KR100473882B1 - 열-유도 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 열-유도 프로모터를 포함하는 핵산 분자와 발현 벡터들, 그리고 본 발명의 핵산 분자를 적어도 하나는 포함하고 있는 숙주 세포들에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 이용하여 한 개 혹은 그 이상의 단백질을 생산하는 키트(kits)와 방법들, 그리고 그것의 다양한 이용에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 가능한 한 선택적으로 열에 유도되는 특성(heat-inducible characteristic)을 지닌 프로모터를 제공하는 것인데, 특히 효모에서 활성을 보이고 고온에서의 단백질 발현에 적합한 프로모터를 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 하기의 핵산들로부터 선택된, 열-유도 프로모터를 포함하는 핵산 분자에 의해 완성되었다: (a) 트레할로스-6-인산 생산효소 활성(trehalose-6-phosphate synthase activity)을 갖는 단백질을 코딩하는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 프로모터 서열을 포함하는 배열을 지닌 핵산; (b) 서열번호 1로 기재되는 서열을 가진 핵산; (c) (a) 또는 (b)에서 제시된 서열들 중 하나와 300 bp의 길이에 걸쳐 적어도 40%의 상동성을 보이는 서열을 가진 핵산; (d) (a), (b) 또는 (c)에서 제시된 핵산들 중 하나의 상보적 가닥(complementary strand)와 혼성화(hybridization)가 가능한 핵산; (e) 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환(substitution), 첨가(addition), 및/또는 결실(deletion)을 통해 얻어진 (a), (b) 또는 (c)에서 제시된 핵산들 중 하나로부터 생긴 유도체(derivative); (f) 열-유도 프로모터의 기능을 가진, (a)에서 (e)까지에서 제시된 핵산 분자들 중 하나로부터 생긴 단편; (g) (a)에서 (f)까지에서 제시된 여러 개의 핵산들의 조합, 이 때 핵산의 서열들은 다를 수도 있고 같을 수도 있다; 또는 (a)에서 (g)까지에서 제시된 핵산들 중 하나에 대하여 상보적 서열을 갖는 핵산 분자.

Description

열-유도 프로모터{Heat-inducible promoter}

본 발명은 열-유도 프로모터(heat-inducible promoter)를 포함하는 핵산(nucleic acid) 분자와 발현 벡터들 그리고 본 발명과 관련한 핵산 분자를 적어도 하나를 포함하고 있는 숙주 세포들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 이용하여 하나 또는 그 이상의 단백질을 생산하는 도구 및 방법과 이 핵산 분자의 다양한 이용에 관한 것이다.

미생물들은 여러 가지 스트레스 상황, 즉 열 충격(heat shock), 냉 충격(cold shock), 에탄올(ethanol), 중금속 이온(heavy-metal ions), 산소결핍(oxygen deprivation) 또는 영양(nutrient) 결핍 특히 포도당(glucose) 결핍 등에 대응하는 능력이 있다. 효모(yeasts) 및 다른 균류(fungi)들은 생장이 감소하는 단계에는 트레할로스(trehalous)를 축적하는 것으로 알려져 있다. 상기의 단계는 일반적으로 물 부족이나 열에 대한 내성이 있는 발달 단계이며 예를 들어 포자(spores), 분생자(conidiae), 균핵(sclerotia), 또는 증식정지기(stationary growth phase)에 있는 세포들이 이에 속한다. 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 세포는 27℃에서 40℃로 열 충격이 한 시간동안 계속되면 그 동안에 트레할로스(trehalose)를 축적한다는 것과 트레할로스의 축적은 내열성(thermotolerance)의 증가와 상호 연관되어 있음이 이미 잘 알려져 있는 사실이다. 트레할로스가 내열성을 유도하기 위한 필수 요인임을 증명하기 위해 선택적 돌연변이들(selective mutations)이 사용되었다.

SHSE(heat shock elements/열 충격 인자들) 및 STREs(stress responsive elements/스트레스 대응 인자들)은 트레할로스 합성에 관여하는 S. cerevisiae 유전자들과 같은 스트레스에 의해 유도되는 유전자들의 프로모터 지역에 존재한다. 이들 인자들은 열 충격 유도 등 스트레스 유도에 의한 스트레스 유전자들의 활성을 조절하는 것으로 보인다. 일반적으로 Ras/cAMP 경로에 의한 Msn2p와 Msn4p의 인산화(phosphorylation)가 Msn2p 및 Msn4p 전사 인자들(transcription factors)을 억제하는 것으로 여겨지고 있다. 이 억제력이 약해지면(즉, 스트레스 상황이 오면) Msn2p와 Msn4p는 활성화된다. CCCCT 서열을 지닌 STREs가 스트레스 상황에 대응하는 역할을 한다고 생각된다.

균류와 특히 효모들은 단백질 합성시 인간과 비슷한 번역중(cotranslational) 및 번역후 수식(posttranslational modification)을 거치기 때문에 재조합 단백질(recombinant protein)의 생산을 위해 많이 사용되어 왔다. 재조합 단백질의 생산을 위해, 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 서열이 종종 적절한 이종 프로모터(heterologous promoter)의 통제하에서 발현된다. 특정 환경 조건(environmental condition)에 의해 유도되는 소위 말하는 유도 프로모터(inducible promoter)들이 상기의 목적에 특히 유용하다는 것이 알려져 있다. 메틸로트로픽 대사(methylotrophic metabolism)에서 핵심 효소를 코딩하는 유전자들의 프로모터들, 예를 들어 MOX(methanol oxidase) 또는 FMD(formate dehydrogenase) 프로모터들은 탄소원(carbon source)에 의해 주로 조절되는 이종유전자 발현(heterologous gene expression)에 광범위하게 이용될 수 있다.

분자 생물학적 연구를 위해 많은 발현 벡터(expression vector)들이 만들어져 왔으며 그 중 한가지로 열-유도 프로모터를 들 수 있는데, 초파리(Drosophila)로부터 만들어진 hsp70 유전자의 열-유도 프로모터가 한 예라 하겠다. 균류의 세포들과 특히 효모들에 있어서 열 충격을 유도하기 위해 과거에 사용되었던 프로모터들은 열 충격에 대해 선택적으로 반응하지 못한다는 단점을 가지고 있었다. 즉, 이들의 활성 및 비활성 기작을 충분히 통제할 수 없었기 때문에 세포에 해로운 단백질들이 생산되는 동안에는 특히 문제를 일으킬 수 있다. 예를 들어 S. cerevisiae로부터 얻은 TPS1 프로모터는 일반적인 스트레스 인자(STRE elements)로 알려진 몇 가지 서열들, 즉 CCCCT와 AGGGG를 가지고 있으나 열 충격 인자(HSE)로서 작용하는 서열, 즉 GGAACAACAATCG를 한 개 이상은 가지고 있지 않다. 더구나, 이들의 광범위한 스트레스에 대한 반응 때문에 현재 이들 프로모터들이 하나의 스트레스 인자에 의해 활성이 되는 정도가 많은 경우에 있어서 만족할 만한 수준의 것이 아님이 잘 알려진 사실이다.

따라서, 본 발명의 목적은 가능한 한 열에 대해 선택적으로 작용하는 열-유도 프로모터를 제공하는 것이며, 좀 더 상세하게는 균류와 특히 효모에서 활성을 가지며 고온에서의 단백질 발현에 적합한 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 하기의 핵산들로부터 선택된 열-유도 프로모터들을 포함하는 핵산 분자에 의해 완성되었다:

(a) 트레할로스-6-인산 생성효소(trehalose-6-phosphate synthase) 활성을 지닌 단백질을 코딩하는 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorhpa) 유전자의 프로모터 서열을 포함하고 있는 핵산;

(b) 서열번호 1로 표시되는 서열을 지닌 핵산;

(c) (a)와 (b)에서 제시된 서열 중 하나를 가진, 300bp의 길이에 걸쳐 적어도 40%의 동일성을 나타내는 서열을 가진 핵산;

(d) (a), (b) 또는 (c)에서 제시된 핵산들 중 하나의 상보적 가닥(complementary strand)에 혼성(hybridize) 가능한 핵산;

(e) 한 개 혹은 그 이상의 뉴클레오티드(nucleotide)의 치환(substitution), 첨가(addition) 및/또는 결실(deletion)을 통해 얻어진, (a), (b) 또는 (c)에서 제시된 핵산들 중 하나의 파생물(derivative);

(f) (a)에서 (e)사이에서 제시된, 열-유도 프로모터의 기능을 가진 핵산들 중 하나의 단편(fragment);

(g) (a)에서 (f)까지에서 제시된 핵산들 중, 서열이 같거나 다른 여러 개의 핵산의 조합(combination);

또는

(a)에서 (g)까지에서 제시된 핵산들 중 하나의 서열에 상보적인 서열을 지닌 핵산분자.

본 발명의 "열-유도 프로모터(heat-inducible promoter)"는 배양 배지에서 온도가 25℃에서 적어도 37℃까지, 바람직하게는 47℃까지 올랐을 때 이 프로모터의 전사 조절에 의해 유전자의 전사(RNA 합성)를 적어도 50% 이상 증가시키는 핵산 서열을 의미한다.

"트레할로스-6-인산 생산효소 활성(Trehalose-6-phosphate synthase activity)"은 글루코스-6-인산(glucose-6-phosphate, Glu6P)과 UDP-글루코스(UDPG)가 트레할로스-6-인산(trehalose-6-phosphate)과 UDP로 전환(conversion)되는 것을 일컫는 것으로 이 반응에서 트레할로스-6-인산 생산효소(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)가 촉매로 작용한다. 단백질 또는 폴리펩티드(polypeptide)의 트레할로스-6-인산 생산효소 활성은 하기의 "재료 및 방법(Materials and Methods)"에서 설명된 방법으로 측정할 수 있다.

"(a), (b) 혹은 (c)에서 제시된 핵산들 중 한 개의 핵산의 상보적 가닥(complementary strand)에 혼성 가능한 배열" 이란 다시 말해서, (a), (b) 혹은 (c)에서 제시된 특징을 가진 어느 핵산의 상보적 가닥과 특정 조건하에서 혼성이 되는 서열이란 뜻이다. 예를 들어, 혼성은 68℃의 2xSSC에서 이루어지거나, 또는 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)사의 디옥시제닌 라벨링 키트(Dioxygenin labelling kit)의 방법에 따라서 이루어질 수 있다. 특정한 혼성화(hybridization) 조건의 예를 구체적으로 들어 보자면, 7% SDS, 1% BSA, 1mM EDTA, 250 mM 소디움 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer), 65℃에서 밤새도록 배양(overnight incubation)한 후, 65℃에서 2xSSC, 0.1% SDS로 세척하는 것이다.

"% 동일성(identity)"이란 두 개 또는 그 이상의 DNA 분자들 또는 두 개 혹은 그 이상의 폴리펩티드 분자들의 서열사이의 유사한 정도를 나타내는 용어로서, 그 서열들의 비교(comparison)에 의해 결정된다. "동일성(identity)"의 비율은 두 개 혹은 그 이상의 서열들의 동일한 지역들의 비율로부터 얻어진 것이며, 이때 서열들 간의 차이나 다른 특정한 서열 양상을 고려하여 결정한 것이다.

연관된 DNA 분자들 또는 폴리펩티드들의 동일성은 기존의 알려진 방법들에 의해 결정될 수 있다. 주로, 특정 요구조건을 충족시키는 연산방식(algorithms)을 이용한 전용 컴퓨터 프로그램이 사용된다. 조사된 서열들 간의 가장 큰 일치를 나타내는 방법이 제일 바람직한 동일성 결정 방법이라 하겠다. 두 서열들 간의 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램들로는 GAP(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(12):387(1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison,(WI)); BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S. et al., J. Molec Biol 215 :403/410(1990)) 등을 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 들 수 있는데 여기에 국한되는 것은 아니다. BLAST X 프로그램은 NCBI(National Centre for Biotechnology Information)나 기타 다른 곳(BLAST Manual, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215 ;403/410 (1990))으로부터 얻을 수 있다. 이미 잘 알려져 있는 스미스 워터만 알고리즘(Smith Waterman algorithm) 역시 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다.

서열 비교시에 바람직한 매개변수(parameters)는 하기와 같다:

연산방식(Algorithm): Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol 48:443-453(1970)

비교 매트릭스(matrix): 일치 = +10,

불일치 = 0

간격에 대한 페널티(Gap penalty): 50

간격의 길이에 대한 페널티: 3

GAP 프로그램도 또한 상기의 매개변수를 가지고 사용 가능하다. 상기의 매개변수들은 핵산 서열 비교를 위한 디폴트 매개변수(default parameter)들이다.

그밖에 다른 연산방식들, 갭 오프닝 페널티(gap opening penalties), 갭 익스텐션 페널티(gap extension penalties), 그리고 the Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September 1997에서 설명하고 있는 것을 포함한 비교 매트릭스(comparison matrices) 등이 사용될 수 있다. 무엇을 선택할 것인가는 정확한 특정 비교영역에 따라 다르고 특히 서열 쌍들 간의 비교인지(이 경우에는 GAP 혹은 Best Fit을 사용함이 바람직함), 아니면 하나의 배열과 서열의 데이타베이스(large database of sequences)를 비교할 것인지(이 경우에는 FASTA 혹은 BLAST를 사용함이 바람직하다)에 따라 달리 결정된다.

놀랍게도, 본 발명의 핵산 분자와 특히 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 트레할로스-6 인산 생산효소(trehalose-6 phosphate synthase, TSP1) 유전자의 프로모터는 적어도 코딩 서열(coding sequence)의 첫 번 300 bp 상류(upstream)에서는 S. cerevisiae에서 찾아볼 수 있고 이 유전자의 열 충격 유도를 포함하여 스트레스 반응에 대해 일차적인 책임이 있는 것으로 여겨지는 STRE 인자를 하나도 갖고 있지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 프로모터는 열에 대해 선택적으로 매우 잘 반응하는 것으로 나타났다.

본 발명의 핵산 분자들은 기존의 방법들에 의해 합성함으로써 제조하거나 또는 적당한 DNA 라이브러리로부터 분리해 낸 후 요구 조건에 맞게 변이시켜 준비할 수 있다. 분리(isolation)시에는 H. polymorpha(도 6 참조)의 TPS1 유전자의 코딩 서열(coding sequence)의 적어도 200-400 bp를 포함하는 탐침(probe)을 마련하여서 분리를 수행함이 바람직하다. 이러한 종류의 탐침은 적당한 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)의 방법으로 마련할 수 있는데, 이때 사용되는 프라이머들은 모두가 적어도 길이가 20-21 bp가 되어야 하고 도 6에 나와있는 적합한 서열들을 가지고 있어야 하며 "주형(template)"으로서 H. polymorpha의 게노믹(genomic) DNA 또는 cDNA를 가지고 있는 것이 바람직하다.

탐침들은 합성하거나, 사용 가능한 TPS1 DNA를 조각내어 그 단편을 이용하여 제조된다. 프로모터 서열의 부분들에 대해 상호 반응하는 탐침들을 이용하여 직접 스크리닝하는 방법도 물론 가능한데 이 방법은 아무리 잘한다 해도 코딩되지 않는(non-coding) 부분들의 서열을 완전하게 보존하는 것이 어렵기 때문에 그다지 바람직한 것은 아니다.

본 발명의 핵산 분자들의 서열을 살펴보면 300 bp의 길이에 걸쳐 상기 (a) 또는 (b)에서 제시된 서열들 중 하나와 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 80%의 동질성을 보여준다.

열-유도 프로모터를 포함하며, 상기 (a) 또는 (b)에서 설명된 서열들 중 하나와 300 bp의 길이에 걸쳐 적어도 90%의 동질성을 보여주는 핵산 분자들이 특히 요구된다. 그러나 가장 바람직한 핵산분자들은 상기 (a) 또는 (b)에서 제시된 서열들 중 하나와 300 bp의 길이에 걸쳐 적어도 95%의 동질성을 보여주는 것이다.

본 발명에 있어 적합한 핵산 분자들은 NGAANNNNNNNGAAN(서열번호 2)의 서열 또는 그 서열의 상보적 서열을 가진 열 충격 인자(heet-shock element)를 적어도 하나는 가지고 있는 것이어야 하며, 여기에서 N으로 표시된 뉴클레오티드는 독립적인 A, T, C 및 G 어느 것도 가능하다. 본 발명의 핵산 분자들은 NGAANNBWMNNGAAN(서열번호 3)의 서열을 가지고 있거나 또는 B자리에 G가, C 자리에 T, W자리에 A 또는 T, M 자리에 C나 A가 들어가 있는 상기 서열의 상보적 서열을 가진 열 충격 인자를 적어도 하나는 가지고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의바람직한 구체예에서, 열 충격 인자는 TGAAGCCTCTTGAAA(서열번호 4) 및/또는 TGAATATAAAGGAAA(서열번호 5) 및/또는 서로 같거나 다른 서열들을 가진 두 개 혹은 그 이상의 열 충격 인자들을 가진 그것의 상보적 서열로부터 선택되었다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자들은 CCCCT 또는 AGGGG의 서열을 가진 STRE 인자를 포함하지 않는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명은 상기에서 언급한 바와 같이 열-유도 프로모터의 기능을 가진 핵산 분자의 단편들을 제공한다. 서열번호 1 상의 228-792 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편이 특히 바람직하며, 493-792 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편은 더욱 바람직하다. 서열번호 1 상의 627-713 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편 또한 유용하다.

본 발명의 핵산 분자들은 또한, 열-유도 프로모터의 전사 조절하에서 적어도 하나의 이종 유전자(heterologous gene) 핵산 서열을 포함하기도 한다.

"이종 유전자(heterologous gene)"라 함은 그 자신의(homologous) 프로모터의 통제하에서는 발현되지 않거나 그 유전자가 유래된 유기체(organism) 내에서는 발현이 되지 않는, 또는 그 자신의 프로모터의 통제하에서든지 그 유전자가 유래된 유기체에서든지 발현되지 않는 구조 유전자(structural gene)의 코딩 부분(coding part)을 말한다.

본 발명의 계속되는 구체 예에서, 본 발명의 핵산 분자들은 하기와 같은 서열들로부터 선택된 열-유도 프로모터의 전사 통제를 받는 핵산 서열을 포함한다:

(ⅰ) 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 트레할로스-6-인산 생산효소(trehalose-6-phosphate synthase)의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;

(ⅱ) 서열번호 6으로 기재되는 핵산 서열;

(ⅲ) 서열번호 6으로 기재되는 서열과 적어도 80%의 상동성(identity)을 보이는 핵산 서열;

(ⅳ) 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열 또는 그 부분적인 서열을 가진, 트레할로스-6-인산 생산효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 핵산 서열;

(ⅴ) 유전 암호(genetic code)의 퇴화(degeneration)를 고려한, 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열 또는 그 부분적인 서열을 가진, 트레할로스-6-인산 생산효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 핵산서열;

(ⅵ) 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 상동성을 보이는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하고 있는 핵산 서열.

(ⅲ)항의 핵산 서열은 서열번호 6으로 기재되는 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 가지는 것이 바람직하고, (ⅵ)항에서 제시된 폴리펩티드를 코딩하고 있는 핵산 서열에서는 그 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 핵산 분자는 발현된 단백질을 밖으로 운반하도록 하는 신호 펩티드(signal peptide)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하기도 하는데, 이때 상기 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 발현될 이종 유전자에 직접적으로 결합하려는 경향이 있다. 많은 진핵세포 단백질(eukaryotic proteins)의 분비(secretion) 및 변형(modification)에는 폴리펩티드가 직접 분비장치(secretion apparatus)로 가기 위해 단백질 서열의 N-말단이 신호서열(signal sequence)과 융합(fusion)되는 것이 필요하다. 히루딘(hirudin)의 분비(Weydemann et al., 1995)를 위해 성공적으로 사용되어 온 S. occidentalis의 GAM1 유전자와 Carcinus maenas의 호르몬 유전자(hormonal gene)로부터 얻어진 성분들은 본 발명에서도 사용가능 할 것으로 생각된다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 전사를 종결하도록 하는 RNA 중합효소에 대한 신호구조(signal structures)를 갖는 종결인자(terminator element)를 포함하기도 한다. 사용 가능한 종결인자들의 예로는 H. polymorpha의 MOX 또는 PHO1 종결인자 등이 있다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 발명에 따른 핵산 분자를 적어도 하나이상 포함하고 있는 숙주 세포(host cell)인데 여기에서의 숙주 세포는 진핵 생물(eukaryotic) 또는 원핵 생물(prokaryotic) 세포이다. 진핵 세포의 한 예로 식물 세포를 들 수 있다. 바람직한 진핵 세포로는 균류 세포(fungal cell)를 들 수 있고 효모 세포는 더욱 바람직하다. 본 발명을 수행하는데 있어서 숙주세포로 특히 관심을 모으고 있는 것이 균류인데, 아스퍼질러스(Aspergilus), 뉴로스포라(Neurospora), 뮤코(Mucor), 트리코더마(Trichoderma), 아크리모니움(Acremonium), 소다리아(Sordaria), 페니실리움(Penicillium)같은 섬유질의 균류(filamentous fungi)나 사카로미세스(Saccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 피키아(Pichia), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 스와니오미세스(Schwanniomyces), 야로위아(Yarrowia), 아르스라(Arxula), 트리코스포론(Trichosporon), 칸디다(Candida)같은 효모가 그 예이다.

본 발명에서 가장 바람직한 세포는 다양한 환경에서 생존가능한(facultative) 메틸로트로픽 한세눌라(methylotrophic Hansenula) 효모, 특히 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)이다. 한세눌라 폴리모르파는 내열성(thermotolerant)이 있는 효모 세포이며 메탄올(methanol)을 탄소 및 에너지원(energy source)으로 이용하는 소위 메틸로트로픽 효모(methylotrophic yeasts)라 불리는 소그룹에 속한다. 한세눌라 폴리모르파는 토양 샘플을 37℃에서 배양시켜(Levine and Cooney, 1973) 분리되었다. 한세눌라 폴리모르파는 고온에서도 성장을 계속하고 단백질을 생산하는데 이는 다른 불필요한 유기체들을 제거하는데 도움이 된다. 그 이유는 한세눌라 폴리모르파가 37℃ 정도에서 매우 높은 최적 성장 온도(optimum growth temperature)를 지니고 있을 뿐만 아니라 대략 50℃ 정도의 온도에서도 해를 입지 않고 살아 남을 수 있기 때문이다(도 1 참조). 성장 정지 기(stationary phase)에 돌입한 후에도 한세눌라 폴리모르파의 생명력(vitality)은 47℃에서 조차도 약 50여 시간동안 줄어들지 않음을 볼 수 있다(도 2 참조).

본 발명의 또 다른 대상은 본 발명의 핵산 분자를 적어도 하나는 포함하고 있는 발현 벡터(expression vector)이다. 이런 발현 벡터는 열-유도 프로모터 이외에도 다른 핵산 서열, 예를 들면 폴리펩티드, 선택표지 유전자(selection marker gene), 대장균의 복제점(replication origin) 등을 코딩하고 있는 핵산 서열을 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 하기의 내용을 포함하는 키트(kit)를 제공한다:

(a) 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 벡터 내로 클로닝하기에 적합한 본 발명의 발현 벡터; 및

(b) 재조합 단백질의 생산과 열-유도 프로모터의 유도에 적합한 숙주세포.

"클로닝(Cloning)"이라 함은 이 목적을 위해 사용될 수 있는 지금까지 알려진 모든 클로닝 방법을 포함하여 일컫는다. 상기의 모든 클로닝 방법을 여기서 전부 설명하지는 않겠지만, 이 분야에 숙련된 사람에게는 익숙한 것이다.

본 발명은 계속해서 하기의 내용을 포함하는 키트를 제공한다.

(a) 발현 벡터, 및

(b) 열-유도 프로모터의 유도와 열-유도 프로모터의 전사 조절을 받는 서열에 의해 발현되는 단백질의 생산에 적합한 숙주 세포.

본 발명의 핵산 분자들, 숙주 세포들, 발현 벡터들 및 키트들은 열-유도 프로모터의 조절을 받는 유전자의 재조합 발현(recombinant expression)을 위해, 또는 하나 이상의 단백질 생산을 위해서 사용될 수 있다.

"적당한 숙주 세포안에서의 재조합 발현(recombinant expression)"이란 이 목적을 위해 이용될 수 있는 알려진 발현 체계(expression system)들에서의 모든 발현 방법(expression methods)을 일컫는 말이다. 상기의 모든 발현 방법을 여기서 전부 설명하지는 않겠지만, 이 분야에 숙련된 사람에게는 익숙한 것이다.

본 발명의 또 다른 대상은 한 개 혹은 그 이상의 단백질 생산을 위한, 하기의 내용을 포함하는 방법이다.

(ⅰ) 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 본 발명의 발현 벡터 내로 클로닝, 그렇게 함으로써 클로닝된 핵산이 열-유도 프로모터의 전사 조절을 받게 된다;

(ⅱ) 상기 (ⅰ)항에서 얻어진 발현 벡터를 열-유도 프로모터의 유도 및 재조합 단백질의 생산을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입;

(ⅲ) 상기 (ⅱ)항에서 얻어진 숙주세포의 배양;

(ⅳ) 기존의 방법을 이용한 열-유도 프로모터의 유도(induction).

본 발명의 발현 벡터가 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하고 열-유도 프로모터의 전사 조절을 받게되면, 한 개 혹은 그 이상의 단백질 생산을 위한 본 발명의 방법은 하기의 내용과 같은 단계를 포함하여야 한다:

(ⅰ) 열-유도 프로모터의 유도 및 재조합 단백질의 생산을 위해 적합한 숙주세포 내로의 발현 벡터 도입;

(ⅱ) 상기 (ⅰ)항에서 얻어진 숙주세포의 배양;

(ⅲ) 기존의 방법을 이용한 열-유도 프로모터의 유도(induction).

본 발명을 하기 도면의 설명에 의하여 상세히 기술한다.

도 1은 27℃, 37℃ 및 47℃에서의 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha)의 성장 곡선(growth curve)을 나타내는 그래프이고,

도 2는 27℃, 37℃ 및 47℃에서 성장 정지기(stationary phase)에 들어간 한세눌라 폴리모르파의 생존력(vitality)을 나타내는 그래프이고,

도 3의 A는 27℃에서 47℃까지 열 충격(heat-shock)을 가한 후 이어서 27℃로 식힌 야생형(wild-type) 한세눌라 폴리모르파 RNA를 노던 블롯(Northern blot)한 결과를 보여주는 전기영동 사진이고,

세포들을 초기 지수기(exponential phase)에 이르기까지 27℃에서 YDP 배지에서 배양하였다; 그후 온도를 47℃까지 높였으며(시간 0), 120분 후에 다시 27℃로 낮추었다.

도 3의 B는 27℃에서 47℃까지 열 충격을 가한 후 이어서 27℃로 식힌(도 3의 A 참조) 후의 한세눌라 폴리모르파의 Tps1 단백질(Tps1p)에 대한 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 보여주는 전기영동 사진이고,

상기에서 TPS1 mRNA의 증가와 Tps1 단백질(Tps1p)의 증가 사이의 상관관계(correlation)를 볼 수 있다.

도 3의 C는 27℃에서 47℃까지 열 충격을 가한 후 이어서 27℃로 식힌(도 3의 A 참조)후의 한세눌라 폴리모르파의 세포내(intracellular) 트레할로스 농도(trehalose concentration) 및 트레할로스-6-인산 생산효소(trehalose-6-phosphate synthase, Tre6P) 활성도를 시간대 별로 보여주는 그래프이고,

○: 세포내 트레할로스 농도,

■: 트레할로스-6-인산 생산효소(Tre6P),

상기에서 TPS1 mRNA의 증가와 트레할로스-6-인산 생산효소의 활성도 및 세포 내 트레할로스 농도의 증가 사이에는 상관관계가 있음을 확인하였다.

도 4의 A는 트레할로스-6-인산 생산효소의 활성도(흰색 막대)와 27℃(위), 37℃(중간) 및 47℃(아래)에서 배양한 한세눌라 폴리모르파의 세포 내에 축적된 트레할로스 농도(검은 막대) 및 7, 10, 17, 36시간 후의 포도당 결핍상황(deprivation)하에서의 트레할로스 농도를 비교해서 보여주는 그래프이고,

□: 트레할로스-6-인산 생산효소의 활성도,

■: 세포 내에 축적된 트레할로스 농도

도 4의 B는 27℃(위), 37℃(중간) 및 47℃(아래)에서 배양한 한세눌라 폴리모르파의 7, 10, 17, 36시간 후의 포도당 결핍상황(deprivation)하에서의 TPS1 mRNA의 변화를 보여주는 전기영동 사진이고,

도 4의 C는 27℃(위), 37℃(중간) 및 47℃(아래)에서 배양한 한세눌라 폴리모르파의 7, 10, 17, 36시간 후의 포도당 결핍상황(deprivation)하에서의 Tps1 단백질(Tps1p)의 변화를 보여주는 전기영동 사진이고,

도 5는 많은 유기체들에 있어서 트레할로스-6-인산 생산효소 유전자의 특정 DNA 서열 지역들 간의 상동성을 보여주는 그림이고,

도 6 의 A 및 B는 한세눌라 폴리모르파의 TPS1 유전자의 DNA 서열(서열번호 8)과 그 아미노산 서열(서열번호 6)을 보여주는 그림이고,

: 프로모터 서열내의 열 충격 인자들(heat-shock elements)

도 7은 pM1(M. Suckow, personal communication)의 유도체인 플라스미드 pC11의 구조를 나타내는 모식도이고,

상기 플라스미드는 lacZ 유전자를 pM1의 폴리링커(polylinker)에 삽입함으로써 얻은 것이다. 상기 플라스미드는 HARS 1 서열( H . polymorpha Autonomously Replicating Sequences), pBR322에서 유래된 ori(origin of replication), 항-앰피실린 유전자(ampicillin-resistance gene), 한세눌라 폴리모르파와 대장균에서 번식(propagation)과 도태(selection)에 관여하는 유전자인 URA3 및 lacZ 유전자 뒤에서 전사 과정을 종결하는 MOX 종결인자(terminator) 등을 포함한다.

도 8은 pC11의 lacZ 리포터 유전자(reporter gene)의 앞부분에 FMD 프로모터를 삽입함으로써 얻은 플라스미드 pC 11-FMD의 구조를 나타내는 모식도이고,

도 9는 pC11의 lacZ 리포터 유전자의 앞부분에 TPS1 프로모터를 삽입함으로써 얻은 플라스미드 pC11-TPS1의 구조를 나타내는 모식도이고,

도 10의 A는 30, 37 및 44℃에서 3가지 다른 탄소원(2% 포도당, 2% 글리세린 또는 2% 메탄올)에 따른 FMD의 활성을 비교 분석한 결과를 보여주는 그래프이고,

도 10의 B는 30, 37 및 44℃에서 3가지 다른 탄소원(2% 포도당, 2% 글리세린 또는 2% 메탄올)에 따른 TPS1 프로모터의 활성을 비교 분석한 결과를 보여주는 그래프이고,

도 11은 실시예 4에서 사용된 플라스미드 pTPS1ConphysMT의 구조를 나타내는 모식도이다.

MOX-T : MOX 종결인자(terminator), Conphys : Conphys 3 유전자,

TPS1 : 한세눌라 폴리모르파의 TPS1 프로모터,

HARS : 한세눌라 폴리모르파의 자기복제 서열( H . polymorpha Autonomously Replicating Sequences),

tet : 항-테트라실린 유전자(tetracycline-resistance gene),

URA3 : 의 URA3 유전자,

amp : 항-암피실린 유전자(ampicilin-resistance gene)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법:

특수시약 및 재료(special reagents and materials)

바이오 101(Bio 101, Vista, USA)

진클린 키트(Geneclean Ⅱ Kit)

바이오래드(BioRad Lab., Munich, Germany)

바이오래드 단백질 분석 키트(BioRad Protein Assay, Bradford)

베링거(Boehringer, Mannheim, Germany)

포도당 측정 키트(GOD/POD kit for glucose measurement), 에탄올 키 트(ethanol kit), 콤플리트 단백질분해효소 칵테일 정("COMPLETE" proteinase cocktail tablets)

플루카 케미(Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland)

사이클로헥시미드(Cycloheximide, Actidion), SDS, 트레할로스 (D+trehalose), PEP, 트리신(TRICIN), NADH, 폴린-시오칼투 페놀 시 약(Folin-Ciocalteu phenol reagent)

아이시엔 바이오케미칼스(ICN Biochemicals, Ohio, USA)

리퀴젤("Liquigel" 40% acrylamide/N'N'-methylene-bisacrylamide, 37.5:1)

코닥(Kodak, New York, USA)

바이오맥스 필름(BIOMAX MR scientific imaging film)

메디아텍(Mediatech, Herndon, USA)

제네티신 설페이트(Geneticin G418 sulfate, antibiotics)

퍼킨엘머(Perkin Elmer Applied Biosystems, Forest City, USA)

DNA 서열결정 키트(DNA sequencing kit)

파마시아(Pharmacia Biotech, Sweden)

세파덱스 컬럼(Nap-10 columns with Sephadex G-25), 제한효소(all restriction enzymes used), 택 폴리머라제(Taq polymerase)

콰이아젠(Qiagen Gmbh, Germany)

플라스미드 미디 키트(Plasmid midi kit, 50)

슈라이처쉘(Schleicher+Schuell, Dassel, Germany)

프로트란(Protran BA 83 0.2 ㎛/Ø 82 ㎜, cellulose nitrate round filter; Protran BA 83 0.2 ㎛, transfer membrane for blots)

시그마(Sigma, St. Louis, USA)

단클론 염소 항-토끼 면역 글로불린(Monoclonal goat anti-rabbit immunoglobulins, alkaline phosphatase conjugate), 트레할로스 (trehalase from pig kidneys, Cat. No. T-8778), UDPG, 포도당-6-인 산(glucose-6-P), LDH, 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase)

스트라타젠(Stratagene, La Jolla, USA)

프라임잇 키트(Prime-It kit, random primer labelling kit), 누크트 랩 칼럼(NucTrap columns, probe purification columns incl. push column beta shield device)

유에스 바이올로지칼(US Biological, Swampscott, USA)

아가(Bacteriological Agar), 브로스(YPD broth enhanced formulation W/Peptone X; LB broth Miller)

사용된 장치(Apparatus used)

일렉트로포레이션 장치(Electroporation unit)

대장균 펄서(E. coli pulser, BioRad Laboratories, Hercules, USA)

HPLC

디오넥스(DIONEX DX-300, DIONEX, Sunnyvale, USA)

냉각 원심분리기(Cooling centrifuges)

센트리콘(Centrikon H-401, Kontron Instr.AG, Zurich, Switzerland)

센트라(IEC Centra GP8R, Brower, Lucerne, Switzerland)

바이오퓨즈(Biofuge 17RS, Heraeus Sepatech, Germany)

PCR 장치

프로젠(Progene, Techne, Cambridge, United Kingdom)

포스포이미저(phosphoimager)

GS 250 분자 이미저(molecular imager, BioLad Laboratories, Hercules, USA)

서열분석기(Sequencer)

ABI 프리즘(PRISM) 301 유전분석기(Genetic Analyzer, Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, USA)

세균 균주와 배양조건(Bacterial strain and culture conditions)

대장균 균주인 DH5α(F'endA1hsdR17rκmκ+supE44thi-1recA1gyra relA(lacZYA-argF)U169(Ф80Δ(lacZ)M15)(Gibco BRL, Gaithersburg MD, USA)가 한세눌라 폴리모르파의 TPS1 유전자의 클로닝을 위해 사용되었다. 모든 실험은 표준방법(Sambrook et al., 1989)에 따라 수행되었으며, 대장균 배양용 배지도 표준방법(Sambrook et al., 1989)에 따라 만들어졌다.

대장균( E. coli )으로부터 플라스미드 DNA 분리(STET prep)

샘부룩 등(Sambrook et al., 1989)에 의해 수정된 방법에 따라 플라스미드 DNA를 분리하였다. 주걱(spatula)을 이용하여 플레이트의 세포물질(cell material)을 긁어모으고, 이 세포물질을 35 ㎕의 라이소자임(lysozyme, 10mg/ml)을 포함한 500 ㎕의 STET(8%[w/v] sucrose, 5%[v/v] Triton X-100, 50 mM Tris-HCI, pH 8.0)에 넣어서 잘 섞었다. 그 후 이 샘플들을 100℃에서 1분 40초 동안 끓였으며 4℃, 20,000 g에서 10분간 원심분리 하였다. 피펫을 이용하여 약 400 ㎕의 상등액을 분리한 후400 ㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 이용하여 DNA를 침전시켰다. 4℃, 20,000 g에서 10분간 원심분리 한 후 전체 상등액을 제거하고 DNA 펠렛(pellet)은 차가운 70%[v/v]의 에탄올로 한번 세척하였다. 마지막으로, DNA를 실온에서 건조시켜서 50-70 ㎕의 TE(10 mM Tris-HCI, pH8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 용해시켰다.

효모 균주 및 배양조건(Yeast strain and culture conditions)

효모 균주는 야생형 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha, P. Piper, London, 1994)가 사용되었다. 저장용 효모균(Stock culture)을 YPD 아가 배지(2%〔w/v〕포도당, 2%〔w/v〕 bactopeptone, 1%〔w/v〕효모 추출물, 2%〔w/v〕agar)에서 배양하였으며 6주마다 다시 저장(re-stock)하였다. 저장된 효모균은 YPD 배양 용액(YPD 아가 배지와 동일한 구성을 이루고 있지만 그 중 2%〔w/v〕아가만 빠진 것이다)을 위한 접종물(inoculum)로 이용되었다.

한세눌라 폴리모르파 (H. polymorpha) RB11 균주(odc1 orotidine-5- phosphate-decarboxylase-deficient(uracil-auxotrophic) H. polymorpha strain(Weydemann et at., 1995))는 실시예 3 및 실시예 4에서 사용되었다. 여기에서 사용된 완전한 배지(full medium)는 2%의 포도당(glucose) 또는 글리세린(glycerine), 1%의 효모 추출물(extract) 및 2%의 박토펩톤(bactopepton)으로 이루어졌다; 반면 선택 배지(selection medium)는 0.17%의 효모 질산염(yeast nitrogen base)과 0.5%의 황산암모늄(ammonium sulfate), 2%의 포도당 또는 글리세린, 38.4 ㎎/ℓ의 아르기닌(arginine), 57.6 ㎎/ℓ의 이소류신(isoleucine), 48 ㎎/ℓ의 페닐알라닌(phenylalanine), 57.6 ㎎/ℓ의 발린(valine), 6 ㎎/ℓ의 트레오닌(threonine), 50 ㎎/ℓ의 이노시톨(inositol), 40 ㎎/ℓ의 트립토판(tryptophan), 15 ㎎/ℓ의 타이로신(tyrosine), 60 ㎎/ℓ의 류신(leucine) 및 4 ㎎/ℓ의 히스티딘(histidine)을 포함하고 있다. 우라실(uracil)은 상기 선택배지에 포함되어있지 않다.

세포 배양을 위해서, 고압멸균된(autoclaved) 액체배지에 저장된 효모 균주를 접종하고 실험에 따라 27℃, 37℃ 및 47℃의 진탕배양기(shaking incubator)에서 밤새 배양하였다.

한세눌라 폴리모르파 세포 배양에서 흡광도(optical density) 결정

흡광도(OD) 결정을 위해 200 ㎕의(YPD에 사용 가능하도록 적당히 희석한 것임) 배양 세포를 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)에 놓고 분광계(Anthos 2001)를 이용하여 620 nm에서 측정하였다. 200 ㎕의 YPD가 대조군(blank)으로 사용되었다.

한세눌라 폴리모르파의 성장 및 열 충격 실험(heat shock experiments)

하룻밤동안 배양된 한세눌라 폴리모르파를 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 들어있는 YPD 배지에 접종시켰다. 이 전배양(preculture)을 열 충격 실험(27℃) 및 성장 실험(27℃, 37℃ 또는 47℃)에 사용하였다.

각각의 성장 실험을 위해 OD₆₂₀ 값이 0.2인 배양세포들을 접종하여 진탕배양기에서 배양하였다. 열 충격 실험을 위해서는 OD₆₂₀ 값이 0.05인 배양세포를 접종시켰다. 이 배양세포들을 흔들리는 수조(Aquatron)속에서 47℃에 이르는 열 충격을 가하기 전에 27℃에서 OD₆₂₀ 값이 0.4(대략 1-1.5x10⁸/㎖)정도가 되기까지 성장시켰다. 두 시간 후에 샘플을 취하고, 배양 세포를 차가운 수조에 한 시간 동안 담가 27℃가 될 때까지 식혔다.

일렉트로포레이션(electroporation)을 통항 한세눌라 폴리모르파의 형질전환(transformation)

100 ㎖의 YPD 배지에 밤새 빽빽히 자란 배양세포 5 ㎖를 접종하였다. 이 배양세포를 OD₆₀₀ 값이 0.8-1.2 정도 될 때까지 37℃에서 약 3시간 동안 진탕배양 하였다. 3,000 rpm으로 원심분리하여 세포들을 수확하고 20 ㎖의 Kp_i 완충액(50 mM/pH 7.5)에 재현탁시켰다. 여기에 0.5 ㎖의 DDT를 첨가하고 37℃에서 15분간 흔들어 준 후 그 세포들을 2,500 rpm에서 원심분리하여 침전시킨 후 STM 완충액(270 mM 수크로스, 10 mM TrisCl, 1 mM MgCl₂, pH 7.5)으로 두 번 세척하였다. 그후 이 세포들을 0.25 ㎖의 STM 완충액에 현탁시키고 60 ㎕씩 분주하여 -70℃에 보관하였다. rDNA 통합벡터(integrative vector)들을 이용한 형질전환을 위해 플라스미드 DNA를 먼저 XhoⅠ 또는 SacⅠ으로 잘라 선형으로 만들었다. 0.1-1 ㎍의 선형 플라스미드 DNA를 수용세포(competent cell)과 혼합하여 2 ㎜ 큐벳(cuvette)에 넣었다. 형질전환은 2.0 ㎸, 25 ㎌ 및 200 Ohm의 진 펄서(Gene Pulser, Bio-Rad, Munich)를 이용하여 수행되었다. 그 후 세포들을 선택 배지로 옮겨 놓기 전에 회복을 위해 37℃에서 1시간 동안 1 ㎖의 YPD 배지에서 배양하였다. 37℃에서 2시간 내지 4시간 동안 배양한 후에 육안으로 확인가능한 군집(macroscopic colony)들이 형성되는 것을 확인하였다.

배지의 포도당 농도(glucose concentration) 결정

배지의 포도당 농도를 GOD 방법(GOD/POD 키트, Bohringer)으로 측정하였다. 샘플들은 물을 이용하여 1:200의 비율로 희석하였다. 190 ㎕의 1%(w/v) GOD 효소용액(enzyme solution)을 각각의 샘플 10 ㎕에 첨가하여 그 혼합물을 대략 25분 동안 27℃에서 배양하였다. 상기 키트에서 제공된 포도당 용액을 대조군(standard)으로 삼았고 여기에서도 10 ㎕(0.91 ㎍ 포도당)이 사용되었다. 분광광도계(Anthos 2001 spectrophotometer)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

트레할로스(trehalose)의 추출(extraction) 및 정량(quantitative detection)

트레할로스의 추출

유리 섬유 여과기(glass-fiber filter, Whatman GF/C)를 이용하여 1-10 ㎖의 배양세포를 여과시키고 물로 세 번 세척하였다. 이 여과기를 물 1 ㎖가 들어있는 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 놓고 30초간 볼텍스(vortex)한 후 조심스럽게 물을 제거하였다. 세포 현탁액(cell suspension)을 수조에서 10분간 끓인 후, 세포 물질(cell material)로부터 상등액(supernatant)을 완전히 분리하기 위하여 20,000 g에서 세 번 원심분리하였다.

HPLC를 이용한 트레할로스 측정(determination)

추출된 당들(extracted sugars)을 음이온 교환 칼럼(anion exchanger column, DIONEX CarboPac PA1 column, 4x250 ㎜)을 이용하여 분리하고, 금 전극(PED = pulsed electrochemical detector)상에서 전류 측정을 통해 검출하였다. 용출 변화도(eluting gradient)의 구성은 하기와 같다:

시간(분)	H2O	H2O	1 M Na-아세테이트	1 M NaOH
0.0	45%	45%	0%	10%
3.5	40%	39%	0%	21%
4.5	35%	35%	20%	10%
5.0	45%	45%	0%	10%
14.0	45%	45%	0%	10%

상기의 조건에서 트레할로스의 체류시간(retention time)은 대략 3.7분이었다. 20 ㎕의 샘플이 각 케이스마다 주입되었으며, 0.1 ㎎/㎖의 트레할로스 용액이 표준(standard)으로 사용되었다.

효소분석(enzymatic assay)을 통한 트레할로스 측정(determination)

더 비용이 많이 드는 HPLC 방법(Parrou and Francois, 1997, modified) 대신에 일부의 경우 이와 동일한 신뢰성을 갖는 효소 분석방법(enzymatic assay method)을 이용하였다: 즉, 25 ㎕의 트레할로스 추출물(trehalose extract)에 12.5 ㎕의 트레할로스 분해효소(trehalase, Sigma) 와 37.5 ㎕의 완충액(0.2 M sodium acetate, 0.03 M CaCl₂, pH 5.7)을 혼합하여 37℃의 수조속에서 5시간 동안 배양하였다. 그 결과, 트레할로스가 두 단위의 포도당으로 완전히 분해되었다. 잠깐 동안의 원심 분리를 거쳐 이 샘플들을 95℃에서 3분간 배양한 후 다시 20,000 g에서 5분간 원심 분리하였다. 트레할로스의 농도를 포도당 농도(GOD/POD kit, 위의 본문 참조)를 측정함으로써 간접적으로 측정하였다. 이렇게 얻은 상등액 10 ㎕가 본 목적을 위해 사용되었다.

단백질 측정(Protein determination)

피터슨(Peterson)의 방법에 따른 단백질 측정(Peterson, 1997)

배양세포 내의 전체 단백질 농도를 측정하기 위해 1 ㎖의 세포 현탁액(cell suspension)을 10%(w/v)의 TCA 용액 1 ㎖에 떨어뜨리고 3,000 g에서 10분 동안 원심분리 하였다. 물-제트 펌프(water-jet pump)와 연결된 파스퇴르 파이펫(Pasteur pipette)으로 상등액을 제거하고 침전물(sediment)을 1 ㎖의 1 N PCA 용액으로 세척하였다. 펠렛(pellet)을 0.8 N NaOH:10%(w/v)SDS(1:1) 용액 5-12 ㎖(실험할 배양세포의 흡광도(OD)에 따라 다름)에 부유시키고 60℃에서 적어도 한 시간 동안 배양하였다. 이 상등액 200 ㎕에 CTC 시약(10% Na₂CO₃, 0.1% CuSO₄, 5H₂ O, 0.2% KNa tartrate) 6배 희석액 600 ㎕를 첨가하였다. 정확히 10분 후, 폴린-시오칼투(Folin-Ciocalteu) 시약의 6배 희석액 200 ㎕를 첨가하고 잠깐 저어서 섞었다. 이 샘플을 30분 동안 어둠 속에 방치한 후 흡광도를 750 nm에서 측정하였으며, 이때 BSA를 표준(standard)으로 사용하였다.

브래드포드(Bradford, 1976)의 방법에 따른 단백질 측정

세포가 포함되지 않은 추출액(cell-free extract) 내의 단백질 농도를 측정하기 위하여 100 ㎕의 적당히 희석한 추출액을 물 700 ㎕와 혼합하였다. 그 후, 200 ㎕의 바이오래드 단백질 분석 시약(BioRad protein assay reagent, Bradford)을 첨가하여 잠깐 흔들어 주었다(Vortex). 흡광도를 595 nm에서 측정하였으며, 이때 BSA를 표준(standard)으로 사용하였다.

효소 활성 측정(Enzyme activity measurements)

투과세포(permeabilized cell)의 준비(preparation)

투과된 세포내의 트레할로스-6-인산 생산효소(trehalose-6-phosphate synthase, Tre-6-P synthase)의 효소 활성을 측정하였다(De Virgilio et al., 1991). 구체적으로, 1-6 ㎖의 세포들을 유리섬유 여과기(GF/C glass-fiber filters, Whatman)를 통해 여과시키고, 얼음물(ice-cold water)로 두 번 세척한 후, 1 ㎖의 라이스 완충액(lyse buffer, 0.2 M TRICIN, pH 7.0, 0.5%(v/v) Triton X-100)에 담가 볼텍싱(vortexing)함으로써 재현탁시켰다. 필터들을 제거하고 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)들을 액화 질소(liquid nitrogen)에 넣어 얼려서 -20℃에 저장하였다. 측정을 하기에 앞서, 세포들을 30℃의 수조 속에 3분간 담가 해동시켰다. 그리고 나서 이 세포들을 0.2 M 트리신(TRICIN, pH 7.0)으로 두 번 세척하고 매번 세척 후마다 4℃ 8,000 rpm(Biofuge 17RS)에서 20초간 원심분리 하였다. 마지막으로, 상기 세포들을 600 ㎕의 0.2 M 트리신(pH7.0)에 재현탁시켰다.

트레할로스-6-인산 생산효소의 활성

트레할로스-6-인산 생산효소(Tre6P synthase)의 활성은 호티거 등(Hottiger et al., 1987)의 방법에 따라 50℃에서 효소 쌍 분석(coupled enzymatic assay)에 의해 측정되었다. 이 때 60 ㎕의 투과된 세포(permeabilized cell)들이 항상 사용되었다. 포도당-6-P가 없는 기질(substrate)과 투과된 세포를 가지고 있지 않은 효소 블랭크(enzyme blanks)가 대조군으로 사용되었다.

웨스턴 블롯 분석(Western Blot analyses)

세포 파쇄(disruption)를 통한 단백질 추출

5-15 ㎖의 배양세포를 4℃ 3,000 rpm(IEC Centra GP8R)에서 5분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 세포 펠렛을 1 ㎖의 물에 현탁시키고 사스테드 튜브(Sarstedt tube, screw closure/나사모양의 폐쇄장치가 달려 있는)에 옮겼다. 10초간 원심분리 한 후, 피펫으로 상등액을 제거하고 펠렛의 무게를 측정하였다. 이때 빈 튜브의 무게는 생각지 않는다. 펠렛 1 ㎎당 1 ㎕의 0.2 M 트리신(TRICIN) 완충액(pH 7.0; 단백질 분해효소 저해제 2 tabs/25 ㎖가 포함됨)을 첨가하고 상기 펠렛을 재현탁시켰다. 유리 구슬(glass bead)을 둥근 관 안에 든 액체 표면의 요철 바로 아래까지 오도록 채워넣고 사스테드 튜브(Sarstedt tube)를 호모게나이저(cell homogenizer, Fastprep FP 120) 안에 단단히 고정시켜서 차가운 곳에 저장하였다. 상기 호모게나이저를 6.0으로 맞추어 30초 동안 두 번 작동시켜서 90% 이상의 세포를 분쇄하였다. 이후부터는 상기 샘플들을 항상 서늘하게 잘 유지하기 위해 엄격한 주의를 기울였다. 바늘(needle)을 이용해 사스테드 튜브에 작은 구멍을 만들고, 이 튜브를 유리관(glass tube) 위에서 4℃ 100 g에서 원심 분리하여 유리 구슬로부터 추출물을 분리하였다. 그리고 나서 세포 분쇄를 위해 사용했던 양의 트리신 완충액을 사스테드 튜브들에 첨가하여 다시 원심분리하였다. 불투명한 추출물(cloudy eztract)을 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)들로 옮겨서 25,000 g, 4℃(Biofuge 17RS)에서 10분씩 3회에 걸쳐 원심분리하였다. 이때 수용성 단백질(Tre6P 생산효소 포함)을 포함하고 있는 상등액이 매번 연달아 사용되었다.

샘플 준비(Sample preparation)

상기 추출물들의 단백질 농도를 브래드포드 방법으로 측정하였다. 그 결과 얻어진 농도에 따라 2.5 ㎍ 단백질/㎕가 되도록 물로 희석하였고, 5x 샘플 완충액(sample buffer) 1 부피를 상기 단백질 용액 4 부피에 첨가하였다. 그 후 이 샘플들을 95℃에서 5분 동안 변성(denature)시켜서 SDS 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 위해 즉시 사용하거나 아니면 냉동시켰다. 10 ㎕, 즉 20 ㎍의 단백질이 분석을 위해 사용되었다.

샘플 완충액(Sample buffer):

1 ㎖ 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.8 ㎖ 글리세린(glycerine), 1.6 ㎖ 10%(w/v) SDS, 0.2 ㎖ 0.05%(w/v) 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 4 ㎖ 물. 사용직전에 19 부피의 샘플 완충액을 1 부피의 머캅토에탄올(2-β-mercaptomethanol)에 첨가.

SDS-PAGE 전기영동(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)

단백질을 분자량에 따라 분리하기 위해 램리 등(Laemmli et al., 1970)의 방법이 사용되었다. 하기에 설명되어 있는 구성을 가진 10% 와 4%의 아크릴아마이드 젤(10x10 ㎝)을 각각 리졸빙 젤(resolving gel)과 스태킹 젤(stacking gel)로 사용하기 위하여 준비하였다:

리졸빙 젤(Resolving gel):

2.5 ㎖ 40% (w/v) 아크릴아마이드/비스아크릴아마이드(acrylamide /bisacrylamide), 2.5 ㎖ 1.5 M Tris-HCI, pH 8.8, 100 ㎕ 10% (w/v) SDS, 4.95 ㎖ 물, 50 ㎕ 10% (w/v) 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulphate), 5 ㎕ TEMED

스태킹 젤(Stacking gel)

1 ㎖ 40% (w/v) 아크릴아마이드/비스아크릴아마이드(acrylamide /bisacrylamide), 2.5 ㎖ 0.5 M Tris-HCI, pH 6.8, 100 ㎕ 10% (w/v) SDS, 6.4 ㎖ 물, 50 ㎕ 10% (w/v) 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulphate), 10 ㎕ TEMED

5x 전기영동 완충액(running bufer)

15 g 트리스(Tris), 72 g 글리신(glycine), 5 g SDS, H₂O를 부어 1 ℓ를 만든다. pH 값은 변동없이 8.3을 유지해야 한다.

각각의 젤에 20 ㎍의 단백질을 로딩(loading)하였다. 하기의 조성(composition)을 지닌 바이오래드(BioRad) 사의 "Kaleidoscope prestained standard"를 표준으로 사용하였다: 미오신(myosin, 204 kDa), 베타-갈락토시다제(β-gakactisudase, 121kDa), BSA(78kDa), 카보안하이드라제(carboanhydrase, 39kDa), 트립신 저해제(soy trypsin inhibitor, 30kDa).

전기영동은 200 볼트의 일정한 전압 하에서 약 1시간 동안(샘플이 젤의 하단(lower edge)까지 도달하면 그 이상 계속하면 안됨) 수행되었다. 전기영동이 끝난 후 상기 젤들을 10%(v/v) 아세틱산(acetic acid)/50%(v/v) 에탄올(ethanol)에 0.1%(w/v)의 쿠마시 블루(Coomassie Blue R250)가 들어있는 염색시약으로 염색하거나(탈색은 염색 1시간 후에 10%(v/v) 아세틱산, 20%(v/v) 에탄올로 한다), 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 블롯(blot)시킨다(다음 단락 참조).

면역블롯(Immunoblotting)

SDS-PAGE 젤들을 트랜스블롯 완충액(transblot buffer, 250 mM Tris, 1250 mM 글리신(glycine), 15%(v/v) 메탄올(methanol))가 들어있는 블로팅 유닛(blotting unit, Scieplas)의 니트로셀룰로스(nitrocellulose)위에서 40 V, 4℃에서 1시간 15분 동안 블로팅하였다.

면역 염색(Immune staining)

니트로셀룰로스 막(nitrcellulose membrane)을 적어도 한 시간 동안 포화 용액(saturation solution, 3%(w/v) BSA in TBS(TBS:20 mM Tris, 500 mM NaCI, pH 7.5))에 담가 두었다가, TTBS(TTBS: TBS와 같지만 0.05%의 트윈(Tween)-20이 더 포함되어 있음)를 이용하여 5분간 세척하였다. 니트로셀룰로스 막에 존재하는 한세눌라 폴리모르파의 Tps1 단백질(Tps1p)과 결합시키기 위하여 다클론 항-Tps1 토끼 항체(Polyclonal anti-Tps1 rabbit antiboy, 1%(w/v)BSA가 포함된 TTBS로 1:50으로 희석한 것)(Eurogentec, Belgium)를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

이어서, 니트로셀룰로스 블롯을 TTBS로 5분 동안 두 번 세척한 후, 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)와 결합된 단클론 항-토끼 항체(monoclonal anti-rabbit antibody, 1%(w/v)BSA가 포함되어 있는 TTBS로 1:10,000 희석한 것)를 첨가하여 1시간 30분 동안 배양하였다. 그 후 TTBS를 가지고 5분 동안 두 번 세척해주고, 다시 TBS를 가지고 5분 동안 한번 세척하였다. 밴드들에 대한 염색을 확실하게 하기 위하여, 1 ㎖의 10x 발색 완충액(color development buer, 100 mM Tris-HCI, pH 9.5, 1 mM MgCl)을 물과 1대 10으로 섞어 희석하고 45 ㎕의 NBT(75 ㎎/㎖ 70%(v/v) DMF)와 35 ㎕의 X-인산(50 ㎎ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidinium salt/ml DMF)을 첨가하였다. 니트로셀룰로스 막을 상기 혼합액과 함께 20분간(혹은 밴드들이 눈으로 분명하게 볼 수 있을 만큼 선명해 질 때까지) 어둠 속에서 배양한 후 물로 세척하여 반응을 중단시켰다.

한세눌라 폴리모르파 세포에 대한 콜로니 PCR

헉슬리 등(Huxley et al., 1990)의 방법을 약간 수정하여 콜로니 PCR을 수행하였다: 각각의 콜로니들을 황색 팁(yellow pipette tip)을 이용하여 모으고 PCR 튜브 속으로 긁어 넣었다. 상기 튜브를 전력으로 가동시킨 마이크로웨이브 오븐(microwave oven)에 넣고 2분간 가열하였다. 그 후 25 ㎕의 PCR 반응액(0.2 ㎕ Taq polymerase, 2.5 ㎕ 10x PCR buffer, 2.5 ㎕ 25 mM MgCl₂, 0.5 ㎕ 10 mM dNTP, 각 프라이머의 최종농도는 0.5 uM로 하고 물을 첨가하여 총 25 ㎕로 맞춘다.)을 각 튜브에 넣고 세포들을 재현탁 시켰다. 상기 튜브들을 92℃로 예열된 PCR 장치에 넣고 PCR 반응을 시작하였다.

노던 블롯 분석(Northern blot analysis)

파이퍼(Piper, 1994)의 방법을 약간 수정하여 한세눌라 폴리모르파의 RNA를 추출하였다. 구체적으로, 40 ㎖의 대수증식기(logarithmic) 세포 또는 20 ㎖의 정지기(stationary) 배양 세포를 모으고(열 충격 실험에서) 얼음같이 찬 멸균된 DEPC 물을 첨가하여 즉시 냉각시켰다. 그후 상기 세포들을 원심 분리를 이용해 침전시키고 다시 멸균된 DEPC 물로 세척하였다. 원심 분리 후 상등액을 따라 버리고 난 후 얻어진 펠렛(pellet)을 -20℃에 보관하였다. 상기 펠렛을 녹인 후 1-2 g의 유리 구슬(glass beads)과 2 ㎖의 RNA 추출 완충액(extraction buffer, 20 mM Tris-HCI, pH 8.5, 10 mM Na₂-EDTA, 1% 〔w/v〕SDS) 및 2 ㎖의 페놀(phenol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 중간에 멈춤 없이 5분간 볼텍싱(vortexing)한 후, 3,500 rpm(IEC Centra GP8R)에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 페놀/클로로포름(phenol/chloroform)이 동일한(1:1) 양으로 들어 있는 새로운 튜브로 옮기고 1분간 볼텍싱한 후 3,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 그 상등액을 같은 양의 클로로포름이 들어 있는 새 튜브로 옮겼다. 이를 다시 1분간 볼텍싱한 후 3,500 rpm에서 2분간 원심분리하였으며 그 상등액을 15 ㎖ 코렉스 튜브(Corex tube)에 옮겨 담았다. 최종 농도 1 M의 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)에 6 M의 ammonium acetate를 첨가하고 또한 2 부피의 에탄올(차게 식힌 것)을 더하여서, 그 튜브를 -20℃의 냉동고에 적어도 20분 이상 넣어두었다. 그 후 7,500 g, 4℃에서 15분간 원심분리함으로써 RNA를 침전시켰다. 상등액은 가만히 따라 버리고 튜브는 흡수지 위에 놓고 건조시켰다. 펠렛을 1 ㎖의 TE 속에 현탁시키고 2.5 부피의 차가운 에탄올과 3 M의 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 7,500 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리한 후 펠렛을 차가운 70%(v/v) 의 에탄올로 세척하고 실온에서 건조시켰다. 최종적으로 RNA를 400 ㎕의 TE에 재현탁시켰다.

샘플 준비

노던 블롯 분석(Sambrook et al.)을 위해 샘플 당 50 ㎍의 RNA를 스피드백(SpeedVac)을 이용하여 10-15분 동안 건조시켰다. 이 RNA를 50 ㎕의 샘플 완충액(최종 농도: 20 mM MOPS, pH 7.0, 0.05 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate), 1 mM EDTA, pH 8.0, 2.2 M 포름알데하이드(formaldehyde), 50% 〔v/vl〕 포름아마이드(formamide))에 재현탁시키고 55℃에서 10분간 가열하였다. 마지막으로, 5.5 ㎕의 RNA가 들어 있는 완충액(10x)과 1 ㎕의 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액(1 ㎕/㎖)을 각 샘플에 첨가하였다.

예비 젤 및 본 젤(Pre-gel and main gel)

추출된 RNA의 완전성(integrity)과 로딩 양을 결정하기 위하여 예비 젤(pre-gel, 40 mM MOPS, pH 7.0, 10 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate), 2 mM EDTA, pH 8.0을 포함하고 있는 MOPS 완충액에 1%〔w/v〕아가로스(agarose)와 0.65 M 포름알데하이드(formaldehyde)를 넣은 것)이 사용되었다. 주 전기영동(main gel electrophoresis, 본 젤(main gel)의 조성은 예비 젤과 동일)은 전기영동 완충액(running buffer)으로 MOPS 완충액을 사용하여 80 V에서 34시간 동안 수행되었다.

블로팅(Blotting)

젤들을 10xSSC(1.5 M NaCl, 170 mM 소듐 사이트레이트(sodium citrate))에 담가 20분 동안 2회 세척하였다. RNA를 캐필러리 트랜스퍼(capillary transfer, 트랜스퍼 완충액(transfer buffer)으로 20xSSC를 사용)에 의해 밤새 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane, BA 83)위로 블로팅시켰다. 니트로셀룰로스 막을 6xSSC로 세척하고 3 MM 여과지들(filter papers, Whatman) 사이에 놓고 80℃의 진공 오븐에서 2시간 동안 구워 RNA가 니트로셀룰로스 막에 고정되도록 하였다.

혼성화(Hybridization)

니트로셀룰로스 막을 10 ㎖의 RNA 혼성화 용액(hybridization solution, 0.5 M NaHPO₄, pH 7.2, 1 mM EDTA, 1%〔w/v〕BSA, 7%〔w/v〕SDS)에 담아 특수 오븐(Hybaid)에 넣고 60℃에서 5시간 동안 예비-혼성화시켰다. 본격적인 혼성화 단계(main hybridization stage)에서는 10 ㎖의 RNA 혼성화 용액에 150 ㎕의 방사성 탐침(radioactive probe, 대략 1 x 10⁷ cpm)을 첨가하여 그 속에 막을 넣어 60℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 마지막으로, 잔여 방사성을 60℃에서 300 ㎖의 세척 완충액(washing buffer, 1 mM EDTA, 40 mM Na₂HPO₄, pH 7.2, 1%〔w/v〕SDS)으로 15분간 두 번 세척하여 제거하였다. 니트로셀룰로스 막을 바이오맥스 필름(BioMax film)에 노출시켰다.

피타제의 검출(Phytase detection)

하룻 밤 동안 배양한 3 ㎖의 한세눌라 폴리모르파 배양액으로부터 세포들을 수확하여 1 ㎖의 5% 글리세린(glycerine)이 포함된 200 ㎕의 YNB 배지에 현탁시켰다. 이를 1-2일 정도 성장시킨 후, OD₆₀₀을 측정하였다. 그 후 세포들을 원심분리를 이용하여 침전시키고 25 ㎕의 상등액을 하기 실험에 사용하였다. 상기 25 ㎕의 상등액에 25 ㎕의 5 M NaAc 및 50 ㎕의 니트로페닐 포스페이트(4-nitrophenyl phosphate)를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 상기의 효소 전환(enzymatic conversion) 반응을 100 ㎕의 15% 트리클로로 아세트산(trichloroacetic acid)을 첨가함으로써 정지시켰다. 100 ㎕의 1 M NaOH를 상기 혼합물에 첨가하면 양성을 나타내는 배양액의 상등액 샘플은 짙은 노란색을 띄게 되는데, 이때 노란색의 정도를 광도계(photometer)를 이용하여 OD₄₀₅에서 측정하였다.

X-gal 오버레이 분석(overlay assay)-β-갈락토시다제(galactosidase)의 검출

실험하게될 균주(strain)들을 37℃에서 4-6시간 동안 선택 배지(selective medium)에서 배양하였다. 각 배양액 4 ㎕을 선택 플레이트(selective plate)에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 플레이트에 신선한 탑 레이어 아가(top layer agar, 0.5% 아가로스(agarose), 0.5 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7); 0.2% SDS; 2% DMF(dimethyl formamide) 2 ㎎/㎖ X-gal(o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside))를 70℃에서 코팅하였다. 몇분 후, lacZ 발현이 일어난 클론들이 푸른색을 띄는 것을 관찰하였다.

<실시예 1> 한세눌라 폴리모르파의 TPS1 유전자 클로닝

<1-1> 방사성 TPS1 탐침(probe)의 제조

사카로미에시스 세레비시애(S. cerevisiae) 에스 폼베(S. pombe), 케이 락티스(K. lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 에이 니거(A. niger, 도 6 참조) 들의 TPS1 유전자로 알려진 서열을 비교하여, 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha)의 게노믹(genomic) DNA를 가지고 PCR(각 각 92℃에서 1분, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분을 포함하는 30 사이클(cycle)로 구성)하는 동안 약 650 bp의 단편(fragment)을 증폭하는, 두 개의 매우 보존적인 지역(highly conserved regions)으로부터 두 개의 퇴화 프라이머(degenerated primers)를 제조하였다. 이들 두 개의 프라이머의 서열은 하기와 같다:

F1(전위 프라이머): 5'TGGCCVYTNTTCCAYTACCATCCYGG3' (서열번호 9)

R1(후위 프라이머): 5'GGCRTGBAAYTTYTGHGGHACACC3' (서열번호 10)

B = C, G, T H = A, C, T R = A, G

V = A, C, G N = A, C, G, T Y = C, T

PCR 산물(product)을 1%(w/v) 아가로스 젤에 로딩하고 전기영동하였다. 650 bp 밴드를 잘라내어 젠클린 키트(Geneclean Ⅱ kit, Bio 101, Vista, USA)를 이용하여 추출하고 방사성 ??α-³²P??-dCTP로 표지하였다. 상기 표지에는 프라임-잇 키트(Prime-it Ⅱ kit)가 사용되었고, 정제(cleaning)에는 누크트랩 칼럼(NucTrap columns)이 사용되었다. 상기와 같이 제조된 방사성 탐침(probe)은 한세눌라 폴리모르파의 TPS1을 스크린하기 위해, 그리고 노던 블롯 분석을 위해서 사용되었다.

<1-2> 한세눌라 폴리모르파의 게노믹 DNA 라이브러리

본 발명에서 사용된 게노믹 DNA 라이브러리(genomic DNA library)를 사용 가능케 만든 사람은 힐브란드(R. Hilbrands, University of Groningen, Netherlands)이다. 게노믹 DNA 라이브러리의 준비는 만일 단편들이 대략 2 kb 혹은 그 이상이 된다면 그다지 문제될 것이 없다. 길이가 2-5 kb인 한세눌라 폴리모르파의 게노믹 DNA 단편들을(이 길이의 대 여섯 배가 될 수도 있다) pHRP2(7813bp)의 BamHl 제한효소 부위(restriction site)안으로 삽입시켰다. 상기 플라스미드(Faber et al., 1992)는 ori(replication origin) 및 항-앰피실린 유전자(ampicillin-resistance gene)를 포함한다. 한세눌라 폴리모르파의 형질전환을 위해서는 HARS1(H. polymorpha autonomously replicating sequence) 서열 및 사카로미에시스 세레비시애에서와 한세눌라 폴리모르파에서 마찬가지로 마커(marker)의 역할을 하는 사카로미에시스 세레비시애의 LEU2 유전자가 중요하다. 상기의 라이브러리에는 20,000개 정도의 서로 다른 클론들이 포함되어 있다.

<1-3> 대장균( E. coli )의 형질전환

게노믹 DNA 라이브러리를 이용한 대장균(E. coli)의 형질전환이 일렉트로포레이션(electroporation, Sambrook et al., 1989)에 의해 수행되었다. 대장균 세포들을 50 LB+Amp(75 ㎎/ℓ) 플레이트에 플레이트 당 2,000- 4,000개의 콜로니를 가지도록 접종한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

<1-4> 한세눌라 폴리모르파 TPS1 유전자의 스크리닝

각 콜로니의 DNA를 분석하기 위하여 니트로셀룰로스 막들을 플레이트들 위에 조심스럽게 놓았다(Sambrook et al., 1989). 가는 바늘을 사용하여 막과 젤을 통해 비대칭적인 4개의 구멍을 만들었다. 이 구멍들은 나중에 다시 재생산될 수 있도록 막들을 플레이트 위의 정 위치에 놓기 위한 마커(marker)로서 작용한다. 막들을 분리하였을 때, 플레이트상의 콜로니들은 막에도 복제되어 있었다.

3 MM 흡수지(absorbent paper, Whatman)를 포함하는 4개의 플라스틱 접시를 준비하여 4개의 각기 다른 용액으로 각 접시를 적시고, 잉여 용액은 버렸다. 먼저, 니트로셀룰로스 막들을 10% (w/v) SDS 용액으로 적셔진 흡수지 위에 3분 동안 놓아두었다(콜로니들을 위로 향하게 놓아둠). 그리고 나서 이 막들을 변성 용액(denaturing solution, 0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl)으로 적신 두 번째 접시로 옮겨 5분 동안 놓아두었다. 다시 이 막들을 차례로 중화 용액(neutralizing solution, 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCI, pH 7.4)과 2xSSC 용액(10xSSC 1.5 M NaCl, 170 mM 소듐 사이트레이트(sodium citrate))을 적신 흡수지 위에 각 5분씩 놓아두었다. DNA를 니트로셀룰로스 막에 고정시키기 위해, 각각의 막을 두 개의 3MM 흡수지 사이에 놓고 2시간 동안 80℃의 진공 오븐에서 구웠다. 그리고 나서 이 막들을 2xSSC 용액에 5분간 적셔두었다가 50℃의 전세척액(prewash solution, 5xSSC, 0.5%〔w/v〕SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 30분 동안 담가두었다. 젖은 크리넥스를 이용하여 잔여분의 세균 물질(bacterial material)들을 제거한 후, 막들을 2시간 동안 68℃의 예비 혼성화 용액(pre-hybridization solution, 6xSSC, 0.25%〔w/v〕의 스킴-밀크 분말(skim-milk powder))에 담가두었다. 본격적인 혼성화를 위해, 대략 1x10의⁷ cpm의 방사성 TPS1 탐침("방사성 TPS1 탐침의 제조" 부분 참조)을 40 ㎖의 예비 혼성화 용액에 첨가하고, 니트로셀룰로스 막들을 68℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 막들을 2xSSC, 0.1%(w/v) SDS 용액으로 간단히 세 번 세척한 후 68℃에서 1시간 동안 1xSSC, 0.1%(w/v) SDS 용액으로 다시 세척하였다. 그 후에 막들을 건조시켜 바이오맥스 필름(BioMax film)에 노출시켰다. 인화된 필름 위에 나타난 표시(signal)를 관찰하여, 플레이트 상에서 양성 반응을 보이는 8개의 콜로니를 수득하고 이들을 저장하였다. 상기 콜로니들로부터 플라스미드를 추출하였다. 실제로 650 bp 단편이 나타났는지를 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다.

<실시예 2> 한세눌라 폴리모르파 TPS1 유전자의 서열 결정(sequencing)

<2-1> 플라스미드 분리

서열 결정을 위하여, 650 bp 단편 내부에서 얻은 프라이머(F4 및 R4, 표 1)와 인서트(insert)쪽의 플리스미드(Plasm. F 및 Plasm. R, 표 1)를 가지고 PCR을 수행하여 가능한 큰 밴드를 형성하는 두 개의 콜로니를 선택하였다. 상기의 두 콜로니(Nos.20.1 및 21.3)로부터 플라스미드 미디 키트(Plasmid Midi Kit, Qiagen)를 이용하여 순수한 플라스미드 추출물을 수득하였다.

<2-2> 서열 결정

서열결정 프로그램(cyclical sequencing program, PCR apparatus: Progene) 및 ABI 301 자동 서열결정장치(automatic sequencer, Perkin Elmer)를 사용하여 서열결정을 수행하였다. 서열결정에는 0.5 ㎕(0.5 ㎍)의 플라스미드 DNA, 1 ㎕의 프라이머(최종 농도 0.5 uM), 4 ㎕의 반응 혼합물(reaction mixture, DNA sequencing kit) 및 4 ㎕의 물이 사용되었다. 상기에 이용된 서열결정 프로그램(sequencing program)은 96℃에서 30초, 50℃에서 15초, 60℃에서 4분으로 구성된 27회의 사이클(cycle)을 포함하고 있다. 반응 중에 10 ㎕의 물을 첨가하고, 소듐 아세테이트(sodium acetate)와 에탄올(ethanol)을 이용하여 DNA를 침전시킴으로써 상기 프로그램을 종료시켰다. 펠렛(pellet)을 1 ㎖의 차가운(ice-cold) 70%(v/v) 에탄올로 두 번 세척한 후, DNA를 잠시 동안 건조시키고 25 ㎕의 TSR(template suppressing reagent, DNA Sequencing Kit)에 재현탁시켰다. 이를 2분간 배양하여 ABI 301 자동 서열결정장치를 위한 샘플의 준비를 완료하였다.

클론 N0.21.3으로부터 얻은 플리스미드의 서열결정에 사용된 프라이머들을 하기 표 1에 나타내었다. 프라이머들은 "급속핵산합성(Expedite^TM Nucleic Acid Synthesis)" 장치의 FMI에서 준비되었다. 서열들은 GCG 프로그램(Devereux et al., 1984)을 이용하여 분석되었다.

명칭	방향(Direction)	길이(bp)	서열
F3	전위(Fowards)	23	서열번호 11
F4	전위	23	서열번호 12
F6	전위	22	서열번호 13
F7	전위	22	서열번호 14
F8	전위	21	서열번호 15
F9	전위	22	서열번호 16
F10	전위	26	서열번호 17
F11	전위	27	서열번호 18
R3	후위(Backwards)	21	서열번호 19
R4	후위	23	서열번호 20
R5	후위	23	서열번호 21
R6	후위	22	서열번호 22
R7	후위	23	서열번호 23
R8	후위	21	서열번호 24
R9	후위	25	서열번호 25
PlasmF	전위	24	서열번호 26
PlasmR	후위	26	서열번호 27

한세눌라 폴리모르파로부터 분리한 프로모터와 그의 활동 양식(mode of action)을 하기에서 자세히 설명하였다. TPS1의 발현을 조절하는 이 프로모터에 대한 연구는 어떤 특정 상태에서의 TPS1 mRNA의 증가를 측정함으로써 이루어졌다. 연구 결과 이 프로모터는 저온에서는 한세눌라 폴리모르파의 TPS1이 적게 발현된 반면에 고온에서는 발현이 크게 증가하였는데, 이는 앞서 설명한 열 충격 유도 프로모터의 경우보다도 훨씬 큰 증가임이 밝혀졌다(도 3의 A, Northern blot of the heat shock). 열에 의해 유도된 TPS1 mRNA의 증가는 Tps1 단백질의 증가(도 3의 B), 및 트레할로스-6-인산 생산효소(trehalose-6-phosphate synthase)의 활성도(activity) 증가, 그리고 세포 내의 트레할로스(trehalose) 농도(도 3의 C)와 서로 상관관계가 있다. 열에 의한 영향(thermal influence)을 최적화하기 위하여, 상기 프로모터를 가능한 한 짧게 만들고 HSE를 포함하고 있는 다른 단편들과 결합시켰다.

열 유도 이외에, 포도당 결핍(glucose deprivation)에 의한 트레할로스의 축적도 관찰해 본 결과, 예상했던 것과 같이 이들 두 스트레스 인자들 사이에는 긴밀한 생물학적 관계(도 4의 A)를 보였다. 트레할로스의 축적은 트레할로스-6-인산 생산효소의 활성도 증가 및 TPS1 mRNA의 증가(도 4의 B), 그리고 포도당 결핍시에 Tps1 단백질의 증가와 함께 관찰된 트레할로스 축적의 증가 등과 상호 관련이 있다(도 4의 C).

TPS1 mRNA의 축적이 극도로 많은 경우는 TPS1 mRNA가 매우 안정적인 상태임을 말해준다. 이점은 프로모터의 분리를 위해 아주 유용한 도구로서 작용할 뿐만 아니라 열과 수분 결핍과 같은 스트레스 상황에 대하여 유기체(organism)를 보호하는 매우 가치있는 수단이 되기도 한다. 적합한 프로모터들과 벡터들(예를 들어 WO 93/17093 및 WO 96/00789에서 설명된)과 함께 제공된 TPS1 DNA는 수분 부족으로부터 식물을 보호하는데 사용 가능하기 때문에 보다 따뜻한 지역 및 강수량이 적은 지역에서의 식물 재배를 가능하게 해준다. TPS1 DNA 뿐만 아니라 이와 관련된 다른 DNA도 물론 이 목적을 위해 이용 가능하다.

<실시예 3> FMD 및 TPS1 프로모터의 조절을 받는 세균 lacZ 유전자의 비교 발현(comparative expression)

한세눌라 폴리모르파의 통합 벡터(integrative vector) pC 11(도 7)에 기초하여, lacZ 리포터 유전자(reporter gene) 앞에 있는 프로모터만 서로 다른 두 개의 유도체(derivative)를 제조하였다. pC11-FMD(도 8)의 경우, lacZ 유전자는 이미 그 특징이 잘 알려진 FMD 프로모터의 조절을 받는다. pC11-TPS1(도 9)의 경우에는 본 발명의 열-유도 프로모터의 조절을 받는다. 이 실험의 목적을 위해, 서열번호 1에 제시된 서열 중 뉴클레오티드 228과 792 사이의 단편(이하, "TPS1 프로모터"라 한다)이 열-유도 프로모터로서 사용되었다.

한세눌라 폴리모르파 RB11 균주가 pC11-FMD 및 pC11-TPS1(재료 및 방법에서 언급됨)에 의해 형질전환 되었다. 플라스미드가 숙주 게놈에 안정적으로 통합된 균주에서는 형질전환체 당 대략 1,000개의 우라실-프로토트로픽(uracil-protophic) 세포 클론이 생산되었다. 이 경우 그 과정은 하기과 같다: 형질전환 후, 그 세포들을 선택 배지를 포함한 플레이트 상에 접종하였다. 3일 후 육안으로 구별이 가능한 분리된 콜로니들을 관찰할 수 있었다. 두 경우 모두, 1,000개의 분리된 콜로니들을 멸균상태에서 새로운 선택 배지로 옮겨서 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 상기 과정을 두 번 더 반복하였다(passaging). 그리고 나서 세포 클론들을 완전 배지 플레이트(full medium plates)로 옮겨서 다시 37℃에서 2일 동안 배양하였다(stabilization). 마지막으로, 잔여 플라스미드(free plasmid)를 제거하기 위해 세포 클론들을 다시 선택 플레이트로 옮겼다. 이들 플레이트를 37℃에서 2일 동안 배양하여 균주의 생산을 완료하였다. 각 균주 내의 플라스미드들의 복제된 정확한 수(copy number)와 위치(integration loci)는 알 수 없었으나, 생산된 다양한 균주들은 이 점에 관해서는 분명히 모두 달랐다(Gatzke et al., 1995).

복제된 수와 게놈상의 환경(genomic envionment)은 모두 유전자의 전사율(transcription rate)에 크게 영향을 미치기 때문에, 각각의 세포 클론들의 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)의 활성도 역시 서로 상당히 다를 것이라고 생각된다. 이 사실은 실험을 통해 입증되었다(자료는 여기에 나와있지 않음). 따라서 각각의 균주를 가지고 프로모터들의 강도(strength)를 직접적으로 비교하는 것은 불가능하다. 그럼에도 불구하고 객관적인 프로모터 연구를 위하여, 독립적으로 생산된 500개의 균주를 서로 결합시켜, 복제수(copy number)와 위치(integration loci)를 고려한 대표적 균주 혼합물(representative strain mixture)이 만들어졌다. 균주 생산을 위해 사용된 pC11-FMD 플라스미드와 pC11-TPS1 플라스미드는 lacZ 유전자 앞에 위치한 각각의 프로모터만 제외하고는 동일하기 때문에 이들은 동일한 방법으로 수주 게놈(host genome)에 통합될 것이라고 가정할 수 있다. 상기 가정은 다음의 실험을 통해 사실로 입증되었다: 즉, 동일한 형질전환으로 얻어진 다양한 균주 혼합물들을 관찰한 결과 이들은 서로 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성에 있어서만 약간의 차이가 있었음을 확인하였다. 따라서 거의 동일한 플라스미드의 변형으로 생긴 균주 혼합물의 베타-갈락토시다제 활성을 측정함으로써 한세눌라 폴리모르파 프로모터들의 객관적 비교가 가능하다.

FMD 또는 TPS1 promoter의 조절을 받는 lacZ의 활성을 3가지 다른 탄소원(carbon source) 및 3가지 다른 온도에서 측정하였다(도 10). 즉, 상기에서 언급한 균주 혼합물을 10 ㎖의 선택 배지에서 OD₆₀₀ 값이 5가 되도록 배양한 후, 세포 추출물(cell extract)들을 가려내고, 이들의 베타-갈락토시다제 활성을 액체배지(liquid media)에서 ONPG 측정 방법으로 측정하였다. 그 과정은 다음과 같다: 원하는 농도에 도달하기 위하여, 배양 세포들을 4℃에서 10분간 원심분리 하고, 세포 펠렛을 10 ㎖의 lacZ 완충액(50 mM sodium phosphate buffer, pH 7, 10 mM KCI, 1 mM MgSO₄)으로 세척하고, 이를 다시 500 ㎕의 lacZ 완충액에 재현탁시킨 후 1.5 ㎖의 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)들로 옮겼다. 직경 0.45 ㎜인 유리 구슬(glass beads)을 현탁액에 첨가하고(튜브 안 액체 표면의 요철(meniscus)부분까지) 그 후에 그 세포들을 비브락스(Vibrax, Janke & Kunkel; 4℃, 2,200 rpm에서 6분)에 넣어 분쇄시켰다. 세포파쇄물(cell lysates)은 원심분리(bench centrifuge ; 4℃, 10분)를 통하여 제거되었다. 수용성 분획(soluble fraction)은 베타-갈락토시다제 활성 및 총 단백질 함유량 측정을 위해 사용되었다. 베타-갈락토시다제 활성의 측정을 위해, 1 ㎖의 ONPG 용액(4 ㎎ ONPG/㎖ lacZ 완충액)을 수용성 분획의 다양한 희석액에 첨가하고, 각각의 혼합물을 1 ㎝의 플라스틱 큐벳(plastic cuvette)으로 옮겼다. ΔE 측정을 위해 3분 동안 30초 간격으로 OD₄₂₀을 측정하였다. 총 단백질 양을 측정하기 위해서는 790 ㎕의 H₂O를 10 ㎕의 각 수용성 분획과 혼합하고(단백질 양에 따라 1:10, 1:5, 1:2로 희석하거나 또는 희석하지 않음), 200 ㎕의 브래드포드 시약(Bradford reagent, Biorad)을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 배양시킨 후, 광도계를 이용하여 OD₄₉₀을 측정하고 세포 추출물 대신 lacZ 완충액을 포함하고 있는 대조군(control sample)에 맞게 조절하였다. 세포 추출물 내의 단백질 농도는 BSA 보정곡선(calibration curve)을 이용하여 흡수된 정도를 알아봄으로써 측정하였다. 특정 베타-갈락토시다제의 활성을 하기의 계산식(formula)에 따라 계산하였다.

부피 활성도(Volume activity, mU/㎖)=ΔE V/εdv 총단백질(total protein)

V : 총 부피(total volume), v : 시료 부피(sample volume),

E : 흡광계수(extinction coefficient, 0.0045 mM ㎝),

d : 층 밀도(layer density, 1 ㎝)

FMD 프로모터는 일차적으로 탄소원의 종류에 따라 영향을 받는 것으로 알려져 있다; 온도의 영향에 대해서는 아직 설명되지 않고 있다(EP patent No. 299108). 상기 사항은 본 발명의 실험에 의하여 확인되었다(도 10의 A). 베타-갈락토시다제는 포도당 조건(glucose condition, glucose repression)에서는 낮은 활성을 보인 반면, 글리세린(glycerine)이나 메탄올(methanol) 조건(derepression 또는 induction)에서는 상당히 높은 활성을 보인 것으로 측정되었다. 베타-갈락토시다제의 활성은 30℃와 37℃에서는 낮았지만, 44℃에서는 극적으로 증가하였다(도 10의 B). 이런 온도에 따른 프로모터 활성의 증가는 메탄올 조건(methanol condition)에서는 일어나지 않는데(도 10의 B), 이 현상은 아직 설명되지 않고 있다. 놀랍게도, TPS1 프로모터에서 측정된 베타-갈락토시다제의 최대 활성은 FMD 프로모터에서의 활성보다도 훨씬 높았다(도 10의 A 및 도 10의 B).

<실시예 4> FMD 및 TPS1 프로모터의 조절을 받는 피타제 유전자(phytase gene)의 비교 발현(comparative expression)

기존의 방법에 따라 벡터 pTPS1ConphysMT 및 pFMTConphysMT를 가지고 형질전환을 수행하여 재조합 균주(recombinant strains)를 제조하였다. 발현 카세트(expression cassette)의 프로모터를 제외하고는 형질전환에 사용된 두 벡터들은 동일하다. pTPS1ConphystMT에 포함된 열-유도 프로모터(heat-inducible promoter)는 3'말단이 EcoR1 제한효소 부위(restriction site)를 가지고 있는, 서열번호 1에 속한 뉴클레오티드 228과 792 사이의 서열과 상응하는 단편인 반면(이하, "TPS1 프로모터"라 칭함), pFMTConPhysMt는 FMD 프로모터를 포함하고 있다. 벡터 pTPS1ConphysMT의 플라스미드 지도(plasmid map)와 뉴클레오티드 서열을 도 11에 나타내었다. 피타제(phytase)의 돌연변이 단백질(mutein)이 리포터 유전자(reporter gene)로서 사용되었다.

일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 형질전환시킨 후, 선택 배지 위에서 적어도 80 세대에 걸친 형질전환에 의해 생산된 우라실-프로토트로픽 클론(uracil-prototrophic clones)을 성장시켜서 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주를 얻었다(Gatzke et al., 1995). 두 가지 균주 집합체들의 대표적인 형질전환체들을 3 ㎖ 배양액에서 각기 서로 다른 조건하에서 배양하였다. 배양은 2% 포도당(glucose) 또는 5% 글리세린(glycerine)이 첨가된, pH 5.0의 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer)으로 조절된 YNB 배지를 이용하여 수행되었다. 48시간 동안 배양한 후 "재료 및 방법(Materials and Methods)" 항에서 설명한 방법에 따라 배양 상등액 내의 분비된 피타제(phytase)의 양을 측정하였다.

온도	FMD Conphys	TPS1 Conphys
	㎎/ℓ OD600 ㎎/OD	㎎/ℓ OD600 ㎎/OD
37℃	2.183 1.4531.500	2.206 1.1041.840 글리세린 2.028 0.6263.240 포도당
40℃	0.916 0.6181.480	1.336 0.6971.920 글리세린 2.379 0.4485.300 포도당
44℃	0.706 0.7740.910	1.219 0.6711.820 글리세린 1.394 0.4183.330 포도당

본 발명에서는 TPS1 프로모터를 지금까지 가장 널리 사용되어온 프로모터인 FMD 프로모터와 비교하였다. FMD 프로모터에 비해 TPS1 프로모터를 사용한 경우 37℃에서 발현 수준이 약간 증가된 결과를 낳았다. 40℃와 44℃에서는 TPS1 프로모터를 사용한 결과 FMD 프로모터를 사용했을 때 보다 두배 내지는 세배나 높은 발현을 관찰할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 열-유도 프로모터(heat-inducible promoter)는 하나 또는 그 이상의 단백질을 재조합 방법으로 생산하는데 널리 이용될 수 있다.

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Leu Pro Ser Leu Leu Arg Asp Gln 145 150 155 160 Leu Asn Ser Lys Gly Leu Pro Asn Val Lys Ile Gly Phe Phe Leu His 165 170 175 Thr Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Ile Leu Pro Val Arg Lys 180 185 190 Glu Ile Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Phe His Thr 195 200 205 Tyr Asp Tyr Val Arg His Phe Leu Ser Ser Val Glu Arg Ile Leu Lys 210 215 220 Leu Arg Thr Ser Pro Gln Gly Val Val Tyr Asn Asp Arg Gln Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ala Tyr Pro Ile Gly Ile Asp Val Asp Lys Phe Leu Asn Gly 245 250 255 Leu Lys Thr Asp Glu Val Lys Ser Arg Ile Lys Gln Leu Glu Thr Arg 260 265 270 Phe Gly Lys Asp Cys Lys Leu Ile Ile Gly Val Asp Arg Leu Asp Tyr 275 280 285 Ile Lys Gly Val Pro Gln Lys Leu His Ala Phe Glu Ile Phe Leu Glu 290 295 300 Arg His Pro Glu Trp Ile Gly Lys Val Val Leu Ile Gln Val Ala Val 305 310 315 320 Pro Ser Arg Gly Asp Val Glu Glu Tyr Gln Ser Leu Arg Ala Ala Val 325 330 335 Asn Glu Leu Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly Thr Val Glu Phe 340 345 350 Val Pro Ile His Phe Leu His Lys Ser Val Asn Phe Gln Glu Leu Ile 355 360 365 Ser Val Tyr Ala Ala Ser Asp Val Cys Val Val Ser Ser Thr Arg Asp 370 375 380 Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Tyr Ile Ala Cys Gln Gln Asp Arg 385 390 395 400 Lys Gly Ser Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser Leu 405 410 415 Asn Gly Ala Leu Val Val Asn Pro Trp Asn Thr Glu Glu Leu Ser Glu 420 425 430 Ala Ile Tyr Glu Gly Leu Ile Met Ser Glu Glu Lys Arg Arg Gly Asn 435 440 445 Phe Gln Lys Met Phe Lys Tyr Ile Glu Lys Tyr Thr Ala Ser Tyr Trp 450 455 460 Gly Glu Asn Phe Val Lys Glu Leu Thr Arg Val 465 470 475 <210> 8 <211> 2695 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 8 cttaaatacc acaataggaa aattatcaat aaagcttttc ggatttcatt acgttatatc 60 gcaaaaaaat agtcgagctt tctgaaccgt tcgttaataa aaaaatagtt ttttcagatt 120 tctatgtgag gcagtcacga tagaattcca tcgaactcgt cagcgccaaa tgtgaatgcg 180 gctttcaaaa gctttgtcga atttgggatg ggaatccatg aatcgaagat gtcaaaatgg 240 gggatcacaa aagtacactc acgaggaaaa tcaaaacctt ctcgtacctt taacacatac 300 ggaaatgatc gatcgatttg agaagattcc tcaatgattt tcgtcatata taggtatctg 360 aggtatttat ggaccgattc gtaataacat catatacatc gcgctttgtc cctgtcccag 420 agatttcgat gaaaaaagcg aattttattc taatatttga agcatgccaa acatggggca 480 gttgatttgt gtgagggtaa aatatcatga attgcaccca tcaaatgcag caagatattg 540 accaatccta taatagaaaa cagacttacc acaaatagat tgtgatgacg atattatgaa 600 tctccagatg aaaggctcga aagctatgaa gcctcttgaa acttttcatg gtgagataat 660 attttcgaaa tttccacgaa cttctaaaac gcaattattg aatataaagg aaaaataata 720 tttccatata gcaagcaaat caagctgcac tcctcatcct taaaactaat aaatcttacc 780 catttgatac caatggtcaa aggtaatgtt atagtggttt caaatagaat cccagtcact 840 attaagaaga ctgaagatga tgaaaatgga aaatcaagat acgactatac aatgtcatca 900 ggcggattag tgacggcatt acaagggctc aaaaatccat ttcgatggtt tggatggcct 960 gggatgtctg ttgatagcga acagggacga caaactgtcg agcgggattt gaaggaaaag 1020 ttcaattgtt atccgatatg gttaagtgac gaaattgcag acttacatta taacggcttt 1080 agcaattcta tactttggcc attgttccac tatcacccag gggagatgaa ttttgatgaa 1140 attgcttggg ccgcttattt ggaagcaaat aaactgtttt gccaaacgat cttaaaggag 1200 ataaaagacg gggacgttat ctgggtacat gattatcatc tcatgttgtt gccttcactg 1260 ctaagagacc aacttaatag taaggggcta ccgaatgtca aaattggctt tttccttcat 1320 actccttttc cttcaagcga aatatacagg atacttcctg taaggaaaga aattctcgaa 1380 ggagtgctta gttgtgattt gataggtttc cacacctatg attatgtccg tcactttctt 1440 agttcggttg aaagaatatt gaaattgcga acgagcccac aaggtgttgt ctataatgat 1500 agacaggtga ctgtaagtgc ttatccgatt ggcattgacg ttgacaaatt cttgaatggt 1560 cttaagactg atgaggtcaa aagcaggata aaacagctgg aaaccagatt tggtaaagat 1620 tgtaaactta ttattggggt ggacaggctg gattacatca aaggtgtacc tcaaaaactc 1680 cacgcgtttg aaattttctt ggagagacac cctgagtgga ttggaaaagt tgttttgata 1740 caggtggctg tcccctcacg aggggacgtt gaagaatatc aatctttgag ggcagctgta 1800 aatgagctag tgggaagaat caatggtaga tttggtaccg tcgaatttgt tcctatccat 1860 ttccttcata aaagcgtgaa cttccaagag ctgatatctg tctacgctgc tagtgatgtt 1920 tgtgtagtgt catcgacacg ggacggaatg aatttggtca gttatgaata cattgcttgt 1980 caacaagatc gaaagggatc tctagtacta agtgaatttg cgggagctgc tcagtcatta 2040 aatggcgctc tcgtagtgaa tccatggaat acagaagaac tcagtgaagc tatttacgaa 2100 ggcttgatca tgagtgaaga gaaaaggagg ggcaattttc agaagatgtt caagtacatt 2160 gagaaatata ctgcaagtta ttggggagag aactttgtga aagaattgac gagagtgtga 2220 ttactgtggt ttgcaggtta atttgaaatg ttcacttgta cttgaagaat tttatattat 2280 atacatgtta tacatcaata ggataaaaat taagtagaca aagttatcat tttgttgggc 2340 tgtaaaaatt gaacgataac aatatatttg acaaaattaa tttgatctaa ttgagctgga 2400 gggcgtaata tatttggttt cctgaatcat cttgtagatc acaatatggg gcagcttctt 2460 tcgcagccga tcacagagaa acacatcaca cttgtccaac atgatcacat atcgcattca 2520 atcggggaaa tgcaaggata caggttgacc atggaagacg cgttctgtga tttgaacgaa 2580 agaatattcg tgacggaaga gggacttgac atcagaaaac aagacgagaa tacagagggt 2640 gatctggagt ctcttcaaat taacatttat ggtgtctttg acggacatgg cggtt 2695 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: PCR primer F1 (forwards) <400> 9 tggccvytnt tccaytacca tccygg 26 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: PCR primer R1 (backwards) <400> 10 ggcrtgbaay ttytghggha cacc 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F3 (forwards) <400> 11 ggaagcaaat aaactgtttt gcc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F4 (forwards) <400> 12 ctgtaagtgc ttatccgatt ggc 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F6 (forwards) <400> 13 ggacgacaaa ctgtcgagcg gg 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F7 (forwards) <400> 14 catactcctt ttccttcaag cg 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F8 (forwards) <400> 15 aaagcgtgaa cttccaagag c 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F9 (forwards) <400> 16 gcgtgtgatt actgtggttt gc 22 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F10 (forwards) <400> 17 ggtgagataa tattttcgaa atttcc 26 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer F11 (forwards) <400> 18 cccatcaaat gcagcaagat attgacc 27 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer R3 (backwards) <400> 19 ccattcaaga atttgtcaac g 21 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer R4 (backwards) <400> 20 catgagatga taatcatgta ccc 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer R5 (backwards) <400> 21 caattttgac attcggtagc ccc 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer R6 (backwards) <400> 22 gtaatgccgt cactaatccg cc 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer R7 (backwards) <400> 23 gaacatcttc tgaaaattgc ccc 23 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer R8 (backwards) <400> 24 ctagctcatt tacagctgcc c 21 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer R9 (backwards) <400> 25 catagctttc gagcctttca tctgg 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer Plasm. F (vorwarts) <400> 26 ggcgagcccg atcttcccca tcgg 24 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sequencing primer Plasm. R (backwards) <400> 27 ctgctcgctt cgctacttgg agccac 26

Claims (30)

1. 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 트레할로스-6-인산 생산효소 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 서열을 포함하고, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 DNA 단편 또는 상기 서열에 상보적인 DNA 단편.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. TGAAGCCTCTTGAAA(서열번호 4), TGAATATAAAGGAAA(서열번호 5) 및 그들의 상보적 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 열 충격 인자(heat shock element) DNA 단편.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 서열번호 1의 228 내지 792번째 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 단편.
12. 서열번호 1의 492 내지 792번째 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 단편.
13. 서열번호 1의 627 내지 713번째 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 단편.
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 제 1항, 제 6항 및 제11항 내지 제13항의 DNA 단편 중 어나 하나의 DNA 단편을 포함하는 원핵(prokaryotic) 또는 진핵(eukaryotic) 세포인 숙주 세포(host cell).
19. 제 18항에 있어서,

    진핵 세포는 균류 세포(fungal cell)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
20. 제 19항에 있어서,

    균류 세포는 효모 세포(yeast cell)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
21. 제 20항에 있어서,

    효모 세포는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
22. 제 1항, 제 6항 및 제11항 내지 제13항의 DNA 단편 중 어느 하나의 DNA 단편을 포함하는 발현 벡터(expression vector).
23. 삭제
24. 하기의 사항을 포함하는 키트(kit):

    (a) 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 클로닝하기에 적합한 제 22항의 발현 벡터, 및

    (b) 열-유도 프로모터의 유도 및 재조합 단백질의 생산에 적합한 숙주 세포.
25. 삭제
26. (ⅰ) 제 22항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

    (ⅱ) 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;

    (ⅲ) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및

    (ⅳ) 상기 형질전환체에 열충격을 가하는 단계를 포함하는 제 22항의 발현 벡터를 이용하여 열-유도 프로모터의 조절을 받는 유전자의 발현을 유도하는 방법.
27. (ⅰ) 제 22항의 발현 벡터에 하나 또는 그 이상의 외래 유전자를 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

    (ⅱ) 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;

    (ⅲ) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;

    (ⅳ) 상기 형질전환체에 열충격을 가하는 단계; 및

    (ⅴ) 통상의 방법을 이용하여 상기 열충격을 가한 형질전환체로부터 외래 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 제 22항의 발현 벡터를 이용한 하나 또는 그 이상의 외래 단백질을 생산하는 방법.
28. 하기의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 하나 또는 그 이상의 단백질 생산 방법:

    (ⅰ) 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나 이상의 핵산을 제 22항의 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계(이 때 상기 핵산은 열-유도 프로모터의 전사 조절을 받게 된다);

    (ⅱ) (ⅰ)에서 수득된 발현 벡터를 열-유도 프로모터의 유도 및 재조합 단백질의 생산에 적합한 숙주세포 내로 도입하는 단계;

    (ⅲ) (ⅱ)에서 수득한 숙주세포를 배양하는 단계; 및,

    (ⅳ) 공지의 방법에 의한 열-유도(heat-induction) 단계.
29. 삭제
30. 제 22항에 있어서, 적어도 하나 이상의 외래단백질을 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.