KR100465666B1 - 와이 씨-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물 - Google Patents
와이 씨-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물에 함유된 YC-1은 저산소 상태 하에서 HIF-1의 활성을 저해함으로써, 암의 증식과 전이 과정에 필수적인 혈관 신생을 유도하는 VEGF와 암의 증식을 촉진하는 EPO 등 저산소 상태에서 암세포 생존을 유도하는 저산소 반응 유전자들의 발현을 억제한다.
따라서 본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항암제의 유효 성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 저산소 상태에서 기존의 항암 치료에 대해 내성이 획득되는 것을 억제함으로써, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제 등 다른 항암 치료의 보조제로도 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 신생 혈관의 무분별한 형성이나 VEGF, EPO, HIF-1 및 그 구성 단백질인 HIF-1α의 과발현, 전이금속이 관여하는 산소 감지 경로와 관련된 질환에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 YC-1(3-(5'-hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazole)을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
암 환자 사망의 주된 원인은 암의 전이(metastasis)에 의한 것으로, 전이란 암세포가 원래의 발생 부위에서 다른 부위로 이동하여 착상 후 증식·확산하는 현상이다.
기존에 사용되어 온 항암제들은 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 암세포의 생장을 저해하고 증식을 억제하는 것이 대부분이다. 그러나 이러한 항암제들은 암의 전이 자체를 막지는 못하기 때문에 암으로 인한 사망률을 저하시키지 못하는 실정이다.
따라서 암의 증식과 전이를 동시에 억제할 수 있는 항암제에 대한 필요성이 증대되고 있으며, 이러한 면에서 최근 각광받는 항암제로 혈관 신생 억제제를 들 수 있다.
혈관 신생은 암에서 두 가지 중요한 역할을 한다. 첫째는 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 것이고, 둘째는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들은 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 주어 암세포가 온몸에 퍼져 전이가 되게 한다.
따라서, 혈관 신생을 억제하는 물질을 항암 치료에 사용하게 되면, 빠른 속도로 증식하고 있는 암세포 주위의 혈관 내피 세포의 생장을 억제함으로써 암의 증식과 전이를 막을 수 있다. 또한 정상 세포 주변의 혈관 내피 세포는 거의 증식이 정지된 상태이기 때문에, 혈관 신생 억제제를 유효 성분으로 하는 항암제의 경우 정상 조직에 대해서는 영향을 미치지 않아, 기존의 항암제가 안고 있던 무차별적인 조직 손상에 대한 우려가 적다는 장점도 있다.
이제까지 혈관 신생을 억제하는 약제에 대한 임상시험은 내피 세포의 성장과 이동을 방해하는 물질을 이용하거나, 또는 내피 세포의 성장 촉진 인자에 대해 억제하는 효과를 가진 약제를 대상으로 하여 시행되고 있다.
내피 세포의 성장과 이동을 억제하는 물질에는 현재 임상 실험 중인 안지오스타틴(angiostatin)과 엔도스타틴(endostatin)을 비롯하여, 혈소판 인자 (platelet factor)-4, 인터루킨 (interleukin)-12, 레티노익산(retinoic acid), TIMP(tissue inhibitors of metalloproteinase)-1 및 TIMP-2 등이 있다.
반면 내피 세포의 성장과 이동을 촉진하는 것으로 알려진 물질로, VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), 안지오제닌(angiogenin), 에스트로겐(estrogen), aFGF(acidic fibroblast growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor) 등이 있다.
상기 인자들 중에서, 암 조직에서는 특히 VEGF가 많이 분비되어 암세포의 성장을 계속적으로 유지시키고 있다.
따라서 VEGF의 발현을 억제하는 물질은 혈관 신생을 억제함으로써 암의 증식 및 전이를 동시에 막을 수 있는 유력한 후보 물질이 될 것이다.
한편 암세포가 과다하게 분비함으로써 문제가 되는 또다른 대표적 물질은 EPO(erythropoietin), 즉 적혈구 생성 촉진 호르몬이다. 암 조직에서 EPO가 증가되면서 적혈구 생성이 가속화되어 암세포로 영양분과 산소가 공급되므로, 결과적으로 암세포의 증식을 돕게 된다.
그러므로 암 조직에서 분비되어 암의 증식과 전이를 유발하는 대표 물질인 VEGF와 암 조직의 증식을 촉진하는 EPO의 발현을 억제할 수 있다면, 암세포의 증식 및 전이를 효과적으로 차단할 수 있기 때문에 이들의 조절에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
VEGF와 EPO의 유전자는 특히 산소 분압이 낮을 때 그 발현이 유도되어 현저하게 mRNA 양이 증가하는 것으로 알려져 있는데, 만성 저산소 상태는 암 조직에서 나타나는 전형적인 현상이기도 하다. 저산소 상태에서 이들을 비롯한 특정 유전자의 발현은 저산소 유도성 전사활성인자 HIF-1(hypoxia-inducibel factor)에 의해 매개되는 것으로, HIF-1은 HIF-1α와 HIF-1β의 두 단백질로 구성된다. 두 구성 단백질 중 HIF-1β는 산소 분압에 상관없이 일정한 양으로 존재하는 반면, HIF-1α는 저산소 상태에서 증가되었다가 산소 분압이 정상으로 돌아오면 급격히 분해되므로, 산소 분압에 따른 HIF-1α의 안정성이 HIF-1의 활성을 조절하게 된다.
HIF-1α의 안정성은 산소 분압 외에도 산소 감지 경로(oxygen sensingpathway)에 관여하는 인자들에 의해 영향을 받게 되며, 이러한 인자들로는 전이금속 이온(transition metal ion), 철 킬레이트제(iron chelator) 및 항산화제 (anti oxidant) 등을 들 수 있다.
HIF-1α의 안정성은 또한 NO(nitric oxide)에 의해서도 조절을 받는다. 저산소 상태가 지속됨에 따라, iNOS(inducible nitric oxide synthetase)에 의해 NO가 생성되는데, NO는 HIF-1α가 축적되는 것을 억제한다. 따라서 NO로 인해 HIF-1이 목표 유전자(target gene)의 조절 부위에 결합하지 못하게 되므로, NO는 저산소 상태에서 VEGF와 EPO의 발현을 저해하여 암의 증식과 전이를 막는 효과를 가져오게 된다.
NO의 또다른 대표적 효과로, sGC(soluble guanylate cyclase)의 헴(heme) 구조의 철분자에 부착하여 sGC를 활성화시켜 cGMP(cyclic guanosine monophosphate) 농도를 증가시킴으로써, 혈관 확장 및 세포 독성 등의 증상이 나타나게 되는데, 저산소 상태에서 NO의 HIF 활성 저해 효과 또한 sGC의 활성화를 통한 cGMP의 증가를 통해 나타날 것이라는 가설이 제기되고 있다. 이외에도 NO가 HIF-1α의 안정성을 조절하는 분자와 결합하여 작용하거나, 산소 감지 경로에 관여하는 인자를 조절함으로써 작용할 것이라고 추측되고 있으나, 아직 구체적으로 확인되지 않았다.
이처럼 암의 증식과 전이에 관련된 인자의 발현을 현저하게 저해할 수 있음에도 불구하고, NO는 반응성이 매우 커 조직에 손상을 입힐 수 있는 물질이기 때문에 치료 목적으로 사용되기에는 부적절하다.
따라서, 암 조직의 증식과 전이에 중요하게 작용하는 VEGF와 EPO의 발현을억제하는 한편, 정상 조직에는 부작용을 미치지 않는 물질에 대한 발명이 요구되어지고 있다.
본 발명의 목적은 암의 증식과 전이를 효과적으로 억제하는 동시에, 부작용을 미치지 않는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 저산소 상태에서 YC-1이 VEGF, EPO 유전자의 발현을 억제함을 나타낸 도이다.
도 2는 저산소 상태에서 YC-1이 HIF-1의 활성을 저해함을 나타낸 도이다.
도 3에서 a,b는 정상 산소 상태와 저산소 상태에서 YC-1이 HIF-1α의 축적에 미치는 영향을 나타낸 도이며, c,d는 정상 산소 상태와 저산소 상태에서 SNP가 HIF-1α의 축적에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 저산소 상태에서 YC-1이 번역후 수준에서 HIF-1α의 발현을 억제함을 나타낸 도이다.
도 5에서 a는 전이 금속이 YC-1과 SNP의 HIF-1α발현 억제 효과에 미치는 영향을 나타낸 도이며, b는 항산화제가 YC-1과 SNP의 HIF-1α발현 억제 효과에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6에서 a는 저산소 상태에서 ODQ와 MB가 YC-1의 HIF-1α발현 억제 효과에 미치는 영향을 나타낸 도이며, b는 저산소 상태에서 ODQ와 MB가 SNP의 HIF-1α발현 억제 효과에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 7은 저산소 상태에서 cGMP가 YC-1의 HIF-1α발현 억제 효과에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 YC-1이 실제 암 조직에서 증식과 전이를 억제하는 효과가 있음을 나타낸 도이다.
본 발명은 저산소 상태에서 VEGF와 EPO의 발현을 억제함으로써 항암 활성을 나타내는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 함유된 YC-1(3-(5'-hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazole)은 저산소 상태에서 HIF-1의 활성을 저해하여 EPO와 VEGF의 발현을 억제한다. 본 발명의 약학적 조성물에 함유된 YC-1은 번역후 수준(post-translational level)에서 HIF-1α의 축적을 저해함으로써 저산소 상태에서 HIF-1 단백질이 합성되는 것을 막아 HIF-1의 활성을 저해한다.
본 발명의 약학적 조성물에 함유된 YC-1은 전이금속 이온에 의한 산소 감지 경로를 저해함으로써 HIF-1의 활성을 조절하는 것으로 보이며, 이것은 HIF-1에 대해 같은 생리적 효과를 나타내는 NO와의 차이점이다.
따라서, 본 발명의 YC-1은 만성 저산소 상태인 암 조직에서 암의 증식과 전이를 돕는 인자인 EPO와 VEGF의 발현을 억제하여 우수한 항암 효과를 나타내는 한편, 반응성이 큰 NO가 수반하는 부작용이 없으므로 항암제의 유효 성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 저산소 상태에서 기존의 항암 치료에 대해 내성이 획득되는 것을 억제함으로써, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제 등 다른 항암 치료의 보조제로도 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 신생 혈관의 무분별한 형성이나 VEGF, EPO, HIF-1 및 그 구성 단백질인 HIF-1α의 과발현, 전이금속이 관여하는 산소 감지 경로와 관련된 질환에 사용될 수 있다.
본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 신생 혈관 형성 및 VEGF, HIF-1의 과발현과 관련된 혈관종, 혈관섬유종, 혈관 기형, 동맥경화, 혈관 유착 및 부종성 경화증 등의 심혈관계 질환을 비롯하여 각막이식성 혈관신생, 혈관 신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증 및 과립성 결막염 등의 안과 질환, 관절염 등의 만성 염증 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 및 여드름 등의 피부 질환 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 EPO, HIF-1의 과발현의 과발현과 관련된 적혈구 증다증, 신장 장애 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 전이금속이 관여하는 산소 감지 경로와 관련된 심장 발작, 조기 노화, 당뇨병 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 YC-1과 약제학적으로 허용되는 담체를 혼합하여제조될 수 있다. 이 약학적 조성물에는 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제 또는 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제로 제형화될 수 있다. 본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비교적 무독성이다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방법으로 투여될 수 있다. 투여량은 체중 1 ㎏ 당 0.3 - 3000 ㎎을 사용하며, 일일 1회 - 3회 투여한다. 투여량 및 투여 횟수는 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하되, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 저산소 상태에서 YC-1이 VEGF, EPO 유전자의 발현을 억제하는 효과
YC-1이 저산소 상태에서 VEGF 유전자와 EPO 유전자의 발현이 유도되는 것을 억제할 수 있는지 확인하였다.
YC-1의 농도를 100, 200 μM로 하고, 양성 대조군으로 사용된 NO 발생 물질인 SNP(sodium nitroprusside)의 농도를 5, 10 μM으로 하여 Hep3B 간암 세포주에 각각 처리하고, 정상 산소 분압 조건(140 ㎜Hg, 20% O2, v/v)과 낮은 산소 분압 조건(7 ㎜Hg, 1% O2, v/v)에서 각각 16시간 동안 배양하였다.
각 조건의 세포로부터 전체 RNA(total RNA)를 추출하기 위해, GIBCO/BRL 사의 TRIZOL 키트를 사용하였다. mRNA 발현 정도를 확인하기 위해, 준정량적(semi-qunatitative) RT-PCR(reverse transcriptase - polymerized chain reaction)을 수행하였다.
RT 반응액은 50㎕ 부피 내에 1㎍의 전체 RNA, 1 ×AMV(avian myeloblastosis virus) 반응 완충액 및 0.2 mM dNTPs, 0.1 unit/㎖ AMV 역전사효소가 함유되었으며, 48 ℃에서 1시간 동안 반응을 진행하였다.
RT 반응으로 cDNA를 얻은 후, 1 × Tfl 반응 완충액, 5 μCi[α-32P]CPT, 1.5 mM 황산마그네슘, 0.1 unit/㎕ Tfl DNA 중합효소 및 250nM 프라이머의 조건에서 PCR 반응을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머는 EPO, VEGF 및 β-액틴을 각각 증폭시킬 수 있도록 제작된 것으로, 그 염기 서열은 다음과 같다.
| 증폭시킬 대상 유전자 | 정방향 프라이머 | 역방향 프라이머 |
| EPO | CTGGAGAGGTACCTCTTGGA(서열번호 1) | CCTGTGTACAGCTTCAGCTT(서열번호 2) |
| VEGF | AACTTTCTGCTGTCTTGG(서열번호 3) | TTTGGTCTGCATTCACAT(서열번호 4) |
| β-액틴 | AAGAGAGGCATCCTCACCCT(서열번호 5) | ATCTCTTGCTCGAAGTCCAG(서열번호 6) |
PCR 반응은 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 70℃에서 1분의 조건으로 20 번을 반복하였으며, 그 결과를 4% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 0.3 ×TBE 완충액(15mM 트리스(Tris), 30 mM 보릭산(boric acid), 0.06 mM EDTA, pH7.5)을 사용하여 100 V, 4℃의 조건으로 전기영동하였다. 전기영동 후 젤을 말려 자기방사표지(auto radiography)법에 의해 각 경우의 mRNA를 정량하고 비교하였다(도 1).
도 1에서, 세포 내에서 항상 일정하게 발현되는 유전자인 β-액틴은 산소 분압이나 YC-1, SNP의 농도에 상관없이 비슷한 수준의 mRNA 발현율을 나타냈다.
그에 비해, EPO 유전자와 VEGF 유전자는 산소 분압이 정상일 때 거의 발현되지 않았으나, 저산소 상태에서 그 발현이 유도되어 mRNA 양이 현저하게 증가함을 알 수 있었다. 이러한 현상은 공지된 바와 일치하는 것이다.
반면, 저산소 상태에서 YC-1을 처리한 경우는 NO를 처리한 경우와 마찬가지로 이들 mRNA의 발현을 억제하였으며, 이러한 억제 효과는 농도가 증가할수록 더 뚜렷하였다.
따라서, YC-1은 NO와 마찬가지로 저산소 상태가 유도하는 EPO 유전자와 VEGF 유전자의 발현을 억제함을 알 수 있다.
[실시예 2] 저산소 상태에서 YC-1의 HIF-1 활성 저해 효과
1) 저산소 상태에서 YC-1의 HIF-1 활성 저해 효과
저산소 상태에서 YC-1가 HIF-1의 활성을 저해함으로써 EPO 유전자와 VEGF 유전자의 발현을 억제함을 확인하였다.
저산소 상태에서 EPO 유전자와 HIF-1 간의 결합력에 대한 YC-1의 영향을 알아볼 수 있도록 EMSA(electrophoretic mobility gel shift assay) 분석을 수행하였다. 핵 추출물을 얻기 위해, 상기 RT-PCR 실험시와 같은 조건으로 Hep3B 세포를 배양한 후, 세포가 배양 중인 용기를 빨리 얼음 위로 옮겨 얼음으로 냉각시킨 PBS 완충액으로 2번 세척하였다. 세포들을 배양 용기로부터 긁어낸 후, 이를 4℃에서 1000 g로 5분간 원심분리하여 얻은 펠렛(pellet)을 PBS로 2번 세척하였다. 펠렛을 0.2 % 노니뎃 P-40(Nonidet P-40)을 함유한 용해 용액에 녹여 핵 추출물을 얻었다(Chun et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 268:652-656, 2000). EMSA 분석에 사용될 프로브(probe)는 [γ-32P]ATP로 표지되었으며, 그 서열은 다음과 같다.
5' - ACCGGCCCTACGTGCTGTCTCAC - 3' (서열번호 7)
EMSA 분석의 반응액은 10 mM 트리스, pH 7.4, 50 mM 염화칼륨, 50 mM 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 5 mM DTT(dithiothreitol), 5 % 글리세롤의 조성으로 이루어진 반응액 20 ㎕내에 5 ㎍의 핵 추출물, 0.4 ㎍의 초음파 처리되고 변성된 송아지 흉선 DNA, 1×104cpm의 프로브를 첨가하였으며, DNA와 단백질의 결합을 위해 4 ℃에서 20분 동안 반응시켰다. 밴드가 이동하는 현상(supershift)을 관찰하기 위해, 1 ㎕의 래트(rat) HIF-1α항혈청(antiserum)을 EMSA 반응액에 첨가하고 4 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응이 끝난 후, 그 결과물을 5 % 비변성(non-denaturing) 폴리아크릴아미드 젤 상에서 0.3 ×TBE 완충액을 사용하여 200 V, 4℃의 조건으로 전기영동하고, 그 결과를 자기방사표지법에 의해 확인하였다(도 2).
공지된 바와 같이 산소 분압이 정상일 때는 HIF-1과 DNA의 결합체를 관찰할 수 없었으나, 저산소 상태에서는 HIF-1과 DNA의 결합체인 밴드(HIF-1)가 비특이적 결합으로 인한 밴드(C) 위쪽에 나타났다. 저산소 상태에서 HIF-1α항혈청을 처리한 경우에는, HIF-1과 단백질의 결합체보다 위쪽으로 이동한 밴드(SS)를 관찰할 수 있었다. 이러한 밴드는 DNA에 결합한 HIF-1에 HIF-1α항혈청이 결합하여 DNA-단백질 결합체의 총 분자량이 증가함으로써 나타나는 것으로, 저산소 상태에서 HIF-1이 DNA에 결합하고 있음을 재차 확인시켜 주는 것이다.
반면 저산소 상태에서 100 μM의 YC-1을 처리한 경우에는 양성 대조군인 5 μM의 SNP 처리시와 마찬가지로 HIF-1과 DNA의 결합이 저해되었으며, 그 저해된 정도는 산소 분압이 정상일 때와 비슷한 정도임을 알 수 있었다.
따라서, YC-1은 NO와 마찬가지로 저산소 상태에서 HIF-1이 유전자의 조절 부위에 결합하는 것을 저해함으로써 EPO와 VEGF의 발현을 억제함을 알 수 있다.
2) 저산소 상태에서 YC-1의 HIF-1α의 축적 억제 효과
저산소 상태에서 YC-1이 HIF-1의 구성 단백질인 HIF-1α의 축적을 억제함으로써 HIF-1과 DNA의 결합을 저해함을 확인하였다.
YC-1와 SNP의 농도를 0, 0.002, 0.01, 0.02, 0.05, 0.25, 1, 2.5, 5, 25, 100, 200 μM 로 달리 하여 Hep3B 세포에 처리한 후, 각각 정상 산소 분압 조건과 낮은 산소 분압 조건 하에서 배양하고 각 조건으로부터 세포 추출물을 얻었다.
웨스턴 분석(Western analysis)을 위해 20 ㎍의 세포 추출물을 4 % SDS/폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기영동하였다. 젤 상에 분리된 단백질들을 밀리포어 (Milipore) 사의 임모빌린 P 멤브레인 (Immobilon-P membrane)로 전이(transfer)하였다.
탈지 우유(nonfat milk)가 5% 함유된 TTBS 용액(0.1% 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 TBS)에 래트의 HIF-1 항체를 1:5000으로 희석한 후, 상기 용액에 멤브레인을 4℃에서 하룻밤 동안 담가두었다. TTBS 용액으로 멤브레인을 세척한 후, 탈지 우유(nonfat milk)가 함유된 TTBS 용액에 호스라디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase)가 부착된 래트 항혈청을 1:5000으로 희석하여, 상기 용액에 멤브레인을 1시간 동안 담가두었다. 세척 후, 아머샴(Amersham) 사의 ECL+(enhanced chemiluminescence plus) 용액을 사용하여 결과를 판독하였다.
도 3a에서, 공지된 바와 같이 HIF-1α는 정상 상태의 산소 분압 하에서 거의 존재하지 않았으나, 저산소 상태에서는 많은 양이 존재하였다. 저산소 상태 하에서 YC-1을 25 μM 까지 처리하였을 때는 HIF-1α의 농도에 영향을 미치지 않았으나, YC-1이 100 μM 이상의 농도로 존재할 때부터 HIF-1α의 축적이 억제되었다. 반면 비특이적으로 나타나는 항체에 결합하여 나타나는 단백질들의 경우(nonspecific band; NS로 표시됨) YC-1의 농도에 상관없이 일정한 수준을 유지하므로, YC-1는 HIF-1α에 대해서만 선택적으로 그 축적을 억제함을 알 수 있다. 한편 정상 상태의 산소 분압 하에서 YC-1은 HIF-1α의 축적에 영향을 미치지 않았다(도 3b).
양성 대조군인 SNP의 경우에도 저산소 상태에서 그 농도가 증가함에 따라 HIF-1α의 축적을 억제하는 효과를 나타냈으며(도 3c), 정상 상태의 산소 분압 하에서는 HIF-1α의 축적에 영향을 미치지 않았다(도 3d).
3) 저산소 상태에서 YC-1이 번역후 수준에서 HIF-1α의 축적을 저해하는 효과
저산소 상태에서 HIF-1α의 축적에 대한 YC-1의 저해 기작은 번역후 수준에서 일어남을 확인하였다.
저산소 상태에서 HIF-1αmRNA의 발현에 미치는 YC-1과 SNP의 영향을 관찰하기 위해, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 반정량적 RT-PCR을 수행하였으며, 이때 사용한 프라이머는 HIF-1α를 증폭할 수 있도록 제작된 것으로 그 염기 서열은 다음과 같다.
5' - CCCCAGATTCAGGATCAGACA - 3' (서열번호 8)
5' - CCATCATGTTCCATTTTTCGC - 3' (서열번호 9)
도 4에 나타난 바와 같이, 저산소 상태에서 YC-1과 SNP는 그 농도에 상관없이 HIF-1αmRNA의 발현에 영향을 미치지 않았다.
따라서 YC-1은 HIF-1α의 발현시 전사 수준에는 영향을 미치지 않고, 번역후 수준에서 HIF-1α의 축적을 저해함으로써 HIF-1의 활성을 억제함을 알 수 있다.
[실시예 3] YC-1의 전이금속과 관련된 산소 감지 경로 억제 효과
저산소 상태에서 HIF-1α의 축적은 산소 감지 경로에 관여하는 요인들, 즉 전이금속 및 세포 내 산화 ·환원 상태에 의해 영향을 받기 때문에, YC-1이 HIF-1α의 축적을 조절하는 기작이 이러한 요인들과 상관 관계가 있는지를 확인하였다.
전이금속에 관한 영향를 알아보기 위해 전이금속인 코발트(cobalt)와 철의 킬레이터인 데스페리옥사민(desferroxamine)을 처리한 군과, 세포 내 산화 ·환원 상태에 관한 영향을 알아보기 위해 항산화제인 트롤록스(trolox)와 NAC(N-acetyl cysteine)를 처리한 군을 각각 준비하였다.
75 μM의 염화코발트, 120 μM의 데스페리옥사민, 5 μM의 트롤록스, 20 mM의 NAC를 각각 Hep3B 세포에 처리하고, 각 경우에 있어 100 μM의 YC-1와 5 μM의 SNP를 각각 처리한 군을 준비하였다. 각 배양 조건으로부터 세포 추출물을 얻고 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 분석을 수행한 후, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이 전이 금속을 처리한 경우, 정상 상태의 산소 분압 하에서 코발트와 데스페리옥사민은 HIF-1α의 축적을 유도하였다(2, 6). 그러나 이러한 효과는 YC-1에 의해 억제되었으며(3, 7), 반면 SNP는 영향을 미치지 않았다(4, 8).
도 5에 나타난 바와 같이 항산화제를 처리한 경우, 트롤록스와 NAC는 YC-1과 SNP에 의해 저해된 HIF-1α의 축적(3, 6)을 다시 회복시키지 못했다(4, 5, 7, 8).
따라서 저산소 상태에서 HIF-1α의 축적에 대한 YC-1의 억제 기작은 전이금속 이온에 의한 산소 감지 경로와 관련된 것이며, 세포 내 산화 ·환원 상태와는 무관함을 알 수 있다. 또한 같은 생리적 활성을 나타내는 NO가 전이금속 이온과 상관없는 기작에 의해 작용하는 것으로 보아, YC-1은 NO와 다른 기작을 통해 저산소상태에서 HIF-1의 활성을 조절함을 알 수 있다.
[실시예 4] 저산소 상태에서 YC-1의 효과와 sGC, cGMP의 상관 관계
YC-1은 기존에 sGC를 활성화시켜 cGMP를 증가시키는 물질로 공지되어 왔기 때문에, 저산소 상태에 대한 YC-1의 효과가 이러한 기작과 관련된 것인가를 확인하였다.
1) 저산소 상태에서 YC-1의 효과와 sGC 활성과의 상관 관계
YC-1의 작용에 미치는 sGC의 영향을 확인하기 위해, sGC의 저해제인 ODQ(1H-(1, 2, 4)oxadiazole(4, 3a)quinoxatin-1-one)과 MB(methylene blue)를 각각 10, 20, 50 μM 씩 Hep3B 세포에 각각 처리하고, 각 경우에 있어 100 μM 의 YC-1과 5 μM 의 SNP를 처리한 군을 준비하였다. 처리한 세포를 정상 산소 분압 조건과 낮은 산소 분압 조건에서 각각 4시간 동안 배양하고, 각 조건으로부터 세포 추출물을 얻었다. 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 분석을 수행한 후, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, ODQ와 MB 모두 저산소 상태 하에서 YC-1의 작용(도 6a) 뿐 아니라 SNP의 작용에 대해 전혀 영향을 미치지 않았다(도 6b).
따라서 저산소 상태에서 HIF-1α의 축적에 대한 YC-1의 저해 효과는 sGC와 무관한 기작에 의해 나타나는 것임을 알 수 있다.
2) 저산소 상태에서 YC-1의 효과와 cGMP 농도와의 상관 관계
YC-1의 작용에 미치는 cGMP 농도의 영향을 확인하기 위해, cGMP의 농도를 증가 또는 감소시키는 물질들을 다양한 농도로 조합하여 Hep3B에 처리한 후 세포를 저산소 상태에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 YC-1과 SNP는 저산소 상태에서 배양하기 5분 전에 처리하였으며, NO 합성 효소의 저해제인 NAME(Ngamma-Nitro-L-arginine methyl ester)과 cGMP 유사체인 8-bromo-cGMP는 배양하기 1시간 전에 처리하였다. 배양 후 각 조건으로부터 세포 추출물을 얻어 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 분석을 수행한 후, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서, 100 μM 의 YC-1은 저산소 상태(2)에 비해 HIF-1α의 축적을 현저히 억제하였으며(3), 이는 지금까지의 결과와 일치하는 것이다. YC-1의 이러한 억제 효과는 NO의 농도에 상관없이 YC-1 단독으로 이루어짐을 확인하였다(4). 한편, YC-1과 SNP가 각각의 작용 농도 이하로 처리된 경우에는 저산소 상태에서 HIF-1α의 축적을 억제하지 못하였으며(5, 6), 이 둘을 혼합하여 cGMP 농도를 크게 증가시킨 경우에도(7) 억제 효과는 나타나지 않았다. cGMP 유사체를 처리한 경우도 HIF-1α의 축적에는 영향을 주지 않았다(10, 11).
따라서, 저산소 상태에서 HIF-1α의 축적을 억제하는 YC-1의 작용은 sGC의 활성화나 cGMP 농도의 증가와는 무관하게 이루어지는 것임을 알 수 있다.
[실시예 5] YC-1의 암 증식 및 전이 억제 효과
YC-1이 실제 암 조직에서 증식과 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
Hep3B 세포주를 누드 마우스(nude mouse)의 피하조직에 접종하여 암 조직이 생성되도록 하였다. YC-1의 투여는 마우스의 체중 1㎏ 당 30㎎의 YC-1을 하루에 한번씩 주사하는 조건으로 수행하였다.
이때 YC-1의 암 전이 억제 효과가 암의 생성 초기에 투여해야만 나타나는 것인지, 또는 암 조직이 이미 생성된 이후에도 효과를 나타내는 것인지를 알아볼 필요가 있었다. 따라서. YC-1의 투여 시기 별로 따른 효과를 관찰할기 위해 한 실험군은 Hep3B 세포주가 접종일부터 시작하여 2주 동안 YC-1을 투여하였으며, 다른 실험군은 Hep3B 세포주를 접종한 지 40일 되는 날부터 시작하여 2주 동안 YC-1을 투여하였다. 반면 대조군은 YC-1을 처리하지 않았다. 이와 같이 실험군과 대조군을 준비한 후, 60일간 암 조직의 크기를 측정하여 그 변화를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, Hep3B 세포주 접종일부터 시작하여 2주 동안 YC-1을 투여한 실험군은 암세포가 접종된 지 30일 경부터 대조군보다 암 조직의 크기가 줄어드는 것을 관찰하였으며, 암세포 접종 후 60일 경에는 대조군에 비해 2.5배 정도로 암 조직의 크기가 줄어들었다. Hep3B 세포주를 접종한 지 40일 되는 날부터 시작하여 2주 동안 YC-1을 투여한 실험군의 경우, YC-1을 투여한 직후부터 대조군보다 암 조직의 크기가 줄어들기 시작하여. 암 세포 접종 후 60일 경에는 대조군에 비해 7배 정도로 암 조직의 크기가 줄어들었다.
따라서 본 발명의 YC-1은 암 조직이 생성되는 초기는 물론 암 조직이 이미 생성된 이후에도 암의 증식과 전이를 억제할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 함유된 YC-1은 저산소 상태에서 HIF-1이 유전자의 조절 부위에 결합하는 것을 저해함으로써, HIF-1에 의해 활성화되는 EPO와 VEGF의 발현을 억제하여 암의 전이를 막는 효과가 있다.
저산소 상태에서 YC-1의 작용 기작은 전이 금속 이온에 의한 산소 감지 경로와 관련된 것으로, NO와는 다른 기작에 의해 HIF-1에 대한 억제 효과를 나타내기 때문에 YC-1은 NO가 야기하는 부작용 없이 효과적인 항암제로 사용될 수 있다.
본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 암 조직이 생성되는 초기 단계 뿐 아니라 암 조직이 이미 생성된 이후의 단계에서도 암의 전이를 우수하게 차단하는 효과가 있으므로, 암의 진행 단계에 따라 선택적으로 사용해야 했던 기존의 항암제와는 달리, 어떠한 단계의 환자에게도 광범위하게 적용시킬 수 있다.
본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 저산소 상태에서 기존의 항암 치료에 대해 내성이 획득되는 것을 억제함으로써, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제 등 다른 항암 치료의 보조제로도 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 YC-1을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물은 신생 혈관의 무분별한 형성이나 VEGF, EPO, HIF-1 및 그 구성 단백질인 HIF-1α의 과발현, 전이금속이 관여하는 산소 감지 경로와 관련된 질환에 사용될 수 있다.
<110> PARK, Jong Wan CHUN, Yang Sook <120> pharmaceutical composition containing YC-1 as effective component <130> 01P-78 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying erythropoietin gene <400> 1 ctggagaggt acctcttgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying erythropoietin gene <400> 2 cctgtgtaca gcttcagctt 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying vascular endothelial growth factor gene <400> 3 aactttctgc tgtcttgg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying vascular endothelial growth factor gene <400> 4 tttggtctgc attcacat 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying beta-actin gene <400> 5 aagagaggca tcctcaccct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse for amplifying beta-actin gene <400> 6 atctcttgct cgaagtccag 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for EMSA assay <400> 7 accggcccta cgtgctgtct cac 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying HIF-1 alpha gene <400> 8 ccccagattc aggatcagac a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying HIF-1 alpha gene <400> 9 ccatcatgtt ccatttttcg c 21
Claims (10)
- YC-1 (3-(5'-hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazole)을 유효 성분으로 함유하는 항암제.
- 제 1항에 있어서, 암의 증식과 전이를 동시에 억제하는 항암제
- YC-1을 유효 성분으로 함유하는, 신생 혈관 형성 및 VEGF, HIF-1의 과발현과 관련된 혈관종, 혈관섬유종, 혈관 기형, 동맥경화, 혈관 유착, 부종성 경화증, 각막이식성 혈관신생, 혈관 신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 관절염, 만성 염증 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- YC-1을 유효 성분으로 함유하는, EPO, HIF-1의 과발현과 관련된 적혈구 증다증, 신장 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- YC-1을 유효 성분으로 함유하는, 전이금속이 관여하는 산소 감지 경로와 관련된 심장 발작, 조기 노화, 당뇨병의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- YC-1을 유효 성분으로 함유하는 항암 치료 보조제.
- YC-1을 유효 성분으로 함유하는, HIF-1α, HIF-1, VEGF의 과발현 또는 신생 혈관 형성과 관련된 VHL(von Hippel-Lindau) 질환, 폐고혈압, 심근비대, 심부전, 임신성 고혈압, 임신중독증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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