BRPI0008789B1 - molécula de ácido nucleico que compreende um promotor que pode ser induzido pelo calor, microorganismo transgênico, vetor de expressão, kit e processo para a produção de uma proteína - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "promotor que pode ser induzido pelo calor". a invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que compreendem um promotor que pode ser induzido pelo calor e a vetores de expressão e a células hospedeiras que contêm pelo menos uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção. a presente invenção refere-se ainda a kits e a processos para a produção de uma ou mais proteínas utilizando as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção e a vários usos das mesmas. o objetivo da invenção é fornecer um promotor cuja característica induzível por calor seja a mais seletiva possível, em particular um promotor que seja ativo em leveduras e que seja adequado para a expressão de proteínas a altas temperaturas. este objetivo é alcançado por uma molécula de ácido nucléico que compreende um promotor que pode ser induzido pelo calor e que é selecionado dos ácidos nucléicos a seguir: (a) um ácido nucléico cuja seqüência compreende a seqüência promotora de um gene de hansenula polymorpha que codifica uma proteína com atividade trealose-6-fosfato sintase; (b) um ácido nucléico com a seqüência indicada na seq id n<0>:1;(c) um ácido nucléico com uma seqüência que exibe pelo menos 40% de identidade em relação a um comprimento de 300 pb com uma das seqüências indicadas em (a) ou (b); (d) um ácido nucléico que se hibridiza à fita complementar de um dos ácidos nucléicos indicados em (a), (b) ou (c); (e) um derivado de um dos ácidos nucléicos indicados em (a), (b) ou (c) obtido pela substituição, adição e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos; (f) um fragmento de um dos ácidos nucléicos indicados em (a) até (e) que mantém a função do promotor que pode ser induzido por calor; (g) uma combinação de vários dos ácidos nucléicos indicados em (a) até (f), em que as seqüências dos ácidos nucléicos podem ser diferentes ou iguais; ou através de uma molécula de ácido nucléico cuja seqüência é complementar à seqüência de um dos ácidos nucléicos indicados em (a) até (g).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO QUE COMPREENDE UM PROMOTOR QUE PODE SER INDUZIDO PELO CALOR, MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, VETOR DE EXPRESSÃO, KIT E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA". A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que compreendem um promotor que pode ser induzido pelo calor, assim como à expressão de vetores e de células hospedeiras contendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção. A presente invenção refere-se ainda a kits e processos para a produção de uma ou mais proteínas utilizando as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção e a vários usos das mesmas.

Os microorganismos são capazes de responder a um número de situações de estresse, tais como o choque de calor ou frio, etanol, íons de metais pesados, falta de oxigênio ou falta de nutrientes, em particular a falta de glicose. É sabido que as leveduras e os outros fungos acumulam trealose durante as fases de crescimento reduzido. Estes são geralmente os estágios de desenvolvimento que, por exemplo, são tolerantes à falta de água e ao calor, tais como os esporos, conídeos, esclerotia ou células na fase estacionária de crescimento. Já é sabido também que as células de Saccharomyces cerevisiae acumulam trealose durante um choque térmico de uma hora de 27°C para 40°C e que o acúmulo de trealose está correlacionado a uma termotolerância aumentada. Mutações seletivas têm sido utilizadas para demonstrar que a trealose é na verdade um fator necessário para a indução da termotolerância.

Os HSEs (elementos de choque térmico) e STREs (elementos de resposta ao estresse) estão presentes nas regiões promotoras dos genes induzidos por estresse, tais como os genes de S. cerevisiae responsáveis pela síntese da trealose. Estes elementos parecem mediar a ativação dos genes de estresse pela indução do estresse, incluindo a indução do choque térmico. É geralmente aceito que a fosforilação de Msn2p e Msn4p através da via de Ras/cAMP inibe os fatores de transcrição Msn2p e Msn4p. Na ausência desta inibição (por exemplo sob condições de estresse) Msn2p e Msn4p se tornam ativos. Aos STREs com a sequência CCCCT é atribuída uma função na resposta às condições de estresse.

Devido a sua capacidade de realizar modificações co-transcri-cionais e pós-transcricionais que são semelhantes às modificações em seres humanos, os fungos, em particular as leveduras, são sistemas atraentes para a produção de proteínas recombinantes. Para a produção de proteínas recombinantes a seqüência codificadora de um gene que codifica uma proteína de interesse é freqüentemente expressa sob o controle de um promotor heterólogo adequado. Os promotores adequados assim denominados que podem ser induzidos por condições ambientais particulares provaram ser particularmente vantajosos para esta finalidade. Os promotores de genes que codificam enzimas importantes no metabolismo metilotrófico, tal como o promotor MOX (metanol oxidase) ou FMD (formato desidrogenase), por exemplo, oferecem possibilidades que podem ser amplamente exploradas para uma expressão de gene heterólogo que é regulada estritamente pela fonte de carbono.

Foram produzidos vetores de expressão para pesquisa em biologia molecular que compreendem um promotor que pode ser induzido por calor, por exemplo o do gene hsp70 de Drosophild. Os promotores empregados no passado para a indução pelo choque térmico em células de fungos e em particular em leveduras possuem o inconveniente de que não respondem seletivamente ao choque térmico. Seu mecanismo de ativação e desativação não pode portanto ser controlado suficientemente bem, o que pode causar problemas em particular durante a produção de proteínas que danificam as células. O promotor TPS1 de S. cerevisise, por exemplo, exibe várias seqüências que são conhecidas como sendo elementos gerais de estresse (elementos STRE), a saber CCCCT e AGGGG, mas não mais que uma seqüência atuando como um elemento de choque térmico (HSE), a saber GGAACAGAACAATCG. Em adição, devido a sua ampla resposta ao estresse, os promotores conhecidos atualmente são ativados por um fator de estresse a um grau que não é satisfatório para muitas aplicações. O objetivo da invenção é portanto fornecer um promotor cuja característica induzível pelo calor seja a mais seletiva possível, especificamente um promotor que seja ativo em fungos e em particular em leveduras e que seja adequado para a expressão de proteína a altas temperaturas.

De acordo com a invenção, este objetivo é alcançado através de uma molécula de ácido nucléico que compreende um promotor que pode ser induzido por calor e que é selecionado dos ácidos nucléicos a seguir: (a) um ácido nucléico cuja seqüência compreende a seqüência promotora de um gene de Hansenula polymorpha que codifica uma proteína com atividade trealose-6-fosfato sintase; (b) um ácido nucléico com a seqüência indicada na SEQ ID N°: 1; (c) um ácido nucléico com uma seqüência que exibe pelo menos 40% de identidade em relação a um comprimento de 300 pb com uma das seqüências indicadas em (a) ou (b); (d) um ácido nucléico que se hibridiza à fita complementar de um dos ácidos nucléicos indicados em (a), (b) ou (c); (e) um derivado de um dos ácidos nucléicos indicados em (a), (b) ou (c) obtido pela substituição, adição e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos; (f) um fragmento de um dos ácidos nucléicos indicados em (a) até (e) que mantém a função do promotor que pode ser induzido por calor; (g) uma combinação de vários dos ácidos nucléicos indicados em (a) até (f), em que as seqüências dos ácidos nucléicos podem ser diferentes ou iguais; ou através de uma molécula de ácido nucléico cuja seqüência é complementar à seqüência de um dos ácidos nucléicos indicados em (a) até (g). O termo "promotor que pode ser induzido por calor", como empregado neste contexto, refere-se a uma seqüência de ácidos nucléicos que, a um aumento de temperatura no meio de cultura de 25°C até pelo menos 37°C, preferencialmente até 47°C, leva a um aumento de pelo menos 50% na transcrição (síntese de RNA) de um gene sob o controle transcricio-nal do promotor. "Atividade de trealose-6-fosfato sintase" refere-se à conversão de glicose-6-fosfato (Giu6P) e UDP-glicose (UDPG) a trealose-6-fosfato e UDP, que é catalisada pela enzima trealose-6-fosfato sintase (TPS). A atividade da trealose-6-fosfato sintase de uma proteína ou polipeptídeo pode ser medida por exemplo pelo processo descrito abaixo em "Materiais e Métodos". O aspecto "seqüência que se hibridiza à fita complementar de um dos ácidos nucléicos indicados em (a), (b) ou (c)" refere-se à seqüência que se hibridiza sob condições rigorosas com a fita complementar de um ácido nucléico que possui as características indicadas em (a), (b) ou (c). Por exemplo, a hibridização pode ser realizada a 68°C em 2x SSC ou de acordo com o protocolo do kit de marcação com Dioxigenin fabricado pela Boehrin-ger (Mannheim). Um exemplo adicional de condições de hibridização rigorosas é a incubação a 65°C durante a noite em SDS 7%, BSA 1%, EDTA 1mM, tampão fosfato de sódio 250 mM (pH 7,2) seguida pela lavagem a 65°C com 2x SSC, SDS 0,1 %. O termo "% de identidade", como conhecido na técnica, refere-se ao grau de similaridade entre as seqüências de duas ou mais moléculas de DNA de duas ou mais moléculas de polipeptídeos, como determinado por uma comparação das seqüências. A porcentagem da "identidade" resulta da porcentagem de regiões idênticas em duas ou mais seqüências em consideração aos espaços ou outras características de seqüência particulares. A identidade de moléculas de DNA ou de polipeptídeos relacionados pode ser determinada através de procedimentos conhecidos. Essén-cialmente, são empregados programas de computador dedicados utilizando algoritmos que levam em conta os requerimentos particulares. Os processos preferidos para a determinação da primeira identidade geram as maiores combinações entre as seqüências estudadas. Os programas de computador para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, mas não estão limitados a, o pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux, J. e outros, Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. e outros, J. Molec Biol 215:403/410 (1990)). O programa BLAST X pode ser obtido do National Centre for Biotechnology Information (NCBI) e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul S. e outros, NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S. e outros, J. Mol. Biol. 215:403/410 (1990)). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido pode ser também utilizado para determinar identidade.

Os parâmetros preferidos para a comparação de seqüências compreende os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J.

Mol. Biol 48:443-453 (1970) Matriz de comparação: Combinações = + 10, Combinações erradas = 0 Penalidade de espaçamento: 50 Penalidade de comprimento de espaçamento: 3 O programa GAP é ainda adequado para uso com os parâmetros acima. Os parâmetros acima são os parâmetros predeterminados para as comparações de seqüência de ácidos nuciéicos.

Podem ser empregados outros algoritmos, penalidade de espaços abertos, penalidades de extensão de espaços, matrizes de comparação incluindo as apresentadas no Program Manual, Wisconsin Package, Versão 9, setembro de 1997. As escolhas que serão feitas dependerão da comparação específica a ser feita e adicionalmente se a comparação será entre pares de seqüências, em cujo caso GAP ou Best Fit são preferidos ou entre uma seqüência e um grande banco de dados de seqüências, em cujo caso FASTA ou BLAST são preferidos.

Surpreendentemente, foi agora descoberto que as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção e em particular o promotor do gene da trealose-6-fosfato sintase (TSP1) de Hansenuia polymorpha, não contêm pelo menos nos primeiros 300 pb a montante da seqüência codifica-dora, qualquer um dos elementos STRE que foram encontrados em S. cere-visiae que foram assumidos como sendo primariamente responsáveis pela resposta ao estresse incluindo a indução pelo choque térmico deste gene. Foi ainda descoberto que este promotor responde bem e muito seletivamente ao calor.

As moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção podem ser preparadas sinteticamente por processos convencionais ou isoladas de bibliotecas de DNA adequadas e subseqüentemente mutadas quando requeridas. A preparação de tais bibliotecas é também conhecida na técnica. O isolamento é preferencialmente realizado pela preparação de uma sonda com um comprimento de pelo menos 200 - 400 pb da seqüência co-dificadora do gene TPS1 de H. polymorpha (ver Figura 6), que é utilizada para selecionar uma biblioteca de DNA, em particular uma biblioteca de DNA genômico. Uma sonda deste tipo pode ser preparada através de PCR (reação em cadeia da polimerase) utilizando iniciadores adequados, dos quais cada um deveria preferencialmente ter pelo menos 20 - 21 pb de comprimento e possui seqüências adequadas de acordo com a Figura 6 (ou à seqüência complementar correspondente) e DNA genômico ou cDNA de H. polymorpha como um "molde".

As sondas podem ser sintetizadas ou preparadas pela fragmentação do DNA de TPS1 disponível quando aplicável. É evidentemente também possível selecionar diretamente através de sondas que correspondem a partes da seqüência promotora; este procedimento é menos preferido, entretanto, devido na melhor das hipóteses à conservação incompleta da seqüência dentro das partes não codificadoras.

Em uma modalidade das moléculas de ácidos nucléicos de acordo com a invenção, a seqüência do ácido nucléico exibe pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 80% de identidade em relação a um comprimento de 300 pb com uma das seqüências indicadas acima em (a) ou (b). São particularmente preferidas as moléculas de ácido nucléico que compreendem um promotor que pode ser induzido por calor e que exibe pelo menos 90% de identidade em relação a um comprimento de 300 pb com uma das seqüências indicadas acima em (a) ou (b). São mais preferidas entretanto as moléculas de ácido nucléico que exibem pelo menos 95% de identidade em relação a um comprimento de 300 pb com uma das seqüências indicadas acima sob (a) ou (b).

As moléculas de ácido nucléico preferidas para realizar a invenção exibem pelo menos um elemento de choque térmico com a sequência NGAANNNNNNNGAAN (SEQ ID N°: 2) ou a sequência complementar da mesma, em que os nucleotídeos representados por N podem ser A, T, C e G idependentemente um do outro. As moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção exibem preferencialmente pelo menos um elemento de choque térmico com a seqüência NGAANNBWMNNGAAN (SEQ ID N°: 3) ou a seqüência complementar da mesma, em que B é um G, C ou T, W um A ou T e M um C ou A.

Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, o elemento de choque térmico é selecionado de TGAAGCCTCTTGAAA (SEQ ID N°: 4) e/ou TGAATATAAAGGAAA (SEQ ID N°: 5) e/ou as seqüências complementares das mesmas, em que dois ou mais dos elementos de choque térmico, quando presentes, podem exibir as mesmas seqüências ou diferentes. Uma molécula de ácido nucléico preferida de acordo com a invenção exibe pelo menos dois elementos diferentes de choque térmico.

Em uma modalidade preferida da invenção, as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção não contêm um elemento STRE que possui a seqüência CCCCT ou AGGGG. A invenção fornece ainda fragmentos das moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção como citado acima que retêm a função do promotor que pode ser induzido por calor. É particularmente preferido um fragmento que compreende a seqüência do nucleotídeo 228 ao nucleotídeo 792 na SEQ ID N°: 1. Um fragmento adicionalmente preferido compreende a seqüência do nucleotídeo 493 ao nucleotídeo 792 na SEQ ID N°: 1. Pode ser também utilizado um fragmento que compreende a seqüência do nucleotídeo 627 ao nucleotídeo 713 na SEQ ID N°: 1.

As moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção podem ainda compreender pelo menos uma seqüência de ácido nucléico para um gene heterólogo sob o controle transcriciona! do promotor que pode ser induzido por calor.

Um "gene heterólogo" deve se referir à parte codificadora de um gene estrutural que não é expresso sob o controle do seu próprio promotor (homólogo) ou não é expresso no organismo do qual deriva ou não é expresso mesmo sob o controle do promotor original nem no organismo original.

Em uma modalidade adicional da invenção, as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção compreendem uma seqüência de ácido nucléico sob o controle transcricional do promotor que pode ser induzido por calor que é selecionado das seqüências a seguir: (i) uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos da trealose-6-fosfato sintase de Hansenula polymorpha; (ii) uma seqüência de ácido nucléico como indicado na SEQ ID N°: 6; (iii) uma seqüência de ácido nucléico que exibe pelo menos 80% de identidade com a seqüência indicada na SEQ ID N°: 6; (iv) uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos indicada na SEQ ID N°: 7 ou com uma seqüência parcial da mesma, em que o polipeptídeo exibe atividade de trealose-6-fosfato sintase; (v) uma seqüência de ácido nucléico que em consideração com a degeneração do código genético codificaria um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos indicada na SEQ ID N°: 7 ou com uma seqüência parcial da mesma, em que o polipeptídeo exibe atividade de trealose-6-fosfato sintase; (vi) uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo cuja seqüência de aminoácidos exibe pelo menos 80% de identidade com a seqüência de aminoácidos indicada na SEQ ID N°: 7. A seqüência de ácido nucléico indicada em (iii) exibe preferencialmente pelo menos 90% de identidade com a seqüência indicada na SEQ ID N°: 6. Em uma forma alternativa das moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção, a seqüência de ácido nucléico indicada em (vi) codifica um polipeptídeo cuja seqüência de aminoácidos exibe pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos indicada na SEQ ID N°: 7. A molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção pode compreender ainda uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptí-deo sinal que garante a exportação da proteína expressa, em que a seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo sinal está preferencialmente ligada diretamente ao gene heterólogo a ser expresso. A secreção e a modificação de muitas proteínas eucarióticas requer que o N-terminal da seqüência da proteína esteja fundido com uma seqüência sinal, a fim de direcionar os polipeptídeos para o aparato de secreção. Os componentes do gene GAM1 de S. occidentalis e de um gene hormonal do carangueijo Car-cinus maenas, que têm sido utilizados com sucesso para a secreção de hi-rudina (Weydemann e outros, 1995), podem ser por exemplo considerados aqui. A molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção pode ainda compreender um elemento terminador que contém as estruturas sinais para a RNA polimerase que levam ao término da transcrição. Os exemplos de elementos terminadores que podem ser empregados são o terminador MOX ou PH01 de H. polymorpha.

Um outro assunto em questão da invenção é uma célula hospedeira que contém pelo menos uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção, em que a célula átomo de hospedeira é uma célula proca-riótica ou eucariótica. A célula eucariótica pode ser por exemplo uma célula vegetal. A célula eucariótica é preferencialmente uma célula de fungo, sendo uma célula de levedura particularmente preferida. Os fungos recebem consideração particular como células hospedeiras para realizarem a presente invenção, por exemplo os fungos filamentosos tais como Aspergillus, Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium, Sordaria e Penicillium ou leveduras tais como Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Kíuyveromyces, Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula, Tríchosporon e Candida.

Na modalidade mais preferida da invenção a célula de levedura é uma levedura Hansenula metilotrófica facultativa, preferencialmente Hansenula polymorpha. H. polymorpha é uma célula de levedura termotolerante e pertence ao pequeno grupo das assim chamadas leveduras metilotróficas que são capazes de utilizar metanol como fonte de carbono e de energia. H. polymorpha foi isolada de amostras de solo pela inoculação a 37°C (Levine e Cooney, 1973). A alta temperatura na qual H. polymorpha continua a crescer e produzir proteínas possibilita que outros organismos sejam eliminados. A razão para isto é que foi mostrado que H. polymorpha não só possui uma temperatura de crescimento ótima muito alta, na região de 37°C, como também sobrevive a temperaturas de aproximadamente 50°C sem ser danificada (ver a Figura 1). A vitalidade de H. polymorpha após entrar na fase estacionária não decresce durante aproximadamente 50 horas mesmo a 47°C (Figura 2).

Um outro assunto em questão da presente invenção é um vetor de expressão que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção. Tal vetor de expressão pode ainda conter outras seqüências de ácido nucléico em adição ao promotor que pode ser induzido por calor, por exemplo uma seqüência que codifica um polipeptídeo, um gene marcador de seleção, uma origem de replicação para E. coli etc. A presente invenção fornece ainda um kit que compreende: (a) um vetor de expressão de acordo com a invenção que é adequado para ter clonado no mesmo um ácido nucléico que codi-fca uma proteína recombinante e (b) uma célula hospedeira recombinante para a indução do promotor que pode ser induzido por calor e para a produção da proteína recombinante. "Clonagem" deve compreender todos os processos conhecidos na técnica que poderíam ser empregados para esta finalidade. Estes processos não estão todos descritos aqui individualmente, sendo familiares a um perito na técnica. A invenção fornece ainda um kit que compreende: (a) um vetor de expressão e (b) uma célula hospedeira adequada para a indução do promotor que pode ser induzido por calor e para a produção de uma proteína codificada por uma seqüência codificadora sob o controle transcricional do promotor que pode ser induzido por calor.

As moléculas de ácido nucléico, células hospedeiras, vetores de expressão e kits de acordo com a invenção podem ser utilizados para expressão recombinante de um gene sob o controle do promotor que pode ser induzido pelo calor ou para a produção de uma ou de mais proteínas. "Expressão recombinante em uma célula hospedeira adequada" deve se referir a todos os processos de expressão conhecidos no estado da técnica em sistemas de expressão conhecidos que deveríam ser utilizados para esta finalidade. Estes processos não são todos descritos individualmente aqui, sendo familiares a um versado na técnica.

Um outro assunto em questão da invenção é um processo para a produção de uma ou mais proteínas, o dito processo compreendendo: (i) a clonagem de pelo menos um ácido nucléico que codifica uma proteína recombinante em um vetor de expressão de acordo com a invenção, tal que o ácido nucléico clonado desta forma esteja sob o controle transcricional do promotor que pode ser induzido por calor; (ii) a introdução do vetor de expressão obtido em (i) em uma célula hospedeira adequada para a indução do promotor que pode ser induzido por calor e para a produção da proteína recombinante; (iii) o cultivo da célula hospedeira obtida em (ii); (iv) a indução do promotor que pode ser induzido por calor por processos conhecidos por si. O vetor de expressão de acordo com a invenção deverá conter uma sequência que codifica um polipeptídeo e estar sob o controle transcricional do promotor que pode ser induzido pelo calor, o processo de acordo com a invenção para a produção de uma ou mais proteínas compreende as etapas a seguir: (i) introdução de um vetor de expressão em uma célula hospedeira adequada para indução do promotor induzível pelo calor e para a produção da proteína recombinante; (ii) cultivo da célula hospedeira obtida em (i); (iii) indução do promotor induzível pelo calor por métodos por si co- nhecidos. A invenção é agora descrita com mais detalhe com referência às figuras, que mostram o seguinte: A Figura 1 apresenta curvas de crescimento de H. polymorpha a 27°C, 37°C e 47°C. A Figura 2 apresenta a vitalidade após a entrada na fase estacionária a 27°C, 37°C e 47°C. A Figura 3A apresenta um Northernblot de RNA de H. polymorpha do tipo selvagem após um choque térmico de 27°C a 47°C e resfriamento subsequente a 27°C. As células foram cultivadas em meio YDP a 27°C até a fase exponencial precoce; a temperatura foi então aumentada até 47°C (tempo zero) e reduzida de novo até a 27°C durante 120 minutos. A Figura 3B apresenta um Westernbiot para a proteína Tps1 (Tpslp) de H. polymorpha após um choque térmico de 27°C a 47°C e resfriamento subseqüente a 27°C (ver Figura 3A), do qual pode ser observada uma correlação entre no aumento de TPS1 mRNA e o aumento em proteína Tps1 (Tpslp). A Figura 3C apresenta uma concentração intracelular de treha-lose e a atividade da trehalose-6-fosfato sintase comparada graficamente contra o tempo para H. polymorpha após um choque térmico de 27°C a 47°C e resfriamento subseqüente a 27°C (ver Figura 3A). Os círculos abertos representam a concentração intracelular de trehalose, os quadrados sólidos a atividade da trehalose-6-fosfato sintase e a concentração intracelular de trehalose. A Figura 4 apresenta três gráficos de barra que representam a atividade da trehalose-6-fosfato sintase (barras brancas) e a concentração intracelular de trehalose (barras pretas) em células de Hansenula polymorpha cultivadas a 27°C (A), 37°C (B) e 47°C (C) e sob falta de glicose após 7, 10, 17 e 36 horas. O acúmulo de trehalose se correlaciona ao aumento na atividade da trehalose-6-fosfato sintase (Figura 4A), àquela do mRNA de TPS1 (Figura 4B) e àquela da proteína Tps1 (Tpslp) (Figura 4C). A Figura 5 apresenta a homologia de certas regiões de seqüên- cia de DNA de trehalose-6-fosfato sintase de alguns organismos. A Figura 6 apresenta a seqüência de DNA do gene TPS1 de H. polymorpha (SEQ ID N°. 8) e a sequência de aminoácido derivada (SEQ ID N°. 6). Os elementos de choque térmico na seqüência promotora estão sublinhados. A Figura 7 apresenta o plasmídeo pC11, um derivado de pM1 (M. Suckow, comunicação pessoal), que foi obtido por inserção do gene lacZ no poiiligante de pM1. O plasmídeo contém a seqüência de HARS1 (H. polymorpha Autonomously Replicating Sequences - Seqüências Autonoma-mente Replicantes de H. polymorpha), a ori (origem de replicação) de pBR322, um gene resistente a ampicilina, o gene URA3 para propagação e seleção em H. polymorpha e em E. coli e um terminador MOX atrás do gene lacZ para terminação do processo de transcrição. A Figura 8 apresenta o plasmídeo pCH-FMD obtido por inserção do promotor FMD em frente do gene repórter lacZ de pC11. A Figura 9 apresenta o plasmídeo pC11-TPS1 obtido por inserção do promotor TPS1 em frente do gene repórter lacZ de pC11. A Figura 10 apresenta uma comparação entre a atividade dos promotores FMD (A) e TS1 (B) a 30, 37 e 44°C em três fontes de carbono diferentes (2% de glicose, 2% de glicerina ou 2% de metanol). A Figura 11 apresenta o plasmídeo pTPSIConphysMT usado no Exemplo 4. MOX-T = terminador MOX, Conphys = gene Conphys3, TPS1 = promotor TPS1 de Hansenula polymorpha, HARS = H. polymorpha Autonomously Replicating Sequences - Seqüências Autonomamente Replicantes de H. polymorpha, tet = gene resistente a tetraciclina, URA3 = URA3 proveniente de S. cerevesiae, amp = gene resistente a ampicilina Exemplos Materiais e Processos Reagentes e materiais especiais Bio 101, Vista, EUA Geneclean II Kit BioRad Lab, Munique, Alemanha BioRad Protein Assay (Bradford) Boehringer, Mnnheim, Alemanha kit GOD/POD para medida de gli- cose, kit de etanol, comprimidos de coquetel inibidores de protei-nase "COMPLETE" Fluka Chemie AG, Buchs, Suíça Cicloheximida (Actidion), SDS, D+ trehalose, PEP, TRIC1N, NADH, re-agente fenol de Folin-Ciocalteu ICN Biochemicals, Ohio, EUA "Liquigel" 40% de acrilamida/Ν'Ν'- metileno-bisacrilamida (37,5 : 1) Kodak, Nova York, EUA película científica de formação de imagem BIOMAX MR

Mediatech, Herndon, EUA Geneticin G418 sulfato (antibiótico) Perkin Elmer Applied Biosystems, kit de seqüenciamento de DNA

Forest City, EUA

Pharmacia Biotech, Suécia colunas Nap-10 (com Sephadex G-25), todas as enzimas de restrição usadas, Taq polimerase Qiagen GmbH, Alemanha Plasmide Midi Kit (50) Schíeicher + Schuell, Dassel, Alemanha Protran BA 83 0,2 pm/diâmetro 82 mm (filtro redondo de nitrato de celulose), Protran BA 83 0,2 μιτι (membrana de transferência para manchas) Sigma, St. Louis, EUA Imunoglobulinas anticoelho de bode monoclonais (conjugado de fosfatase alcalina), trehalase de rins de porco (N°. do Cat. T-8778), UDPG, glicose-6-Ρ, LDH, piruvato quinase Stratagene, La Jolla, EUA Prime-lt kit II (kit de marcação desordenada de iniciador), colunas NucTrap (colunas de purificação de sonda inclusive dispositivo de proteção beta de coluna de impulsão) US Biological, Swampscott, EUA Ágar Bacteriológico, caldo YPD formulação melhorada W/Peptona X, LB caldo Miller Aparelhagem Usada Unidade de eletroporação pulsador de E. coli, BioRad Labo- ratories, Hercules, EUA HPLC DIONEX DX-300, DIONEX, Sun- nyvale, EUA

Centrífugas de resfriamento Centrikon H-401, Kontron Instr. AG, Zurique, Suíça IEC Centra GP8R, Brouwer, Lu- cerna, Suíça Biofuge 17RS, Heraeus Sepatech, Alemanha aparelhagem PCR Progene, Techne, Cambridge, Reino Unido "Phosphoimager" (gerador de imagem através de fósforo) GS 250 Molecular Imager (inclusive equipamento associado), BioRad Laboratories, Hercules, EUA

Fotômetro Anthos 2001 (para placas de mi- crotítulo), Anthos Labtec Instruments, Salzburg, Áustria, Shima-dzu UV-160A, Japão Seqüenciador ABI PRISM 301 Genetic Analyzer, Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, EUA

Cepa Bacteriana e Condições de Cultura A cepa de E. coli DHSaifa (F'endA1/?sc/R17rkmk + supE44thi- 1recA1gyra relA (lacZYA-argF) U169 (fiSOdelta (lacZ) M15) (Gibco, BRL, Gaithersburg MD, EUA) foi empregada para clonagem do gene TPS1 de H. polymorpha, sendo seguidos os protocolos padronizados (Sambrook e outros, 1989) o meio para E. Coii foi também produzido de acordo com uma receita padrão (Sambrook e outros,, 1989).

Isolamento de DNA de Plasmídeo de E. Coli (STET prep) Foi isolado o DNA de plasmídeo de acordo com um protocolo modificado de acordo com Sambrook e outros (1989). Foi usada uma espátula para raspar o material da célula de uma placa. Este material foi então adicionado a 500 μΙ STET (8% [peso/volume] sacarose, 5% [volume/voiume] Triton X-100, EDTA 50 mM, Tris-HCí 50 mM, pH 8,0) com 35 μΙ de lisozima (10 mg/ml) e misturados. As amostras foram então fervidas durante 1 minuto e 40 segundos a 100°C e centrifugadas durante 10 minutos a 20.000 g e 4°C. Aproximadamente 400 μΙ de sobrenadante foram retirados por meio de uma pipeta e o DNA precipitado usando-se 400 μΙ de isopropanol. Após centrifugação durante 10 minutos a 20.000 g e 4°C, todo o sobrenadante foi descartado e o pélete de DNA lavado uma vez com etano! a 70% [v/v] gelado. Finalmente, o DNA foi seco à temperatura ambiente e suspenso em 50-70 1 μΙ de TE (Tris-HCI 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0).

Cepa de Levedura e Condições de Cultura A cepa de levedura empregado era Hansenuia polymorpha do tipo selvagem (tornada disponível por P. Piper, Londres (1994)). Foram cultivados culturas em estoque sobre Ágar YPD (2% [peso/volume] glicose, 2% [peso/volume] bactopeptona, 1% [peso/volume] extrato de levedura, 2% [peso/volume] ágar) e re-estocado de seis em seis semanas. Elas serviram como inóculo para culturas líquidas de YPD (a composição era a mesma que ágar YPD, porém sem 2% [peso/volume] ágar). A cepa H. polymorpha RB11 (odc1 orotidina-5-fosfato-descar-boxilase-deficiente (uracil-auxotrófica) cepa H. polymorpha (Weydemann e outros, 1995)) foi usada para os experimentos 3 e 4. O meio completo empregado continha 2% de glicose ou de glicerina, 1% de extrato de levedura e 2% de bactopeptona, o meio de seleção continha 0,17% de base nitroge- nio de levedura, sulfato de amônio a 0,5%, 2% de glicose ou de glicerina, 38,4 mg/l de arginina, 57,6 mg/l de isoleucina, 48 mg/l de fenilalanina, 57,6 mg/l de valina, 6 mg/l de treonina, 50 mg/l de inositol, 40 mg/l de triptofano, 15 mg/l de tirosina, 60 mg/l de leucina, 4 mg/l de histidina. Uracil não está presente no meio seletivo.

Para o cultivo de células de cultura, meios líquidos autoclavados foram inoculados com cultura em estoque e incubados durante toda a noite em incubadores com agitação a 27°C, 37°C e 47°C, dependendo do experimento.

Determinação da Densidade Óptica das Culturas de Células de H. Polvmorpha Para determinar a densidade óptica (OD), 200 μΙ (adequadamente diluídos quando aplicável com YPD) de cultura de célula foram colocados em um pequeno frasco de uma placa de mícrotítulo e medidos a 620 nm usando-se um fotoespetrômetro Anthos 2001. 200 μΙ de YPD foram empregados como ensaio em branco.

Experimentos de Crescimento e de Choque Térmico com H. Polvmorpha Foram usadas culturas de toda a noite para inocular o meio de YPD em frascos de Erienmeyer. Foi tomado cuidado para inocular esta pré-cultura à temperatura à qual foi inicial o próprio experimento (27°C para choques térmicos, 27°C, 37°C ou 47°C para experimentos de crescimento).

As culturas foram inoculadas a um Οϋβ20 inicial de 0,2 para cada experimento de crescimento e mantidas continuamente em incubadores com agitação (Multitron). Ao contrário, as culturas foram inoculadas a um OD inicial de 0,05 para experimentos de choque térmico. A cultura foi deixada crescer a 27°C até um ODg20 de 0,4 (aproximadamente 1-1,5 x 108 células por ml de cultura) antes do desempenho do choque térmico a 47°C em um banho de água com função de agitação (Aquatron). Foram retiradas amostras então durante mais duas horas. A cultura de célula foi então resfriada em um segundo banho de água durante uma hora a 27°C. Transformação de H. Polvmorpha por Eletroporação 100 ml de YPD foram inoculados com 5 ml de uma cultura de toda a noite densamente cultivada. A cultura foi agitada a 37°C durante aproximadamente três horas até um ODggo ^e 0,8-1,2. As células foram colhidas por centrifugação a 3.000 rpm e ressuspensas em 20 ml de tampão Kpj (50 mM/pH 7,5). Após adição de 0,5 ml de DTT e agitação durante 15 minutos a 37°C, as células foram sedimentadas por centrifugação a 2.500 rpm e lavadas duas vezes com tampão STM (sacarose 270 mM, TrisCI 10 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,5). Elas foram então suspensas em 0,25 ml de tampão STM e alíquotas de 60 μ! estocadas a -70°C. Para transformação com vetores de integração rDNA, o DNA do plasmídeo foi primeiro linearizado com Xho\ ou Saci. 0,1-1 pg do DNA do plasmídeo linearizado foi misturado com células competentes novas degeladas sobre gelo. Estas preparações foram então colocadas em uma cubeta de 2 mm. A transformação foi realizada em um Gene Pulser (Bio-Rad, Munique) a 2,0 kV, 25 pF e 200 Ohm. As células foram então incubadas em 1 ml de YPD durante uma hora a 37°C para recuperação antes de serem aplicadas sobre meio seletivo. Colônias macroscópicas foram visíveis após a incubação durante dois a quatro dias a 37°C.

Determinação da Concentração de Glicose no Meio A concentração de glicose no meio foi determinada por meio do método GOD (GOD/POD Kit, Bõhringer). As amostras foram diluídas 1:200 com água. Foram adicionados 190 μΙ 1% (peso/volume) solução de enzima GOD (fornecida em forma de pó com o kit) a 10 μΙ de cada amostra e a mistura foi incubada durante aproximadamente 25 minutos a 27°C. A solução de glicose fornecida no kit foi usada como o padrão, também sendo empregados 10 μΙ (0,91 pg de glicose) neste caso. A absorção foi medida no espetrofotômetro Anthos 2001 a 405 nm.

Extração e Deteção Quantitativa de Trehalose Extração de Trehalose 1- 10 ml de cultura de célula foram filtrados através de um filtro de fibra de vidro (Whatman GF/C) e lavados três vezes com água. O filtro foi colocado em um tubo de Eppendorf com 1 ml de água e aplicado vórtice durante 30 segundos antes de ser cuidadosamente espremido e removida a água. A suspensão de célula foi então fervida durante 10 minutos no banho de água. Para separar completamente o sobrenadante do material da célula, este foi centrifugado três vezes a 20.000 g.

Determinação de Trehalose por Hplc Os açúcares extraídos foram separados por meio de uma coluna trocadora de ânion (coluna DIONEX CarboPac PA1, 4 x 250 mm) e detectados amperometricamente em um eletrodo de ouro (PED = detector eletro-químico pulsado). A composição do gradiente de eluição é como a seguir: Tempo (minutos) H2O H2O acetato de Na 1 M NaOH 1 M 0,0 45% 45% 0% 10% 3.5 40% 39% 0% 21% 4.5 35% 35% 20% 10% 5.0 45% 45% 0% 10% 14.0 45% 45% 0% 10% Estas condições resultaram em um tempo de retenção para a trehalose de aproximadamente 3,7 minutos. 20 μΙ de amostra foram injetados em cada caso. Foi empregada uma solução de trehalose de 0,1 mg/m! como 0 padrão.

Determinação de Trehalose por Dosagem Enzimática Foi usado um método de dosagem enzimática igualmente confiável em alguns casos como uma alternativa ao método HPLC mais oneroso (Parrou e François, 1997, modificado): 25 μΙ de extrato de trehalose foram misturados com 12,5 μΙ de trehalase (Sigma) e 37,5 μΙ de solução tampona-dora (acetato de sódio 0,2 M, CaCl2 0,03 M, pH 5,7) e incubados durante cinco horas a 37°C em um banho de água. Isto resultou na ruptura completa de trehalose a duas unidades de glicose. Após breve centrifugação, as amostras foram incubadas durante três minutos a 95°C e então centrifugadas de novo durante mais cinco minutos a 20.000 g. A concentração de trehalose foi determinada indiretamente por determinação da concentração de glicose (kit GOD/POD, ver acima). Foram usados 10 μΙ deste sobrenadante para esta finalidade.

Determinação de Proteína Determinação de Proteína de acordo com Peterson (Levemente Modificado) (Peterson (1997) Para determinar a concentração total de proteína de uma cultura de célula 1 ml de suspensão de célula foi precipitado em 1 ml de TCA a 10% (peso/voiume) e centrifugado durante 10 minutos a 3.000 g. O sobre-nadante foi retirado por meio de uma pipeta de Pasteur ligada a uma bomba de jato de água e o sedimento lavado em 1 ml de PCA 1 N. O pélete foi então suspenso em 5-12 ml (dependendo do OD da cultura de célula a ser estudada) de uma solução de NaOH 0,8 N : SDS a 10% (peso/volume) 1:1 e incubado durante pelo menos uma hora a 60°C. A 200 μΙ desta suspensão foram adicionados 600 μΙ de diluição 6x de reagente CTC (10% de Na2CC>3, 0,1% de CUSO4. 5 H2O, 0,2% de tartarato de KNa). Após exatamente 10 minutos, foram adicionados 200 μΙ de diluição 6x de reagente de Folin-Ciocalteu e misturado rapidamente. As amostras foram deixadas no escuro durante 30 minutos, após o que foi medida a absorção a 750 nm, BSA servindo como o padrão.

Determinação de Proteína de Acordo com Bradford (1976) Para determinar a concentração de proteína em extrato isento de célula, 100 μΙ de um extrato adequadamente diluído foram misturados com 700 μΙ de água. Foram então adicionados 200 μΙ de reagente de dosagem de proteína da BioRad (Bradford) e agitado rapidamente (Vortex). A absorção foi medida a 595 nm, BSA servindo como 0 padrão.

Medidas da Atividade da Enzima Preparação de Células Permeabilizadas A atividade enzimática de trehalose-6-fosfato sintase (Tre-6-Ρ sintase) foi medida em células permeabilizadas (De Virgílio e outros, 1991). Para esta finalidade, foram filtrados 1-6 ml de células (sobre filtros de fibra de vidro GF/C, Whatman), lavados duas vezes usando-se água gelada e ressuspensos por vórtice em 1 ml de tampão de lise (TRICIN 0,2 M, pH 7,0, Triton X-100 a 0,5% [v/v]. Os filtros foram removidos e os tubos de Eppen-dorf congelados em nitrogênio líquido e estocados a -20°C. Antes do de- sempenho da medida, as células foram descongeladas em um banho de água durante três minutos a 30°C. Elas foram então lavadas duas vezes em TR1CIN 0,2 M (pH 7,0) e centrifugadas durante 20 segundos a 4°C e 8.000 rpm (Biofuge 17RS) após cada lavagem. Finalmente, as células foram res-suspensas em 600 pl de TRICIN 0,2 M (pH 7,0).

Atividade da trehalose-6-fosfato sintase A atividade da Tre6P sintase foi determinada pela dosagem en-zimática acoplada de acordo com Hottiger e outros (1987) a 50°C, sendo sempre empregados 60 μΙ de células permeabilizadas. Tanto o substrato (sem glicose-6-Ρ) como brancos de enzima (sem células permeabilizadas) foram processados como controles.

Análises de Western Blot Extração de proteína por ruptura de célula 5-15 m! de cultura de célula foram centrifugados durante 5 minutos a 4°C e 3.000 rpm (IEC Centra GP8R) e o sobrenadante então decantado. O pélete foi suspenso em 1 ml de água e transferido a um tubo de Sarstedt (com fechamento em rosca). Após centrifugação durante 10 segundos, o sobrenadante foi retirado por meio de uma pipeta e o pélete pesado, um tubo vazio servindo como um peso morto. Foi adicionado 1 μΙ de TRICIN 0,2 M (pH 7,0; com inibidores de proteinase [2 tabs/25 ml]) por mg de pélete e o pélete ressuspenso. Foram adicionadas esferas de vidro até um pouco abaixo do menisco de líquido, após o que os tubos de Sarstedt foram montados firmemente em um homogeneizador de célula (Fastprep FP120) no estoque a frio. O homogeneizador de célula foi posto para funcionar duas vezes durante 30 segundos a um ajuste de 6,0, resultando em > 90% de ruptura de célula. Deste ponto em diante, foi dada atenção restrita para manter as amostras bem resfriadas em todas as ocasiões. Foi produzido um pequeno orifício no tubo de Sarstedt por meio de uma agulha. O tubo foi colocado sobre um tubo de vidro e centrifugado a 4°C e 100 g, separando desse modo o extrato das esferas de vidro. A quantidade de tampão TRICIN usada para ruptura de célula foi então adicionada uma vez aos tubos de Sarstedt, que foram de novo centrifugados. O extrato turvo foi então transferido para tubos de Eppendorf e centrifugados três vezes durante dez minutos a 25.000 g e 4°C (Biofuge 17RS), o sobrenadante contendo as proteínas solúveis (inclusive a Tre6P sintase) sendo subseqüentemente usada cada vez.

Preparação da Amostra A concentração de proteína destes extratos foi então determinada com o método de Bradford (ver acima). De acordo com os valores obtidos, eles foram diluídos com água até 2,5 pg de proteína/μΙ e um volume de tampão de amostra 5 x foi adicionado a quatro volumes desta solução de proteína. As amostras foram então desnaturadas durante cinco minutos a 95°C e usadas imediatamente para eletroforese em gel SDS ou congeladas. 10 pl, isto é, 20 pg de proteína foram usados para a análise.

Tampão de Amostra: 1 ml de Tris-HCI 0,5 M, pH 6,8, 0,8 ml de glicerina, 1,6 ml de SDS a 10% [peso/volume], 0,2 ml de azul de bromofenol a 0,05% [peso/ volume], 4 mí de água. 19 volumes de tampão de amostra foram adicionados a um volume de 2-beta-mercaptometanoí imediatamente antes do uso.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) 0 sistema de acordo com Laemmli e outros (1970) foi empregado para a separação das proteínas de acordo com seu peso molecular. Foi preparado um gel de acrílamida a 10% e a 4% (dimensões totais) 10x10 cm) com a composição para uso como o gel de resolução e gel de empilha-mento respectivamente.

Gel de Resolução: 2,5 ml de acrilamida/bisacrilamida a 40% (peso/volume), 2,5 ml de Tris-HCI 1,5 M, pH 8,8, 100 pl de SDS a 10% (peso/volume), 4,95 ml de água, 50 pl de persulfato de amônio a 10% (peso/volume), 5 pl de TEMED Ge! para Formação de Pilha 1 ml de acrilamida/bisacrilamida a 40% (peso/volume), 2,5 ml de Tris-HCI 0,5 M, pH 6,8, 100 μΙ de SDS a 10% (peso/volume), 6,4 ml de água, 50 μ! de persulfato de amônio a 10% (peso/volume), 10 μΙ de TEMED 5 vezes Tampão de Corrida 15 g de Tris, 72 g de glicina, 5 g de SDS, H2O adicionada a 1 litro, O valor de pH devia ser aproximadamente 8,3, sem ajuste adicional, 20 pg de proteína foram carregados em cada gel. O "padrão pré-corado Kaleidoscope" da BioRad, cuja composição é a seguinte, foi empregado como 0 padrão: miosina (204 kDa), beta-galactosidase (121 kDa), BSA (78 kDa), carboanidrase (39 kDa), inibidor de tripsina de soja (30 kDa), A eletroforese em gel foi realizada durante aproximadamente uma hora (porém não mais do que para a frente da amostra alcançar o borda inferior do gel) a uma voltagem constante de 200 V, Estes géis foram então corados com Azul de Coomassie R250 a 1,0% (peso/volume) em ácido acético a 10% (v/v)/etanol a 50% (v/v)(e descorados após aproximadamente uma hora com ácido acético a 10% (v/v), etanol a 20% (v/v) ou transferidos para uma membrana de nitrocelulose (consultar a próxima seção). "Imunoblotting'1 Os géis SDS-PAGE foram então transferidos para uma membrana de nitrocelulose em uma unidade de transferência (Scieplas) com tampão de transferência (Tris 250 mM, glicina 1250 mM, metanol 15% (v/v) durante 1 hora e 15 minutos a 40 V e 4°C.

Coloração Imunológica A membrana de nitrocelulose foi primeiro mantida durante pelo menos uma hora em uma solução de saturação que compreende 3% (peso/volume) em TBS (TBS: Tris 20 mM, NaCI 500 mM, pH ajustado até 7,5 com HCI), seguido por lavagem durante 5 minutos usando-se TTBS (TTBS: como TBS, porém com 0,05% de Tween-20). Foi então adicionado durante toda a noite a 4°C anticorpo policlonal de coelho anti-Tps1p (diluído 1:50 com BSA a 1% [peso/volume] em TTBS (Eurogentec, Bélgica), cuja finalidade era ligar a proteína Tps1 (Tpslp) de H. polymorpha presente na nitrocelulose. A mancha em nitrocelulose foi subseqüentemente lavada duas vezes durante 5 minutos com TTBS e incubada durante 1 hora e 30 minutos com um anticorpo monoclonal anticoelho acoplado com fosfatase alcalina (diluída 1:10.000 com 1% de [peso/volume] de BSA em TTBS). Isto foi seguido por lavagem duas vezes durante 5 minutos com TTBS e uma vez durante 5 minutos com TBS. Para desenvolver a partida das faixas, 1 ml de tampão de revelação de cor 10x (Tris-HCI 100 mM, pH 9,5, MgCI 1 mm) foi diluído 1:10 com água e 45 μΙ de NBT (75 mg/ml de DMF a 70% [volu-me/volume] e foram adicionados 35 μΙ de X-fosfato (50 mg de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoíila, sal de toluidínio/ml de DMF). As membranas foram incubadas no escuro com esta mistura durante 20 minutos (ou que as faixas se tornassem claramente visíveis) antes de serem lavadas com água para interromper a reação. PCR da Colônia com Células de H. polvmoroha Foi realizada PCR da colônia de acordo com um protocolo por Huxley e outros (1990, modificado): colônias individuais foram coletadas por meio de uma ponta de pipeta amarela e raspadas em um tubo de PCR. Os tubos foram então aquecidos durante 2 minutos a potência total em um forno de microondas. Finalmente foram adicionados a cada tubo 25 μΙ de mistura de PCR (0,2 μΙ de Taq polimerase, 2,5 μΙ de tampão de PCR 10x, 2,5 μΙ de MgCl2 25 mM, 0,5 μΙ de dNTP 10 mM, 0,5 μΜ por concentração final de cada iniciador e foi adicionada água para levar o volume até 25 μΙ) e as células ressuspensas. Os tubos foram então imediatamente colocados na unidade de PCR, que foi preaquecida até 92°C e o programa iniciado.

Análise de Northern blot 0 RNA foi extraído de H. polymorpha de acordo com um protocolo por Piper (1994, adaptado). Para esta finalidade, foram coletados 40 ml logarítmicos ou 20 ml de cultura de célula estacionária e (em experimentos de choque térmico) resfriados imediatamente pela adição de água DEPC estéril, gelada. As células foram então sedimentadas por centrifugação e lavadas de novo com água DEPC estéril. O pélete obtido após centrifugação e descarga do sobrenadante foi estocado a -20°C. Após degelo, foram adicionados ao pélete 1-2 g de esferas de vidro, 2 ml de tampão de extração de RNA (Tris-HCI 20 mM, pH 8,5, Na2-EDTA 10 mM, SDS a 1% [peso/ volume]) e 2 ml de fenol. Esta mistura foi então submetida a vórtice sem inter- rupção durante 5 minutos à temperatura ambiente, antes de ser centrifugada durante 5 minutos a 3.500 rpm (IEC Centra GP8R). A fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo que contém um volume igual de fe-nol/clorofórmio (1:1). A suspensão foi submetida a vórtice durante 1 minuto e centrifugada durante 5 minutos a 3.500 rpm e o sobrenadante colocado em um novo tubo que contém um volume igual de clorofórmio. A operação com vórtice foi repetida durante 1 minuto, centrifugação a 3.500 rpm durante 2 minutos e o sobrenadante transferido para tubos de Corex de 15 ml. Foi adicionado acetato de amônio 6 M até uma concentração final de acetato de amônio 1 M, seguido por 2 volumes de etanol (resfriado a gelo) e os tubos foram mantidos no compartimento do congelador a -20°C durante pelo menos 20 minutos. O RNA foi então sedimentado por centrifugação durante 15 minutos a 7.500 g e 4°C. O sobrenadante foi decantado e os tubos secos sobre papel absorvente. Os péletes foram então suspensos em 1 ml de TE e o RNA precipitado por adição de acetato de sódio 3 M (até uma concentração final de 0,2 M) e 2,5 volumes de etanol gelado. Após a centrifugação durante 15 minutos a 7.500 g e 4°C, o pélete foi lavado com etanol a 70% (volume/volume) gelado e seca à temperatura ambiente. Finalmente, o RNA foi ressuspenso em 400 μΙ de TE.

Preparação da Amostra 50 pg de RNA por amostra foram secos no SpeedVac durante 10-15 minutos para a análise de Northern blot (de acordo com Sambrook e outros, 1989). O RNA foi então ressuspenso em 50 μΙ de tampão de amostra (concentrações finais: MOPS 20 mM, pH 7,0, acetato de sódio 0,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, formaldeído 2,2 M, formamida a 50% (volume/volume) e aquecido durante 10 minutos a 55°C. Finalmente, foram adicionados a cada amostra 5,5 μΙ de tampão de carregamento de RNA (10 x) e 1 μΐ de solução de brometo de etídio (1 μΙ/ml).

Pré-qel e Gel Principal Uma agarose pré-gel (1% (peso/volume) de agarose e formaí-deído 0,65 M em um tampão MOPS contendo MOPS 40 mM, pH 7,0, acetato de sódio 10 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0) foi usada para testar a integridade do RNA extraído e para calibrar visualmente a quantidade carregada. A eletro-forese do gel principal (composição idêntica àquela do pré-gel) foi realizada durante 34 horas a 80 V com tampão MOPS que serve como o tampão de corrida.

Blottinq Os géis foram primeiro lavados duas vezes durante 20 minutos em SSC 10x (NaCI 1,5 M, citrato de sódio 170 mM). O RNA foi então transferidos para uma membrana durante toda a noite por transferência capilar (com SSC 20 x como o tampão de transferência) sobre uma membrana de nitroceluíose (BA 83). A membrana foi então lavada em SSC 6x, colocada entre papéis de filtro 3MM (Whatman) e cozidas em uma estufa a vácuo durante 2 horas a 80°C, o que permitiu que o RNA fosse afixado à nitrocelulo-se.

Hibridizacão A membrana de nitroceluíose foi pré-hibridizada em uma estufa especial (Hybaid) em 10 ml de solução de hibridização de RNA (NaHPC>4 0,5 M, pH 7,2, EDTA 1 mM, BSA a 1% [peso/volume], SDS a 7% [peso/ volume]) durante 5 horas a 60°C. Para o estágio principal de hibridização, foram adicionados 150 pl da sonda radioativa (aproximadamente 1x10^ cpm no total) a 10 ml de solução de hibridização de RNA e a membrana incubada na mesma durante toda a noite a 60°C. Finalmente, a radioatividade em excesso foi lavada duas vezes durante 15 minutos a 60°C com 300 ml de água de lavagem (EDTA 1 mM, Na2HP04 40 mM, pH 7,2, SDS a 1% [peso/volume]). A membrana de nitroceluíose foi exposta sobre película de BioMax.

Detecção de Fitase As células de H. polymorpha foram colhidas de culturas de toda a noite de 3 ml e suspensas em 200 μΙ de meio YNB e 1 ml de glicerina a 5%. Após crescimento durante 1-2 dias, foi primeiro determinado o ODgoo- As células foram então sedimentadas por centrifugação e foram usados subsequentemente 25 μΙ do sobrenadante. Foram adicionados a esta alíquota 25 μΙ de NaAc 5 M e 50 μΙ de fosfto de 4-nitrofenila. A mistura foi in- cubada durante 30 minutos a 37°C. A conversão enzimática do substrato foi interrompida pela adição de 100 pl de ácido tricloroacético a 15%. Após a adição de 100 μ! de NaOH 1 M, as amostras de sobrenadante de culturas positivas eram coloridas de amarelo escuro. A cor amarela foi avaliada quantitativamente por medida OD405 no fotômetro.

Ensaio Sobreposição com X-gal - Detecção de Beta-galactosidase As cepas a serem testadas foram cultivadas em meio seletivo durante 4-6 horas a 37°C. Uma gota de 4 μΙ de cada cultura foi colocada sobre uma placa seletiva e incubada durante toda a noite a 37°C. A placa foi revestida como ágar camada de topo nova (agarose a 0,5%, Na2HP04/ NaH2PÜ4 0,5 M (pH 7); SDS a 0,2%; DMF a 2% (dimetil formamida) 2mg/m! de X-gal (o-nitrofenil-beta-D-galactopiranosídeo) a 70°C. Após alguns minutos, os clones com expressão lacZ exibiram cor azul.

Exemplo 1 Clonagem do gene TPS1 de H. oolvmorpha Preparação de uma sonda TPS1 radioativa Baseado em uma comparação de seqüência dos genes TPS1 conhecidos de S. cerevisiae, S. pombe, K. lactis, Candida albicans e A, niger (ver Figura 6), podiam ser preparados dois iniciadores degenerados partindo de duas regiões altamente conservadas que amplificavam um fragmento de aproximadamente 650 bp durante PCR (que consiste em 30 ciclos cada um compreendendo 1 minuto a 92°C, 30 segundos a 52°C, 1 minuto a 72°C) com DNA genômico proveniente de H. polymorpha. Duas seqüências dos dois iniciadores eram como a seguir: F1 (para a frente): 5' TGGCCVYTNTTCCAYTACCATCCYGG 3' (SEQ ID N° 9) R1 (para trás): 5' GGCRTGBAAYTTYTGHGGHACACC 3' (SEQ ID N°. 10) B = C, G, T H = A, C, T R = A, G

V = A, C, G N = A, C, G, T Y = C, T O produto de PCR foi então carregado sobre um gel preparativo de agarose a 1 % (peso/volume) e separado eletroforeticamente. A faixa de 650 pb foi recortada, extraída usando-se o kit Geneclean II (Bio 101, Vista, EUA) e marcada com [alfa-32P]-dCTP radioativo. O kit Prime-lt II foi empregado para esta finalidade e as colunas NucTrap para limpeza. Esta sonda radioativa foi usada para a seleção de TPS1 de H. polymorpha e para a análise Northern blot.

Coleção de D NA Genòmico de H. Polymorpha A coleção de DNA genòmico usada foi tornada disponível por R. Hilbrands (University of Groningen, Holanda). A preparação da coleção de DNA genòmico não é crítica, contanto que os fragmentos sejam > aproximadamente 2 kb. Os fragmentos de DNA genòmico de H. polymorpha com 2-5 kb de comprimento (possivelmente diversas vezes este comprimento) foram clonados no sítio de restrição BamH\ de pHRP2 (7813 pb). Este plasmídeo (Faber e outros, 1992) contém uma ori (origem de replicação) e um gene de resistência a ampiciiina para replicação e seleção em E. coli. Para transformação de H. polymorpha estão presentes a seqüência HARS1 (H. polymorpha autonomously replicating sequence - seqüência autonomamente repli-cante de H. polymorpha) e o gene LEU2 de S. cerevisiae que age como um marcador que também funciona em H. polymorpha. Esta coleção contém alguns 20.000 clones diferentes.

Transformação de E, coli A transformação de E. coli com a coleção de DNA genòmico foi realizada por eietroporação (Sambrook e outros, 1989) e as células foram aplicadas sobre placas 50 LB+Amp (75 mg/l) (2.000-4.000 colônias por placa). As placas foram incubadas durante toda a noite a 37°C.

Seleção para o gene TPS1 de H. polymorpha Para permitir a análise do DNA das colônias individuais, membranas de nitrocelulose foram colocadas cuidadosamente sobre as placas (de acordo com Sambrook e outros, 1989). Foi usada uma agulha fina para produzir quatro orifícios distribuídos assimetricamente em toda a membrana e o gel. Estes agiram como marcadores para permitir a orientação das membranas sobre as placas a serem reproduzidas a um estágio posteriore.

Quando foram retiradas as membranas, as colônias presentes na placa foram replicadas.

Foi depositado papel absorvente 3MM (Whatman) em quatro pratos de plástico e cada prato umedecido com uma de quatro soluções diferentes. O líquido em excesso foi descartado. As membranas de nitrocelu-lose foram primeiro colocadas (com as colônias de face para cima) sobre papel absorvente encharcado em SDS a 10% (peso/volume) durante 3 minutos. Elas foram então colocadas no segundo prato que contém solução desnaturante (NaOH 0,5 N, NaCI 1,5 M) e mantidas ali durante 5 minutos. Então elas foram mantidas por sua vez sobre papel absorvente com solução neutralízante (NaCI 1,5 M, Tris-HC! 0,5 M, pH 7,4) e com SSC 2 x (SSC 10 x, NaCI 1,5 M, citrato de sódio 170 mM), durante 5 minutos cada uma. Para fixar o DNA à nitrocelulose, cada membrana foi colocada entre dois papéis absorventes 3MM e cozida em uma estufa a vácuo a 80°C durante 2 horas. As membranas foram então umedecidas durante 5 minutos em SSC 2 x, antes de serem imersas durante 30 minutos em uma solução de pré-lavagem a 50°C (SSC 5x, SDS a 0,5% [peso/volume], EDTA 1 mM, pH 8,0). Foi usado um papel Kleenex úmido para eliminar material bacteriano em excesso antes que as membranas fossem colocadas durante 2 horas em solução de pré-hibridização (SSC 6x, leite desnatado em pó a 0,25% [peso/volume] a 68°C. Para o processo de hibridização principal, aproximadamente 1 x107 cpm de sonda TPS1 radioativa (consultar "preparação de uma sonda TPS1 radioativa") foram colocados em 40 ml de solução de pré-hibridização e as membranas incubadas na mesma durante toda a noite a 68°C. Após breve enxágüe três vezes em SSC 2 x, SDS a 0,1% (peso/vofume) e lavagem durante 1 hora a 68°C em SSC 1 x, SDS a 0,1% (peso/volume), as membranas foram secas e expostas sobre película Bio-Max. O sinais nas películas reveladas permitiram que fossem colhidas 8 colônias positivas sobre as placas e os estoques criados pelas mesmas. Os plasmídeos foram extraídos destas colônias. Foi empregada PCR para testar se o fragmento de 650 pb estava de fato presente.

Exemplo 2 Seqüenciamento do Gene TPS1 de H. Polvmomha Isolamento do plasmídeo Para seqüenciamento foram selecionadas duas colônias que, por meio de PCR com iniciador desde dentro do fragmento de 650 pb para fora (F4 e R4, ver Tabela 1) e do plasmídeo em direção à inserção (Plasm. F e Plasm. R, ver Tabela 1) forneceu as maiores faixas possíveis. Foram preparados extratos puros de plasmídeo partindo destas duas colônias (N°s. 20.1 e 21.3) por meio do Plasmid Midi Kit (Qíagen).

Seqüenciamento Foram produzidas seqüências por meio de um programa cíclico de seqüenciamento (aparelhagem para PCR: Progene) e o seqüenciador automático ABI 301 (Perkin Elmer). Foram usados 0,5 μΙ (0,5 pg) de D NA do plasmídeo, 1 μΙ de iniciador (concentração final 0,5 μΜ), 4 μΙ de mistura da reação (kit de seqüenciamento de DNA) e 4 μΙ de água para esta finalidade. O programa de seqüenciamento empregado envolveu 27 ciclos compreendendo 30 segundos a 96°C, 15 segundos a 50°C e 4 minutos a 60°C. Após completado o programa, foram adicionados 10 μΙ de água à reação e o DNA precipitou com acetato de sódio e etanol. O pélete foi lavado duas vezes usando-se 1 ml de etanol gelado a 70% (volume/volume). O DNA foi então rapidamente seco e ressuspenso em 25 μ! de reagente de supressão de matriz, DNA Sequencing Kit). Após incubação durante dois minutos, as amostras estavam então prontas para seqüenciamento no ABI 301.

Os iniciadores empregados para seqüenciamento do plasmídeo proveniente do clone N°. 21.3 estão relacionados na Tabela 1. Eles foram preparados no FMI em equipamento "Expedite TM Nucleic Acid Synthesis". As seqüências foram analisadas por meio do programa GCG (Devereux e outros, 1984).

Tabela 1 Lista dos iniciadores empregados para o seqüenciamento do gene TPS1 Tabela 1 - Continuação Um promotor isolado de H. polymorpha e seu modo de ação são descritos a seguir com mais detalhe. Este promotor, que controla a expressão de TPS1, foi estudado por medida do aumento em mRNA de TPS1 sob certas condições. Foi descoberto que enquanto este promotor expressava pequenas quantidades de TPS1 a temperaturas muito baixas para H. polymorpha, a expressão aumentava muito fortemente a altas temperaturas, isto é, muito mais fortemente do que é o caso com promotores induzidos por choque térmico previamente descritos (ver Figura 3A, Northern blot do choque térmico). O aumento induzido pelo calor em mRNA de TPS1 se correlaciona com o aumento na proteína de Tps1 (Figura 3B), com o aumento da atividade de trehalose-6-fosfato sintase e com o aumento da concentração intracelular de trehalose (Figura 3C). Para otimizar a influência térmica, o promotor pode por exemplo ser seletivamente encurtado e acoplado com outros segmentos que contenham HSE.

Além da indução pelo calor, também foi observado um acúmulo de trehalose dependente da falta de glicose, como antecipado devido à relação biológica próxima entre estes dois fatores de estresse (ver Figura 4A). Este acúmulo de trehalose está correlacionado com o aumento da atividade da trehalose-6-fosfato sintase, com o aumento no mRNA de TPS1 (Figura 4B) e com o aumento do acúmulo de trehalose observado com o aumento na proteína Tps1 durante falta de glicose. O acúmulo extremamente alto de mRNA de TPS1 indica que o mRNA de TPS1 é altamente estável, o que o torna (e o cDNA baseado no mesmo ou informação que possa ser obtida partindo do mesmo) não apenas um instrumento valioso para isolamento do promotor, mas também um meio particularmente valioso para a proteção de outros organismos contra uma faixa de condições de estresse, tal como calor ou aridez. O DNA de TPS1 dotado de promotores e vetores adequados (por exemplo como descrito em WO 93/17093 e WO 96/00789) pode por exemplo ser empregado para proteger plantas de falta d'água, permitindo desse modo que elas sejam cultivadas em regiões mais quentes e em regiões com menor precipitação de chuvas. Não apenas o DNA de TPS1, porém também o DNA relacionado ao mesmo pode evidentemente ser empregado para esta finalidade.

Exemplo 3 Expressão Comparativa de um Gene Bacteriano Lacz sob o Controle do FMD e do Promotor TPS1 Baseado no vetor pC11 integrativo de H. polymorpha (Figura 7), foram construídos dois derivados que diferem apenas no respectivo promotor em frente do gene repórter lacZ. No caso de pC11-FMD (Figura 8), o gene lacZ está sob o controle do promotor FMD, que já foi bem caracterizado no caso de pC11-TPS1 (Figura 9), está sob controle do promotor induzível pelo calor a ser testado. Para a finalidade deste experimento, o fragmento entre os nucleotídeos 228 e 792 da seqüência indicada sob a SEQ ID N°. 1 (citada a seguir como o promotor TPS1) foi usado como o promotor induzí-vei pelo calor, O H. polymorpha RB11 foi transformado com pC11-FMD e pC11-TPS1 (consultar Materiais e Processos). Foram produzidas separadamente cepas estáveis em que o respectivo piasmídeo estava presente em um estado integrado genomicamente estável partindo de aproximadamente 1.000 clones de célula uracil-prototrófica para cada transformação. O procedimento neste caso era o seguinte: após a transformação, as células foram aplicadas sobre placas contendo meios seletivos. Foram visíveis colônias isoladas macroscópicas após três dias. Em ambos os casos, 1.000 colônias isoladas separadas foram transferidas sob condições estéreis a novas placas seletivas, que foram então incubadas durante dois dias a 37°C.

Este procedimento foi repetido mais duas vezes (passagem). Os cíones de células foram então transferidos a placas médias cheias e incubados de novo durante dois dias a 37°C (estabilização). Finalmente, os clones de células foram transferidos de novo para placas seletivas, para eliminar alguns plasmídeos livres remanescentes. Após a incubação destas placas durante dois dias a 37°C, a produção das cepas estava completa. O número exato de cópias e os locais de integração dos plasmídeos nas cepas individuais não foram determinados; de acordo com Gatzke e outros (1995), entretanto, as várias cepas produzidas deviam diferir claramente uma da outra sob este aspecto.

Como tanto o número de cópia como o ambiente genômico têm uma grande influência sobre a taxa de transcrição de um gene, devia se supor que os clones individuais de célula também diferissem consideravelmente um do outro em relação a sua atividade de beta-galactosidase. Isto foi confirmado experimentalmente (os dados não estão apresentados). Não foi portanto possível comparar as resistências do promotor diretamente por meio de cepas individuais. Para permitir estudos objetivos de promotor apesar disso, 500 cepas individuais que tinham sido produzidas separadamente foram combinadas, o objetivo sendo criar misturas representativas de cepas com relação ao número da cópia e aos locais de integração. Como os plasmídeos pC11-FMD e pC11-TPS1 usados para a produção da cepa são idênticos com exceção do respectivo promotor localizado na frente do gene lacZ, pode se supor que eles estão integrados ao genoma do hospedeiro em uma maneira homogênea. Esta hipótese foi confirmada pela observação de que várias misturas de cepa provenientes da mesma transformação diferem uma da outra apenas ligeiramente em sua atividade de beta-galactosidase (dados não apresentados). A determinação da atividade de beta-galactosidase de misturas de cepa produzidas por transformação com plasmídeos que são amplamente idênticos devia portanto permitir comparações objetivas do promotor em H. polymorpha.

As atividades de lacZ sob o controle de promotores FMD ou TPS1 foram realizadas a três temperaturas diferentes em três fontes de car- bono diferentes (ver Figura 10). Para esta finalidade, as misturas de cepa descritas acima foram cultivadas até um ODgoo de 5 em 10 ml de meio seletivo às temperaturas e com as fontes de carbono indicadas, após o que foram preparados extratos de célula, cujas atividades de beta-galactosidase foram determinadas por meio de medidas ONPG em meios líquidos. O procedimento foi como a seguir: após alcançar a densidade desejada, as culturas foram centrifugadas durante 10 minutos a 4°C, os péletes de célula lavadas em 10 ml de tampão lacZ (tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7; KCI 10 mM; MgSÜ4 1 mM, ressuspensas em 500 pl de tampão lacZ e transferidas para tubos de Eppendorf de 1,5 ml. Foram adicionadas esferas de vidro com 0,45 mm de diâmetro às suspensões (até o menisco do líquido), após o que as células foram rompidas em um Vibrax (Janke & Kunkel; 6 minutos; 4°C ; 2.200 rpm). Os lisados de célula foram removidos e centrifugados (centrífuga de bancada; 4°C ; 10 minutos). As frações solúveis foram usadas tanto para determinação das atividades da beta-galactosidase como para medida do teor total de proteína. Para as medidas da atividade de beta-galactosidase, foi adicionado 1 ml de solução de ONPG (4 mg de ONPG/ml de tampão lacZ) a várias diluições das frações solúveis e cada mistura foi então transferida para uma cubeta de plástico de 1 cm. O OD420 foi então medido a intervalos de 30 segundos durante um período de 3 minutos para permitir a medida do ΔΕ.

Para determinar o teor total de proteína dos extratos de célula, 790 μΙ de H2O foram misturados com 10 μΙ da respectiva fração solúvel (diluída 1:10, 1:5, 1:2 ou não diluída, de acordo com 0 teor de proteína) e foram adicionados 200 μΙ de reagente de Bradford (Biorad). Após inibição durante 10 minutos à temperatura ambiente, foi determinado fotometricamente 0 OD490 e ajustado a uma amostra de controle que contém tampão lacZ em vez de extrato de célula. A concentração de proteína no extrato de célula foi então determinada partindo dos valores de absorção por meio de uma curva de calibração BSA. As atividades específicas de beta-galactosidase foram calculadas de acordo com a fórmula a seguir: Atividade em volume (mU/mL) = ΔΕ V/ε d v proteína total V: volume total v: volume da amostra e: coeficiente de extinção (0,0045 mM cm) d: densidade da camada (1 cm) É sabido que o promotor FMD é controlado principal mente pelo tipo da fonte de carbono; não foi descrita ainda uma dependência de temperatura (Patente EP N°. 299.108). Isto foi confirmado pelas medidas realizadas aqui (ver Figura 10A). É sabido que as atividades de beta-galactosidase são baixas sob condições de glicose (repressão de glicose), enquanto que valores substancialmente mais altos foram medidos sob condições de glicerina ou de metanol (nãorepressão ou indução). As variações de temperatura não levaram a mudanças drásticas nos valores medidos obtidos (ver Figura 10A). Isto também foi observado no sistema do teste empregado aqui. As atividades de beta-galactosidase eram baixas a 30°C ou a 37°C, porém sobem drasticamente a 44°C (ver Figura 10B). Esta elevação que depende da temperatura em atividade de promotor não ocorreu sob condições de metanol (Figura 10B), um fenômeno que não foi descrito ainda. Surpreendentemente, as atividades de beta-galactosidase mais altas medidas para os promotores de TPS1 eram substancialmente mais altas do que aquelas para os promotores FMD (ver Figs. 10A,B).

Exemplo 4 Expressão Comparativa de um Gene de Fitase sob o Controle do Promotor FMD E TPS1 Cepas recombinantes foram geradas por transformação com os vetores pTPS1 ConphysMT e pFMTConphysMT de acordo com procedimentos padronizados. Com exceção do elemento promotor no cassete de expressão, o dois vetores empregados para transformação são idênticos. O promotor induzível pelo calor contido no pTPS1 ConphysMT é o fragmento correspondente à sequência entre os nucleotídeos 228 e 792 na SEQ ID N°. 1, cujo terminal 3' possui um sítio de restrição EcoRl (denominado a seguir promotor TPS1), enquanto que o pFMTConphysMT contém o promotor FMD. 0 mapa do plasmídeo e a seqüência de nucleotídeo do vetor pTPSIConphysMT são apresentados na Figura 11. Foi usada uma muteína de uma fitase como o gene repórter.

Após a transformação por eletroporação, foram obtidas cepas recombinantes de H. polymorpha por crescimento dos clones uracil-prototróficos produzidos por transformação sobre meio seletivo pelo menos em 80 gerações (Gatzke e outros, 1995). Transformantes representativos das duas coleções de cepa produzidas foram cultivados comparativamente sob diferentes condições em culturas líquidas de 3 ml. O cultivo foi realizado em um meio YNB tamponado com tampão fosfato 0,1 M pH 5,0 suplementado com 2% de glicose ou 5% de glicerina. Após 48 horas a fitase secretada foi avaliada quantitativamente nas alíquotas do sobrenadante da cultura com a ajuda do método descrito sob Materiais e Processos.

Neste estudo, o promotor TPS1 foi comparado com o promotor mais amplamente usado até esta data, o promotor FMD. O uso do promotor TPS1 resultou em valores de expressão ligeiramente aumentados a 37°C quando comparado com o promotor FMD. Uma expressão duas a três vezes mais alta do que aquela observada com o promotor FMD foi observada a 40°C e 44°C quando foi empregado o promotor TPS1.

Claims (14)

1. Molécula de ácido nucléico que compreende um promotor que pode ser induzido pelo calor, caracterizada pelo fato de que o promotor que pode ser induzido pelo calor é selecionado dos seguintes ácidos nucléicos: (a) um ácido nucléico com a seqüência indicada na SEQ ID N°: 1; (b) um fragmento do ácido nucléico indicado em (a) que mantém a função do promotor que pode ser induzido por calor; contanto que a molécula de ácido nucléico não exiba a seqüência promotora do gene da trealose-6-fosfato sintase de Saccharomyces cerevisiae ou de Schizosaccharomyces pombe, em que a molécula de ácido nucléico ainda compreende uma seqüência de acido nucléico para um gene heterólogo sob controle transcri-cional de um promotor que pode ser induzido pelo calor.

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que esta exibe um elemento de choque térmico que possui a seqüência NGAANNNNNNNGAAN (SEQ ID N°: 2), em que os nucleotídeos representados por N podem ser A, T, C ou G independentes um do outro.

3. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que esta exibe um elemento de choque térmico que possui a seqüência NGAANNBWMNNGAAN(SEQ ID N°: 3), em que B é um G, C ou T, W é um A ou T e M é um C ou A.

4. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o elemento de choque térmico é selecionado de TGAAGCCTCTTGAAA (SEQ ID N°: 4) e/ou TGAATATAAAGGAAA (SEQ ID N°: 5), em que dois elementos de choque térmico, quando presentes, podem exibir as mesmas seqüências ou diferentes.

5. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que esta exibe dois elementos de choque térmico diferentes.

6. Molécula de ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o elemento STRE que possui a seqüência CCCCT ou AGGGG está ausente da dita molécula de ácido nucléico.

7. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento indicado em (b) compreende a seqüência do nucleotídeo 228 até o nucleotídeo 792 na SEQ ID N°: 1.

8. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento indicado em (b) compreende a seqüência do nucleotídeo 492 até o nucleotídeo 792 na SEQ ID N°: 1.

9. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento indicado em (b) compreende a seqüência do nucleotídeo 627 até o nucleotídeo 713 na SEQ ID N°: 1.

10. Microorganismo transgênico que contém uma molécula de ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o microorganismo transgênico é uma célula de levedura.

11. Microorganismo transgênico de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura é de Hansenula polymorpha.

12. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

13. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um vetor de expressão como definido na reivindicação 12, e (b) uma célula de levedura que é adequada para a indução do promotor que pode ser induzido pelo calor e para a produção de uma proteína codificada por uma seqüência codificadora sob o controle transcricional do promotor que pode ser induzido pelo calor.

14. Processo para a produção de uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende (i) a introdução de um vetor de expressão como definido na reivindicação 12, em uma célula de levedura adequada para a indu- ção do promotor que pode ser induzido por calor e para a produção da proteína recombinante; (ii) o cultivo da célula de levedura obtida em (i); (iii) a indução do promotor que pode ser induzido por calor a uma temperatura na faixa de 27°C a 47°C por processos conhecidos por si.