KR100504130B1

KR100504130B1 - Ｉｃａｍ－１ 결합 단백질 및 이를 코딩하는폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는벡터 및 숙주세포, 상기 단백질을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR100504130B1
Application number: KR10-2003-0013610A
Authority: KR
Inventors: 한장희; 이왕재
Original assignee: 한장희; 이왕재
Priority date: 2003-03-05
Filing date: 2003-03-05
Publication date: 2005-07-27
Also published as: KR20040078763A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 결합 단백질을 제공한다. 본 발명의 ICAM-1 결합 단백질은 ICAM-1에 특이적으로 높은 친화성으로 결합하면서도 분자의 크기가 작아 대장균에서도 효과적으로 발현시킬 수 있다.

Description

ＩＣＡＭ－１ 결합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주세포, 상기 단백질을 포함하는 조성물{A protein against ICAM-1 and a polynucleotide encoding the same, a vector and a host cell containing the polynucleotide and a composition comprising the protein}

본 발명은 ICAM-1 결합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주세포, 상기 ICAM-1 결합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)은 세포간 접착에 관여하는 단백질로서 염증 세포를 세정맥(venule)의 내피세포에 강하게 접착시키는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, ICAM-1은 염증관련 질병, 예를 들면, 내이 염증, 류마토이드 관절염 및 조직이식 관련 증상에 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이를 이용한 치료법을 개발하고자 하는 연구도 진행되어 왔다.

한편, 항체의 가변영역 단편(Fv)은 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)의 두가지 체인 형태의 헤테로다이머로서 항원 결합에 필수적인 항체의 최소 구성요소이다. 그러나, Fv 자체는 낮은 농도에서도 생리적 조건에서 해리되어 원하는 효과를 얻을 수 없는 문제점이 있어, 이를 개선하기 위하여 VH와 VL 사이를 적절한 링커 펩티드를 매개로 연결함으로써 단일쇄 폴리펩티드 형태의 단일쇄 단편(single chain Fv, scFv)이 개발된 바 있다.

이러한 scFv는 항체 자체보다 크기가 작기 때문에 치료제로 이용시 목표장기로의 접근성이 높고, 인체내에서 항체가 생길 가능성이 적을 뿐 아니라, 혈액으로부터 보다 빨리 제거되고 조직에 빨리 침투하여 고른 분포를 나타내는 장점이 있다. 또한, scFv는 적절한 벡터 및 숙주세포를 사용함으로써 대량생산이 가능하다.

따라서, ICAM-1에 효과적으로 결합하여 그의 작용을 저해함으로써 염증관련 질병을 치료할 수 있는 scFv ("ICAM-1 결합 단백질" 또는 "ICAM-1 결합 scFv")의 개발이 요구되고 있다. 이와 관련된 선행기술로는 미국특허 제5,747,035호가 개시된 바 있으며, 상기 선행기술은 림프구 상의 LFA-1과 관련되는 세포 접착 작용에 의하여 야기되는 질병을 치료하는 방법을 개시하고 있다. 구체적으로는 LFA-1과 ICAM-1의 상호작용을 저해할 수 있는 항-ICAM-1 항체, 용해성 ICAM-1 및 그들의 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 LFA-1 길항제(antagonist)의 폴리펩티드 변이체를 약제학적으로 효과적인 양으로 치료가 요구되는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다. 여기서, 상기 폴리펩티드는 신장으로부터 제거되고 IgG의 Fc 영역을 포함하지 않고, 상기 변이체는 특정한 아미노산 서열을 갖는 IgG의 Fc 영역의 샐비지 수용체 결합 에피토프를 포함하는 것이다. 그러나, 항-ICAM-1 단일쇄 단편(scFv)에 관하여는 구체적으로 언급되어 있지 않으며, 다른 에피토프와 조합하여 사용하여야 하는 것으로 개시되어 있다.

이에 본 발명자들은 우수한 ICAM-1 저해활성을 갖는 scFv를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 ICAM-1에 효과적으로 결합하여 그의 작용을 저해할 수 있는 ICAM-1 결합 단백질(또는 "ICAM-1 결합 scFv")을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 ICAM-1 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 벡터와 숙주세포를 제공하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 ICAM-1 결합 단백질을 유효성분으로 포함하는 염증치료용 조성물을 제공하는 것을 포함한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 ICAM-1 결합 단백질, 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 ICAM-1 결합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 ICAM-1 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이러한 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 ICAM-1 결합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 ICAM-1 결합 단백질을 제공한다.

본 발명자들은 항원으로서 ICAM-1을 마우스에 면역시키고, 이들로부터 분리한 비장세포를 혈구암세포와 접합(fusion)시켜 다수의 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line)를 제조한 후, 이중 ICAM-1이 코팅된 플레이트를 사용하여 ELISA 분석을 수행한 다음, ICAM-1에 친화성(affinity)이 높은 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주들을 선발하였다.

본 발명자들은 상기 하이브리도마 세포주들로부터 mRNA 를 분리하고, 이로부터 중쇄 및 경쇄 가변영역의 cDNA 단편들을 합성한 후, 상기 중쇄 및 경쇄의 cDNA 단편을 적절한 링커를 통하여 연결하여 ICAM-1 결합 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 제조하였다.

상기 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 파지 벡터를 제조하고, 파지 디스플레이법(Phage display method, Bird, R.E., 등 (1988) Science 242, 423-426)을 이용하여 ICAM-1에 특이적으로 강한 친화성을 가지고 결합하는 scFv를 선발하였다. 상기 선발된 scFv의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 확인한 결과 각각 서열번호 1 및 서열번호 2 였다.

따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 ICAM-1 결합 단백질[즉, 항-ICAM-1 단일쇄 가변영역 단편(scFv)]을 포함한다.

본 발명에 따른 ICAM-1 결합 단백질은 서열번호 1의 중쇄 아미노산 서열과 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 연결하는 적절한 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 ICAM-1 결합 단백질은 중쇄 아미노산 서열(서열번호 1)-링커 폴리펩티드-경쇄 아미노서산 서열(서열번호 2)의 형태이거나 경쇄 아미노산 서열(서열번호 2)-링커 폴리펩티드-중쇄 아미노산 서열(서열번호 1)의 형태일 수 있으며, 서열번호 1- 링커 폴리펩티드-서열번호 2의 형태가 바람직하다.

상기 링커 폴리펩티드로는 scFv 분야에서 통상적으로 사용되는 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를들어, 링커 폴리펩티드는 VH의 C-말단과 VL의 N-말단, 또는 VL의 C-말단과 VH의 N-말단 사이를 약 3∼4 nm 의 범위를 걸치도록 디자인될 수 있으며, 유연성을 부여하기 위하여, G와 S가 번갈아 나타내는 모티프를 가지며, (G₄S)n 링커의 형태를 띨 수 있다. 본 발명의 ICAM-1 결합 단백질의 링커 폴리펩티드로 사용될 수 있는 서열의 예로는 서열번호 4 내지 8의 아미노산 서열 등을 열거할 수 있으며, 본 발명에 따른 ICAM-1 결합 단백질은 서열번호 4의 링커 폴리펩티드를 포함한 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 바람직하다.

본 발명은 또한 상기 ICAM-1 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이러한 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 형질전환된 숙주세포는 상기 벡터를 통상적인 형질전환 방법으로 적절한 숙주(예를들어, 대장균)를 형질전환시켜 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 치료학적으로 유효한 양의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 ICAM-1 결합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 액제, 정제 또는 캅셀제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 주사제의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 사용되는 ICAM-1 결합 단백질의 치료학적으로 유효한 양은 1일 0.01 mg ∼ 1000 mg의 범위일 수 있으며, 단위투여량 형태는 1 mg ∼ 1000 mg의 범위로 ICAM-1 결합 단백질을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체로는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 등 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 멸균 수용액 등의 액제 또는 주사제의 형태로 제제화할 수 있으며, 필요시 10∼40%의 프로필렌 글리콜, 및 용혈현상을 방지하는데 충분한 양(예 : 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 항-ICAM-1 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 확립

ICAM-1(R&D system 사, 미국)을 마우스에 면역시키고, 이들로부터 분리한 비장세포를 혈구암세포(SP₂O-Ag14, ATCC CRL-1581)와 접합(fusion)시켜 다수의 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line)를 제조한 후, 이중 ICAM-1이 코팅된 플레이트를 사용하여 ELISA 분석을 수행한 다음, ICAM-1에 친화성(affinity)이 높은 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주들을 선발하였다.

실시예2 : 항-ICAM-1 단일쇄 가변영역 단편(scFv)의 선발

실시예 1에서 얻어진 하이브리도마 세포주들로부터 mRNA를 분리하고, 이로부터 중쇄 및 경쇄 가변영역의 cDNA단편들을 합성한 후, 상기 중쇄 및 경쇄의 cDNA 단편을 링커를 통하여 연결하여 ICAM-1에 결합하는 단일쇄 가변영역 단편(scFv)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리 (phage display library)를 제조하였다.

1. 제1-가닥 cDNA 합성 및 PCR 증폭

실시예 1에서 얻어진 하이브리도마 세포주로부터, RNasy Total RNA kit (Quiagen Inc., 미국)와 mRNA purification system(Promega 사, 미국)을 이용하여 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA 1㎍에 10㎕ 5× 역전사 버퍼, 2㎕ 6.25mM dNTPs mix, 15U RNase inhibitor, 1㎕ cDNA 합성 프라이머 (25 pmol) (서열번호 10)를 첨가하고 DEPC-H₂O로 50㎕를 채운 다음, 70℃에서 10분간 반응시킨 후 37℃까지 냉각시켜서 100 U M-MLV 역전사 효소(reverse transcriptase)를 첨가한 다음 1시간 동안 반응시켰다.

얻어진 cDNA 반응액 중, 5㎕를 취해서 2㎕ dNTPs, 5㎕ 10×Taq polymerase buffer, 2㎕ 프라이머 (생쥐 VH, Vκ 프라이머)(Pharmacia 사, Mouse scFv Module Heavy Primer 1 and 2, 카탈로그 번호 27-1586-01), 5U PWO polymerase (Boerhinger Manheim, 독일)를 첨가하고 dH₂O로 50㎕로 채워서 PCR 반응액을 준비하였다. 다음으로, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 60초의 조건으로 25회 반응시킨 다음, 72℃에서 5분 동안 연장 반응을 실시하여 PCR을 수행하였다. 상기 프라이머로는 생쥐 VH 증폭을 위하여, 생쥐 VH 증폭용 전위(forward) 및 후위(reverse) 프라이머를 사용하였고, 생쥐 VL 증폭을 위하여 생쥐 VL 증폭용 전위(forward) 및 후위(reverse) 프라이머(Pharmacia 사, Mouse scFv Module Light Primer Mix, 카탈로그 번호 27-1583-01)를 사용하였다. 상기 PCR 결과 VH 및 VL DNA를 증폭하였다.

2. scFv 유전자의 조합 및 E.coli 파지미드 발현 벡터에로의 도입

증폭된 VH와 VL 를 아가로즈 겔 전기영동을 실시하여 순수 분리하고, 각각 1 ㎍의 VH, VL 및 링커-프라이머 믹스(Pharmacia 사, 카탈로그 번호 27-1588-01) DNA를 25 ㎕ PCR 반응액에 첨가하고, 7 회 반응(94℃에서 1분, 63℃에서 4분)시켜 VH-링커 DNA와 링커 DNA-VL DNA를 중합시켰다. 다음으로, EcoRI 부위가 들어가 있는 중쇄의 전위 프라이머(서열번호 11)와 XbaI 부위가 첨부된 경쇄의 후위 프라이머(서열번호 12)를 첨가한 후 20회 더 PCR (94℃에서 60초, 55℃에서 120초, 72℃에서 120초)을 수행하여 scFv 유전자를 제조하였다.

제조된 scFv를 아가로즈겔에서 전기영동한 다음 분리 및 정제하여 파지미드 벡터(phagemid vector)인 pCANTAB 5E (Pharmacia 사, 카탈로그 번호 27-9901-01)의 SfiI 및 NotI 부위에 서브클로닝하였다. 상기 벡터는 용해성 항체의 C 말단에 E 태그(E tag)가 삽입되어 있어 항-E 태그 항체 (Pharmacia 사, 카탈로그 번호 27-9412-02)를 사용한 ELISA로 검출할 수 있다. 서브클로닝 여부는 상기 벡터로 E.coli TG1를 형질전환시키고 배양하여 얻어진 단일 콜로니로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고, 상응하는 프라어머를 사용한 PCR 증폭을 통하여 확인하였다. 그 결과, 조합되고, 재배열된 scFv를 포함하는 재조합 파지미드로 형질전환된 대장균 ("E.coli/scFv 파지미드")을 확인하였다.

E.coli/scFv 파지미드에 M13 헬퍼 파지를 감염시켜 파지를 구출(rescue)하였다. 이를 위해 먼저, 상기 E.coli/scFv 파지미드를 2×YT + 1% 포도당 + 0.1 mg/ml 앰피실린을 함유하는 배지를 이용하여 37℃에서 배양하다가 대수기에서 5×10⁸ pfu/ml의 M13K07 헬퍼 파지를 접종하였다. 상기 헬퍼 파지로 감염된 트랜스펙탄트(transfectant)는 50㎍/ml의 카나마이신이 첨가되고, 포도당이 빠진 2×YT + 앰피실린 + 카나마이신 배지에서 37℃에서, 16시간 동안 배양하였다. 그 결과 얻어진 배양물을 원심분리하여 세포를 가라 앉혀 파지 항체(phage antibody) 용액을 얻고, 이를 4℃에서 보존하거나 패닝(panning)을 실시하였다. 상기 파지 구출(rescue) 과정에 사용된 배지 및 헬퍼 파지 등은 scFv-파지 키트(scFv phage kit)(Pharmacia 사)를 사용하였다.

3. 패닝을 통한 항-ICAM-1 scFv의 선발

상기 파지 항체 용액 10 ml에 PEG/NaCl 2ml를 넣고, 잘 섞은 후 얼음에서 1시간 동안 방치한 후 12,000rpm으로 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 침전물을 16 ml의 2xYT 배지로 녹인 후 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 파지 항체 여과액을 얻었다. 패닝을 위하여 ICAM-1 항원을 다량 발현하는 IM-9 세포의 추출물 1mg/ml에 정사각형의 니트로셀룰로즈 종이(가로 세로 각각 1cm)를 넣어 1시간 동안 둔 후 실온에서 말렸다. 상기 니트로셀룰로즈 종이를 PBS로 3번 세척하고 10% 탈지분유로 블록킹하였다. 상기 파지 항체 여과액 16 ml를 블록킹 버퍼 14 ml로 희석한 다음, 20 ml의 파지 항체 희석액에 상기 니트로셀룰로즈 종이를 넣고 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 다음으로 30ml의 PBS로 20번 세척한 후 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS로 20번 더 세척하였다. 세척된 상기 니트로셀룰로즈 종이로 E.coli TG1세포를 재감염 시킨 후, O.D.₆₀₀ 값이 0.5가 될 때까지 생육시켰다. 다음으로 특이적 파지-디프플레이 scFv가 선발될 때까지 차회의 선발을 위하여 상기한 파지구출(phage rescue) 과정을 반복하였다.

그 결과, 5가지의 후보 클론을 선발하였으며, 이중 ICAM-1에 대한 결합 특이성 및 친화성이 가장 높은 클론을 JH 6-5로 명명하고, 항-ICAM-1 scFv를 코딩하는 유전자의 염기서열을 결정, 얻어진 scFv의 생화학적, 생리학적 및 발현 특성을 조사하였다.

실시예 3 : 선발된 항-ICAM-1 scFv 유전자의 염기서열 결정

JH 6-5 클론으로부터 파지미드 벡터 pCANTAB5E를 분리 정제하고, 클로닝 부위 주위의 전위/후위 프라이머를 이용하여 PCR하고, 전기영동을 실시하여 약 720 bp 크기의 삽입체를 확인하였다. 다음으로, pCANTAB5E 벡터에 특이적인 프라이머(서열번호 13 및 서열번호 14)를 이용하여 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법으로 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 확인하였다.

실시예 4 : 선발된 클론(JH 6-5)을 이용한 항-ICAM-1 scFv의 생산

실시예3에서 선발된 E.coli JH 6-5를 배양한 다음, 항-ICAM-1 scFv를 분리 정제하고, 그 특성을 조사하였다.

먼저, 상기 JH 6-5 클론을 2×YT + 100㎍/ml 앰피실린 + 0.1% 포도당를 포함한 배지에서 37 ℃에서 O.D.₆₀₀ 값이 0.9가 될때까지 배양하였다. 다음으로, 1 mM IPTG를 첨가하고 30℃에서 밤샘 동안 배양하여 발현을 유도한 후, 전세포, 세포질, 및 패리플라즈믹 추출물에 대하여 항-E 항체를 이용한 ELISA를 실시하였다. 그 결과, 패리플라즈믹 위치에서 항-ICAM-1 scFv가 가장 많이 발현됨을 알 수 있었다.

다음으로, 전세포로부터 센트리콘(centricon^??) (Millipore 사)을 이용하여 농축하고, E-태그를 이용한 친화성 크로마토그래피 정제 시스템(purification system) (Pharmacia 사: 카탈로그 번호 17-1362-01)을 사용하여 순수 정제한 후, 결합 친화성 및 활성도 조사에 사용하였다. 순수 분리된 JH 6-5 scFv를 전기영동한 다음 웨스턴 블롯팅한 결과를 도1에 나타내었다. 그 결과, 분자량 약 30kD의 위치에서 온전한 형태의 scFv를 확인할 수 있었다 (도1의 6-5 레인 참조). 웨스턴 블롯팅은 순수 분리된 scFv를 먼저 12% SDS-PAGE에서 전기영동한 다음 니트로셀룰로즈 막상으로 전이시키고 항-E 태그 mAb 및 알칼리 포스파타제(AP) 결합 항-생쥐 IgG과 차례로 반응시킨 NBT/BCIP로 발색하였다.

실시예 5 : 플로우 사이토메트리를 이용한 ICAM-1에 대한 결합 친화성 조사

ICAM-1 분자를 발현하는 것으로 확인된 사람 림프아구종세포주 IM-9 세포와 사람 단핵구세포주 THP-1 세포 (5x10⁵ 세포)를 차가운 PBS로 세척하고, 여기에 정제된 scFv를 각각 4μg, 8μg, 16μg, 32μg, 및 64μg 첨가한 후 4℃에서 30분 동안 반응시키고 차가운 PBS로 세포를 2번 세척한 다음 항-E 태그 mAb (1μg)로 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 잔여물은 다시 차가운 PBS로 닦아낸 다음 FITC-결합 항-생쥐 IgG (0.5μg)로 4℃에서, 30분 동안 반응시킨 후 1% 포름알데히드로 고정하여 FACS 분석을 하였다. 대조군으로는 ICAM-1을 발현하지 않는 사람 백혈병 T 세포주 Jurkat 세포를 사용하였다.

상기 FACS 분석 결과 중, IM-9세포를 각각 항-ICAM-1 mAb (A), scFv/항-E 태그 mAb (B), 항-E 태그 mAb (C), BL21(DE3) 추출물 (D)과 배양한 다음 항-마우스 IgG-FITC로 표지한 다음 FACS 분석한 결과를 도2에 나타내었다. 상기 도2 중, D는 scFv 유전자가 도입되지 않은 BL21(DE3) 세포 추출물에 대한 결합 활성을 측정한 것이다. 또한, 도3은 ICAM-1을 생산하지 않는 Jurkat 세포주를 항-CM1 mAb (A) 및 scFv/항-E 태그 mAb (B)과 배양한 다음 항-마우스 IgG-FITC로 표지한 다음 FACS 분석한 결과를 나타낸다. 도2 및 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 scFv은 항-ICAM-1 mAb과 유사한 결과를 나타내어, ICAM-1에 대하여 결합함을 알 수 있었다. 도면에는 나타내지 않았으나, THP-1 세포주를 이용한 실험에서도 동일한 결과를 얻었다.

실시예 6 : JH 6-5 유래의 항-ICAM-1 scFv의 대량생산용 시스템의 확립

1. 대량생산용 발현시스템의 확립

JH 6-5 scFv를 pCANTAB 5E 벡터를 이용하여 발현시키는 경우 보다, 발현 수준을 높일 수 있고, 히스티딘 태그(histidine tag)를 가지고 있어 분리 정제가 용이한 pET-28a 벡터에 JH 6-5 scFv 유전자를 재조합하였다 (도4a). 먼저, JH 6-5 scFv DNA를 EcoI과 SalI 제한효소로 처리한 다음, 같은 효소로 잘려진 pET-28a(Novagen Co.) 벡터와 몰농도 3:1의 비율로 섞고, T4 리가제를 이용하여 4℃에서 연결시킨 다음, 비발현숙주인 E.coli JM109 (endA1 recA1 gyrA96 thi hsdR17 relA1 supE44 Δ(lac-proAB) F'(traD36 lacIqZ ΔM15 proA⁺B⁺)에 형질전환하였다. 다음으로, 상기 E.coli JM109에서 알칼리 분해(alkaline lsyis)법을 이용하여 JH 6-5 scFv DNA를 포함하는 pET-28a 벡터를 분리하여 발현 숙주인 BL21(DE3)(F^- ompT hsdSB(rB^-mB^-) gal dcm (DE3))(Novagen Co.)에 형질전환하여 JH 6-5 scFv 생산용 균주를 확립하였다.

얻어진 생산용 균주를 소량 배양한 후, 총 단백질을 추출한 다음 상기 실시예4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 그 결과를 도4b에 나타내었다. 도4b에 나타낸 바와 같이, 다른 벡터를 사용한 경우(데이터 보이지 않음)보다 pET-28a 벡터를 사용하여 제조된 발현 균주가 더 높은 발현 수준을 나타냄을 알 수 있었다. 상기 도4b 중 28kD와 34kD의 두개의 밴드는 모두 JH 6-5 scFv이나 28kD scFv는 His-tag 부분이 잘려나간 형태이다. 실시예4에서 언급한 scFv 보다 크기가 증가한 이유는 벡터를 pCANTAB5에서 pET28-a로 대체하면서 His-tag 등의 폴리펩타이드 서열이 첨가되었기 때문이다.

2. 상기 JH 6-5 scFv 발현 균주의 배양 및 JH 6-5 scFv의 분리정제

고체배지에서 자란 상기 생산용 균주를 카나마이신(30μg/ml)을 함유하고 있는 LB 배지 10ml에 접종한 다음, O.D.₆₀₀= 0.6일 때 500ml LB(30μg/ml kanamycin)에 접종하여 37℃에서, 250 rpm으로 교반하면서, O.D.₆₀₀= 0.5 - 1.0 수준이 될 때까지 배양한 다음, 1mM IPTG를 첨가하여 2시간 동안 scFv 발현을 유도하였다. 배양액은 원심분리 후 상등액은 버리고 세포침전물을 10ml의 결합 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트 pH8.0, 300mM NaCl, 5mM 이미다졸)에 현탁시킨 다음 100μg/ml 리소라임을 첨가하여 얼음 위에서 30분 동안 반응시킨 후 초음파 처리로 세포를 파괴하고 프로테아제 저해제를 첨가하여 세포추출물을 얻었다.

상기 세포추출물을 여과지로 여과시킨 후 Ni⁺-NTA 칼럼(2ml)에 투여한 후 세척 버퍼(washing buffer) (50 mM 소듐 포스페이트 pH8.0, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸)로 충분히 씻은 다음 용출 버퍼(elution buffer) (50 mM 소듐 포스페이트 pH8.0, 300mM NaCl, 200mM 이미다졸)를 적용하여 용출하여 JH 6-5 scFv 분획을 모아 센트리콘(centricon)을 이용하여 농축한 후 PBS로 완충용액을 교환함으로써 정제를 완료하였다.

각 정제된 과정에서 얻어진 JH 6-5 scFv 시료를 12% SDS-PAGE에 전기영동한 다음 니트로셀룰로즈 막으로 전이하고 항-E 태그 mAb(1:1000) 및 AP 결합된 항-생쥐 IgG로 표지한 다음 NBT/BCIP로 발색하였다. 그 결과를 도5에 나타내었다. 도5에 나타낸 바와 같이, 총 단백질추출물에 비하여 높은 순도로 scFv가 얻어짐을 알 수 있었다. 또한, 정제과정을 거침에 따라 28kD에 비하여 36kD의 양이 상대적으로 증가하였다. 도5에서, A : 총 단백질 추출물, B-C : 용출되어 나온 액(flow through), D-I : 시료를 모은 분획이다.

본 발명의 ICAM-1 결합 단백질은 ICAM-1에 특이적으로 높은 친화성으로 결합하면서도 분자의 크기가 작아 대장균에서도 발현시킬 수 있으므로 대량생산이 가능하다. 본 발명의 ICAM-1 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 의하면, 상기 ICAM-1 결합 단백질를 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 ICAM-1 결합 단백질을 포함하는 조성물은 생체 내에서 안정하고, 목표장기에 대한 특이성이 좋고, 조직을 잘 투과할 수 있고, 작용 후 쉽게 제거될 수 있어 염증을 효과적으로 치료할 수 있다.

도1은 본 발명의 ICAM-1 결합 scFv의 웨스턴 블롯팅한 결과이다.

도2는 IM-9 세포를 본 발명의 scFv/항-E 태그 mAb으로 처리하고 항-마우스 IgG-FITC로 표지한 다음 FACS 분석한 결과이다.

도3은 Jurkat 세포주를 scFv/항-E 태그 mAb으로 처리하고 항-마우스 IgG-FITC로 표지한 다음 FACS 분석한 결과이다.

도4a는 본 발명의 JH 6-5 scFv 유전자가 pET-28a 벡터에 재조합된 유전자 지도이다.

도4b는 발현 균주의 총 단백질을 추출한 다음 웨스턴 블롯팅한 결과이다.

도5는 본 발명의 scFv를 발현 균주로부터 Ni⁺-NTA 칼럼을 이용한 정제 과정에서 얻어지는 시료에 대하여 웨스턴 블롯팅한 결과이다.

<110> HAHN, JANG HEE LEE, WANG JAE <120> A protein against ICAM-1 and a polynucleotide encoding the same, a vector and a host cell containing the polynucleotide and a composition comprising the protein <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln 50 55 60 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Pro Ala Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gly Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Tyr Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Leu Ile Tyr Asn Ala Tyr Asp Gly Phe Gly Tyr Trp 100 105 110 <210> 2 <211> 99 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Val Ala Pro Gly 35 40 45 Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 50 55 60 Thr Ile Asn Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 65 70 75 80 Glu Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 85 90 95 Ile Lys Arg <210> 3 <211> 304 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg 20 25 30 Gly Ser Glu Phe Tyr Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu 35 40 45 Gln Glu Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 50 55 60 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr Trp Val His Trp 65 70 75 80 Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 85 90 95 Pro Gly Asn Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 100 105 110 Lys Leu Thr Ala Val Thr Pro Ala Ser Thr Ala Tyr Met Gly Leu Ser 115 120 125 Ser Leu Thr Asn Glu Tyr Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Ile Tyr 130 135 140 Asn Ala Tyr Asp Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gly Gln Gly Thr Thr Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 165 170 175 Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 180 185 190 Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile 195 200 205 Arg Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu 210 215 220 Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Val Ala Pro Gly Val Pro Phe Arg Phe 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Met 245 250 255 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Ser Gly Tyr 260 265 270 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala 275 280 285 Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala 290 295 300 <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER PEPTIDE <400> 4 Gly Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln 20 25 30 Ser Pro <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER PEPTIDE <400> 5 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER PEPTIDE <400> 6 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER PEPTIDE <400> 7 Gly Ser Thr Ser Gly Lys Pro Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER PEPTIDE <400> 8 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 9 <211> 912 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcta tgcggcccag 120 ccggccatgg cccaggtgaa actgcaggag tcagggactg tgctggcaag gcctggggct 180 tccgtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacagtttta gcagctactg ggtgcactgg 240 gtaaaacaga ggcctggaca gggtctagaa tggattggtg ctatttatcc tggaaatagt 300 gaaactagat acaaccagaa gttcaagggc aaggccaaac tgactgcagt cacacccgcc 360 agcacggcct acatgggcct cagcagcctg acaaatgagt actctgcggt ctattactgt 420 acactcatct acaatgctta cgacgggttt ggttactggg ggggccaagg caccacggtc 480 accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggac 540 atcgagctca ctcagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagag ggtcaccatg 600 acctgcagtg ccagctcaag tatacgttac atatattggt accaacagaa gcctggatcc 660 tcccccagac tcctgattta tgacacatcc aacgtggctc ctggagtccc ttttcgcttc 720 agtggcagtg ggtctgggac ctcttattct ctcacaatca accgaatgga ggctgaggat 780 gctgccactt attactgcca ggagtggagt ggttatccgt acacgttcgg aggggggaca 840 aagttggaaa taaaacgggc ggccgcaggt gcgccggtgc cgtatccgga tccgctggaa 900 ccgcgtgccg ca 912 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 10 cagttttttt tttttttttt t 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 11 ggaattctat gcggcccagc cg 22 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 12 gctctagatt caacagtcta tgcggcacg 29 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 13 ccatgattac gccaagcttt ggagcc 26 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 14 cgatctaaag ttttgtcgtc tttcc 25

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 결합 단백질.
제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 ICAM-1 결합 단백질.
제1항 또는 제2항에 따른 ICAM-1 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제3항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제5항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주세포.
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