 및 스트레인 IAM 2616 을 포함한 많은 스트레인을 배양함으로써 제조된 로이신 아미노펩티다제 II 를 첨가함으로써 미소 (miso)를 제조하는 것이 개시되어 있다. 아스페르길루스 오리자에 스트레인 460 은 겔 여과에 의해 26.5, 56, 및 61 kDa 의 세가지 분자량을 가지는 많은 로이신 아미노펩티다제를 생성하는 것으로 알려져 있다 (각각 Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 757-765; Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 767-774; Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 775-782). 페니실륨 시트리움은 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바 65 kDa 의 분자량을 가지는 세포내 로이신 아미노펩티다제를 생성한다 (Kwon et al., 1996, Journal of Industrial Microbiology 17: 30-35).

WO 97/04108 (Roehm) 에는 아스페르길루스 소자에 (A. sojae) 로이신 아미노펩티다제를 코드화하는 DNA 가 개시되어 있다. 창과 스미스는 사카로마이세스 세레비시아에로부터 얻어지는 액포 아미노펩티다제를 코드화하는 유전자의 분자 클로닝 및 서열화를 개시하였다 (Chang and Smith, 1989, Journal of Biological Chemistry 264: 6979-6983). 창 등은 사카로마이세스 세레비시아에로부터 얻어지는 메티오닌 아미노펩티다제를 코드화하는 유전자의 분자 클로닝 및 서열화를 개시하였다 (Chang et al., 1992, Journal of Biological Chemistry 267: 8007-8011).

원하는 감각기관에 반응하는 성질 및 고도의 가수분해를 가지는 단백질 가수분해물의 제조는 일반적으로, 펩티다제 활성의 혼합물을 사용하는 것을 필요로 한다. 감각기관에 반응하는 성질 및 단독으로 또는 다른 효소와 조합하여 식품 제품에서 사용된 단백질 가수분해물의 고도의 가수분해를 개선시키는데 유용한 활성을 가지는 단일 성분의 펩티다제 효소를 제공하는 것이 바람직할 것이다.

본 발명의 목적은 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 개선된 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명은 하기의 것들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다:

(a) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 33 부터 673 까지와 최소한 50 % 동일한 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

(b) 스트린전시가 낮은 조건하에서 (i) SEQ ID NO: 1 의 핵산 서열 또는 (ii) 그것의 상보하는 가닥; 또는 최소한 100 개의 뉴클레오티드를 가지는 그것의 하위서열과 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드;

(c) (a) 또는 (b) 의 대립성 변이체;

(d) 단편이 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 (a), (b), 또는 (c) 의 단편; 및

(e) (i) 37 ℃ 에서 측정되는 바 pH 5.0 내지 8.5 의 pH 범위에서 아미노펩티다제 활성을 가지고 있고,

(ii) 7.4 내지 8.5 의 등전점을 가지고 있으며,

(iii) 트리스-HCl 완충액중에서 Gly-pNA 를 사용하여 pH 7.5 에서 측정되는 바, 20 내지 55 ℃ 의 온도 범위에서 아미노펩티다제 활성을 가지고 있고,

(iv) Ala-pNA, Gly-pNA, Leu-pNA, Glu-pNA, Asp-pNA, Lys-pNA, Ile-pNA 및 Val-pNA를 가수분해하고,

(v) Phe-pNA 또는 Pro-pNA를 가수분해하지 않으며,

(vi) 페닐메탄술포닐 플루오라이드에 의하여 억제되지 않고, EDTA, 디-이소프로필 플루오로 포스페이트, p-클로로머큐리벤조산 및 요오도아세트산에 의하여 약간 억제되며, o-페난트롤린에 의해 완전히 억제되고, 및/또는

(vii) 스핑고모나스 속에 속하는 스트레인으로부터 얻어지고 67±5 kDa 의 분자량을 가지는 폴리펩티드.

본 발명은 또한 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 핵산 서열, 및 핵산 서열을 포함하고 있는 핵산 구성물, 벡터, 및 숙주 세포 뿐만 아니라 폴리펩티드의 제조 및 사용 방법에도 관한 것이다.

도 1 은 DMSO 중의 Ala-pNA 의 100 mg/ml 용액을 사용하여 실온에서 측정된, 스핑고모나스 캡슐라타 (Sphingomonas capsulata) 아미노펩티다제의 활성 대 pH 를 도시한다.

도 2 는 50 mM 의 인산 나트륨 완충액 pH 7.5 중에서의 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제의 활성 대 온도를 도시한다.

도 3 은 50 mM 의 인산 나트륨 완충액 pH 7.5 중에서의 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제의 활성 대 온도를 도시한다.

도 4 는 각각 낮은 및 높은 Flavourzyme^TM 바탕 용량에 스핑고모나스 캡슐라타 미정제 효소 추출물 및 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제를 첨가하였을 때 DH 에 미치는 효과를 도시한다.

도 5 는 각각 낮은 및 높은 Flavourzyme^TM 바탕 용량에 스핑고모나스 캡슐라타 미정제 효소 추출물 및 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제를 첨가하였을 때 DH 에 미치는 효과를 도시한다.

도 6 은 Flavourzyme^TM, Alcalase 및 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제의 상이한 조합에 의하여 얻어진 DH 를 도시한다.

도 7 은 Flavourzyme^TM, Alcalase 및 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제의 상이한 조합에 의하여 얻어진 DH 를 도시한다.

도 8 은 pSJ1678 의 제한 지도를 도시한다.

도 9 는 스핑고모나스 캡슐라타 IFO 12533 아미노펩티다제의 핵산 서열 및 추론되는 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO: 1 과 2)을 도시한다.

도 10 은 pMRT014-1 의 제한 지도를 도시한다.

아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드

본원에서 용어 "아미노펩티다제 활성" 은 펩티드, 올리고펩티드 또는 단백질의 N-말단 단부로부터 아미노산이 제거되는 것을 촉매하는 펩티다제 활성으로서 규정된다. 일반적인 방식으로 규정된 아미노펩티다제 활성은 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 N-말단으로부터 아미노산 X 를 절단할 수 있는데, 이 때 X 는 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어떠한 아미노산이든지 나타낼 수 있지만, 최소한 Ala, Gly, Leu, Glu, Asp, Lys, Ile 및/또는 Val 이다. 본 발명의 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드는 절단될 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열과 같이 비특이적일 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 목적에 대하여, 아미노펩티다제 활성은 405 nm 에서 p-니트로아닐리드의 가수분해의 초기 속도를 측정함으로써 측정된다.

첫 번째 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 33 부터 673 까지의 아미노산 (즉 성숙한 폴리펩티드)에 최소한 약 50 %, 바람직하게는 최소한 약 55 %, 바람직하게는 최소한 약 60 %, 바람직하게는 최소한 약 65 %, 바람직하게는 최소한 약 70 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 80 %, 더욱 바람직하게는 최소한 약 90 %, 가장 바람직하게는 최소한 약 95 %, 더욱더 바람직하게는 최소한 약 97 % 의 동일성을 가지며, 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 아미노산 서열을 가지는 단리된 폴리펩티드 (이하 "상동성 폴리펩티드" 로 언급됨)에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상동성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열과 5 아미노산, 바람직하게는 4 아미노산, 보다 바람직하게는 3 아미노산, 보다 바람직하게는 2 아미노산, 및 가장 바람직하게는 1 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 목적에 대해, 둘 또는 그 이상의 아미노산 서열 사이의 동일성 정도는 다음의 변수를 가지는 BLAST 2.0 단백질 데이터베이스 연구 프로그램 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402)에 의하여 측정된다: blastall -p blastp -a 4 -e 10 -E 0 -v 500 -b 250 -I [의문의 파일] -d prot_all, 상기에서, -p 는 프로그램 이름을 나타내고, -a 는 사용하기 위한 프로세서의 번호를 나타내며, -e 는 기대값을 나타내고, -E 는 갭을 연장시키기 위한 비용을 나타내며, -v 는 원-라인 디스크립션의 번호를 나타내고, -b 는 나타내기 위한 배열의 수를 나타내며, -I 는 의문의 파일을 나타내고, -d 는 연구에 사용된 데이터베이스를 나타낸다.

바람직하게도, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열, 또는 그것의 대립성 변이체; 또는 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 그것의 단편을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 성숙한 폴리펩티드인 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 33 부터 673, 또는 그것의 대립성 변이체; 또는 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 그것의 단편을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 33 부터 673 까지를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열, 또는 그것의 대립성 변이체; 또는 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 그것의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 33 부터 673 까지의 아미노산 또는 그것의 대립성 변이체; 또는 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 그것의 단편으로 구성된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 38 부터 654 까지의 아미노산으로 구성된다.

SEQ ID NO: 2 의 단편은 이 아미노산 서열의 아미노 및/또는 카르복시 말단으로부터 하나 또는 둘 이상의 아미노산이 결실되어 있는 폴리펩티드이다. 바람직하게도, 단편은 최소한 524 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 최소한 574 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 최소한 624 아미노산 잔기를 포함한다.

대립성 변이체는 동일한 염색체상의 유전자좌를 차지하는 유전자의 둘 또는 그 이상의 교체 형태중 어느 하나를 말한다. 대립성 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 군집내에서 다형태를 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 사일런트성 (코드화된 폴리펩티드에 변화가 없음)일 수 있거나 또는 변경된 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화할 수도 있다. 폴리펩티드의 대립성 변이체는 유전자의 대립성 변이체에 의하여 코드화된 폴리펩티드이다.

상동성 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하나 또는 둘 이상의 아미노산 잔기의 삽입 및/또는 상이한 아미노산 잔기에 의한 하나 또는 둘 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의하여 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 바람직하게도, 아미노산 변화는 미미한 성질의 것, 즉 단백질의 접힘 및/또는 활성에 유의할만하게 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환; 작은 결실, 전형적으로 1 내지 약 30 개의 아미노산의 결실; 작은 아미노- 또는 카르복시-말단의 연장, 예컨대 아미노-말단의 메티오닌 잔기; 약 20 내지 25 개 까지의 잔기의 작은 링커 펩티드; 또는 전체 전하 또는 다른 기능을 변화시킴에 의해 정제를 용이하게 하는 작은 연장, 예컨대 폴리-히스티딘 트랙, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이다.

보존성 치환의 실예는 염기성 아미노산 (아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (로이신, 이소로이신 및 발린), 방향성 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 메티오닌)의 군 내에 있다. 일반적으로 특이한 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당해 기술분야에 공지이며, 예컨대 문헌에 기술되어 있다 (H. Neurath and R.L. Hill, 1979, in The Proteins, Academic Press, New York). 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly 과 이것들의 역이다.

두 번째 구체예에서, 본 발명은 스트린전시가 낮은 조건하에서, 보다 바람직하게는 중간 정도의 엄격한 조건하에서, 가장 바람직하게는 스트린전시가 매우 높은 조건하에서, SEQ ID NO: 1 의 핵산 서열 또는 그것의 상보하는 가닥; 또는 아미노펩티다제 활성을 가지는 폴리펩티드 단편을 코드화하는 그것의 하위서열 (J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York); 또는 폴리펩티드의 대립성 변이체 및 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 단편과 동일한 조건하에서 혼성화하는 핵산 프로브와 혼성화하는 핵산 서열에 의하여 코드화되는, 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

SEQ ID NO: 1 의 핵산 서열 또는 그것의 하위서열과, 또한 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열 또는 그것의 단편은, 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들을 따라 상이한 속 또는 종의 스트레인으로부터 아미노펩티다제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 확인하고 클론하기 위한 핵산 프로브를 디자인하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 그러한 프로브들은 관심의 속 또는 종의 게놈 DNA 또는 cDNA 와의 혼성화를 위하여, 표준 서던 블롯팅 과정을 따라, 그 안에 있는 상응하는 유전자를 확인하고 단리하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 프로브들은 전체 서열보다 상당히 더 짧을 수 있지만, 최소한 15, 바람직하게는 최소한 25, 가장 바람직하게는 최소한 35 개의 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 더 긴 프로브도 사용될 수 있다. DNA 와 RNA 프로브가 둘 다 사용될 수 있다. 프로브들은 전형적으로 상응하는 유전자의 검출을 위하여 표지될 수 있다 (예를 들면 ³²P, ³H, ³⁵S, 비오틴, 또는 아비딘을 사용하여). 그러한 프로브들은 본 발명에 포함된다.

그러므로, 그러한 다른 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 는 상술된 프로브와 혼성화하고 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 에 대하여 스크린될 수 있다. 그러한 다른 유기체로부터 얻어진 게놈성 또는 다른 DNA 는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여, 또는 다른 단리 기법에 의하여 단리될 수 있다. 라이브러리로부터의 DNA 또는 단리된 DNA 는 니트로셀룰로스 또는 다른 적당한 담체 물질에 전달되고 그 위에 고정될 수 있다. SEQ ID NO: 1 과 상동하는 클론 또는 DNA를 확인하기 위하여, 담체물질이 서던 블롯에 사용된다. 본 발명의 목적에 대하여, 혼성화는 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1 에 도시된 핵산 서열, 그것의 상보하는 가닥, 또는 그것의 하위서열에 상응하는 핵산 프로브에, 스트린전시가 낮은 조건에서부터 매우 높은 조건하에서 혼성화하는 것을 가리킨다. 이들 조건하에서 핵산 프로브가 혼성화하는 분자는 X-선 필름을 사용하여 검출된다.

바람직한 구체예에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 2 의 폴리펩티드 또는 그것의 하위서열을 코드화하는 핵산 서열이다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 1 이다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 프로브는 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 성숙한 폴리펩티드를 코드화하는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 670에서 2592 까지이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 프로브는 대장균 NRRL B-30032 에 함유된 플라스미드 pMRT004.1-14 에 함유된 핵산 서열이며, 이 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2 의 폴리펩티드를 코드화한다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 프로브는 대장균 NRRL NRRL B-30032 에 함유된 플라스미드 pMRT004.1-14 에 함유되어 있는 SEQ ID NO: 2 의 성숙한 폴리펩티드 (즉, 아미노산 33 부터 673 까지)를 코드화하는 핵산 서열이다.

길이가 최소한 100 뉴클레오티드인 긴 프로브에 대하여, 낮은 스트린전시에서 매우 높은 스트린전시의 조건은, 표준 서던 블롯팅 과정후에, 42 ℃에서, 5× SSPE, 0.3 % 의 SDS, 200 ㎍/ml 의 전단되고 변성된 연어 정자 DNA, 및 낮은, 중간의 및 높은 및 매우 높은 엄격한 조건에 대하여 각각 25, 35, 또는 50 % 의 포름아미드중에서의 예비혼성화 및 혼성화로서 규정된다.

길이가 최소한 100 뉴클레오티드인 긴 프로브에 대하여, 담체 물질은 최종적으로 각각 15 분씩, 2×SSC, 0.2 % 의 SDS 를 사용하여, 바람직하게는 최소한 42 ℃에서 (매우 낮은 스트린전시), 보다 바람직하게는 최소한 50 ℃에서 (낮은 스트린전시), 보다 바람직하게는 최소한 55 ℃에서 (중간 스트린전시), 보다 바람직하게는 최소한 60 ℃에서 (중간-높은 스트린전시), 더욱 바람직하게는 최소한 65 ℃에서 (높은 스트린전시), 가장 바람직하게는 최소한 70 ℃에서 (매우 높은 스트린전시) 3 회 세척된다.

길이가 약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드인 짧은 프로브에 대해서는, 엄격한 조건은 볼튼과 맥카티에 따르는 식을 사용하여 계산된 Tm (Bolton and McCarthy, 1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)보다 5 내지 10 ℃ 낮은 온도에서, 표준 서던 블롯팅 과정후에, 0.9 M 의 NaCl, 0.09 M 의 트리스-HCl, pH 7.6, 6 mM 의 EDTA, 0.5 % 의 NP-40, 1×의 덴하르드트 용액, 1 mM 의 피로인산 나트륨, 1 mM 의 모노염기성 인산 나트륨, 0.1 mM 의 ATP, 및 ml 당 0.2 mg 의 효모 RNA 중에서의 예비혼성화, 혼성화, 및 세척후-혼성화로서 규정된다.

길이가 약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드인 짧은 프로브에 대해서, 담체 물질은 계산된 Tm 보다 5 내지 10 ℃ 낮은 온도에서, 0.1 % 의 SDS 가 첨가된 6×SSC 에서 15 분동안 1 회, 그리고 6×SSC 를 사용하여 15 분동안씩 2 회 세척된다.

세 번째 구체예에서, 본 발명은 다음의 물리화학적 성질을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다: (a) 37 ℃에서 측정되는 바, pH 5.0 내지 8.5 의 pH 범위에서 아미노펩티다제 활성, (b) 7.4 내지 8.5 범위의 등전점 (pI), (c) 트리스-HCl 완충액중에서 Gly-pNA를 사용하여 pH 7.5에서 측정되는 바, 20 내지 55 ℃ 의 온도범위에서 아미노펩티다제 활성, (d) Ala-pNA, Gly-pNA, Leu-pNE, Glu-pNA, Asp-pNA, Lys-pNA, Ile-pNA 및 Val-pNA를 혼성화시킴, (e) Phe-pNA 또는 Pro-pNA 와는 혼성화하지 않음, (f) 페닐메탄술포닐 플루오라이드에 의해서는 억제되지 않고, EDTA, 디-이소프로필 플루오로 포스페이트, p-클로로머큐리벤조산, 및 요오도아세트산에 의해서는 약간 억제되며, o-페난트롤린에 의해서 완전히 억제되고, 및/또는 (g) 스핑고모나스 속에 속하는 스트레인으로부터 얻어지고 67±5 kDa 의 분자량을 가짐.

바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 37 ℃에서 측정되는 바, 5.0 내지 8.5 의 pH 범위, 바람직하게는 6.5 내지 8.0 의 pH 범위에서 아미노펩티다제 활성을 가지며, 보다 바람직하게는 37 ℃에서 측정되는 바, 7.0 내지 7.5 의 pH 범위에서 아미노펩티다제 활성을 가진다.

아미노펩티다제의 등전점은 새롭게 제조된 효소의 등전점이 활성 염색 방법을 사용하여 8.4 로서 평가되지만, 정제 및/또는 보관하는 중에 7.4 에서 8.5 로 변화되기 때문에 가변적이다. 등전점의 불확실성은 그것의 아미노말단으로부터 아미노펩티다제가 자체적으로 소화되는 것에 기인하는 것 같다.

다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 67±5 kDa 의 분자량, 보다 바람직하게는 67±2 kDa 의 분자량을 가지며, 스핑고모나스에 속하는 스트레인, 보다 바람직하게는 스핑고모나스 캡슐라타, 가장 바람직하게는 스핑고모나스 캡슐라타 IFO 12533 으로부터 얻어진다. 분자량은 파마시아사 (Uppsala, Sweden)로부터의 FAST 시스템의 장치위에서 10 내지 15 % 구배의 겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의하여 측정된다. 효소의 분자량은 다음과 같은 분자량 마아커의 회귀선으로부터 평가되었다: 포스포릴라제 b (94 kDa), 알부민 (67 kDa), 오브알부민 (43 kDa), 카르보닉 안하이드라제 (30 kDa), 트립신 억제제 (20.1 kDa), 및 α-락트알부민 (14.4 kDa).

네 번째 구체예로, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드에 대하여 면역화학적 동일성 또는 부분적인 면역화학적 동일성을 가지는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 면역화학적 성질은 잘 알려져 있는 오크털로니 이중 면역확산 과정에 의하여 면역학적인 교차-반응 동일성 시험에 의해 측정된다. 구체적으로, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드의 에피토프에 대해 면역학적으로 반응하거나 또는 결합하는 다클론성 항체를 함유하고 있는 항혈청이, 하뵈와 잉길드에 의해 설명된 과정에 따라 토끼 (또는 다른 설치류)를 면역시킴으로써 제조된다 (Harboe and Ingild, In N. H. Axelsen, J. Krøll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, or Johnstone and Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (pp. 27-31)). 면역화학적 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드는 특이한 면역화학적 기법을 사용하여 침전물의 총 융합, 동일한 침전 형태, 및/또는 동일한 전기영동적 이동성과 같은 동일한 방식으로 항혈청과 반응하는 폴리펩티드이다. 면역화학적 동일성에 대한 추가의 설명은 문헌을 참조한다 (Axelsen, Bock and Krøll, In N. H. Axelsen, J. Krøll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 10). 부분적인 면역화학적 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드는 특이한 면역화학적 기법을 사용하여 침전물의 부분적인 융합, 부분적으로 동일한 침전 형태, 및/또는 부분적으로 동일한 전기영동적 이동성과 같은, 부분적으로 동일한 방식으로 항혈청과 반응하는 폴리펩티드이다. 부분적인 면역화학적 동일성에 대한 추가의 설명은 문헌을 참조한다 (Bock and Axelsen, In N. H. Axelsen, J. Krøll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 11).

항체는 또한 단클론성 항체일 수도 있다. 단클론성 항체들은 예컨대 할로우와 레인의 방법을 따라 제조되고 사용될 수 있다 (E. Harlow and D. Lane, editors, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York).

본 발명의 폴리펩티드는 최소한 20 %, 바람직하게는 최소한 40 %, 보다 바람직하게는 최소한 60 %, 더욱 바람직하게는 최소한 80 %, 더욱 더 바람직하게는 최소한 90 %, 가장 바람직하게는 최소한 100 % 의 SEQ ID NO: 2 의 아미노펩티다제 활성을 갖는다.

본 발명의 폴리펩티드는 어떠한 속의 미생물로부터도 얻어질 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 바실루스 폴리펩티드, 예컨대 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리퀴에파시엔스, 바실루스 브레비스, 바실루스 써큘란스, 바실루스 코아귤란스, 바실루스 라우투스, 바실루스 렌투스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 써모필루스, 바실루스 서브틸리스, 또는 바실루스 튜링기엔시스 폴리펩티드; 또는 스트렙토마이세스 폴리펩티드, 예컨대 스트렙토마이세스 리비단스 또는 스트렙토마이세스 뮤리누스 폴리펩티드와 같은 그람 포지티브 박테리아 폴리펩티드; 또는 예컨대 대장균 또는 슈도모나스 종의 폴리펩티드와 같은 그람 네가티브 박테리아 폴리펩티드일 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 스핑고모나스 폴리펩티드, 예컨대 스핑고모나스 아드해시바, 스핑고모나스 캡슐라타, 스핑고모나스 파라파우시모빌리스, 스핑고모나스 파우시모빌리스, 또는 스핑고모나스 야노이쿠이애 폴리펩티드이다.

보다 바람직한 구체예에서, 스핑고모나스 캡슐라타 폴리펩티드는 스핑고모나스 캡슐라타 IFO 12533 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다.

상기 언급된 종에 대하여, 본 발명은 그것들이 알려져 있는 종 명에도 불구하고 다른 분류학적 동등물을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 당업자들은 쉽게 적절한 동등물의 정체를 인지할 것이다. 예를 들어, 스핑고모나스 캡슐라타는 또한 플라보박테리움 캡슐라툼으로서도 공지되어 있고, 스핑고모나스 파우시모빌리스는 플라보박테리움 데보란스 및 슈도모나스 파우시모빌리스로서 공지되어 있으며, 스핑고모나스 종은 크로모박테리움 리비둠으로서도 알려져 있다. 스핑고모나스의 분류에 대해서는 문헌을 참조한다 (Yabuuchi et al., 1990, Microbiol. Immunol. 34:99-119).

이들 종의 스트레인은 많은 컬춰 콜렉션, 예컨대 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC), 도이취 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 (DSM), 센트라알뷰레 푸어 쉼멜컬춰스 (CBS), 및 아그리컬춰럴 리서취 서비스 페이턴트 컬춰 콜렉션, 노던 리져날 리서취 센터 (NRRL)에서 대중에게 쉽게 접할 수 있다.

나아가, 그러한 폴리펩티드들은 상기 언급된 프로브를 사용하여 자연 (예컨대 토양, 퇴비, 물 등)으로부터 단리된 미생물을 포함하여 다른 공급원으로부터 확인되고 얻어질 수 있다. 자연 서식지로부터 미생물을 단리하는 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 그런 다음 다른 미생물의 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 유사하게 스크리닝함으로써 핵산 서열이 유도될 수 있다. 일단 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열이 프로브(들)을 사용하여 검출되었으면, 서열은 당업자들에게 공지되어 있는 기법들을 사용하여 단리되거나 또는 클론될 수 있다 (Sambrook et al., 1989, 상기 동일).

본원에서 규정되는 바와 같이, "단리된" 폴리펩티드는 본질적으로 다른 비-아미노펩티다제 폴리펩티드가 없는, 예컨대 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바, 최소한 약 20 % 순수한, 바람직하게는 최소한 약 40 % 순수한, 보다 바람직하게는 최소한 약 60 % 순수한, 더욱 더 바람직하게는 최소한 약 80 % 순수한, 가장 바람직하게는 최소한 약 90 % 순수한, 또 더욱 바람직하게는 최소한 약 95 % 순수한 폴리펩티드이다.

본 발명의 핵산 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드는 또한 다른 폴리펩티드가 폴리펩티드 또는 그것의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합되어 있는 융합된 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 융합된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 (또는 그것의 부분)을 본 발명의 핵산 서열 (또는 그것의 부분)에 융합시킴으로써 생성된다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 기법들은 기술분야에 공지이며, 그러한 것의 실예로는, 폴리펩티드들을 코드화하는 코딩 서열들이 프레임내에 있고, 융합된 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들) 및 터미네이터의 조절하에 놓이도록 결찰시키는 것이 있다.

핵산 서열

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1 에 나타낸다. 다른 보다 바람직한 구체예에서, 핵산 서열은 대장균 NRRL B-30032 에 함유된 플라스미드 pMRT004.1-14 에 함유된 서열이다. 다른 보다 바람직한 구체예에서, 핵산 서열은 대장균 NRRL B-30032 에 함유된 플라스미드 pMRT004.1-14 에 함유된 SEQ ID NO: 2 의 성숙한 폴리펩티드 (즉 아미노산 33 부터 673 까지)를 코드화하는 서열이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 서열은 성숙한 폴리펩티드를 코드화하는, SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 670 부터 2592 까지이다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드, 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는데, 그것은 유전자 코드의 축퇴성에 의하여 SEQ ID NO: 1 과는 상이하다. 본 발명은 또한 포스포리파제 활성을 가지는 SEQ ID NO:2 의 단편을 코드화하는 SEQ ID NO: 1 의 하위서열에도 관한 것이다.

SEQ ID NO: 1 의 하위서열은 하나 또는 둘 이상의 뉴클레오티드가 5' 및/또는 3' 단부로부터 결실되어 있는 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1 에 의해 포함되는 핵산 서열이다. 바람직하게도, 하위서열은 최소한 1572 개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 최소한 1722 개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 최소한 1872 개의 뉴클레오티드를 함유한다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 의 성숙한 폴리펩티드 코딩 영역에 최소한 하나의 돌연변이를 포함하고 있는 돌연변이체 핵산 서열에 관한 것으로, 상기에서 돌연변이체 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 33 부터 673 까지의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 코드화한다.

폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 단리 또는 클론하기 위하여 사용된 기법들은 기술분야에 공지이며, 실예로 게놈 DNA 로부터의 단리, cDNA 로부터의 제조, 또는 이것들의 조합을 들 수 있다. 그러한 게놈 DNA 로부터의 본 발명의 핵산 서열의 클로닝은 예컨대 잘 알려져 있는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 구조적 특징을 공유하고 있는 클론된 DNA 단편을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝을 사용함으로써 이루어질 수 있다 (Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York). 다른 핵산 증폭 과정, 예컨대 리가제 연쇄 반응 (LCR), 결찰된 활성화된 전사 (LAT) 및 핵산 서열-기초 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다. 핵산 서열은 스핑고모나스의 스트레인, 또는 다른 또는 관련된 유기체로부터 클론될 수 있고, 그러므로, 예를 들면 핵산 서열의 폴리펩티드 코드화 영역의 대립성 또는 종 변이체일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단리된 핵산 서열" 은 본질적으로 다른 핵산 서열이 없는, 예컨대 아가로스 전기영동에 의해 측정되는 바, 최소한 약 20 % 순수한, 바람직하게는 최소한 약 40 % 순수한, 보다 바람직하게는 최소한 약 60 % 순수한, 더욱 더 바람직하게는 최소한 약 80 % 순수한, 가장 바람직하게는 최소한 약 90 % 순수한 핵산 서열이다. 예를 들어, 단리된 핵산 서열은 핵산 서열을 그것의 천연 위치로부터 그것이 재생될 상이한 부위로 재위치시키기 위한 유전자 공학에 사용된 표준 클로닝 과정에 의하여 얻어질 수 있다. 클로닝 과정은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하고 있는 원하는 핵산 단편의 절출 및 단리, 단편의 벡터 분자 안으로의 삽입, 및 핵산 서열의 다중 복사물 또는 클론이 복제될 장소인 숙주 세포안으로의 재조합 벡터의 통합을 포함할 것이다. 핵산 서열은 게놈성, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원일 수 있고, 또는 이것들의 어떠한 조합일 수도 있다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열 (즉, 뉴클레오티드 670 내지 2592)에 대하여 최소한 약 50 %, 바람직하게는 약 55 %, 바람직하게는 약 60 %, 바람직하게는 약 65 %, 바람직하게는 약 70 %, 바람직하게는 약 80 %, 보다 바람직하게는 약 90 %, 더욱 바람직하게는 약 95 %, 가장 바람직하게는 약 97 % 의 상동성을 가지며, 활성 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 목적에 대하여, 두 개의 핵산 서열 사이의 상동성의 정도는 윌부어-리프만 방법에 의하여, LASERGENE^TM MEGALIGN^TM 소프트웨어 (DNASTAR, Inc., Madison, WI)를 사용하여 동일성 표 및 다음의 다중 배열 파라메터: 10 의 갭 페널티 및 10 의 갭 길이 페널티를 사용하여 측정된다 (Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80:726-730). 페어와이즈 (pairwise) 배열 파라메터들은 Ktuple=3, 갭 페널티=3, 및 윈도우즈=20 이었다.

본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 변형이, 실질적으로 폴리펩티드와 유사한 폴리펩티들을 합성하기 위하여 필요할 수 있다. 폴리펩티드에 대하여 "실질적으로 유사한" 이란 용어는 폴리펩티드의 비-자연적으로 발생하는 형태를 말한다. 이들 폴리펩티드들은 그것의 천연 공급원으로부터 단리된 폴리펩티드와 여러 가지 공학적인 방법으로 다를 수 있다. 예를 들어, 비활성, 열안정성, pH 최적, 등이 상이한, 폴리펩티드의 변이체들을 예컨대 부위-특정 돌연변이 생성을 사용하여 합성하는 것이 관심이 있을 수 있다. 유사한 서열이 SEQ ID NO: 1 의 폴리펩티드 코드화 부분, 예컨대 그것의 하위서열로서 표시된 핵산 서열을 토대로 하여, 및/또는 핵산 서열에 의하여 코드화된 폴리펩티드의 다른 아미노산 서열을 유발시키지 않는, 그러나 효소의 생성을 위해 의도된 숙주 유기체의 코돈 관례에 상응하는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의하여, 또는 상이한 아미노산 서열을 유발할 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의하여 구성될 수 있다. 뉴클레오티드 치환에 대한 일반적인 설명은 문헌을 참조한다 (Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107).

당업자에게는 그러한 치환이 분자의 기능에 중요한 영역 밖에서 이루어질 수 있으며, 그 결과 여전히 활성 폴리펩티드를 유발한다는 것이 인지될 것이다. 본 발명의 단리된 핵산 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드의 활성에 필수적인 아미노산 잔기, 및 그러므로 바람직하게는 치환이 일어나지 않은 아미노산 잔기들은 당해 기술분야에 공지되어 있는 과정, 예컨대 부위-특정 돌연변이생성 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이생성에 따라 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085). 후자의 기법에서, 돌연변이는 분자내에 있는 모든 양으로 하전된 잔기마다에 도입되고, 그 결과 돌연변이 분자는 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 아미노펩티다제 활성에 대하여 시험된다. 기질-효소 상호반응의 부위는 또한 핵자기 공명 분석, 결정학 또는 광친화성 표지화와 같은 기법들에 의하여 측정되는 것과 같이 삼-차원적인 구조 분석에 의하여 측정될 수 있다 (de Vos et al., 1992, Science 255:306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:59-64).

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 핵산 서열에 관한 것으로, 그것은 본원에서 규정되는 바와 같이, 스트린전시가 낮은 조건하에서, 보다 바람직하게는 중간정도의 엄격한 조건하에서, 더욱 바람직하게는 스트린전시가 높은 조건하에서, 가장 바람직하게는 스트린전시가 매우 높은 조건하에서, SEQ ID NO: 1 의 핵산 서열 또는 그것의 상보하는 가닥; 또는 그것의 대립성 변이체 및 서열과 상기와 동일한 조건하에서 혼성화하는 핵산 프로브와 혼성화한다 (Sambrook et al., 1989, 상기 동일).

본 발명은 또한 (a) SEQ ID NO: 1 의 서열, 또는 그것의 상보하는 가닥, 또는 아미노펩티다제 활성을 가지는 폴리펩티드 단편을 코드화하는 그것의 하위서열과, 스트린전시가 낮은, 중간의, 높은 또는 매우 높은 조건하에서 혼성화함으로써; 및 (b) 핵산 서열을 단리함으로써 생성된 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.

돌연변이 핵산 서열을 제조하는 방법

본 발명은 또한 돌연변이 핵산 서열을 제조하는 방법에도 관련된 것으로, 이 방법은 최소한 하나의 돌연변이를 SEQ ID NO: 1 의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열 또는 그것이 하위서열안에 도입시키는 것으로 이루어지며, 상기 돌여변이 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 33 내지 673 또는 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 그것의 단편으로 구성되는 폴리펩티드를 코드화한다.

다른 뉴클레오티드에 대하여 한 뉴클레오티드를 스위치시키기 위하여 핵산 서열안에 돌연변이를 도입시키는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들중 어느 것을 사용하는 부위-특정 돌연변이 생성에 의하여 이루어질 수 있다. 특별히 유용한 것은 괸심의 삽입물과 원하는 돌연변이를 함유하고 있는 두 개의 합성 프라이머를 가지고 있는 슈퍼코일링된 이중 가닥의 DNA 벡터를 사용하는 과정이다. 각각이 벡터의 반대쪽 가닥에 상보하는 두 개의 뉴클레오티드 프라이머는 Pfu DNA 중합효소에 의하여 온도 사이클링하는 중에 연장된다. 프라이머가 통합되는 때, 스태거된 닉을 함유하는 돌연변이된 플라스미드가 생성된다. 온도 사이클링에 이어서, 생성물은 모 (parental) DNA 주형을 소화하고 돌연변이-함유 합성 DNA를 선택하기 위하여, 메틸화되고 헤미메틸화된 DNA 에 특이적인 DpnI 을 사용하여 처리된다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 다른 과정들도 또한 사용될 수 있다.

핵산 구성물

본 발명은 또한 조절 서열과 부합하는 조건하에서 적당한 숙주 세포안에서 코딩 서열의 발현을 특정하는 하나 또는 둘 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 본 발명의 핵산 서열을 포함하고 있는 핵산 구성물에도 관한 것이다. 발현은 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 전사, 후-전사 변형, 번역, 후-번역 변형, 및 분비를 포함하여 폴리펩티드의 생성에 포함된 어떠한 단계든지 포함하는 것으로 이해될 것이다.

"핵산 구성물" 은 본원에서 자연적으로 발생하는 유전자로부터 단리되거나 또는 그렇지 않다면 자연에 존재할 방식으로 조합되고 나란히 배치되는 핵산의 절편을 함유하도록 변형된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자로서 규정된다. 용어 핵산 구성물은 핵산 구성물이 본 발명의 코딩 서열의 발현에 필요한 모든 조절 서열을 함유한 때에는 용어 발현 카세트와 동의어적이다. 용어 "코딩 서열" 은 본원에서 그것의 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접적으로 특정하는 핵산 서열의 부분으로서 규정된다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 mRNA 의 5' 단부에 있는 오픈 리딩 프레임의 바로 위쪽에 위치한 리보솜 결합 부위 (원핵세포) 및 mRNA 의 3' 단부에 있는 오픈 리딩 프레임의 바로 아래쪽에 위치한 전사 터미네이터 서열에 의해 결정된다. 코딩 서열에는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, DNA,, cDNA, 및 재조합 핵산 서열이 포함될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 핵산 서열은 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위한 다양한 방법에 의하여 조작될 수 있다. 그것이 벡터안에 삽입되기 전 핵산 서열의 조작은 발현 벡터에 따라 바람직할 수도 있고 필요할 수도 있다. 재조합 DNA 방법들을 활용하여 핵산 서열을 변형시키는 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

본원에서 용어 "조절 서열" 은 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위해 필요한 또는 유익한 모든 성분들을 포함하는 것으로 규정된다. 각각의 조절 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열에 대하여 천연적이거나 또는 외래적이다. 그러한 조절 서열로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열, 및 전사 터미네이터가 있다. 최소한으로, 조절 서열로는 프로모터, 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 조절 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 코딩 영역과 함께 조절 서열의 결찰을 용이하게 하기 위한 특이한 제한 부위들을 도입시킬 목적으로 링커와 함께 제공된다. 본원에서 용어 "작동가능하게 연결된" 은 조절 서열이 폴리펩티드의 발현을 특정하도록 DNA 서열의 코딩 서열에 관련된 위치에 조절 서열이 적절하게 위치되어 있는 형태로서 규정된다.

조절 서열은 핵산 서열의 발현을 위하여 숙주 세포에 의하여 인지되는 핵산 서열인 적절한 프로모터 서열이다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 중재하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 절단된 및 하이브리드 프로모터를 포함하여, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 것이면 어떠한 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대하여 동종 또는 이종성인 세포내 또는 세포외재성 폴리펩티드를 코드화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다.

본 발명의 핵산 구성물의 전사를, 특히 박테리아 숙주 세포에서 특정하기에 적당한 프로모터의 실예로는 대장균 lac 오페론으로부터 얻어지는 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리컬러 아가라제 유전자 (dagA)로부터 얻어지는 프로모터, 바실루스 서브틸리스 레반슈크라제 유전자 (sacB)로부터 얻어지는 프로모터, 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자 (amyL)로부터 얻어지는 프로모터, 바실루스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM)로부터 얻어지는 프로모터, 바실루스 아밀로리퀴에파시엔스 알파-아밀라제 유전자 (amyQ)로부터 얻어지는 프로모터, 바실루스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자 (penP)로부터 얻어지는 프로모터, 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 로부터 얻어지는 프로모터, 및 원핵생물의 베타-락타마제 유전자로부터 얻어지는 프로모터 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731), 뿐만 아니라 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Poceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)가 있다. 추가의 프로모터들은 문헌에 설명되어 있다 ( "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94; 및 Sambrook et al., 1989, 상기 동일).

조절 서열은 또한 전사를 끝내기 위하여 숙주 세포에 의해 인지된 서열인 적당한 전사 터미네이터 서열일 수 있다. 터미네이터 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능할 수 있는 것이면 어떠한 터미네이터든지 본 발명에 사용될 수 있다.

조절 서열은 또한 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA 의 비번역 영역인 적당한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능할 수 있는 것이면 어떠한 리더 서열이든지 본 발명에 사용될 수 있다.

조절 서열은 또한 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있으며, 이것은 숙주 세포의 분비 경로안에 코드화된 폴리펩티드를 특정할 수 있는 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코드한다. 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 단부는 분비된 폴리펩티드를 코드화하는 코딩 영역의 절편을 가지고 있는 번역 리딩 프레임에 자연적으로 연결되어 있는 신호 펩티드 코딩 영역을 본질적으로 함유할 수 있다. 또는 달리, 코딩 서열의 5' 단부는 코딩 서열에 대하여 외래성인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 코딩 서열이 정상적으로 신호 펩티드 코딩 영역을 함유하지 않은 경우에 필요할 수 있다. 또는 달리, 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 단순히 폴리펩티드의 증가된 분비를 얻기 위하여 천연 신호 펩티드 코딩 영역을 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로안에 특정하는 것이면 어떠한 신호 펩티드 코딩 영역이든지 본 발명에 사용될 수 있다.

박테리아 숙주 세포를 위한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 바실루스 NCIB 11837 로부터의 말토제닉 아밀라제 유전자, 바실루스 스테아로써모필루스 알파-아밀라제 유전자, 바실루스 리케니포르미스 서브틸리신 유전자, 바실루스 리케니포르미르 베타-락타마제 유전자, 바실루스 스테아로써모필루스 중성 프로테아제 유전자 (nprT, nprS, nprM), 또는 바실루스 서브틸리스 prsA 유전자로부터 얻어지는 신호 펩티드 코딩 영역이다. 추가의 신호 펩티드에 대한 설명은 문헌을 참조한다 (Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137).

조절 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 코드하는 프로펩티드 코딩 영역일 수 있다. 그 결과의 폴리펩티드는 프로효소 또는 프로폴리펩티드 (또는 어떤 경우에는 자이모겐)로서 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 비활성이며, 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의하여 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실루스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제 유전자 (aprE) 또는 바실루스 서브틸리스 중성 프로테아제 유전자 (nprT)로부터 얻어질 수 있다.

폴리펩티드의 아미노 말단에 신호 펩티드와 프로펩티드 영역 두 가지가 모두 존재하는 경우에는, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 다음에 위치하고 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단의 뒤에 위치한다.

또한 숙주 세포의 성장과 관련하여 폴리펩티드의 발현의 조절을 허용하는 조절 서열이 첨가되는 것이 바람직할 것이다. 조절 시스템의 실예는 조절 화합물의 존재를 포함하여, 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 시작되고 끝나는 유전자의 발현을 유발하는 것들이다. 원핵 시스템에서의 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함할 것이다. 조절 서열의 다른 실예는 유전자 증폭을 허용하는 것들이다. 이들 경우에, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열은 조절 서열과 작동가능하게 연결될 것이다.

발현 벡터

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열, 프로모터, 및 전사 및 번역 중지 신호를 포함하고 있는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상술된 다양한 핵산 및 조절 서열은 함께 결합되어 하나 또는 둘 이상의 편리한 제한 부위에서 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 삽입 또는 치환을 허용하기 위하여 상기 부위들을 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터가 생성될 수 있다. 또는 달리, 본 발명의 핵산 서열은 핵산 서열 또는 그 서열을 포함하는 핵산 구성물을 발현에 적절한 벡터안에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터를 제조함에 있어서, 코딩 서열은 코딩 서열이 발현을 위해 적절한 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터에 위치된다.

재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 과정을 편리하게 수행받을 수 있고 핵산 서열의 발현을 발생할 수 있으면 어떠한 벡터든지 될 수 있다 (예컨대 플라스미드 또는 바이러스). 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터와의 부합성에 좌우된다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있다.

벡터는 자동적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체외적으로 존재하며, 그것의 복제가 염색체 복제와는 무관한 존재, 예컨대 플라스미드, 염색체외재성 엘레먼트, 미니염색체, 또는 인공 염색체와 같은 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 확실히 하기 위한 어떠한 수단을 함유할 수 있다. 또는 달리, 벡터는 숙주 세포에 도입되었을 때, 게놈안으로 통합되고, 그것이 통합되는 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 나아가, 숙주 세포의 게놈안에 도입될 총 DNA를 함께 함유하고 있는 단일한 벡터 또는 플라스미드 또는 둘 또는 그 이상의 벡터 또는 플라스미드가 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게도 형질전환된 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 또는 둘 이상의 선택가능한 마아커를 함유한다. 선택가능한 마아커는 그것의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구체에 대한 무기영양체, 등을 제공하는 유전자이다. 박테리아성 선택가능한 마아커의 실예로는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로로암페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생물질 내성을 부여하는 마아커가 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게도 숙주 세포 게놈안으로의 벡터의 안정한 통합 또는 숙주 세포의 게놈과 무관하게 세포에서의 벡터의 자가 복제를 허용하는 엘레먼트(들)을 함유한다.

숙주 세포 게놈안으로의 통합을 위하여, 벡터는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 또는 동종 또는 비동종 재조합에 의하여 게놈안으로의 벡터의 안정한 통합을 위한 벡터의 어떠한 다른 엘레먼트에 의존할 것이다. 또는 달리, 벡터는 숙주 세포의 게놈안으로의 동종 재조합에 의하여 통합을 지시하기 위한 추가의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 추가의 핵산 서열은 염색체(들)의 정확한 위치(들)에서 숙주 세포 게놈안에 백터가 통합되는 것을 가능하게 한다. 정확한 위치에서의 통합의 가능성을 증가시키기 위하여, 통합 엘레먼트들은 바람직하게 충분한 수, 예컨대 100 내지 1,500 염기쌍, 바람직하게는 400 내지 1,500 염기쌍, 가장 바람직하게는 800 내지 1,500 염기쌍의 핵산을 함유하여야 하며, 이 핵산은 동종 재조합의 가능성을 증강시키기 위하여 상응하는 표적 서열에 대하여 매우 상동성이 높다. 통합 엘레먼트들은 숙주 세포의 게놈의 표적 서열과 상동하는 어떠한 서열일 수 있다. 나아가, 통합 엘레먼트들은 비-코드화 또는 코드화 핵산 서열일 수 있다. 다른 한편으로, 벡터는 비-동종성 재조합에 의하여 숙주 세포의 게놈안에 통합될 수 있다.

자가 복제를 위하여, 벡터는 추가로 의문의 숙주 세포에서 벡터가 자동적으로 복제하는 것을 가능하게 하는 복제 기원을 포함할 수 있다. 박테리아성 복제 기원의 실예로는 대장균에서의 복제를 허용하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177, 및 pACYC184 의 복제 기원, 및 바실루스에서의 복제를 가능하게 하는 pUB110, pE194, pTA1060 및 pAMβ1 의 복제 기원이 있다. 복제 기원은 그것의 숙주 세포에서의 기능을 온도-민감성으로 만드는 돌연변이를 가지고 있는 것일 수 있다 (Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433).

본 발명의 핵산 서열의 하나 이상의 복사물이 유전자 생성물의 생성을 증가시키기 위하여 숙주 세포안에 삽입될 수 있다. 핵산 서열의 복사물 수의 증가는 서열의 최소한 하나의 추가의 복사물을 숙주 세포의 게놈안에 삽입하거나 또는 세포가 선택가능한 마아커 유전자의 증폭된 복사물을 함유하고 있는 경우에 핵산 서열과 함께 증폭가능한 선택가능한 마아커 유전자를 포함함으로써 얻어질 수 있고, 그로써 핵산 서열의 추가의 복사물이 적절한 선택제의 존재하에 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.

상술된 엘레먼트를 본 발명의 재조합 발현벡터를 구성하기 위하여 결찰시키기 위해 사용된 과정들은 당업자에게 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., 1989, 상기 동일).

숙주 세포

본 발명은 또한 발명의 핵산 서열을 포함하고 있는, 폴리펩티드의 재조합 제조에 유익하게 사용되는 재조합 숙주 세포에도 관한 것이다. 본 발명의 핵산 서열을 포함하고 있는 벡터는 숙주 세포안에 도입되어서 벡터는 앞서 설명된 바와 같이 염색체의 통합체로서 또는 자체-복제하는 염색체외재성 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포" 는 복제되는 동안 발생하는 돌연변이에 기인한 모 세포와는 동일하지 않은 모세포의 어떠한 자손이든지 포함한다. 숙주 세포의 선택은 크게는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자 및 그것의 공급원에 좌우될 것이다.

숙주 세포는 어떠한 단세포적인 미생물, 예컨대 원핵세포일 수 있다. 유용한 단세포적 세포로는 그람 포지티브 박테리아와 같은 박테리아 세포, 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 바실루스 세포, 예컨대 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리퀴에파시엔스, 바실루스 브레비스, 바실루스 써큘란스, 바실루스 클라우시, 바실루스 코아귤란스, 바실루스 라우투스, 바실루스 렌투스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 스테아로써모필루스, 바실루스 서브틸리스 및 바실루스 튜링기엔스; 또는 스트렙토마이세스 세포, 예컨대 스트렙토마이세스 리비단스 또는 스트렙토마이세스 뮤리누스, 또는 그람 네가티브 박테리아, 예컨대 대장균 및 슈도모나스 종이 있다. 바람직한 구체예에서, 박테리아 숙주 세포는 바실루스 렌투스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 스테아로써모필루스 또는 바실루스 서브틸리스 세포이다. 다른 바람직한 구체예에서, 바실루스 세포는 친알칼리성 바실루스이다.

박테리아 숙주 세포안으로의 벡터의 도입은 예를 들면 원형질체 형질전환에 의하여 (Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), 경합 세포를 사용함으로써 (Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829; Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), 일렉트로포레이션에 의하여 (Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), 또는 포합에 의하여 (Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278) 이루어질 수 있다.

제조 방법

본 발명은 또한 (a) 그것의 야생형 형태가 폴리펩티드를 생성할 수 있는 스트레인을 배양함으로써, 폴리펩티드를 포함하고 있는 상층액을 제조하는 단계; 그리고 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어지는, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에도 관한 것이다. 바람직하게는, 스트레인은 스핑고모나스 속에 속하는 것이고, 보다 바람직하게는 스핑고모나스 캡슐라타이다.

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 제조를 유도할 수 있는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 그리고 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어지는, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에도 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) SEQ ID NO: 1 의 핵산 서열에 최소한 하나의 돌연변이를 가지고 있으며, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는, SEQ ID NO: 1 의 돌연변이 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 폴리펩티드의 생성을 유도할 수 있는 조건하에서 배양하는 단계; 그리고 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어지는, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에도 관한 것이다.

본 발명의 제조 방법에서, 세포는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 폴리펩티드의 제조에 적당한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 적당한 배지에서 및 폴리펩티드가 발현되고 및/또는 단리되는 것을 허용하는 조건하에서 수행되는 실험실 또는 산업적 규모의 발효기에서 진동 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모의 발효 (연속식, 배치식, 또는 고체 상태 발효를 포함함)에 의하여 배양될 수 있다. 배양은 탄소 및 질소 공급원과 무기염을 포함하고 있는 적당한 영양 배지에서, 당해 기술분야에 공지되어 있는 과정을 사용하여 일어난다. 적당한 배지는 상업적인 공급자들로부터 활용가능하거나 또는 공개된 조성 (예컨대 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션의 카탈로그)에 따라 제조될 수 있다. 만약 폴리펩티드가 영양 배지안으로 분비된다면, 폴리펩티드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 만약 폴리펩티드가 분비되지 않는다면, 폴리펩티드는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.

폴리펩티드는 폴리펩티드에 대하여 특이한, 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 이들 검출 방법은 특이한 항체의 사용, 효소 생성물의 형성, 또는 효소 기질의 소멸을 포함할 것이다. 예를 들어, 효소 검정은 폴리펩티드의 활성을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 아미노펩티다제 활성을 측정하기 위한 과정은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 앞서 설명된 바와 같이, 아미노펩티다제 활성은 405 nm에서 p-니트로아닐리드의 초기 가수분해 속도를 측정함으로써 측정된다.

그 결과의 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 종래 과정에 의하여 영양 배지로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있는 다양한 과정, 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 크로마토그래피 (예컨대 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 축출), 전기영동적 과정 (예컨대 예비용 등전점 포커싱), 차등 용해도 (예컨대 암모늄 술페이트 침전), SDS-PAGE, 또는 추출에 의하여 정제될 수 있다 (Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

식물

본 발명은 또한 회수가능한 양으로 폴리펩티드를 발현하고 생성하기 위하여 발명의 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열로 형질전환된 트란스제닉 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에도 관한 것이다. 폴리펩티드는 식물 또는 식물 부분으로부터 회수될 수 있다. 또는 달리, 재조합 폴리펩티드를 함유하고 있는 식물 또는 식물 부분이 식품 또는 사료의 질을 개선하기 위하여, 예컨대 영양가, 기호, 및 유동학적 성질을 개선시키기 위하여, 또는 영양적이지 못한 인자를 파괴하기 위하여 사용될 수 있다.

트란스제닉 식물은 짧은 쌍떡잎 또는 외떡잎에 대하여 쌍떡잎식물이거나 또는 외덕잎식물일 수 있다. 외떡잎 식물의 예로는 풀, 예컨대 메도우 풀 (블루 그래스, 포아풀), 페스투카와 같은 사료, 로리움, 템퍼레이트 그래스, 예컨대 아그로스티스, 및 곡물, 예컨대 밀, 귀리, 호밀, 보리, 쌀, 수수 및 옥수수가 있다.

쌍떡잎 식물의 실예로는 담배, 콩과 식물, 예컨대 루핀스, 감자, 사탕무우, 완두콩, 빈 및 소이빈, 및 십자화과 식물 (겨자과 식물), 예컨대 콜리플라워, 지방 종자 평지 및 밀접하게 관련된 모델 유기체, 아라비돕시스 탈리아나가 있다.

식물 부분의 예로는 줄기, 칼루스 (유합조직), 잎, 뿌리, 과일, 종자, 및 덩이줄기가 있다. 본 명세서에서는 또한 특이한 식물 조직, 예컨대 엽록체, 아포플라스트, 미토콘드리아, 액포, 페르옥시솜, 및 세포질이 식물 부분으로서 간주된다. 나아가, 어떠한 식물 세포가, 그것이 조직 기원이든 아니든 식물 부분으로서 간주된다.

또한 그러한 식물, 식물 부분 및 식물 세포의 자손도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 트란스제닉 식물 또는 식물 세포는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 간단히 설명하면, 식물 또는 식물 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 하나 또는 둘 이상의 발현 구성물을 식물 숙주 게놈안에 통합시키고, 그 결과 변형된 식물 또는 식물 세포를 트란스제닉 식물 또는 식물 세포안에서 증식시킴으로써 제조된다.

편리하게도, 발현 구성물은 선택된 식물 또는 식물 부분에서 핵산 서열의 발현에 필요한 적절한 조절 서열과 작동가능하게 결합되어 있는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하고 있는 핵산 구성물이다. 나아가, 발현 구성물은 그 안에 발현 구성물이 통합되어 있는 숙주 세포를 확인하기 위하여 유용한 선택가능한 마아커 및 관심의 식물안에 구성물을 도입시키기 위하여 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다 (후자는 사용되는 DNA 도입 방법에 따라 좌우된다).

조절 서열, 예컨대 프로모터 및 터미네이터 서열 및 임의로 신호 또는 수송 서열의 선택은, 예컨대 폴리펩티드가 어디서 어떻게 발현되기를 원하는지를 기초로 결정된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 발현은 구성성이거나 또는 유도성일 수 있으며, 또는 발생, 단계 또는 조직 특이적일 수 있고, 발현 생성물은 특이한 조직 또는 식물 부분, 예컨대 종자 또는 잎으로 표적화될 수 있다. 조절 서열은 예를 들면 문헌에 설명되어 있다 (Tague et al., Plant. Phys., 86, 506, 1988).

구성성 발현을 위해서는 35S-CaMV 프로모터가 사용될 수 있다 (Franck et al, 1980, Cell 21:285-294). 기관-특이적 프로모터는 예컨대 저장 장소 조직, 예를 들면 종자, 감자 덩이줄기, 및 과일로부터 (Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24:275-303), 또는 분열조직과 같은 대사 장소 조직으로부터 (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24:863-878) 얻어지는 프로모터, 쌀로부터 얻어지는 글루텔린, 프롤라민, 글로불린 또는 알부민 프로모터와 같은 종자 특이적 프로모터 (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 8 pp. 885-889 (1998)), 콘라드 등에 의해 설명된 바와 같은 비키아 파바로부터 얻어지는 레구민 B4 및 미지의 종자 단백질 유전자로부터의 비키아 파바 프로모터 (Conrad U. et al., Journal of Plant Physiology Vol. 152, No. 6 pp. 708-711 (1998)), 종자 오일 바디 단백질로부터의 프로모터 (Chen et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 9 pp. 935-941 (1989)), 브라시카 나푸스로부터 얻어지는 저장 단백질 napA 프로모터, 또는 당해 기술 분야에 공지되어 있는, 예컨대 WO 91/14772 에 기재되어 있는 바와 같은 다른 종자 특이적 프로모터이다. 나아가, 프로모터는 잎 특이적 프로모터, 예를 들면 쌀 또는 감자로부터 얻어지는 rbcs 프로모터 (Kyozuka et al., Plant Physiology Vol. 102, No. 3 pp. 991-1000 (1993)), 클로렐라 바이러스 아데닌 메틸트란스페라제 유전자 프로모터 (Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, No. 1 pp. 85-93 (1994)), 또는 쌀로부터 얻어지는 aldP 유전자 프로모터 (Kagaya et al., Molecular and General Genetics Vol. 248, No. 6 pp. 668-674 (1995)), 또는 감자 pin2 프로모터와 같은 상처 유도성 프로모터 (Xu et al., Plant Molecular Biology Vol. 22, No. 4 pp. 573-588 (1993))일 수 있다.

프로모터 인핸서 엘레먼트는 식물에서 폴리펩티드의 더 높은 수준의 발현을 이루기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모터 인핸서 엘레먼트는 프로모터와 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 사이에 위치한 인트론일 수 있다. 예를 들어, 쿠 등은 상기 문헌에서 발현을 증강시키기 위하여 쌀의 액틴 1 유전자의 첫 번째 인트론을 사용하는 것을 개시하였다.

발현 구성물의 선택가능한 마아커 유전자 및 어떠한 다른 부분들은 당해 기술 분야에서 활용가능한 것들로부터 선택될 수 있다.

핵산 구성물은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 종래 기법들, 예를 들어 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스-매개 형질전환, 마이크로 주사, 입자 충격, 바이오리스틱 (biolistic) 형질전환, 및 일렉트로포레이션 (Gasser et al., Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al., Nature, 338, 274, 1989)에 따라 식물의 게놈안에 통합될 수 있다.

현재, 트란스제닉 쌍떡잎 식물을 생성하기 위해 선택된 방법은 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전달이지만 (Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19:15-38), 이 방법은 또한 비록 다른 형질전환 방법이 이들 식물에 대해 일반적으로 바람직하긴 하지만, 외떡잎 식물의 형질전환을 위해서도 사용될 수 있다. 현재, 트란스제닉 외떡잎 식물을 생성하기 위하여 선택된 방법은 배의 (embryonic) 콜리 (calli) 또는 발생하는 배의 입자 충격 (형질전환하는 DNA 로 코팅된 현미경으로 볼 수 있는 금 또는 텅스텐 입자)이다 (Christou, 1992, Plant J. 2:275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10:667-674). 외떡잎 식물을 형질전환시키기 위한 또 다른 방법은 문헌에 기재되어 있는 것과 같은 원형질체 형질전환을 기초로 한다 (Omirulleh S. et al., Plant Molecular Biology Vol. 21, No. 3 pp. 415-428 (1993)).

형질전환에 이어서, 발현 구성물이 통합되어 있는 형질전환체들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 선택되고 전체 식물에서 재생된다.

본 발명은 또한 (a) 본 발명의 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하고 있는 트란스제닉 식물 또는 식물 세포를, 폴리펩티드의 생성을 유도할 수 있는 조건하에서 배양하는 단계; 그리고 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어지는, 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법에도 관한 것이다.

아미노펩티다제 활성의 제거 또는 감소

본 발명은 또한 모 세포의 돌연변이 세포의 제조 방법에도 관한 것으로, 이 방법은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 또는 그것의 조절 서열을 파괴하거나 또는 삭제하는 것으로 이루어지며, 그 결과 동일한 조건하에서 배양되었을 때 돌연변이 세포는 모 세포보다 더 적은 폴리펩티드를 생성한다.

아미노펩티다제 활성이 감소된 스트레인의 제조는 편리하게도 세포에서 아미노펩티다제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드의 발현에 필요한 핵산 서열을 변형시키거나 또는 비활성화시킴으로써 이루어질 수 있다. 변형되거나 또는 비활성화될 핵산 서열은 예를 들면 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 또는 아미노펩티다제 활성을 나타내기 위하여 필요한 그것의 부분일 수 있고, 또는 핵산 서열은 핵산 서열의 코딩 서열로부터 폴리펩티드의 발현에 필요한 조절 기능을 가질 수도 있다. 그러한 조절 또는 제어 서열의 실예로는 프로모터 서열 또는 그것의 기능적인 부분, 즉 폴리펩티드의 발현을 이루기에 충분한 부분이다. 가능한 변형에 대한 다른 조절 서열은 상술되었다.

핵산 서열의 변형 및 비활성화는, 세포에 대하여 돌연변이 생성을 수행하고, 아미노펩티다제 생성 능력이 감소되어 있는 세포를 선택하거나 또는 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. 특이적이거나 무작위한 돌연변이생성은 예를 들면 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이 생성제를 사용함으로써, 적당한 뉴클레오티드를 사용함으로써, 또는 DNA 서열에 대하여 PCR 생성된 돌연변이 생성을 수행함으로써 수행될 수 있다. 나아가, 돌연변이생성은 이들 돌연변이생성제의 어떠한 조합을 사용하여서도 수행될 수 있다.

본 발명의 목적에 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이생성제의 실예로는 자외선 (UV) 조사, 히드록실아민, N-미텔-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), O-메틸 히드록실아민, 질산, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS), 아황산 나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체가 있다.

그러한 제제들이 사용될 때, 돌연변이 생성은 전형적으로 돌연변이될 세포를 선택된 돌연변이생성제의 존재하에 적당한 조건하에서 인큐베이션시키고, 감소된 아미노펩티다제 활성 또는 생성을 보이는 세포들을 선택함으로써 수행된다.

본 발명의 폴리펩티드의 생성의 변형 또는 비활성화는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 또는 그것의 전사 또는 번역에 필요한 조절 엘레먼트에 하나 또는 둘 이상의 뉴클레오티드를 도입, 치환 또는 제거함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드는 중지 코돈의 도입, 출발 코돈의 제거, 또는 오픈 리딩 프레임의 변화를 초래하기 위하여 삽입되거나 또는 제거될 수 있다. 그러한 변형 또는 비활성화는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법에 따라 부위-특정 돌연변이생성에 의하여 또는 PCR 생성된 돌연변이 생성에 의하여 이루어질 수 있다. 비록 원리적으로는 변형이 생체내에서, 즉 변형될 핵산 서열을 발현하는 세포에 대하여 이루어질 수 있긴 하지만, 변형은 하기에서 예시되는 바와 같이 시험관내에서 수행되는 것이 바람직하다.

선택된 숙주 세포에 의한 생성을 비활성화 또는 감소시키기 위한 편리한 방법의 실예는 유전자 대체 또는 유전자 방해 기법을 기초로 한다. 예를 들어, 유전자 방해 방법에서, 관심의 내인성 유전자 또는 유전자 단편에 상응하는 핵산 서열이, 숙주 세포에 형질전환되었을 때 결핍성 유전자를 생성하게 되는 결핍성 핵산 서열을 생성하도록 시험관내에서 돌연변이된다. 동종 재조합에 의하여, 결핍성 핵산 서열은 내인성 유전자 또는 유전자 단편을 대체한다. 결핍성 유전자 또는 유전자 단편은 또한 폴리펩티드를 코드화하는 유전자가 변형되어 있거나 또는 파괴되어 있는 형질전환체를 선택하기 위하여 사용될 수 있는 마아커를 코드화하는 것이 바람직할 것이다.

또는 달리, 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 변형 또는 비활성화는 폴리펩티드 코드화 서열에 상보하는 핵산 서열을 사용하여 수립된 안티-센스 기법에 의하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 세포에 의한 폴리펩티드의 생성은 세포에서 전사될 수 있고 세포에서 생성된 폴리펩티드 mRNA 와 혼성화할 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 도입시킴으로써 감소되거나 또는 제거될 수 있다. 상보하는 안티-센스 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드 mRNA 와 혼성화되는 것을 허용하는 조건하에서, 번역되는 폴리펩티드의 양은 그로써 감소되거나 또는 제거된다.

본 발명의 방법에 따라 변형될 세포가 미생물 기원의 것, 예컨대 세포에 대하여 동종이거나 또는 이종성인, 원하는 단백질 생성물의 생성에 적당한 진균 스트레인인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 또는 그것의 조절 서열의 파괴 또는 결실을 포함하고 있음으로써, 그 결과 돌연변이 세포가 모 세포보다 더 적은 폴리펩티드를 생성하게 되는 모 세포의 돌연변이 세포에 관한 것이다.

그렇게 생성된 폴리펩티드-결핍성 돌연변이 세포는 특히 동종성 및/또는 이종성 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 유용하다. 그러므로, 본 발명은 추가로 (a) 돌연변이 세포를 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건하에서 배양하는 단계; 그리고 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어지는, 동종성 또는 이종성 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 용어 "이종성 폴리펩티드" 는 본원에서 숙주 세포에 대하여 천연적이지 않은 폴리펩티드, 천연 서열을 변경하도록 변형이 만들어져 있는 천연 단백질, 또는 그것의 발현이 재조합 DNA 기법에 의하여 숙주 세포의 조작의 결과로서 정량적으로 변경된 천연 단백질로서 규정된다.

또 다른 추가의 측면으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라 관심의 생성물 두가지를 모두 생성하는 세포의 발효에 의하여 본질적으로 아미노펩티다제 활성이 없는 단백질 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 아미노펩티다제 활성을 억제할 수 있는 유효량의 제제를 발효중에 또는 발효가 완료된 후에 발효 육즙에 첨가하는 단계, 발효 육즙으로부터 관심의 생성물을 회수하는 단계, 그리고 임의로 회수된 생성물에 대하여 추가의 정제를 수행하는 단계로 이루어진다. 이 방법은 또한 하기의 실시예에서 예시된다.

또 다른 추가의 측면으로, 본 발명은 본질적으로 아미노펩티다제 활성이 없는 단백질 생성물을 생성하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법에서 관심의 단백질 생성물은 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 세포에 존재하는 DNA 서열에 의하여 코드화된다. 이 방법은 생성물의 발현이 허용되는 조건하에서 세포를 배양하는 단계, 그 결과의 배양 육즙에 대하여 조합된 pH 및 온도 처리를 수행함으로써 아미노펩티다제 활성을 실질적으로 감소시키는 단계, 그리고 배양 육즙으로부터 생성물을 회수하는 단계로 이루어진다. 또는 달리, 조합된 pH 및 온도 처리는 배양 육즙으로부터 회수된 효소 제제에 대하여 수행될 수도 있다. 조합된 pH 및 온도 처리는 임의로 아미노펩티다제 억제제로의 처리와 함게 조합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 이런 측면에 따라서, 최소한 60 %, 바람직하게는 최소한 75 %, 보다 바람직하게는 최소한 85 %, 더욱 바람직하게는 최소한 95 %, 가장 바람직하게는 최소한 99 % 의 아미노펩티다제 활성을 제거하는 것이 가능하다. 이 방법을 사용함으로써 아미노펩티다제 활성의 완전한 제거가 얻어질 수 있을 것으로 예상된다.

조합된 pH 및 온도 처리는 바람직하게는 6.5 내지 7.5 범위의 pH 및 40 내지 60 ℃ 범위의 온도에서, 원하는 효과를 얻기에 충분한 기간동안 수행되며, 전형적으로는 30 내지 60 분이면 충분하다.

관심의 생성물의 배양 및 정제에 사용된 방법들은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들에 의하여 수행될 수 있다.

본질적으로 아미노펩티다제가 없는 생성물을 생성하기 위한 본 발명의 방법은 진핵 폴리펩티드, 특히 효소와 같은 진균 단백질의 생성시에 특히 관심을 끈다. 효소는 예컨대 당분해 효소, 지방 분해 효소, 단백질 분해 효소, 셀룰로스 분해 효소, 산화환원 효소, 또는 식물 세포-벽 분해 효소로부터 선택될 수 있다. 그러한 효소들의 실예로는 아미노펩티다제, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카르보히드라제, 카르복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 시클로덱스트린 글리코실트란스페라제, 데옥시리보튜클레아제, 에스테라제, 갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글로코시다제, 할로퍼옥시다제, 헤미셀룰라제, 인버타제, 이소메라제, 락카제, 리가제, 리파제, 리아제, 만노시다제, 옥시다제, 펙틴 분해 효소, 과산화효소, 피타제, 페놀옥시다제, 폴리페놀옥시다제, 단백질 분해 효소, 리보뉴클레아제, 트란스페라제, 트란스글루타미나제, 또는 크실라제가 있다. 아미노펩티다제-결핍 세포는 또한 약제학적으로 관심을 끄는 이종성 단백질, 예컨대 호르몬, 성장 인자, 등의 발현에 사용될 수 있다.

용어 "진핵 폴리펩티드" 는 천연 폴리펩티드뿐만 아니라 예컨대 효소와 같은, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가에 의해, 또는 활성, 열적 용해도, pH 내성 등과 같은 변형에 의해 변형되어 있는 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

추가의 측면으로, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 아미노펩티다제 활성이 본질적으로 없는 단백질 생성물에 관한 것이다.

용도

본 발명의 폴리펩티드는 가수분해 및 풍미 발생의 정도를 증가시키기 위한 단백질 가수분해물의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 효소를 탈활성화시키는데에도 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 서열의 특정 서열의 절단이 바람직한 많은 경우의 목적에 대하여 유용할 것이다. 예를 들어, 일부의 단백질 또는 펩티드는 성숙한 단백질의 N-말단에 추가의 많은 아미노산 잔기를 포함하고 있는 비활성 선구체의 형태로 합성된다. 본 발명의 폴리펩티드는 그러한 선구체 단백질을 활성화시키기 위하여 필요한 후-번역 프로세싱을 제공할 수 있다.

신호 펩티드

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2 의 1 내지 32 의 아미노산으로 구성된 신호 펩티드를 코드화하는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 574 부터 669 까지의 뉴클레오티드로 구성되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 단백질을 코드화하는 유전자를 포함하고 있는 핵산 구성물에 관한 것으로, 상기 유전자는 핵산 서열에 대하여 외래적이다.

본 발명은 또한 재조합 발현 벡터 및 그러한 핵산 구성물을 포함하고 있는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 574 부터 669 까지의 뉴클레오티드로 구성되는 신호 펩티드 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 단백질을 코드화하는, 핵산 서열에 대하여 외래적인 유전자를 포함하는 핵산 구성물을 포함하고 있는 재조합 숙주 세포를, 단백질의 생성에 적당한 조건하에서 배양하는 단계; 그리고 (b) 단백질을 회수하는 단계로 이루어지는, 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

핵산 서열은 또한 다른 조절 서열과 함께 외래 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 다른 조절 서열은 상기에서 설명되어 있다.

단백질은 어떠한 단백질일 수 있다. 나아가, 단백질은 숙주 세포에 대하여 천연이거나 또는 이종성일 수 있다. 용어 "단백질" 은 본원에서 코드화된 생성물의 특정한 길이를 언급하는 것이 아니며, 따라서 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질을 포함한다. 용어 "단백질" 은 또한 코드화된 단백질을 형성하기 위하여 조합된 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 단백질은 또한 하나 또는 둘 이상이 숙주 세포에 대하여 이종성이거나 또는 천연적인 최소한 둘 이상의 상이한 단백질로부터 얻어진 부분적인 또는 완전한 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 포함한다. 단백질은 나아가 상기 언급된 단백질 및 하이브리드 단백질의 자연적으로 발생하는 대립성 및 공학제조된 변이체를 포함한다.

바람직하게도, 단백질은 호르몬, 호르몬 변이체, 효소, 그것의 수용체 또는 부분, 항체 또는 그것의 일부, 또는 수용체이다. 보다 바람직한 구체예에서, 단백질은 산화환원 효소, 트란스페라제, 가수분해효소, 리아제, 이소메라제, 또는 리가제이다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 단백질은 아미노펩티다제, 아밀라제, 카르보히드라제, 카르복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 시클로덱스트린, 글리코실트란스페라제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 인버타제, 락카제, 리파제, 만노시다제, 뮤타나제, 산화효소, 펙틴 분해 효소, 과산화효소, 피타제, 폴리페놀옥시다제, 단백질 분해 효소, 리보뉴클레아제, 트란스글루타미나제 또는 크실라나제이다.

유전자는 원핵, 진핵 또는 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 목적에 대해 본원에서 사용되는 용어 "으로부터 얻어진" 은 주어진 공급원과 관련하여 단백질이 공급원에 의해 또는 그 안에 공급원으로부터의 유전자가 삽입되어 있는 세포에 의해 생성되는 것을 의미할 것이다.

본 발명을 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안될 하기의 실시예에 의하여 추가로 설명하기로 한다.

실시예 1: 스핑고모나스 캡슐라타로부터 미정제 효소 추출 분말의 제조

스핑고모나스 캡슐라타 IFO 12533 을 0.5 % 의 슈크로스, 1 % 의 젤라틴, 0.5 % 의 효모 추출물, 1 % 의 콘 스팁 액, 0.3 % 의 NaCl, 0.2 % 의 K₂HPO₄, 및 0.1 % 의 MgSO₄·7H₂O 로 구성된 배지 3 리터를 함유하고 있는 5 리터의 발효기에서 통기 및 교반하면서 9 시간동안 30 ℃에서 배양하였다. 배양 육즙으로부터 세포 덩어리를 수집하여 10 mM 의 트리스-HCl pH 8.0 완충액으로 2 번 세척하여 43 g 습식 중량의 세포 덩어리를 수득하였다. 세포 덩어리를 200 ml 의 10 mM 트리스-HCl pH 8.0 완충액에 현탁하고, 라이소자임과 트리톤 X-100을 각각 최종 농도 1 mg/ml 과 0.1 % 로 첨가함으로써 용해시키고, 그 용액을 37 ℃에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 용액을 초음파처리한 후, 15,000×g 에서 10 분동안 원심분리하였다. 상층액을 회수하고 (200 ml) 프로타민 술페이트를 최종 농도 0.1 % 로 첨가하여 핵산을 침전시켰다. 침전을 동일한 방식으로 원심분리를 통하여 따라버리고, 그 결과의 용액을 미정제 효소 추출물로서 사용하였다.

다양한 합성 펩티드에 대한 미정제 효소 추출물의 활성을 하기 표 1 에서와 같이 측정하였다. 그 결과 미정제 효소 추출물이 디펩티딜 펩티다제 IV, 로이신 아미노펩티다제, 글리신 아미노펩티다제, 및 프롤릴 올리고펩티다제 활성을 가지고 있는 것으로 증명되었다.

미정제 효소 추출물 용액에서의 다양한 펩티다제 활성의 활성

펩티다제	기질	활성 (%)
프롤릴 올리고펩티다제	Z-Ala-Ala-Pro-pNA	46.0
프롤릴 올리고펩티다제	Z-Gly-Pro-pNA	68.7
디펩티딜 펩티다제 IV	Gly-Pro-pNA	21.9
글리신 아미노펩티다제	Gly-pNA	100
로이신 아미노펩티다제	Leu-pNA	67.8

미정제 효소 추출물을 동일한 부피의 저온 아세톤을 첨가함으로써 침전시켰다. 효소 침전을 작은 부피의 10 mM 의 인산염 pH 6.0 완충액에 녹이고, 불용성 물질을 원심분리에 의하여 제거하였다. 효소를 동결건조시켜서 미정제 효소 분말을 제조하였다.

실시예 2: 미정제 효소 분말로부터 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다 제 I 의 정제

실시예 1 에서 설명된 미정제 효소 분말을 20 mM 의 인산염 pH 7.0 완충액에 녹이고, 샘플의 전도성이 로딩 완충액, 즉 20 mM 의 인산염 pH 7.0 과 동등해질 때까지 희석하였다. 샘플을 20 mM 의 인산염 pH 7.0 완충액으로 미리 평형화하여 놓은 파마시아 Q-세파로스 또는 모노 Q 칼럼위에 로딩하였다. 이들 칼럼으로부터의 흐름-통과액에 대하여 알라닌-파라-니트로아닐리드 (Ala-pNA)를 사용하여 하기에서 설명되는 과정을 사용하여 아미노펩티다제 활성에 대하여 검정하였다.

디메틸술폭시드중의 ml 당 100 mg 의 Ala-pNA 의 스톡 용액을 50 mM 의 인산 나트륨 pH 7.5 완충액을 사용하여 ml 당 2 mg 의 농도로 희석하였다. 아미노펩티다제와 파라-니트로아닐리드와의 반응은, 10 내지 50 ㎕ 의 효소 용액의 분취액이 미소적정 플레이트 웰에 있는 200 ㎕ 의 기질 용액에 첨가되었을 때 개시되었다. 파라-니트로아닐리드의 가수분해의 초기 속도에 대한 분석은 405 nm 에서 및 실온에서 THERMOmax Microplate Reader (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)에서 모니터하였다.

아미노펩티다제 활성은 흐름-통과액에 존재하였다. 흐름-통과액을 DIAFLO PM 10 한외여과 멤브레인 (Amicon, Inc., USA)이 장착되어 있는 아미콘 스피랄 한외여과 시스템 (Amicon, New Bedford, MA, USA)을 사용하여 농축시킨 후, 농축된 흐름-통과액의 pH를 70 mM 의 아세트산 나트륨 pH 4.0 완충액을 사용하여 pH 6.0 으로 조정하였다.

농축된 흐름-통과액을 50 mM 의 MES pH 6.0 으로 미리 평형시켜놓은 파마시아 모노 S 5/5 예비-팩킹된 7 × 50 mm 칼럼 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에 적용하였다. 분획을 아미노펩티다제 활성에 대하여 상술한 바와 같이 검정하였다. 결합된 아미노펩티다제 활성을 50 mM 의 MES pH 6.0 완충액중의 0 부터 0.2 M 까지의 NaCl 구배를 사용하여 용출시켰다. 그런 다음 유의할만한 활성을 포함하고 있는 분획들을 PM 10 한외여과 멤브레인을 사용하여 다시 한 번 농축시킨 다음, 0.5 M 의 암모늄 술페이트가 함유되어 있는 50 mM 의 인산염 pH 7.0 완충액에 평형화하였다.

그런 다음 농축된 샘플을 0.5 M 의 암모늄 술페이트가 함유되어 있는 50 mM 의 인산염 pH 7.0 완충액으로 미리 평형화하여 놓은 페닐 슈퍼로스 칼럼위에 로딩하였다. 효소를 0.5 M 암모늄 술페이트가 함유되어 있는 50 mM 의 인산염 완충액으로부터 암모늄 술페이를 함유하지 않는 50 mM 의 인산염 완충액의 구배를 사용하여 용출하였다. 활성 분획들을 모았다.

정제된 아미노펩티다제의 SDS-PAGE 분석 결과, 분자량이 67 kDa 인 한 밴드가 나타났다. 정제된 아미노펩티다제를 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 으로 표시하였다.

실시예 3: 미정제 효소 분말로부터 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 정제

실시예 1 에서 설명한 미정제 효소 분말을 증류수에 녹이고, 15 mM 의 인산 나트륨 pH 6.0 완충액으로 미리 평형하여 놓은 CM 세파로스 CL-6B 칼럼 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)위에 로딩하였다. 아미노펩티다제 I 활성은 15 mM 부터 60 mM 까지의 인산 나트륨 pH 6.0 완충액의 선형 구배를 사용하여 용출하였다. 7.4 ml 씩의 분획을 모아서 실시예 2 에서 설명한 바와 같이 아미노펩티다제 활성에 대하여 검정하였다.

활성 분획을 모아서 15 mM 의 인산염 pH 6.0 완충액에 대하여 투석하였다. 투석액을 차례로 15 mM 의 인산 나트륨 pH 6.0 완충액으로 평형시켜 놓은 히드록실아파타이트 칼럼위에 로딩하였다. 아미노펩티다제 I 활성은 15 mM 부터 300 mM 까지의 인산 나트륨 pH 6.0 완충액의 선형 구배를 사용하여 용출하였다. 분획들을 모아서 아미노펩티다제 활성에 대하여 검정하였다. 활성 분획을 모아서 증류수에 대하여 투석하고, 동결건조시켰다.

실시예 4: 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 정제

스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 을, 스핑고모나스 캡슐라타 스트레인 IFO 12533 을 15 시간동안 31 ℃ 에서, 250 rpm 에서, 및 초기 pH 7.45 에서, 리터당 10 g 의 박토펩톤, 5 g 의 효모 추출물, 3 g 의 NaCl, 2 g 의 K₂HPO₄, 0.1 g 의 MgSO₄·7H₂O, 및 5 g 의 글루코스 (각각 별도로 오토클레이브함)로 구성된 1.5 리터의 배지에서 배양시킴으로써 생성된 배양 육즙 상층액으로부터 정제하였다.

아미노펩티다제 I 활성을 실시예 2 에서 설명한 바와 같이 알라닌-파라-니트로아닐리드 (Ala-pNA)를 사용하여 측정하였다.

원심분리에 의하여 제조되고 훠트만 글래스 마이크로섬유 필터 (Whatman, Maidstone, England)를 사용하여 여과하고, 0.22 mm 의 필터가 장착된 Nalgene 필터웨어를 사용하여 여과한 다음, PM 10 한외여과 멤브레인이 장착되어 있는 아미콘 스피랄 한외여과 시스템을 사용하여 농축한 배양 육즙 상층액 (대략 1 리터)을 10 mM 의 인산 나트륨 pH 6.0 완충액으로, 전도성 및 pH 가 로딩 완충액, 즉 50 mM 의 MES pH 6.0 과 동일하게 될 때까지 평형시켰다. 여과된 용액을 50 mM 의 MES pH 6.0 완충액으로 미리 평형시켜 놓은 대략 180 ml 의 SP-세파로스, 패스트 플로우 (Pharmacia Biotech Ab, Uppsala, Sweden)를 함유하고 있는 24×390 mm 칼럼위에 로딩하였다. 아미노펩티다제 I 활성을 나타내는 단백질을 50 mM 의 MES pH 6.0 완충액중의 0 부터 0.2 M 까지의 NaCl 의 240 ml 구배를 사용하여 용출하였다. 아미노펩티다제 I 활성을 가지고 있는 분획을 모아서, PM 10 멤브레인을 사용하여 탈염시킨 다음, 20 mM 의 인산 나트륨 pH 7.0 완충액으로 평형시켰다.

그런 다음 모아진 용액을 20 mM 의 인산 나트륨 pH 7.0 완충액으로 미리 평형시켜 놓은 파마시아 모노Q 비드 칼럼위에 로딩하였다. 아미노펩티다제 I 활성을 나타내는 단백질을 칼럼에 결합하지 않았고, 흐름-통과액에 모였다. 흐름-통과액을 상술한 바와 같이 PM 10 멤브레인 시스템을 사용하여 농축하였고, pH 를 70 mM 의 인산 나트륨 pH 4.0 완충액을 사용하여 6.0 으로 조정하였다.

농축된 흐름-통과액을 50 mM 의 MES pH 6.0 완충액으로 평형시켜 놓은 파마시아 S 칼럼위에 로딩하였다. 아미노펩티다제는 50 mM 의 MES pH 6.0 완충액중의 0 부터 0.2 M 까지의 NaCl 의 60 ml 의 구배를 사용하여 용출하였다. 그런 다음 유의할만한 Ala-pNA 활성을 나타내는 분획을 모아서, 상술한 바와 같이 PM 10 멤브레인을 사용하여 농축하고, 0.5 M 의 (NH₄)₂SO₄ 를 함유하고 있는 50 mM 의 인산염 pH 7.0 완충액으로 평형시켰다.

마지막으로, 농축된 샘플을 0.5 M 의 (NH₄)₂SO₄ 를 함유하고 있는 50 mM 의 인산염 pH 7.0 완충액으로 미리 평형시켜 놓은 파마시아 페닐 슈퍼로스 5/5 예비-팩킹된 7 × 50 mm 칼럼 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에 로딩하였다. 그런 다음 아미노펩티다제 I 활성을 나타내는 단백질을 50 mM 의 인산염 pH 7.0 완충액중의 0.5 부터 0 M 까지의 (NH₄)₂SO₄ 의 30 ml 의 구배를 사용하여 용출하였다. 아미노펩티다제 I 활성을 함유하고 있는 분획들을 SDS-PAGE 에 의하여 분석한 후, 모았다.

정제된 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 SDS-PAGE 분석 결과, 분자량이 67 kDa 인 한 밴드가 나타났다.

실시예 5: 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I (67 kDa)의 아미노산 서열화

실시예 2 에서 설명된 바와 같은 정제된 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 샘플을 8 내지 16 % 의 트리스-글리신 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동하였고, 계속해서 10 % 메탄올중의 10 mM CAPS (3-[시클로헥실아미노]-1-프로판술폰산) pH 11 을 사용하여 2 시간동안에 PVDF 막에 블롯-전달하였다. PVDF 막을 40 % 메탄올/1 % 아세트산중의 0.1 % 쿠마찌 블루 R-250 으로 20 초동안 염색하고 50 % 에탄올중에서 탈염하여 단백질 밴드를 관찰하였다. 67 kDa 의 주요 밴드를 절출하여, 블롯 카트리지와 액상 TFA 전달을 사용하여 제조자의 지시를 따라 어플라이드 바이오시스템스 모델 476A 단백질 서열화기상에서 아미노 말단의 서열화를 수행하였다. 단백질은 에드만 서열화 화합물에 대하여 N-말단적으로 차단된 것으로 나타났다.

실시예 2 에서 설명된 정제된 아미노펩티다제 I 의 1.0 ml 의 샘플을 Savant Speed Vac AS160 상에서 건조시킨 후, 300 ㎕ 의 70 % 포름산 (수성)에 재구성하였다. 약간의 시아노겐 브로마이드 결정을 첨가하고 실온에서 및 어두운 곳에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 샘플을 스피드 백에서 재건조하고 트리신 샘플 완충액 (Novex, San Diego, CA, USA)에 재구성하였다. 시아노겐 브로마이드 절단 단편을 10 내지 20 % 의 트리신 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 42, 30, 17, 15, 10, 6 및 4 kDa 의 밴드로 단리한 다음, PVDF 막에 블롯-전달하였다. 6, 10, 15, 17, 30, 및 42 kDa 밴드를 절출하여 아미노 말단 서열화를 수행하였다. 15, 10, 및 6 kDa 밴드의 N-말단 서열화로 다음의 서열을 얻었다:

15 kDa: AVPIAHGVPDAQDVPYPG (SEQ ID NO: 2)

10 kDa: AVNGDAYDADKLKGAITNAKTGNPGAGRPI (SEQ ID NO: 2)

6 kDa: GSIGLEHHRSSENQQEPKSLTDWAA (SEQ ID NO: 2)

정제된 아미노펩티다제를 또한 부분적으로 엔도프로테이나제 Glu-C 를 사용하여 다음과 같이 소화시켰다: 2.5 % 의 SDS 를 함유하고 있는 7.5 ㎕ 의 0.125 M 트리스-HCl pH 6.7 을 0.125 M 트리스-HCl pH 6.7 중의 농축된 아미노펩티다제 60 ㎕ 에 첨가하였다. 샘플을 혼합한 후, 2 분동안 끓이고, 23 ℃ 에서 15 분동안 냉각시켰다. 그런 다음 10 ㎕ 의 엔도프로테이나제 Glu-C 서열화 등급 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 0.125 M 트리스-HCl pH 6.7 중의 400 ㎍/ml 의 농도로 첨가하였다. 샘플을 2 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션후, 45 ㎕ 의 2X 트리신 SDS 샘플 완충액 (Novex, San Diego, CA, USA)을 첨가하고, 샘플을 5 분동안 끓였다.

펩티드 단편을 환원하는 조건하에서 10 내지 20 % 의 노벡스 트리스-트리신 겔을 사용하여 단리하였다. 펩티드 밴드를 관찰하고, 40, 30, 25, 22, 20, 17, 10, 6, 5, 및 4 kDa 밴드를 절출하였다. 40, 30, 및 10 kDa 밴드를 서열화한 결과, 그것들이 매우 혼합되어 있는 것으로 나타났다. 17 과 22 kDa 밴드가 혼합되어 있지만, 주요 서열은 다음과 같았다: FKDEPNPYDKARMADAKVLSLFNSLGVTLDKDGKV (SEQ ID NO: 2).

실시예 6: 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I (67 kDa)의 특성확인

디메틸술폭시드의 ml 당 각각의 파라-니트로아닐리드의 100 mg 의 스톡 용액을 50 mM 의 인산 나트륨 pH 7.5 완충액으로 ml 당 2 mg 의 농도로 희석하였다. 기질이 불완전하게 용해된 경우에는, 그것들의 현탁액을 사용하였다 (하기 표 2 의 별표로 표시됨). 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 과 각각의 파라-니트로아닐리드와의 반응은 50 mM 의 인산 나트륨 pH 7.5 완충액중의 효소 용액의 10 ㎕ 의 분취액을 96 웰 미소적정 플레이트의 190 ㎕ 의 기질 용액에 첨가하였을 때 개시되었다. 파라-니트로아닐리드의 가수분해의 초기 속도에 대한 분석은 405 nm 에서 및 25 ℃에서 THERMOmax Microplate Reader (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)에서 모니터하였다. 그 결과 (하기 표 2)는 아미노펩티다제 I 이 바람직하게도 Ala-pNA 를 가수분해하였을 뿐만 아니라, Gly-pNA 도 가수분해한 것으로 나타났다. 그러나, 디펩티드 기질중에서 아미노펩티다제 I 은 Ala-Ala-pNA 보다 Gly-Phe-pNA 를 더 빨리 가수분해하였다.

스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 기질 특이성

아미노산 p-니트로아닐리드	상대 활성 (%)
Ala	100
Met	24
Gly*	20
Leu	18.5
Glu*	6
Asp	4.5
Lys	6
Ile	0.5
Val	0.5
Phe*	0
Pro	0

67 kDa 아미노펩티다제 I 에 대한 pH 최적을 다음의 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 상이한 pH 에서의 완충 용액을, 증류수를 4.25 g 의 아세트산 나트륨 및 3.78 g 의 트리스 (유리 염기)에 최종 부피 250 ml 로 첨가하고, 36.5 내지 38 % 의 HCl 을 사용하여 pH 를 8.5, 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, 5.80, 5.5 및 5.0 으로 조정하였다. DMSO 중의 Ala-pNA 의 100 mg/ml 용액 20 ㎕ 를 980 ㎕ 의 각각의 완충 용액에 첨가하였다. 그런 다음 기질의 첨가가 완료된 후에 완충 용액에 대하여 pH 를 측정한 결과, 8.5, 8.0, 7.57, 7.30, 7.09, 6.68, 6.14, 및 5.25 였다. 2 mg/ml 농도의 기질의 다른 용액을 다양한 pH 에서 준비하였다. 반응은 10 mM 의 트리스-HCl pH 7.5 로 5-배 희석된 10 ㎕ 의 효소 용액을 다양한 pH 의 기질 200 ㎕ 용액에 실온에서 첨가함으로써 개시되었고, 이것을 405 nm 에서 모니터하였다.

그 결과를 하기 표 3 에 나타내는데, 결과는 아미노펩티다제 I 이 5.3 내지 8.5 범위, 보다 바람직하게는 7.0 내지 7.5 의 pH 최적을 가짐을 증명하였다 (도 1 참조). 5.25 내지 8.5 범위의 pH 에서는 Ala-pNA 의 검출가능한 자가가수분해가 없었다. pH 5.5 에서, 아미노펩티다제 I 에 의해 촉매된 Ala-pNA 의 가수분해는, 외관상의 Km 및 Vmax 가 기질에 의한 효소의 활성화에 기인하여 음의 값을 가지는 미카엘리스-멘튼 역학을 따르지 않았다. pH 7.5에서, Km 은 2.5 mM 이었다.

스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 pH 프로필

pH	상대 활성 (%)
5.25	24.9
6.14	56.4
6.68	78.4
7.09	99.4
7.30	100
7.57	92.8
8.0	61
8.49	24.2

온도 최적은 기질로서 Ala-pNA 를 사용하여 50 mM 의 인산 나트륨 pH 7.5 완충액중에서 30 내지 55 ℃ 의 온도 범위에 걸쳐 측정하였다. 그 결과 아미노펩티다제 I 은 pH 7.5 에서 35 내지 46 ℃ 의 온도 범위, 보다 바람직하게는 40 내지 45 ℃ 의 온도범위에서 온도 최적을 가졌다 (도 2 참조).

아미노펩티다제 I 의 온도 안정성을, 50 mM 의 인산 나트륨 pH 7.5 완충액중에서 35 내지 55 ℃ 범위의 온도에서 20 분동안 효소를 인큐베이션한 후, 얼음위에서 냉각시키고, 기질로서 Ala-pNA 를 사용하여 상술한 바와 같이 pH 7.5 에서 잔류 활성을 측정함으로써 측정하였다. 그 결과 (도 3 참조), 아미노펩티다제 I 은 pH 7.5 에서 약 40 ℃ 까지에서 100 % 안정하였다. 45 ℃ 에서는, 효소는 대략 60 % 의 잔류 활성을 보유하였고, 50 ℃ 에서는 효소는 완전히 비활성화되었다.

실시예 7: 미정제 및 정제된 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 DH 증가 효과 사이의 비교

스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I (67 kDa)의 DH 증가 효과를 콩 단백질 가수분해에서 평가하였고, 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 제조된 미정제 효소 분말의 성능과 비교하였다.

콩 단백질의 가수분해 정도 (DH)는 다음과 같이 측정하였다: 아들러-니쎈에 의해서 설명된 바와 같이 (Adler-Nissen, 1986, Enzymic Hydrolysis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers) 규정된 DH 는 본질적으로 처취 등에 의해서 설명된 바와 같이 (Church et al., 1983, Journal of Dairy Science 66: 1219-1227) 상층액과 OPA (오르토-프탈디알데하이드, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)와의 반응에 의해, 아들러-니쎈에 의해 측정된 바와 같은 보정 인자 (Adler-Nissen, 1979, Agricultural and Food Chemistry 27: 1256-1262)를 사용하여 측정하였다.

아미노펩티다제 I 을 증가하는 용량으로 FLAVOURZYME 1000L^TM 의 낮은 바탕 (1.5 % 의 기질 단백질) 또는 높은 바탕 (6 % 의 기질 단백질) 중 어느 하나 및 1.5 % 의 기질 단백질의 ALCALASE 2.4L 의 단위용량에 첨가하였다.

가수분해를 10 ml 의 규모로 50 ℃ 에서 18 시간동안 수행하였다. 초기 pH 는 가수분해중에 pH 의 재조정없이 7 이었다. 효소의 비활성화는 85 ℃ 에서 3 분동안 수조에서 수행하였다. 기질 농도는 소이빈 밀에서 얻은 2 % 의 단백질이었다. 기질을 수조에서 85 ℃ 에서 3 분동안 열처리하였다. 상술된 FLAVOURZYME 1000L^TM 및 ALCALASE 2.4L 와 함께 사용한 효소는 미정제 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 분말 (실시예 1 참조) 및 실시예 4 에서 설명된 정제된 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 이었다.

사용된 아미노펩티다제 I 의 단위용량은 pH 7.5 에서 Ala-pNa 의 가수분해에 의하여 측정된 알라닐-아미노펩티다제 유니트 (AAU)를 기초로 하였다. 아미노펩티다제 I 의 1 AAU 유니트는 pH 7.5, 및 0.05 의 이온 강도에서, 9.1 mM 의 Ala-pNa 용액중에서 분당 1.0 마이크로몰의 Ala-pNa 를 가수분해하는 효소의 양으로서 규정된다.

정제된 아미노펩티다제 I 의 비활성은 대략 12 AAU/mg 효소였다. 그러므로, 예를 들어 200 mg 의 콩 단백질당 0.24 AAU 의 용량은 kg 의 콩 단백질당 0.1 g 의 효소에 해당한다.

AAU 의 단위용량의 함수로서의 DH 는 FLAVOURZYME^TM 의 낮은 바탕 용량에 대해서는 도 4 에, 높은 바탕 용량의 FLAVOURZYME^TM 에 대해서는 도 5 에 도시되어 있다.

도 4 및 5 는 가수분해물이 가장 높은 용량의 AAU 에서 아미노펩티다제 I 활성으로 거의 포화되어 있음을 보여준다. 미정제 효소는 낮은 용량의 FLAVOURZYME^TM 에 첨가되었을 때 DH 를 44 % 에서 72 % 로 증가시킬 수 있었다. 정제된 아미노펩티다제 I 은 DH 를 61 내지 62 % 로 증가시켰다. 그러므로, 정제된 아미노펩티다제 I 은 미정제 효소의 DH 증가 효과의 (62-44)/(72-44)×100 % = 64 % 의 원인이 되었다. 미정제 효소는 높은 용량의 FLAVOURZYME^TM 에 첨가되었을 때 DH 를 61 % 에서 77 % 로 증가시켰다. 정제된 아미노펩티다제 I 은 DH 를 71 % 로 증가시켰다. 그러므로, 정제된 아미노펩티다제 I 은 미정제 효소의 DH 증가 효과의 (71-61)/(77-61)×100 % = 63 % 의 원인이 되었다.

아미노펩티다제 I 의 첨가를 대신하는 것은 더 많은 FLAVOURZYME^TM 의 첨가이다. 1.5 % 의 바탕 용량에 0.5 % 의 추가의 FLAVOURZYME^TM 을 첨가함으로써 DH 가 44 % 에서 48 % 로 증가하였다. 아미노펩티다제 I 을 첨가하는 것의 효과는 미정제 효소의 효과의 (62-48)/(72-48)×100 % = 58 % 로 계산되었다.

마찬가지로, 6 % FLAVOURZYME^TM 의 바탕 용량에 1 % 의 추가의 FLAVOURZYME^TM 을 첨가함으로써 DH 가 61 % 에서 63 % 로 증가되었다. 아미노펩티다제 I 의 효과는 미정제 효소의 효과의 (71-63)/(77-63)×100 % = 57% 로 계산되었다.

얻어진 가장 높은 DH 는 77 % 였다. DH 값은 가용성 단백질이 아니라 총 단백질을 토대로 하였다. 단백질 용해도는 약 85 % 였다. 그러므로, 가용성 단백질에서의 DH 는 약 91 % 였고, 거의 100 % 에 가까웠다.

AAU 첨가에 기인한 개별적인 유리 아미노산 (FAA)의 % 상대 증가는 하기 표 4 에 나타낸다. Hyp, 메티오닌술폰산, 및 Trp 은 그것들의 매우 변동적이고 불확실한 결과 때문에 하기 표에 포함되지 않았다.

그 결과는 미정제 또는 정제된 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 이 첨가되었을 때, Gly 이 가장 높은 증가를 나타낸 아미노산이었음을 보여주었다. 방출이 증가된 다른 아미노산들로는 Ala, Glu, Gln, Asp 및 Ser 이 있지만, 이들 아미노산에 대하여 미정제 효소는 아마도 미정제 효소에 존재하는 다른 아미노펩티다제들 때문에 정제된 아미노펩티다제 I 단독으로 사용되었을 때보다 더 많이 방출하는 것으로 나타났다.

높은 DH 의 가수분해물은 고용량의 FLAVOURZYME^TM 을 사용함으로써 생성되었다. 동일한 높은 DH 및 FAA 의 방출은 67 kDa 의 아미노펩티다제 I 또는 미정제 효소가 보충된 저용량의 FLAVOURZYME^TM 을 사용함으로써 얻어졌다. 상기 표 4 에 따라서, 67 kDa 의 아미노펩티다제 I 이 보충된 저용량의 FLAVOURZYME^TM 을 사용함으로써 얻어진 가수분해물은, 고용량의 FLAVOURZYME^TM 을 단독으로 사용함으로써 얻어진 가수분해물과 비교하여 보다 높은 수준의, 특히 Gly, 또한 Ala, Glu 및 Asp 와 보다 낮은 수준의 Met, Pro 및 Ile 을 포함할 것이다.

실시예 8: 젤라틴 가수분해에서 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 DH 증가 효과

스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 의 DH 증가 효과를 젤라틴 가수분해에서 시험하였다.

아미노펩티다제 I 을 증가하는 용량으로, 실시예 7 에서 수행한 바와 같이 낮은 또는 높은 바탕값의 FLAVOURZYME^TM 및 ALCALASE 에 첨가하였다.

가수분해를 에펜도르프 튜브로 200 ㎕ 의 반응액중에서 수행하였다. 기질인 젤라틴 (Merck)은 증류수에 85 ℃ 에서 5 분동안 용해시켰다. 50 ℃ 로 냉각한 다음, pH 를 6.5 로 조정하였다. 최종 젤라틴 농도는 효소의 첨가후에 2 % 로 조정하였다. 각각의 반응에서 기질의 농도는 4 mg 인 것으로 계산되었다.

FLAVOURZYME^TM 및 ALCALASE 와 함께 사용된 효소는 실시예 7 에서와 같이 미정제 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 분말과 정제된 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 이었다. 미정제 및 정제된 효소 두 가지의 글리신 아미노펩티다제 유니트 (GAPU)는, 기질로서 Gly-pNA 를 사용하여 50 mM 의 트리스-HCl pH 7.5 완충액중에서 37 ℃ 에서 측정하였다. Gly-pNA (Bachem Feinchemikalien AG, Bubendorf, Switzerland)을 40 % 의 디옥산에 2.5 mg/ml 의 농도로 녹이고, 1.5 부피의 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5)을 1 mg/ml 의 기질 농도에 첨가하였다. 효소 샘플을 500 ㎕ 의 동일한 완충액으로 희석하고, 100 ㎕ 의 기질 용액을 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 반응을 300 ㎕ 의 1 M 아세트산 나트륨 pH 4.0 완충액을 첨가함으로써 종결시켰다. 블랭크 반응을 위해서, 효소 용액에 중지 용액을 첨가하고 5 분동안 37 ℃ 에서 인큐베이션한 후, 기질 용액을 첨가하였다. 410 nm 에서의 흡광도를 샘플 및 블랭크 반응 두가지에 대하여 모두 측정하였다. 효소 활성을 pNA 에 대하여 410 nm 에서 분자 흡광 계수를 사용하여 9480 M-1 cm-1 로서 계산하였다. 1 유니트의 GAPU 를 상술된 조건하에서 분당 37 ℃ 에서 1 마이크로몰의 Gly-pNA 를 가수분해하는 효소의 양으로서 규정한다. 사용된 미정제 및 정제된 아미노펩티다제 I 의 비활성은 각각 0.725 GAPU/mg 및 6.45 GAPU/mg 이었다. 효소는 하기 표 5 의 개략도에 따라 4 mg 단백질로 정량하였다.

튜브 번호	FLAVOURZYMETM (㎍)	ALCALASE (㎍)	아미노펩티다제 I (㎍)
1	80 (2 %)	40 (1 %)
2	〃	〃
3	〃	〃
4	〃	〃
5	〃	〃	8 (0.2 %)0.05 U
6	〃	〃	31 (0.77 %)0.2 U
7	〃	〃	78 (2 %) 0.5 U
8	〃	〃	155 (4 %) 1.0 U
9	280 (7 %)	40 (1 %)
10	〃	〃
11	〃	〃
12	〃	〃
13	〃	〃	8 (0.2 %) 0.05 U
14	〃	〃	31 (0.77 %)0.2 U
15	〃	〃	78 (2 %) 0.5 U
16	〃	〃	155 (4 %) 1.0 U

효소/기질 비는 중량으로 표시된 효소의 양뒤에 괄호안에 표시된다.

가수분해 반응을 50 ℃ 에서 18 시간동안 수행하였다. 효소들을 85 ℃ 에서 5 분동안 비활성화시킨 후 원심분리하였다. DH 를 OPA 방법을 사용하여 가수분해물의 총 단백질 함량을 토대로 계산하였다.

도 6 및 7 에 도시된 정제된 아미노펩티다제 I 의 DH-증가 효과는, 낮은 FLAVOURZYME^TM 바탕에 미정제 및 정제된 효소 (0/2 U/4 mg 젤라틴)를 첨가함으로써 DH 가 38 % 에서 각각 67 % 및 61 % 로 증가하였음을 증명하였다. DH 증가 효과는 거의 이 용량에서 포화되었다.

FLAVOURZYME^TM 의 용량이 7 % 까지 증가되었을 때, 대조 DH 는 43 % 로 증가하였다. 그러나, 정제된 아미노펩티다제 I 로 얻어진 DH 는 61 % 였고, 이것은 낮은 FLAVOURZYME^TM 바탕으로 얻어진 것과 거의 일치하였다.

이들 결과는 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 이 단백질을 매우 높은 DH 로 가수분해함을 나타낸다. 나아가, 아미노펩티다제 I 을 사용함으로써, 동일한 DH 를 얻기 위해 다른 단백질 분해 효소의 용량이 감소될 수 있다.

실시예 9: 스핑고모나스 캡슐라타 B46 아미노펩티다제 I 유전자 확인을 위한 프로브의 제조

하기에 표시된 스핑고모나스 캡슐라타 B46 아미노펩티다제 I 의 내부 아미노산 서열을 토대로, 스핑고모나스 캡슐라타 B46 아미노펩티다제 I 을 확인하기 위하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 경유하여 프로브를 증폭시키기 위하여 축퇴성 프라이머를 합성하였다.

내부 펩티드 AB0713: AVNGDAYDADKLKGAITNAKTGNPGAGRPI (SEQ ID NO: 2)

내부 펩티드 AB0781: FKDEPNPYDKARMADAKVLSLFNSLGVTLDKDGKV (SEQ ID NO: 2)

하기에서 550-39-1, 550-23-4, 및 550-39-2 로 표시된 프라이머들을 하기에서 설명되는 증폭 반응에 사용하였다.

550-23-4: 5'-gcrtcrtangcrtcncc-3' (SEQ ID NO: 3)

550-39-1: 5'-aargaygarccnaaycc-3' (SEQ ID NO: 4)

550-39-2: 5'-acyttytcrtcyttrtc-3' (SEQ ID NO: 5)

증폭 반응을 50 pmol 의 프라이머 550-39-1 과 550-23-4 또는 550-39-1 과 550-39-2, 주형으로서의 1 ㎍ 의 스핑고모나스 캡슐라타 B46 염색체상의 DNA, 1× PCR 완충액 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 200 μM 의 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 0.5 U 의 AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer, Foster City, CA)를 사용하여 총 부피 50 ㎕ 부피로 만들었다. 스핑고모나스 캡슐라타 B46 염색체 DNA 를 키아겐 게노믹 핸드북 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)에 설명된 박테리아 단리 프로토콜을 사용하여 단리하였다. 반응물을 95 ℃ 에서 10 분동안 1 사이클, 각각 95 ℃ 에서 1 분동안, 44 ℃ 에서 1 분동안, 및 72 ℃ 에서 1 분동안 35 사이클, 그리고 72 ℃ 에서 7 분동안 1 사이클로 프로그램된, 스트라타진 로보사이클러 40 (Stratagene, La Jolla, CA)에서 인큐베이션하였다.

프라이머 550-39-1 과 550-39-2 를 사용한 증폭은 100bp 로 표시된 100 염기쌍의 생성물을 유도하였고, 프라이머 550-39-1 과 550-23-4 를 사용한 증폭은 191bp 로 표시된 191 염기쌍의 생성물을 유도하였다. 두가지 PCR 생성물을 TOPO/TA 클로닝 키트 (Invitrogen, Inc., LaJolla, CA)로부터의 벡터 pCR2.1/TOPO 에 제조자의 지시를 따라 개별적으로 클론하였다. 어플라이드 바이오시스템스 모델 377 서열화기 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용한 서열화 결과, 100 염기쌍의 생성물의 서열이 191 염기쌍의 생성물내에 함유되어 있었고, 이것은 아미노산 서열 AB0713 이 아미노산 서열 AB0781 의 위쪽으로 대략 30 아미노산을 덮고 있음을 나타낸다.

그런 다음 하기에서 설명될, 550-71-2 와 550-79-1 로 표시되는 비-축퇴성 프라이머의 새로운 세트를 사용하여 Genius System PCR DIG 프로브 합성 키트 (Boehringer-Mannheim Corporation, Indianapolis, IN)를 사용하여 제조자의 지시를 따라, 95 ℃ 에서 2 분동안 1 사이클, 각각 95 ℃ 에서 1 분동안, 56 ℃ 에서 1 분동안, 및 72 ℃ 에서 1 분동안 25 사이클, 그리고 72 ℃ 에서 7 분동안 1 사이클로 프로그램된, 스트라타진 로보사이클러 40 (Stratagene, La Jolla, CA)에서 191bp 의 DIG-표지된 프로브를 PCR-증폭시켰다.

550-71-2: 5'-cttttcgtccttgtccagc-3' (SEQ ID NO: 6)

550-79-1: 5'-gcgtcatatgcgtctcc-3' (SEQ ID NO: 7)

실시예 10: 염색체 라이브러리의 스크리닝

실시예 9 에서 설명된 프로브 191bp 를 사용하여 스핑고모나스 캡슐라타 B46 의 염색체 라이브러리를 스크린하였다. 라이브러리는 Sau 3A 부분적으로 소화된 (5 내지 7 kb) 스핑고모나스 캡슐라타 B46 염색체 DNA 를 벡터 pSJ1678 의 Bam HI 부위에 결찰시킴으로써 구성하였다 (도 8). 대장균 XL1 블루 MR (Statagene, Inc., La Jolla, CA)을 염색체 라이브러리로 형질전환하고, 제니우스 DIG 비방사성 핵산 표지화 및 검출 시스템 (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN)을 사용하여 제조자의 지시를 따라 제조된 DIG-표지된 191bp 프로브를 사용하여 콜로니 리프트에 의하여 스크리닝하였다. 대략 5000 개의 콜로니를 스크리닝한 후, 5 개의 콜로니가 프로브에 혼성화하였고, 그 결과의 플라스미드를 pMRT004.1-7, pMRT004.1-14, pMRT004.1-15, pMRT004.1-16 및 pMRT004.1-17 로 표시하였다. 모든 양성 클론으로부터의 플라스미드 DNA 를 키아겐 미니프렙 플라스미드 키트 (Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 제조하였다. 1 % 의 아가로스 셀상에서의 제한 엔도뉴클레아제 Pst I 을 사용한 플라스미드 DNA 의 제한 분석 결과, 플라스미드 pMRT004.1-7 이 대략 6 kb 의 삽입물을 함유하였고, 플라스미드 pMRT004.1-14 가 대략 5.6 kb 의 삽입물을 함유하였으며, 플라스미드 pMRT004.1-15 가 대략 8.5 kb 의 삽입물을 함유하였고, 플라스미드 pMRT004.1-16 이 대략 8.6 kb 의 삽입물을 함유하였으며, 플라스미드 pMRT004.1-17 이 대략 7.2 kb 의 삽입물을 함유한 것으로 나타났다. 이 겔을 제니우스 DIG 비방사성 핵산 표지화 및 검출 시스템을 사용하여 제조자의 지시를 따라, DIG-표지된 191bp 프로브를 사용하여 서던 혼성화에 의하여 추가로 분석하였다. 그 결과, DIG-표지된 191bp 프로브가 pMRT004.1-7, pMRT004.1-14, pMRT004.1-16 및 pMRT004.1-17 에서는 대략 3500 bp 의 단편들에 혼성화하한 한편으로, pMRT004.1-15 에서는 대략 1600 bp 의 단편에 혼성화한 것으로 나타났다.

pMRT004.1-7 과 pMRT004.1-14 로부터의 플라스미드 DNA 를 QIAGEN Maxiprep 플라스미드 키트 (Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 제조한 후, 서열화를 수행하였다. DNA 서열화는 염료-터미네이터 화학을 사용하여 어플라이드 바이오시스템스 모델 377 XL 자동 DNA 서열화기를 사용하여 수행하였다. 연속적인 서열을 트랜스포존 삽입 스트래티지 (Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 사용하여 제조자의 지시를 따라 제조하였다. 그 결과 단백질의 N-말단을 향해 있는 아미노펩티다제 I 유전자의 대략 3 분의 1 이 이 클론으로부터 빠져 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 아미노펩티다제 I 유전자의 나머지를 Ava I, Sph I 및 Eco RI을 사용한 제한 분석을 토대로 완전한 아미노펩티다제 I 을 함유하는 것으로 나타난 클론 pMRT004.1-14 를 서열화함으로써 얻었다.

실시예 11: PCR 을 경유한 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 유전자의 단리

PCR 을 사용하여 실시예10에서 설명된 클론 pMRT004.1-14 로부터의 Nru I/Bgl II 단편으로서 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 유전자를 단리하였다. 증폭은 하기에서 설명되는 바와 같은 프라이머 591-35-1 및 591-36-1 을 사용하여 수행하였다. 증폭 반응은 50 pmol 의 프라이머 591-35-1 과 591-36-1, 주형으로서의 10 ng 의 pMRT004.1-14 플라스미드 DNA, 1× PCR 완충액 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 200 μM 의 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1 ㎕ 의 DMSO 및 0.5 U 의 AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer, Foster City, CA)를 사용하여 총 부피 50 ㎕ 부피로 만들었다. 반응물을 95 ℃ 에서 10 분동안 1 사이클, 각각 95 ℃ 에서 1.5 분동안, 55 ℃ 에서 1.5 분동안, 및 72 ℃ 에서 3 분동안 30 사이클, 그리고 72 ℃ 에서 7 분동안 1 사이클로 프로그램된, 스트라타진 로보사이클러 40 (Stratagene, La Jolla, CA)에서 인큐베이션하였다.

591-35-1: 5'-cgaatcggccagatctccatcg-3' (SEQ ID NO: 8)

591-36-1: 5'-gatcctggcgcagctcgcgaaggcgcagg-3' ( SEQ ID NO: 9)

증폭 결과 2100 bp 의 PCR 생성물이 생성되었다. 2100 bp 의 생성물을 인비트로겐 TOPO/TA 클로닝 키트로부터의 pCR2.1/TOPO 에 제조자의 지시를 따라 클론하였고, 전술한 바와 같이 서열화하였다. 이 새로운 클론을 pMRT010-4 로 표시하였다. pMRT010-4 로부터 추론된 아미노산 서열과 pMRT004.1-14 로부터의 아미노펩티다제 I 의 공지의 아미노산 서열과의 비교 결과는 그것들이 동일함을 나타냈다. 그러나, DNA 수준에서, pMRT010-4 는 아미노산 위치 170 에 사일런트 점 돌연변이를 함유하였으며, 그로써 글리신을 코드화하는 코돈 ggt 가 또한 글리신을 코드화하는 ggc 로 변화되었다.

아미노펩티다제 I 클론은 673 아미노산의 폴리펩티드를 코드화하는 2019 bp 의 오픈 리딩 프레임을 코드화하였다. 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 1) 및 추론된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2)은 도 9 에 도시된다. max. C, max. Y, max. S, 및 각각 0.42, 0.34, 0.95 및 0.55 의 평균 S 를 포함하는 SignalP 프로그램 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1-6)을 사용하여, 32 잔기의 신호 펩티드를 예상하였고, 따라서, 이것은 분비된 아미노펩티다제 I 에 대한 대략 70,600 달톤의 분자량을 나타낸다. 그러므로, 성숙한 아미노펩티다제 I 은 641 아미노산으로 구성된다.

아미노펩티다제 서열의 비교용 배열을 다음의 변수를 가지는 BLAST 2.0 단백질 데이터베이스 연구 프로그램 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402)을 사용하여 실시하였다: blastall -p blastp -a 4 -e 10 -E 0 -v 500 -b 250 -I[의문 파일] -d prot_all, 식에서 -p 는 프로그램 이름이며, -a 는 사용하기 위한 프로세서의 번호를 나타내고, -e 는 기대값을 나타내며, -E 는 갭을 연장하기 위한 비용을 나타내고, -v 는 원-라인 디스크립션의 번호를 나타내며, -b 는 나타내기 위한 배열의 수를 나타내고, -I 는 의문 파일을 나타내며, -d 는 연구를 위해 사용된 데이터베이스를 나타낸다.

BLAST 연구는 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 이 시네코시스티스 종 (Synechocystis sp.)으로부터의 가상적인 67 kDa 의 단백질과 23 % 의 동일성을 보이는 영역을 공유함을 나타냈다 (승인 번호 Q55449).

실시예 12: 바실루스 발현 벡터 pPL2419CAsub2-P _ter /498 안으로의 스핑고모나스 캡슐라타 아미노펩티다제 I 유전자의 클로닝

바실루스 서브틸리스에서 아미노펩티다제 I 을 발현하고 분비하기 위한 스트래티지는, 강한 프로모터와 그람 포지티브 신호 서열 뒤에 있는 단백질의 성숙한 영역을 코드화하는 아미노펩티다제 유전자의 영역을 바실루스 통합 벡터에 프레임내로 클론하기 위한 것이다. 발현과 분비를 위하여 플라스미드 pCAsub2-P_ter/498 을 선택하였는데, 왜냐하면 그것이 강한 프로모터, P_ter 와, 바실루스 프로테아제 PD498 (미국 특허 제 5,621,089 호)로부터의 그람 포지티브 신호 서열을 코드화하기 때문이다. 이 플라스미드는 플라스미드 p498-5 (미국 특허 제 5,621,089 호)를 Sph I 으로 소화시키고, P_ter/498 발현 카세트를 함유하고 있는 2500 bp 단편을 pCI20R (Marsh et al., 1984, Gene 32: 481-485)의 Sph I 부위에 클론하여 pCI20R-P_ter/498 을 생성함으로써 앞서 제조하였다. 그런 다음 pCI20R-P_ter/498 을 Hind III 와 BamHI 으로 소화시키고, P_ter/498 발현 카세트를 함유하고 있는 2500 bp 단편을 pSJ2882 (WO 98/22598)의 HindIII/BamHI 부위에 클론함으로써 pSJ2882-P_ter/498 을 제조하였다. pSJ2882-P_ter/498 을 HindIII 로 소화시키고, 클레노우 단편으로 처리하여 블런트 단부를 생성한 다음, BamHI 으로 소화하였다. 그런 다음 P_ter/498 발현 카세트를 함유하고 있는 2500 bp 단편을 통합 벡터 pCAsub2 (WO 98/22598)의 NotI (클레노우 단편으로 충전함)/BamHI 부위에 클론하여 pCAsub2-P_ter/498 을 제조하였다.

아미노펩티다제 I 유전자를 함유하는 최종 통합 벡터를 제조하기 위하여, pCAsub2-P_ter/498 로부터의 플라스미드 DNA 를 MscI 및 BglII 로 소화하고, pMRT010-4 로부터의 플라스미드 DNA를 NruI 과 BglII 로 소화시켰다. pCAsub2-P_ter/498 로부터의 8000 bp 의 MscI/BglII 단편과 pMRT010-4 로부터의 2100 bp 의 NruI/BglII 단편을 1 % 아가로스 겔 상에서 단리하고, QIAGEN 아가로스 DNA 겔 추출 키트 II (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)를 사용하여 제조자의 지시를 따라 추출하였다. 이들 두 개의 단편의 결찰을 래피드 DNA 결찰 키트 (Boehringer-Mannheim Corp., Indianapolis, IN)를 사용하여 수행하여 통합 벡터 pMRT014-1 (도 10)을 제조하였고, 이것을 직접 바실루스 서브틸리스 PL1801 spoIIE 세포로 페티트 등의 방법 (Petit et al., 1990, 상기 동일)을 따라 형질전환하였다. 형질전환체들을 클로르암페니콜 내성에 대하여 선택하였다. 바실루스 서브틸리스 PL1801 spoIIE 는 유전자 apr 과 npr 이 결실되어 있고 Tn917 이 spoIIE 에 삽입되어 있는 바실루스 서브틸리스 168 이다 (Bacillus Stock Center, Columbus, OH). 형질전환체들을 클로르암페니콜을 5 ㎍/ml 로 함유하고 있는 트립톤 혈액 아가 염기 (TBAB) 플레이트위에 플레이팅하고, 37 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 바실루스 서브틸리스 1801Ⅱe::pMRT014-1 로 표시된 형질전환체로부터 게놈 DNA 를 Qiagen Genomic Handbook (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)에 설명되어 있는 박테리아 단리 프로토콜을 사용하여 단리하였다. 바실루스 서브틸리스 1801IIe::pMRT014-1 로부터의 게놈 DNA 를 바실루스 서브틸리스 164△5 (WO 98/22598)에 상술된 바와 같이 형질전환하였다. 바실루스 서브틸리스 A164△5::pMRT014-1 로 표시된 형질전환체를 30 ㎍/ml 의 클로르암페니콜을 함유하고 있는 TBAT 아가 플레이트상에서 세 번 증폭시켰다.

실시예 13: 바실루스 서브틸리스에서의 스핑소모나스 캡슐라타 B46 아미노펩티다제 I 유전자의 발현

바실루스 서브틸리스 A164△5::pMRT014-1 을 10 % 의 슈크로스, 4 % 의 소이빈 가루, 0.42 % 의 무수 인산 2나트륨, 0.01 % 의 플루론산, 및 0.5 % 의 탄산 칼슘으로 구성된 PS-1 배지 50 ml을 함유하고 있는 진동 플라스크중에서, 2 개 한 벌로 37 ℃ 에서 및 250 rpm 에서 4 일동안 배양하였다. 또한, 통합 벡터를 함유하고 있는 바실루스 서브틸리스 A164△5::pCAsub2 를 네가티브 대조표준으로서 사용하였다.

각 플라스크로부터 샘플 1 ml 씩을 24, 48 및 72 시간째에 취하였다. 아미노펩티다제 I 통합의 생육성 및 안정성을 루리아-베르타니 (LB) 플레이트상에 플레이팅하고, 계속해서 30 ㎍/ml 의 클로르암페니콜을 함유하고 있는 TBAB 위에 반점을 냄으로써 확인하였다. 각각의 경우에, 통합은 TBAB 플레이트위에 패취된 콜로니의 하룻밤동안의 성장에 의해 나타난 바와 같이 100 % 안정하였다.

Novex 8-16 % 트리스-글리신 프리캐스트 겔스-1.0 mm × 12 웰과 Novex DryEase 미니 겔 건조 시스템 (Novel Experimental Technology, San Diego, CA)을 사용하는 SDS-PAGE 분석을, 발현 수준을 측정하기 위하여 제조자의 지시를 따라 각 플라스크로부터 취한 12 ㎕ 의 상층액에 대하여 수행하였다. 시험된 스트레인에 대한 발현 수준을 또한 L-Ala-pNA 를 기질로서 사용하는 아미노펩티다제 플레이트 검정을 통하여 분광학적으로 측정하였다. SDS-PAGE 겔 데이터는 그 아미노펩티다제 I 의 발현이 바실루스 서브틸리스 A164△5::pMRT014-1 에 대하여 관찰되었으며, 48 시간째에 가장 높은 발현이 관찰되었음을 나타내는 분광학적 데이터를 확증하였다.

생물학적 물질의 기탁

다음의 생물학적 물질을 부다페스트 조약의 견지에서, 미합중국 일리노이주 61604 페오리아시 유니버시티 스트리트 1815 에 소재하는 어그리컬춰럴 리서취 서비스 페턴트 컬춰 콜렉션, 노던 리져널 리서취 센터에 기탁하였고, 다음의 승인 번호를 받았다:

기탁 승인 번호 기탁일

대장균 XL1 블루 MR pMRT004.1-14 NRRL B-30032 1998 년 6 월 10 일

본원에서 설명되고 청구되는 발명은 본원에 개시된 특정 구체예에 의하여 제한받지 않는데, 왜냐하면 이들 구체예는 발명의 여러 측면을 예시하는 것으로 의도되었기 때문이다. 어떠한 동등한 구체예도 본 발명의 범주내에 포함된다. 실제로, 본원에 제시되고 설명된 것들 외에 발명의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범주내에 포함되는 것으로 의도된다. 대립되는 경우에는 본 발명의 정의를 포함한 개시 내용이 조절할 것이다.

기탁된 미생물에 대한 언급

(PCT 제13 bis 규칙)

A. 상세한 설명 페이지 _행의 미생물과 관련한 선택용지
B. 기탁의 확인 다른 기탁이 추가용지상에서 확인됨 □
기탁기관의 명칭 : 노던 리저날 리서치 센터
기탁기관주소 (우편번호와 국가명 포함) : 미합중국 일리노이 61604 페오리아 유니버시티 스트리트 1815
기탁일 : 1998년 6월 10일	수탁번호 : NRRL B-30032
C. 추가지시 (적용되지 않을 경우 공란). 별도의 첨부용지상에 본 정보가 계속됨 □
유럽 및/또는 오스트레일리아 특허가 청구되는 지정국에서는 특허출원의 계류중 기탁된 미생물 시료 분양이 시료를 요구하는 사람에 의해서 지정된 전문가에게만 가능하다(EPC 규칙 28(4)/오스트레일리아 1991년 제정규칙 No.71의 규정 3.25)
D. 지시가 적용될 지정국가 (모든 지정국가에 대한 지시가 아닐 경우)
E. 지시의 별도 제공 (적용되지 않을 경우 공란)
이하에 기술된 지시가 이후에 국제사무국에 제출될 것임 (예를들면, 기탁의 수탁번호와 같이 지시의 일반적 특성을 특정할 것)
□ 본 용지는 국제출원이 출원된 때 국제출원과 함께 접수함 (수리관청이 점검함) -------------- (담당자) □ 국제사무국에 의한 접수일 (출원인으로부터) -------------- (담당자)

<110> Alexander Blinkovsky Tony Byun Alan V. Klotz Alan Sloma Maria Tang Mikio Fujii Chigusa Marumoto Lene Venke Kofod <120> Polypeptides Having Aminopeptidase Activity And Nucleic Acids Encoding Same <130> 5379.204-KR <140> To Be Assigned <141> 2000-06-15 <150> 60/069719 <151> 1997-12-16 <150> 1465/97 <151> 1997-12-16 <150> PA 1998 00670 <151> 1998-05-15 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3000 <212> DNA <213> Sphingomonas <400> 1 atcggccatg accagcagtt ccacgtcggc ctgcggttcg gccgcgccga tcacttcggc 60 atcgatctgg tgaaactggc gatagcggcc cttttgcggg cgctcatagc ggaacagggc 120 cccgtgcgtc gcgatcttga gcggggcgtg ctgctgccag ccattggtga gataggcgcg 180 ggcgaggccg gcggtgaatt cgggccgcag cgtcagcgat tcgccgccgc gatcctcgaa 240 cgaatacatt tccttcgata ccacgtcggt ggtttcgccc agcgagcgcg agaacaccgt 300 ggtcttttcg aagaccggca tttccacccg gcgaaagcga tagagcttgc gcacgcgctc 360 gaacgtttcc acgacatggc caaaggcctc ggcctcaagc ccgaaaatgt cctgggtgcc 420 acgaatagcc ttgggtgtcg gaatggtttg cttgctcatg gcgcgcgcgg atagcggctt 480 tcgcgcggtg ggggaagcat ccgtggcgat ccgccgcgta ttgtgcccat ctggccgttg 540 cagatgagac cgcttggcgg catgaaaggc gccatgcgca aaacccccca aggcattggc 600 ctgctttccg ccctttccac gtccaccttg gcacttgcca ccctgatcct ggcgcagccc 660 gcgctggcgc aggtgcagcc ggcgagcaac agccgcccga tggcagtgcc gatcgctcat 720 ggggtgcccg atgcgcagga cgtgccctat cccggcacga tcgggctgca gatcgatgcc 780 accgatctgg ccaccggggc gttccgggtg gtggaaaccg tgccggtggc ggccgatgcc 840 aaggaactga tcctgcaact gccggcctgg ctgccgggtg agcatggcaa tcgcggcccc 900 gtggccgagc tggccggcat cacgtttgaa gccaagggcc agaagctggc ctggacccgc 960 gacccggtgg aagtgaacgc gttccacatc cccctgcccg ccggcaccag cgaagtggtg 1020 gcccgcttca tccacacctc gccgctgcgc gacagcgaag gccgcatcac cgttacgcgc 1080 gaaatgctca acgtgcagtg ggagaagatg agcctctatc ccgccggtca ctatgtgcgg 1140 cagatcaagg tgcgtcccac cgtcagcttc ccgcagggct ggaccgtgtt caccgcgctg 1200 gatggcaaga cgcagagcgg cgcgggcaat accgtgacct gggccgaaac cgactatgaa 1260 accctggtcg attcgccgat ctttgccggg ctctatgccg cgcggcatga tctgggccac 1320 aacgtctatt tcgatctggt ggccgacaag cccgagctgc tggcgatcaa gccggaaaac 1380 ctggccgcct atcgcaacct ggccgacgaa gccgtgggcg cattcggcgc gcgccatttc 1440 gatcactacg atttcctgct cgcgctgacc gatcgcatgg gcagcatcgg cctggaacac 1500 caccgttcca gcgaaaacca gcaggaaccc aagagcctga ccgactgggc cgcctatgac 1560 tgggaccgca acgtgatcgc ccacgaattc agccacagct gggatggcaa gtatcgccgc 1620 tcggccaagc tgtggacgcc cgactatcgc cagccgatgc aggacaacct gctgtgggtc 1680 tatgaagggc agacgcagtt ctggggcctg gtcctggccg cacgctcggg cgtgcagagc 1740 aaggacgtgg tcttgggcag cctcgccaac tatgccggca cgttcaccca gaccgccggg 1800 cgcgactggc gctcggtgga agacacgacg atggatccca tcttcgccgc ccgcaagccc 1860 aagccctatt cctcgcttac ccgtaacgag gactattaca ccgaaggcgc gctggtgtgg 1920 ctggaagcgg accagatcat ccgcgatggc accggcggca agaagggcct ggatgatttc 1980 gccaaggcgt tctttggcgt gcgcgacggc gattggggcg tgctgaccta tgaattcgat 2040 gacgtggtca agaccctcaa cggcgtctat ccctatgact gggccacgtt cctcaagacc 2100 cgcctgcaga cgccgggcca gccggtgccg ctcggcggga tcgagcgcgg cggctacaag 2160 ctggaattca aggacgagcc caacccctat gacaaggcgc gcatggccga tgccaaggtg 2220 ctcagcctgt tcaactcgct gggcgtgacg ctggacaagg acggcaaagt caccgcctcg 2280 cgctgggatg gcccggcgtt caaggcgggg ctggtttcgg gcatgcaggt gatggccgtg 2340 aacggcgacg cctatgacgc ggacaagctc aagggcgcga tcaccaatgc caagaccggc 2400 aaccccggcg ccggccgccc gatcgaactg ctggtcaagc gtgacgatcg ctttgtcacg 2460 ctgccgatca cctatgccga tggcctgcgc tggccgtggc tggtgcgcac ggcgccgggc 2520 acggcaccga ccgggctgga caagctgctg gccccgcacg ccagcaagct gcccgtgggc 2580 aaggctgcca agtgatgtca ggggccgggc caagcctgca tctgggccgc ctggccccac 2640 cccgcttcat cctgttcctg gtgctgctga tgggcggcac cggggcgtgg tgggtgtggc 2700 atcccctcac ccgcaacagt ggcgaactgg ccgattcgct ggccatgggc tttgattttg 2760 cggcgctggc attcctgttg tcgctggtgc cactgctgcg ctgtgccgat gccgatacga 2820 tgcggcaaag cgcggtggac aacgatgcca accgcgtgct ggtgctgtgc atcaccaccg 2880 ttctgaccgc agtggtgatg gcatcgatcg ccggcgagct gccccgcgcg gcacatggcg 2940 attcgctggc aaagctccgg ctgatcggga cgctggtgct gacctggctt tttgccaaca 3000 <210> 2 <211> 673 <212> PRT <213> Sphingomonas <400> 2 Met Arg Lys Thr Pro Gln Gly Ile Gly Leu Leu Ser Ala Leu Ser Thr 1 5 10 15 Ser Thr Leu Ala Leu Ala Thr Leu Ile Leu Ala Gln Pro Ala Leu Ala 20 25 30 Gln Val Gln Pro Ala Ser Asn Ser Arg Pro Met Ala Val Pro Ile Ala 35 40 45 His Gly Val Pro Asp Ala Gln Asp Val Pro Tyr Pro Gly Thr Ile Gly 50 55 60 Leu Gln Ile Asp Ala Thr Asp Leu Ala Thr Gly Ala Phe Arg Val Val 65 70 75 80 Glu Thr Val Pro Val Ala Ala Asp Ala Lys Glu Leu Ile Leu Gln Leu 85 90 95 Pro Ala Trp Leu Pro Gly Glu His Gly Asn Arg Gly Pro Val Ala Glu 100 105 110 Leu Ala Gly Ile Thr Phe Glu Ala Lys Gly Gln Lys Leu Ala Trp Thr 115 120 125 Arg Asp Pro Val Glu Val Asn Ala Phe His Ile Pro Leu Pro Ala Gly 130 135 140 Thr Ser Glu Val Val Ala Arg Phe Ile His Thr Ser Pro Leu Arg Asp 145 150 155 160 Ser Glu Gly Arg Ile Thr Val Thr Arg Glu Met Leu Asn Val Gln Trp 165 170 175 Glu Lys Met Ser Leu Tyr Pro Ala Gly His Tyr Val Arg Gln Ile Lys 180 185 190 Val Arg Pro Thr Val Ser Phe Pro Gln Gly Trp Thr Val Phe Thr Ala 195 200 205 Leu Asp Gly Lys Thr Gln Ser Gly Ala Gly Asn Thr Val Thr Trp Ala 210 215 220 Glu Thr Asp Tyr Glu Thr Leu Val Asp Ser Pro Ile Phe Ala Gly Leu 225 230 235 240 Tyr Ala Ala Arg His Asp Leu Gly His Asn Val Tyr Phe Asp Leu Val 245 250 255 Ala Asp Lys Pro Glu Leu Leu Ala Ile Lys Pro Glu Asn Leu Ala Ala 260 265 270 Tyr Arg Asn Leu Ala Asp Glu Ala Val Gly Ala Phe Gly Ala Arg His 275 280 285 Phe Asp His Tyr Asp Phe Leu Leu Ala Leu Thr Asp Arg Met Gly Ser 290 295 300 Ile Gly Leu Glu His His Arg Ser Ser Glu Asn Gln Gln Glu Pro Lys 305 310 315 320 Ser Leu Thr Asp Trp Ala Ala Tyr Asp Trp Asp Arg Asn Val Ile Ala 325 330 335 His Glu Phe Ser His Ser Trp Asp Gly Lys Tyr Arg Arg Ser Ala Lys 340 345 350 Leu Trp Thr Pro Asp Tyr Arg Gln Pro Met Gln Asp Asn Leu Leu Trp 355 360 365 Val Tyr Glu Gly Gln Thr Gln Phe Trp Gly Leu Val Leu Ala Ala Arg 370 375 380 Ser Gly Val Gln Ser Lys Asp Val Val Leu Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 385 390 395 400 Ala Gly Thr Phe Thr Gln Thr Ala Gly Arg Asp Trp Arg Ser Val Glu 405 410 415 Asp Thr Thr Met Asp Pro Ile Phe Ala Ala Arg Lys Pro Lys Pro Tyr 420 425 430 Ser Ser Leu Thr Arg Asn Glu Asp Tyr Tyr Thr Glu Gly Ala Leu Val 435 440 445 Trp Leu Glu Ala Asp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Thr Gly Gly Lys Lys 450 455 460 Gly Leu Asp Asp Phe Ala Lys Ala Phe Phe Gly Val Arg Asp Gly Asp 465 470 475 480 Trp Gly Val Leu Thr Tyr Glu Phe Asp Asp Val Val Lys Thr Leu Asn 485 490 495 Gly Val Tyr Pro Tyr Asp Trp Ala Thr Phe Leu Lys Thr Arg Leu Gln 500 505 510 Thr Pro Gly Gln Pro Val Pro Leu Gly Gly Ile Glu Arg Gly Gly Tyr 515 520 525 Lys Leu Glu Phe Lys Asp Glu Pro Asn Pro Tyr Asp Lys Ala Arg Met 530 535 540 Ala Asp Ala Lys Val Leu Ser Leu Phe Asn Ser Leu Gly Val Thr Leu 545 550 555 560 Asp Lys Asp Gly Lys Val Thr Ala Ser Arg Trp Asp Gly Pro Ala Phe 565 570 575 Lys Ala Gly Leu Val Ser Gly Met Gln Val Met Ala Val Asn Gly Asp 580 585 590 Ala Tyr Asp Ala Asp Lys Leu Lys Gly Ala Ile Thr Asn Ala Lys Thr 595 600 605 Gly Asn Pro Gly Ala Gly Arg Pro Ile Glu Leu Leu Val Lys Arg Asp 610 615 620 Asp Arg Phe Val Thr Leu Pro Ile Thr Tyr Ala Asp Gly Leu Arg Trp 625 630 635 640 Pro Trp Leu Val Arg Thr Ala Pro Gly Thr Ala Pro Thr Gly Leu Asp 645 650 655 Lys Leu Leu Ala Pro His Ala Ser Lys Leu Pro Val Gly Lys Ala Ala 660 665 670 Lys <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Sphingomonas <220> <221> misc_feature <222> (1)...(17) <223> n = A,T,C or G <400> 3 gcrtcrtang crtcncc 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Sphingomonas <220> <221> misc_feature <222> (1)...(17) <223> n = A,T,C or G <400> 4 aargaygarc cnaaycc 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Sphingomonas <400> 5 acyttytcrt cyttrtc 17 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Sphingomonas <400> 6 cttttcgtcc ttgtccagc 19 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Sphingomonas <400> 7 gcgtcatatg cgtctcc 17 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Sphingomonas <400> 8 cgaatcggcc agatctccat cg 22 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Sphingomonas <400> 9 gatcctggcg cagctcgcga aggcgcagg 29

Claims (34)

1. SEQ ID NO:2의 아미노산 33 내지 673으로 구성된, 아미노펩티다제 활성을 갖는 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:1의 누클레오티드 670 내지 2592 및 그것의 상보적 가닥을 갖는 핵산에 의해 코드화되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 스핑고모나스 (Sphingomonas) 균주로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제 3 항에 있어서, 스핑고모나스 캡슐라타 (Sphingomonas capsulata) 균주로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제 1 항에 있어서, 에스케리키아 콜리 (E. coli) NRRL B-30032 에 함유된 플라스미드 pMRT004.1-14에 함유된 핵산 서열에 의해 코드화되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
6. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 갖는 단리된 핵산 서열.
7. 제 6 항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
8. 제 6 항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 박테리아 숙주 세포.
9. (a) 야생형 형태가 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 박테리아 균주를 배양하는 단계; 및

   (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항, 제 2 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 제조방법.
10. (a) 제 1 항, 제 2 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

    (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항, 제 2 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 제조방법.
11. (a) 박테리아 숙주세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열인 SEQ ID NO:1에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, SEQ ID NO:1의 돌연변이 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이 핵산서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 33 내지 673으로 구성되는 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

    (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 제조방법.
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