KR100860081B1

KR100860081B1 - ＶＤＵＰ1 유전자를 이용하여 ＨＩＦ1-α의 분해를 조절하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR100860081B1
Application number: KR1020060111849A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 전준호
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-11-13
Filing date: 2006-11-13
Publication date: 2008-09-24
Also published as: KR20080043162A

Abstract

본 발명은 HIF1-α (Hypoxia-inducible factor 1-α)를 조절하여 암, 류마티스성 관절염, 건선 또는 당뇨병성 망막증을 치료하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자 또는 VDUP1와 이를 조절하는 물질을 이용하여 상기 질병을 억제하는 방법에 관한 것이다.

VDUP1, HIF1-α, 핵이동, 암전이치료법.

Description

ＶＤＵＰ1 유전자를 이용하여 ＨＩＦ1-α의 분해를 조절하기 위한 조성물{Pharmaceutical composition for regulating the degradation of HIF1-α}

도 1의 a는 293T 세포에 VDUP1, HIF1-α 유전자를 트랜스펙션시키고, 24시간 후에 세포를 저산소 혹은 정상산소에 4시간 처리한 후 각각의 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 발현을 확인한 사진이다.

도1의 b는 힐라세포에 VDUP1을 여러 농도로 트랜스펙션한 후 세포내 자체의 HIF1-α 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.

도1의 c는 293T 세포에 VDUP1, HIF1-α를 트랜스팩션하고 동시에 HIF1-α-반응 리포터 (HRE-Luc)을 다시 트랜스팩션한후 리보터의 활성을 측정한 결과이다.

도1의 d는 힐라세포에 VDUP1 siRNA를 트랜스팩션하여 VDUP1 발현을 억제한 후 HIF1-α의 발현을 측정한 사진이다.

도 2의 a는 VDUP1이 결핍된 생쥐 섬유아세포 (-/-)에서 HIF1-α 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.

도 2의 b는 VDUP1이 결핍된 생쥐 섬유아세포 (-/-)에서 HIF1-α에 의해 조절되는 여러 유전자(VEGF, Glut-1, MMP2, MIC2, cyclin G2)의 발현을 RT-PCR로 확인한 사진이다.

도 2의 c는 B16-F10 세포주를 10 uM SAHA로 처리하고 15시간후 VDUP1과 HIF1-α의 양을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.

도 2의 d는 힐라세포에 VDUP1 siRNA를 트랜스팩션하고 50 ng/ml TNF-α로 6시간 처리한후 HIF1-α 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.

도 3의 a는 293T 세포에 VDUP1, pVHL 유전자를 트랜스팩션한후 각각의 항체로 면역침전을 하여 결합을 확인한 사진이다.

도 3의 b는 힐라세포 라이세이트를 VDUP1 항체로 면역 침전한후 다시 pVHL을 웨스턴 블랏하여 결합을 확인한 사진이다.

도 3의 c는 294T 세포에 pVHL, HIF1-α 그리고 여러농도의 VDUP1을 트랜스펙션하여 결합을 확인한 사진이다.

도 3의 d는 VDUP1이 결핍된 생쥐 섬유아세포 세포 (-/-)에서 pVHL과 HIF1-α의 결합이 감소된 것을 보여주는 사진이다.

도 3의 e는 힐라세포를 SAHA를 처리하고나서 pVHL과 HIF1-α의 결합이 증가된 것을 보여주는 사진이다.

도 3의 f는 힐라세포에 HA-유비퀴틴, pVHL, VDUP1을 트랜스팩션하고 HA 항체로 웨스턴 블랏을 하여 유비퀴틴 양이 증가됨을 보여주는 사진이다.

도 4의 a,b,c는 힐라세포에 VDUP1, pVHL, HIF1-α를 트랜스팩션한 후, 콘포칼현미경으로 각각의 발현을 측정하여 그 결과를 정량화한 결과이다.

도 4의 d,e,f는 힐라세포에 VDUP, 돌연변이VDUP, pVHL, HIF1-α를 각각 트랜스팩션한 후, 콘포칼현미경으로 발현을 측정하여 그 결과를 정량화한 결과이다.

도 5의 a는 힐라와 H-1299세포에 VDUP1, 돌연변이 VDUP1을 각각 트랜스팩션한 후 24시간 경과 후 HIF1-α 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.

도 5의 b는 힐라세포에 VDUP1과 돌연변이 VDUP1을 트랜스팩션한 후 배양액에 분비된 VEGF 양을 확인한 결과이다.

도 5의 c는 힐라세포에 VDUP1과 돌연변이VDUP1을 각각 트랜스팩션한 후 세포의 전이력을 트핸스웰 챔버를 이용하여 측정한 결과이다.

도 5의 d는 B16-F10 세포에 VDUP1 혹은 돌연변이 VDUP1을 발현한 후 생쥐의 동맥에 주사하고 2주 후에 폐에 전이된 양을 측정한 결과이다.

본 발명은 HIF1-α (Hypoxia-inducible factor 1-α)의 안정성과 관련한 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1)의 이용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 VDUP1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자 또는 VDUP1와 이를 조절하는 물질을 포함하는, HIF1-α 단백질의 분해를 촉진시키기 위한 조성물 등에 관한 것이다.

진핵세포는 산소를 감지하고 다수의 조절 유전자에 의해 저산소 상태에 적응한다. 포유류 세포에서 전사 복합체 HIF-1은 세포와 계(systemic) 수준에서 산소 농도의 항상성에 본질적인 역할을 한다(Iyer, N.V., et al., Genes Dev. 12, 149- 162, 1998; 및 Semenza, G.L., J. Appl. Physiol. 88, 1474-1480, 2000). HIF-1은 에리쓰로포이에틴(erythropoietin)과 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)와 같은 유전자의 전사를 촉진하며, 상기한 에리쓰로포이에틴 및 혈관 내피 성장 인자는 적혈구 생성과 혈관신생을 촉진시키거나 포도당 이동과 대사에 관여하는 유전자를 활성화시킴으로써 산소 이용능을 높인다(Semenza, G..L., Annu. Rev, Cell Dev. Biol. 15, 551-578, 1999).

HIF-1은 저산소 상태에 의해 조절되는 α 아단위체인 HIF1-α와 산소에 영향을 받지 않는 HIF1-β 아단위체, 이렇게 두 개의 아단위체로 구성되어 있다(Wang, G.L., et al., Proc, Nat1. Acad. Sci. USA 92, 1995). HIF1-α 는 세포내의 산소 항상성 유지, 암전이, 혈관생성에 중요한 조절인자로 알려졌다(Nat Rev Drug Discov 2:, 803-811, 2003; Curr Opin Genet Dev 14: 81-85, 2004. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 343-354, 2004). 최근 보고에 의하면 이외에도 염증반응, 면역세포 기능조절 등 다양한 생체기능조절에 관련하는 것으로 보고되고 있다 (J Immunol1 74: 7592-7599, 2005; J Clin Invest 115: 1806-1815, 2005). HIF1-α는 두가지 수준에서 발현이 조절이 되는데, 전사 수준 및 단백질 합성/분해 수준에서 조절을 받고 있다. HIF1-α 단백질은 산소 의존적으로 단백질 분해효소에 의해 세포 내에서 분해된다. 즉 산소가 존재하면 HIF1-α의 402번과 564번의 아미노산이 산화되면서 von Hippel-Lindau (pVHL)가 결합하여 유비퀴틴 결합체가 형성이 되면서 HIF1-α을 분해한다. 반면 산소가 없는 상태에서는 HIF1-α는 핵으로 이동하여 핵 내에서 여러 유전자의 발현을 증진시키고 산소가 다시 공급이 되면 세포질로 다시 이동을 한다(EMBO J. 19: 4298-4309, 2000). 따라서 HIF1-α 단백질의 분해는 핵과 세포질 간의 이동이 중요한 기작인데 이동을 결정하는 것은 단백질이 가지고 있는 핵 이동신호 모티브(NES, nuclear export sequence)가 중요하다. 그러나 아직 어떤 인자들이 HIF1-α 이동에 관련하는 가는 잘 알려져 있지 않다.

Vitamin D3 upregulating protein 1(VDUP1)은 혈액종양세포인 HL-60 세포에서 비타민 D3(vitamin D3)에 의해 증가하는 유전자로 처음 알려졌다(Biochem. Biophys. Acta, 1219: 26-32, 1994). 최근에는 VDUP1이 티오레독신(thioredoxin, Trx)과 반응하여 Trx의 기능을 억제하고, 다른 인자들과 Trx의 작용도 저해한다고 보고되었다(J. Biol. Chem., 274: 21645- 21650, 1999, J. Immunol., 164: 6287-6295, 2000). 이는 VDUP1은 세포 내의 산화 환원반응을 조절하는 Trx에 음성 조절자(negative regulator)로 작용하여 산화적 스트레스(oxidative stress)에 세포를 더욱 민감하게 한다는 것을 의미한다. 또한 VDUP1 안티 센스(anti sense) DNA가 설치류 흑색종(murine melanoma) 세포에서 멜라닌 합성(melanin synthesis)이나 종양형성(tumorigenesis)을 조절하며(Immunology Letters, 86: 235-247, 2003), 암세포의 세포주기를 억제하여 항암효과를 나타내고 실제로 암 조직에서 VDUP-1의 발현이 정상조직에 비해 감소하여 있다고 알려져 있다. 이와 같이 VDUP1의 발현은 여러 암조직에서 발현이 감소되어 있는데 아직 그 역할은 정확하게 규명되지 않고 있다.

이에 본 발명자들은 VDUP1이 HIF1-α의 이동과 분해에 어떻게 관련하는 가를 알고자 시험관 내 조건(in vitro)에서 VDUP1이 HIF1-α 단백질의 양을 조절하고 이를 VDUP1 유전자의 결손 혹은 억제된 세포에서 검정하고, VDUP1가 HIF1-α의 세포 내의 핵과 세포질간의 이동을 조절하는 중요한 인자임을 규명하였다. 또한, VDUP1의 발현조절을 통해 HIF1-α 를 조절함으로써 암세포의 전이를 억제, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막증 등의 치료에도 활용할 수 있는 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 VDUP1의 HIF1-α단백질에 대한 음성 조절 인자로서의 작용에 근거하여 VDUP1 단백질을 포함하는, HIF1-α 단백질의 발현을 억제하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 VDUP1 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, HIF1-α 단백질의 분해를 촉진시키기 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 VDUP1 단백질과 이의 촉진제를 포함하는, HIF1-α 단백질의 분해를 촉진시키기 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 암전이에 가장 중요한 유전자인 HIF1-α를 조절하여 암전이 등을 억제하는 방법에 관한 것으로, VDUP1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자 또는 VDUP1와 이를 조절하는 물질을 이용하여 암전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 본 발명자는 VDUP1에 의해 pVHL(von Hippel-Lindau protein)과 HIF1-α의 유비퀴틴화가 증가되고, 또한 상기 결합물의 핵 밖으로의 이동을 매개함에 따라 HIF1-α의 발현이 억제되어 HIF1-α의 세포내 양을 조절할 수 있다는 것을 처음으로 밝혀내었다.

본 발명은 VDUP1 단백질이 HIF1-α의 안정성을 조절한다는 특징을 기초로 한다.

HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1)은 세포내 산소 농도에 따라 그의 양이 조절되는 단백질로서, 정상농도(normaxia)에서는 세포내에서 거의 관찰되지 않다가, 저산소농도(hypoxia) 조건이 되면 세포내에서 많이 관찰된다. HIF-1은 HIF1-α와 HIF1-β의 2개의 아단위로 구성되어 있고, HIF1-α 는 정상산소 농도에서 VHL 단백질이 HIF1-α 의 아미노산 잔기를 하이드록실화시키고 이에 의해 HIF1-α 가 유비퀴틴화되며, 유비퀴틴화된 HIF1-α 가 프로테오좀에 의해 분해된다. 반면, 저산소 조건에서는 HIF1-α 가 HIF1-β와 결합하여 분해가 일어나지 않는다.

HIF-1은 저산소 조건에서는 세포의 생존을 개선시키기 위해 전사인자로 작용한다. 구체적으로, 저산소 조건하에서 HIF-1의 양이 증대되어, 산소가 없는 상태에서 에너지를 내기 위해 필요한 해당작용에 필요한 효소의 발현양을 증가시켜 에너지가 생성되게 하며, 산소가 부족한 지역에서 혈관신생을 촉진하는 VEGF 등의 발현을 촉진하고, 기존의 혈액에서 산소공급을 늘리기 위해 에리쓰로포이에틴 등의 발현을 촉진하며, 산소가 부족할 때도 세포의 생존을 개선시키는 단백질들의 발현을 촉진시킨다. 상기한 HIF-1의 전사 인자로서의 작용과 관련하여, 대사작용과 관련된 효소로는 아데닐레이트 키나제-3, 카본산 안하이드라제-9, 글루코즈 트랜스포터-1, -3, 해당과정의 효소들을 예로 들 수 있으며, 혈관신생과 관련한 단백질로는 α1B 아드레날린작용성 수용체, 엔도텔린-1, HO-1(Heme Oxygenase-1), 산화질소 신타제-2, PAI-1(Plasminogen Activator Inhibitor 1), VEGF, VEGF 수용체 FLT-1(Fms-like Tyrosine Kinase-1) 등을 예로 들 수 있으며, 적혈구 형성과 관련한 단백질로는 세룰로플라스민, 에르쓰로포이에틴, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 등을 예로 들 수 있으며, 증식/생존과 관련된 단백질로는 아드레노메듈린, 사이클린 G2, EPO(Erythropoietin), Heme 옥시게나제-1, IGF2(Insulin-like Growth Factor 2), IGFBP-1(Insulin-like Growth Factor Binding Protein-1), -2, -3, NOS2(Nitric oxide Synthase 2), NIP3(Nineteen KDa Interacting Protein 3), p21, TGF-β3(Transforming Growth Factor-β3), VEGF 등을 예로 들 수 있다.

HIF-1의 전사 인자로서의 작용에 기인하여, 장기 또는 조직에 산소와 영양분을 공급하는 혈관이 막혀 산소가 모자라는 저산소 조건과 영양분도 고갈도는 저포도당 조건에 동시에 빠지는 허혈조건(ischemia)에 도달하는 허혈성 질병의 경우 HIF-1의 발현을 증대시켜 에너지 생성 및 혈관신생을 증대시킴으로써 뇌경색, 심근경색 등이 경색증(Wurzel J 및 Goldman B.I., N Engl J Med. 343(2):148-9, 2000)을 치료하고, 이외에도 HIF-1의 발현 증가로 허혈성 뇌졸중 등을 치료할 수 있으며, 또한 궤양 및 상처치료에도 이용될 수 있다.

고형암의 경우 모세혈관으로부터 최대 0.5mm 이상 떨어지면 확산에 의한 산소 및 영양분의 공급이 부족하여 죽게 되므로 이의 성장에 혈관의 생성이 필수적이고, 또한 저산소 조건에서도 살아남도록 선별되어 해당과정이 잘 발달되어 있다. 따라서, HIF-1가 줄어들면 혈관신생이 저하되어 암이 성장할 수 없어지므로 암을 치료할 수 있다. 이외에도, 혈관신생을 분자수준에서 차단함으로써 류마티스성 관절염(Folkman J., Nat Med. 1(1):27-31, 1995), 건선(Folkman J., Nat Med. 1(1):27-31, 1995), 당뇨병성 망막증(Folkman J., Nat Med. 1(1):27-31, 1995) 등의 치료에도 이용될 수 있다.

한편, 본 발명자들은 시험관 내 조건(in vitro)에서 VDUP1이 HIF1-α 단백질의 양을 조절하고 이를 VDUP1 유전자의 결손 혹은 억제된 세포에서 검정하고, VDUP1가 HIF1-α의 세포내의 핵과 세포질간의 이동을 조절하는 중요한 인자임을 규명하고 나아가 암세포의 전이 등을 조절함을 밝힘으로써, VDUP1의 발현조절을 통해 암전이를 조절하는, 그리고 전이성 암, 당뇨병성 망막증 등의 치료에 활용할 수 있는 가능성을 확인하였다. 이러한 결과들이 VDUP1이 HIF1-α 단백질의 음성 조절인자로 작용함을 증명하는 것이다.

본 발명에 의하면, VDUP1과 HIF1-α 유전자를 세포에 트랜스펙션하여 각각을 과발현하였을 때, 산소가 있는 상태나 없는 상태 모두에서, VDUP1이 HIF1-α 단백질 발현을 급격히 감소시켰다. 또한 세포내에 자체 존재하는 HIF1-α의 양도 감소시킴을 확인할 수 있었다.

또한 VDUP1이 HIF1-α에 의한 유전자 발현 활성에 미치는 영향을 살피기 위해 HIF1-α에 의해 조절되는 HIF1-α-반응 요소 리포터(HRE-LUC)의 활성을 측정하였는데, VDUP1이 농도의존적으로 HIF1-α의 유전자 발현 활성을 감소시킴을 알 수 있었다. 역으로 VDUP1의 발현을 siRNA-VDUP1으로 감소시켰을 때, HIF1-α이 증가함을 관찰 할 수 있었다(도 1d). 그리고 VDUP1이 결핍된 세포에서 다시 HIF1-α의 발현을 확인하였데, HIF1-α의 단백질 양은 증가하였으나 HIF1-α의 유전자 변화는 없었으며, 한편 pVHL 단백질이나 유전자 발현은 변화가 없었다. 이어서 HIF1-α에 의해 조절되는 여러 유전자의 발현을 조사하였는데, VDUP1이 결핍된 세포에서 VEGF, Glut-1(Glucose Transporter-1), MMP2(Matrix Metallo Protienase 2), MIC2(Macrophage Inhibitory Cytokine 2), cyclin G2와 같은 유전자의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 히스톤 디아세틸레이즈 저해제인 SAHA(Suberoylanilide Hydroxamic Acid)는 VDUP1의 발현을 증가시키는데 이때 HIF1-α의 발현은 상대적으로 감소하는 것을 관찰하였고(도 2의 c), TNF-α는 거꾸로 VDUP1의 발현을 억제하고, HIF1-α 발현을 증가시키는데 이때 VDUP1을 siRNA로 감소시키면 HIF1-α의 발현이 더욱 증가하는 것을 알 수 있었다(도 2의 d). 이러한 결과들은 VDUP1이 HIF1-α의 발현을 감소시키는 것을 증명하는 것이다.

또한 본 발명에 의하면, VDUP1에 의해 pVHL/HIF1-α의 핵 밖으로의 이등이 매개된다는 것을 알 수 있었다. pVHL/HIF1-α의 핵 밖으로의 이동은 HIF1-α의 분해의 선제조건인데, VDUP1도 핵 속에 존재하는데, VDUP1이 실제 pVHL/HIF1-α의 이동에 관련하는 가를 측정하였다. VDUP1 단독으로 과발현시에는 VDUP1이 약 30 내지 35% (저산소시), 약 45 내지 69% (산소시) 세포질에 있는데(도 4의 a, b, c), pVHL와 HIF1-α를 동시에 과발현시키면 VDUP1은 거의 세포질로 이동함을 관찰하였다(도 4의 c). 이 상황에서 pVHL의 핵 속에서의 양도 감소하며 HIF1-α도 핵에서 사라짐을 알 수 있었다(도 4의 b). pVHL은 핵 이동에 관련된 NES가 없는데, VDUP1은 NES를 가지고 있음을 알 수 있었다(도 4의 d). 이 NES중 한 아미노산을 치환한 돌연변이 VDUP1 (VDUP1-L294A)를 만들어 비교하였을 때 돌연변이 VDUP1은 핵 이동이 저해되 많은 양이 (3-4배) 핵 속에 그대로 머무는 것을 알 수 있었다(도 4의 e 및 도 4의 f). 한편 NES를 통한 핵이동을 저해하는 leptomycin B(LMB)를 처리하면 돌연변이 VDUP과 같은 결과를 관찰 할 수 있었다(도 4의 d, e, f). 이상의 결과를 종합하면 VDUP1이 NES를 통해 pVHL/HIF1-α의 핵밖으로의 이동을 매개한다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 데이터를 종합적으로 고려할 때, VDUP1이 HIF1-α의 발현을 억제하는 것이라는 결론 내릴 수 있다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 VDUP1 단백질을 포함하는, HIF1-α 단백질의 발현을 억제하는 조성물을 제공한다.

본원에 사용된 VDUP1은 포유동물, 예를 들면 쥐, 토끼, 돼지, 소, 말, 바람직하게는 인간의 모든 조직, 기관으로부터 얻는 천연, 합성, 반합성 또는 재조합되어 실질적으로 정제된 VDUP1의 아미노산 서열을 가리킨다. 일례로서, HIF1-α 아세틸화효소로서의 작용 활성을 갖고 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한 실질적으로 정제된 폴리펩타이드 또는 그의 변이체 또는 단편이 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어, “실질적으로 정제된”은 천연 환경으로부터 분리되었거나, 단리된 핵산 또는 아미노산 서열들이 천연적으로 결합되어 있던 다른 성분들로부터 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이 유리된 상태를 가리킨다.

VDUP1 단백질은 미리스틸화, 포스포릴화, 글리코실화, 단백 분해 절단 등을 포함한 해독 후 변형을 포함한다.

이러한 VDUP1 단백질은 포유류의 조직으로부터 직접 분리하여 제조할 수 있다. 배양액 또는 세포 추출물에 함유된 VDUP1 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다. 이들 방법의 예로는 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해성을 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 포커싱 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 예시할 수 있다.

다른 방도로서, VDUP1은 당 분야에 공지된 폴리펩타이드 화학 합성 방법에 의하여 제조할 수 있다. 펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 특히, 바람직한 폴리펩타이드의 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase syntheses)을 이용하는 것이다. VDUP1은 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 그 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press (1980)).

또 다른 방도로서, VDUP1은 유전자 재조합 기술에 의하여 제조할 수 있다. VDUP1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하여, 그 발현벡터를 적당한 숙주세포에서 발현시키고, 숙주세포로부터 펩타이드를 분리한다. 유전공학적으로 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. VDUP1 유전자는 당업자에게 알려진 많은 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 포유류 세포 또는 조직으로부터 분리한 mRNA로부터 역전사에 의한 통상적인 방법, 예를 들면 PCR 또는 써던 블롯 분석에 의해 cDNA 또는 발현 라이브러리를 생성할 수 있다. 얻은 DNA는 pBR322, pUC19 또는 T 벡터와 같은 벡터 내로 아클로닝할 수 있다. VDUP1 암호화 DNA 서열이 일단 동정되면 적절한 발현 벡터, 예를 들면 이. 콜라이로부터 유래된 플라스미드(예, pET3A, pBluescript 또는 pUC19), 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 플라스미드(예, pUB110, pTB5 또는 pC194), 효모로부터 유래된 플라스미드(pSH19 및 pSH15), 박테리오파아지(예, 람다 파아지), 동물 바이러스(예, 레트로바이러스) 및 곤충 바이러스(예, 백큘로바이러스)로 클로닝시킬 수 있다. 재조합 벡터는 형질전환 및 파아지 감염에 대한 표준 기술을 이용하여 적절한 숙주 내로 도입한다. 예를 들면, 이. 콜라이의 경우 염화칼슘 방법을 사용한다(S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, 1972). 바실러스의 형질전환은 문헌[S. Chang, et al., Molecular and General Genetics, 168:111, 1979]에 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 효모의 형질전환은 문헌[Parent, et al., Yeast, 1:83-138, 1985]에 공지된 방법에 따라 리튬아세테이트나 스페로플라스트 (spheroplast)법 등을 실시할 수 있다. 동물 세포의 형질전환은 예를 들면 문헌[Virology, 52:456, 1973]에 기술된 방법에 따라 실시할 수 있다. 배큘로바이러스에 의한 곤충세포의 형질전환은 문헌[Biotechnology, 6:47, 1988]에 기술된 방법에 따라 실시할 수 있다. 형질전환체는 사용된 숙주 세포에 따라 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 배양한다. 예를 들면, 이. 콜라이를 배양하는 경우, 세포는 30 내지 40℃에서 LB 배지에서 포화정지 단계까지 성장시킨다. VDUP1 단백질은 형질전환체의 배양물로부터 예를 들면 배양된 세포 또는 배양 용액으로부터 추출하여 분리 정제할 수 있다. 배양액 또는 세포 추출물에 함유된 VDUP1 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다. 이들 방법의 예로는 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해성을 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔 여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용한 방법, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같이 친수성의 차이를 이용한 방법 및 등전점 포커싱 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용한 방법을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 투여, 또는 비경구 투여 될 수 있다. 경구투여용으로, 화합물은 캡슐제, 환제, 정제, 트로커(troches)제, 산제, 액제, 현탁제 또는 유제와 같은 고체 또는 액체 제제로 제형화될 수 있다. 고체 단위 용량 형태는 예를들어, 활탁제 및 락토오즈, 슈크로오즈 또는 옥수수 전분과 같은 불활성 충전제를 함유하는 일반적인 젤라틴 형태인 캡슐일 수 있다. 다른 양태에 있어서 통상적인 정제 개지(예: 락토오즈, 수트로오즈 및 옥수수 전분) 및 활탁제(예: 스테라르산 또는 마그네슘 스테아레이트)와 혼합하여 정제화할 수 있다.

비경구 투여용의 경우, 화합물은 계면활성제 및 다른 약제학적으로 허용되는 보조제를 첨가하거나 첨가하지 않고, 멸균 액체(예: 물, 알콜, 오일) 및 다른 허용되는 유기 용매일 수 있는 약제학적 담체와 함께, 생리학적으로 허용되는 희석제중의 화합물의 액체 또는 현탁제의 주사 용량으로 투여할 수 있다. 상기 제제에 사용될 수 있는 오일의 예로는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일, 예를 들어, 피넛츠유, 두유 및 광유 등이 있다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로오스 및 관련된 당용액, 에탄올, 글리콜(예: 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌, 글리콜 또는 2-피롤리돈)이 특히 주사용액으로 바람직한 액체 담체이다. 본 발명의 조성물은 활성 성분의 서방성을 허용하는 방법으로 제형화될 수 있는 데포우(depot) 주사 또는 이식 제제 형태로 투여될 수 있다. 활성 성분은 펠릿 또는 작은 원통형으로 압착시키고 데포우 주사제 또는 이식제로서 피하내 또는 근육내로 이식시킬 수 있다. 이식은 생물학적으로 분해될 수 있는 중합체 또는 합성 실리콘, 예를 들어, 실라스틱과 같은 불활성 물질을 사용할 수 있다. 피하 주사시, 용량은 일반적으로 체중 1kg당 1,000 내지 150,000단위이며 이를 1일 1회 또는 수회 분할하여 투여하나 용량은 증상에 따라 적당하게 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은 제조자에 의해 권장되는 투여량에 따라 투여할 수 있다. 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 1 ug/ml 농도로 피하주사될 수 있다. 이때, VDUP1 단백질은 0.1 내지 10 ug/ml 의 양으로 포함될 수 있다.

본 발명에 따라 VDUP1은 pVHL와 HIF1-α의 결합 및 유비퀴틴화를 증가시키는 기능을 한다. pVHL와 HIF1-α의 결합 및 유비퀴틴화가 증가되면, HIF1-α의 분해를 촉진하여 HIF1-α 발현이 억제된다. 이로써 암전이가 억제되며, 그 외에 류마티스 성 관절염, 건선 또는 당뇨병성 망막증의 유발이 억제된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 VDUP1 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, HIF1-α 단백질의 분해를 촉진시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적상 상기한 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 핵산 서열은 VDUP1 단백질을 암호화는 핵산 서열로서, 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.

상기한 바와 같은 VDUP1 암호화 핵산 서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 VDUP1 단백질 암호화 핵산 서열은 이를 발현하는 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 벡터에 제공된다. VDUP1 유전자 핵산 분자를 포함하는 벡터로는 플라스미드, 파아지, 코스미드, 바이러스 벡터 등이 포함된다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

VDUP1 암호화 핵산 분자는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것 뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 VDUP1 단백질을 발현하는 발현 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다. 세포내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 약제학적 유효량의 VDUP1 단백질과 이의 촉진제를 포함하는, HIF1-α 단백질의 분해를 촉진시키기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본원에 사용된 용어 “촉진제”는 VDUP1의 발현을 증대시키거나 지속시킴으로써 HIF1-α의 발현을 상대적으로 감소시켜 주는 분자를 가리킨다. 촉진제는 VDUP1과 결합하여 그의 효과를 조절하는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 기타 다른 모든 분자를 포함할 수 있다. 이러한 촉진제 효능에 대한 화합물은, VDUP1 단백질 또는 이의 등가물을 스크리닝하고자 하는 화합물이 포함된 시료와 접촉시켜 VDUP1 작용 활성의 증가를 검출함으로써 스크리닝할 수 있다. 본 발명에서는 히스톤 디아세틸레이즈 저해제인 SAHA를 사용하였더니 VDUP1의 발현은 증가하는 반면, 이때 HIF1-α의 발현은 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 2의 c). 본 조성물의 경우, VDUP1 단백질은 0.1 내지 10 ug/ml, 촉진제는 10 내지 30 ug/ml의 양이 포함될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 양태로서, SAHA가 20 ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기한 바와 같은 VDUP1 단백질, VDUP1 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 또는 VDUP1 단백질과 이의 촉진제를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은, HIF-1α 단백질의 분해를 촉진시킴으로써 암, 류마티스성 관절염, 건선, 당뇨병성 망막증 등을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

참조예 1. 결합력 검정

VDUP1과 pVHL과의 상호 결합을 검정하기 위해 HA가 표지가 된 pVHL과 GST(Glutathione S-transferase)가 표지가된 VDUP1을 각각 세포내에 트렌스펙션하고 24시간후 세포의 라이세이트를 얻어 각각의 항체로 배양하고 결합된 항체를 다시 글루타치온-세파로스 4B (Amersham Bioscience)와 배양하였다. 이 결합체를 다시 세척용 용액으로 세척한후 남은 단백질들을 SDS-PAGE에 전기영동한후 결합된 VDUP1혹은 pVHL을 동일한 항체로 웨스턴 블랏을 하여 검정하였다.

참조예 2. 유비퀴틴화 검정

단백질의 유비퀴팀화를 검정하기 위해 세포에 HA가 표지된 유비퀴틴을 트렌스팩션하고 24시간후에 세포에 MG-132를 처리하고 저산소에 4시간 배양하였다. 그 후 세포 리아세이트를 HA 항체가 결합된 아가로스 (Sigma)와 배양하고 이에 결합된 단백질을 SDS-PAGE로 전기영동한후 다시 HA 항체로 웨스턴 블랏으로 검정하였다.

참조예 3. 세포 전이 검정

세포의 전이능력은 바이오코오트 매트리젤 전이 챔버 (BD Bioscience)를 이용하여 점검하였다. 즉, 힐라세포를 위 챔버에 3만개로 배양하고 낮은 챔버에는 배양액만을 넣어 배양하였다. 12시간 경과후 챔버 전체를 저산소조건으로 16시간 배양하고 중간 막을 회수하여 위부분을 면봉으로 닦아 위에 붙은 세포들을 완전히 제거한 후 아래 막에 붙은 세포를 Toluidine Blue (Sigma)로 염색하고 세포수를 세었다.

참조예 4. 동물모델에서 전이 검정

30만개의 B16-F10세포를 0.1ml의 식염수에 섞은후 생쥐의 혈관에 주사기를 이용하여 주사하였다. 2주후 생쥐를 희생하고 생쥐의 폐를 회수한 후 폐에 전이된 세포 콜로니 수를 세었다.

참조예 5. siRNA 를 이용한 VDUP1 발현 저해

VDUP1의 siRNA의 디자인하여 삼천리 약품 (주)에서 합성하였다.

즉, VDUP1 # 1 (sense); 5'-UCA UGC CAC CAC CGA CUU ATT-3', VDUP1 # 1 (antisense); 5'-UAA GUC GGU GGU GGC AUG ATT-3', VDUP1 # 2 (sense); 5'-CCA UCC AUG CUG ACU UUG ATT-3', and VDUP1 # 2 (antisense); 5'- UCA AAG UCA GCA UGG AUG GTT-3'.

siRNA 대조군으로는 luciferase 서열을 이용하였다 (sense); 5'-CGU ACG CGG AAU ACU UCG ATT-3', (antisense); 5'-UCG AAG UAU UCC GCG UAC GTT-3'.

100 nM의 각 혼합체를 LipofectAMINE Plus (Invitrogen)를 이용하여 세포에 트랜스펙션하였다.

실시예 1. VDUP1에의한 HIF1 -α의 발현 감소

VDUP1과 HIF1-α의 관계를 규명하기 위해 VDUP1과 HIF1-α 유전자를 293T 세포에 트랜스펙션시키고, 24시간 후에 세포를 저산소 혹은 정상산소에 4시간 처리한 후 각각의 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 발현을 확인하였다. 이를 통해, 산소가 있는 상태나 없는 상태 모두에서, VDUP1이 HIF1-α 단백질 발현을 급격히 감소시킨다는 것을 알 수 있었다(도 1의 a). 또한 힐라세포에 VDUP1을 여러 농도로 트랜스펙션한 후 세포내 자체의 HIF1-α 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하는 실험을 통해 VDUP1이 세포내에 자체적으로 존재하는 HIF1-α의 양도 감소시킴을 확인하였다(도 1의 b). 다음으로 VDUP1이 HIF1-α에의한 유전자 발현 활성에 미치는 영향을 살피기 위해 293T 세포에 VDUP1, HIF1-α를 트랜스팩션하고 동시에 HIF1-α-반응 리포터 (HRE-Luc)을 다시 트랜스팩션한후 리포터(HRE-LUC)의 활성을 측정함으로써, VDUP1이 농도의존적으로 HIF1-α의 유전자 발현 활성을 감소시킴을 알 수 있었다(도 1의 c). 또한 힐라세포에 VDUP1 siRNA를 트랜스팩션하여 VDUP1 발현을 억제한 후 HIF1-α의 발현을 측정하였다. 이를 통해 역으로 VDUP1의 발현을 siRNA-VDUP1으로 감소시키는 경우에는 HIF1-α의 발현이 증가함을 관찰 할 수 있었다(도 1의 d).

VDUP, pVHL, HIF1-α의 상호 결합을 측정하기 위하여, 294T 세포에 pVHL, HIF1-α 그리고 여러농도의 VDUP1을 트랜스펙션하여 결합을 확인하였다(도 3의 c). 본 실험에 의해 VDUP1의 양이 증가할수록, pVHL과 HIF1-α의 결합이 더욱 많아지는 것을 알 수 있었다. 그러나 VDUP1이 결핍된 294T 세포(-/-)에서는 pVHL과 HIF1-α의 결합이 감소된 것을 볼 수 있었다(도 3의 d). 한편 VDUP1을 증가시키는 SAHA를 힐라세포에 처리한 경우에는 pVHL과 HIF1-α의 결합이 더 강해지는 것을 확인하였다(도 3의 e). 한편 HIF1-α의 분해는 HIF1-α의 유비퀴틴화에 의해 결정되므로 VDUP1에의한 HIF1-α의 유비퀴틴화를 측정하였는데, VDUP1의 양이 증가됨에따라 HIF1-α의 유비퀴틴이 증가됨을 관찰하였다. 이상의 결과로 VDUP1은 pVHL과 HIF1-α의 결합 및 유비퀴틴화를 증가시킴을 알 수 있었다.

VDUP1이 결핍된 293T 세포 (-/-)에서 다시 HIF1-α의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였는데, HIF1-α의 단백질 양은 증가하였으나 HIF1-α의 유전자는 변화가 없음을 알 수 있었다(도 2의 a). 한편 pVHL 단백질이나 유전자 발현에는 변화가 없었다. 이어서 VDUP1이 결핍된 293T 세포 (-/-)에서 HIF1-α에 의해 조절되는 여러 유전자(β-액틴, VEGF, Glut-1, MIC2, cyclin G2)의 발현을 RT-PCR로 확인한 사진 이다. VDUP1이 결핍된 세포에서 VEGF, Glut-1, MMP2, MIC2, cyclin G2와 같은 유전자의 발현이 증가됨을 알 수 있었다 (도 2의 b). 또한 B16-F10 세포주를 10 uM SAHA로 처리하고 15시간 후 VDUP1과 HIF1-α의 양을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 상기 실험에 의해 SAHA가 산소가 있는 상태나 없는 상태 모두에서, VDUP1의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였으며, 이때 HIF1-α의 발현은 상대적으로 감소하는 것을 관찰하였다(도 2의 c). 또한 힐라세포에 VDUP1 siRNA를 트랜스팩션하고 50 ng/ml TNF-α로 6시간 처리한 후 HIF1-α 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하여, TNF-α는 거꾸로 VDUP1의 발현을 억제하고, HIF1-α 발현을 증가시키는데 이때 VDUP1을 siRNA로 감소시키면 HIF1-α의 발현이 더욱 증가함을 확인하였다(도 2의 d). 이상의 결과를 종합하여 VDUP1이 HIF1-α의 발현을 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2. VDUP1에의한 pVHL 과 HIF1 -α의 결합

VDUP1과 pVHL의 관계를 알아보기 위해, 293T 세포에 VDUP1과 pVHL을 동시에 트랜스펙션하고 각각의 항체로 면역침전을 시켰다. 이에 의해 VDUP1와 pVHL이 서로 결합함을 알 수 있었다(도 3의 a). 더욱이 힐라세포 라이세이트를 VDUP1 항체로 면역침전한 후 다시 pVHL을 웨스턴 블랏하여 두 단백질이 서로 결합함을 다시 확인할 수 있었다(도 3의 b). 다음으로 294T 세포에 여러농도의 VDUP1, pVHL 및 HIF1-α를 트랜스펙션하여 그 결합을 확인하였다. 상호 결합을 측정함으로서 VDUP1의 양이 증가할수록 pVHL과 HIF1-α의 결합이 더욱 많아진다는 것을 알 수 있었다(도 3의 c). 그러나 VDUP1이 결손된 294T 세포주에서는 이러한 결합을 관찰할 수 없었다(도 3d의 d). 한편 VDUP1을 증가시키는 SAHA를 힐라세포에 처리하였다. 그리고 웨스턴 블럿을 하여 SAHA의 처리에 의해 pVHL과 HIF1-α의 결합이 더 강해짐을 알 수 있었다(도 3의 e). 한편 HIF1-α의 분해는 HIF1-α의 유비퀴틴화에 의해 결정되므로 VDUP1에의한 HIF1-α의 유비퀴틴화를 측정하였는데, VDUP1의 양이 증가됨에따라 HIF1-α의 유비퀴틴이 증가됨을 관찰하였다. 이상의 결과로 VDUP1은 pVHL과 HIF1-α의 결합 및 유비퀴틴화를 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 3. VDUP1에의한 pVHL / HIF1 -α의 핵밖으로 이동

pVHL/HIF1-α의 핵 밖으로의 이동은 HIF1-α의 분해의 선제조건이다. VDUP1도 핵 속에 존재하는데, VDUP1이 실제 pVHL/HIF1-α의 이동에 관련하는가를 측정하기 위해, 힐라세포에 VDUP1, pVHL, HIF1-α를 트랜스팩션한 후 콘포칼현미경으로 각각의 발현을 측정하여 그 결과를 정량화하였다(도 4의 a 내지 도 4의 c). VDUP1 단독으로 과발현시에는 VDUP1이 약 30 내지 35% (저산소시), 약 45 내지 69% (산소시) 세포질에 있는데, pVHL와 HIF1-α를 동시에 과발현시키면 VDUP1은 거의 세포질로 이동함을 관찰하였다(도 4의 c). 이때 pVHL의 핵속에서의 양도 감소하며 HIF1-α도 핵에서 사라짐을 확인하였다(도 4의 b). 또한 pVHL은 핵이동에 관련된 NES가 없는데, VDUP1은 NES를 가지고 있음을 알 수 있었다(도 4의 d). 이 NES중 한 아미노산을 치환한 돌연변이 VDUP1 (VDUP1-L294A)를 만들어 비교하였을 때 돌연변이 VDUP1은 핵 이동이 저해되어 많은 양이 (3 내지 4배) 핵속에 그대로 머무는 것을 알 수 있었다(도 4의 e 및 도 4의 f). 한편 NES를 통한 핵이동을 저해하는 Leptomycin B (LMB)를 처리하면 돌연변이 VDUP과 같은 결과를 관찰할 수 있었다(도4의 d 내지 도 4의 f). 이상의 결과를 종합하여 VDUP1은 NES를 통해 pVHL/HIF1-α의 핵밖으로의 이동을 매개하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. VDUP1에의한 암전이 억제

위의 결과들로 VDUP1이 HIF1-α의 발현을 억제하는 것을 알 수 있었는데, 실제 암전이에 미치는 영향을 측정하였다. 우선 힐라와 H-1299세포에 VDUP1, 돌연변이 VDUP를 각각 트랜스팩션한 후 24시간 경과 후 HIF1-α 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 이를 통해 VDUP1이 HIF1-α 발현을 억제하며, 돌연변이 VDUP1는 HIF1-α양을 상대적으로 감소시키지 못함을 확인하였다(도 5의 a). 다음 힐라세포에 VDUP1을 트랜스팩션한 후 배양액에 분비된 VEGF의 양을 측정함으로써, VDUP1이 VEGF의 양을 감소시지만 돌연변이 VDUP1은 VEGF 양을 상대적으로 적게 감소시킨다는 것을 확인할 수 있다(도 5의 b). 또한 B16-F10 세포에 VDUP1 혹은 돌연변이 VDUP1을 발현한 후 생쥐의 동맥에 주사하고 2주 후에 폐에 전이된 양을 측정하였다. 본 실험에서, 두 경우 모두 암세포의 전이가 억제되었으나 돌연변이 VDUP1의 경우는 이러한 효과가 상대적으로 감소되었음을 알 수 있었다(도 5의 c).

또한 상기 실험을 통해 VDUP1이 암전이를 억제함을 확인하였다(도 5의 d).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 VDUP1은 HIF1-α의 핵이동을 매개함으로 HIF1-α의 분해를 촉진하여 HIF1-α 발현을 억제하는 유전자임을 알 수 있었다. 따라서 VDUP1 유전자, VDUP1 단백질, 또는 VDUP1 단백질과 이의 촉진제를 이용하여 HIF1-α 단백질의 분해를 촉진함으로써 암, 류마티스성 관절염, 건선, 당뇨병성 망막증 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질을 포함하는, HIF1-α 단백질의 발현을 억제하는 조성물.
VDUP1 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, HIF1-α 단백질의 분해를 촉진시키기 위한 조성물.
VDUP1 단백질과 이의 촉진제를 포함하는, HIF1-α 단백질의 분해를 촉진시키기 위한 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 촉진제는 SAHA(Suberoylanilide Hydroxamic Acid)인 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물은 암의 전이 치료, 류마티스성 관절염, 건선 또는 당뇨병성 망막증의 치료용인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 포함된 것을 특징으로 조성물.
VDUP1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 과발현시켜 HIF1-α의 핵 이동을 억제하는 방법.