KR100452027B1 - ＭｘＡ 단백질의 다형 유전자의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MxA 단백질의 다형 유전자 및 그 사용방법에 관한 것으로서, 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위한 유용한 지표가 될 수 있는 다형 부위를 갖는 폴리뉴클레오티드로서 서열번호 1∼4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 특징으로 한다.

Description

ＭｘＡ단백질의 다형 유전자의 사용 방법{USE OF POLYMORPHISM OF MxA PROTEIN}
본 발명은 MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자와, 상기 다형 유전자를 사용하여 인터페론 요법의 대상이 될 개체에서의 인터페론의 유효성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
인터페론은 척추동물 세포가 분비하는 단백질이고, 항바이러스성 작용, 면역조절작용 및 세포증식 억제작용을 갖는다. 이 때문에, 인터페론은 C형 간염 등의 여러가지 바이러스 감염증 및 악성종양 등의 치료에 널리 사용되고 있다. 그러나,인터페론에 대하여 감수성을 나타내지 않는 환자의 존재가 알려지기에 이르렀다. 인터페론 요법이 효과를 나타내지 않는 감염자에게 인터페론 요법을 계속하는 것은 환자에게 발열이나 빈혈 등의 부작용을 일으킬 뿐만 아니라, 다른 치료의 개시를 지연시키는 것이 된다. 따라서, 인터페론의 유효성을 미리 예측하여 이와 같은 비감수성의 환자를 인터페론 요법으로부터 배제하는 것이 요망되고 있다.
한편, 인플루엔자 바이러스에 저항성을 갖는 마우스로부터 발견해낸 인터페론 의존성 단백질, 즉 MxA 단백질이 알려져 있고 사람에게서도 MxA 단백질이 발견되고 있다. MxA 단백질은 인플루엔자 바이러스에 대한 저항성에 관여하는 것이 알려져 있었지만, 최근 만성 c형 간염 바이러스(이하, HCV라고 함)의 감염자에서의 MxA mRNA 및 MxA 단백질의 발현수준이, 인터페론 요법에 대한 감염자의 응답과 관련이 있다는 것이 보고되었다. 이 사실은 MxA 유전자가 인터페론 요법의 유효성을 치료전에 예측하기 위한 유용한 지표가 될 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
그래서, 본 발명자는 HCV 감염자의 인터페론 요법에 대한 응답성에 관여하여 MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자의 존재를 조사했다. 그 결과, 특정의 다형 유전자를 갖는 환자만이 인터페론에 대하여 감수성을 갖고 인터페론 요법이 유효하다는 것을 알았다.
상기 사정을 감안하여 본 발명의 제 1 과제는, 환자에 대한 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위해 유용한, MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 제 2 과제는 상기 MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자를 사용하여 환자에 대한 인터페론의 유용성을 예측하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 제 3 과제는 상기 MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자 중 인터페론 감수성의 원인인 다형 유전자를 사용하여 인터페론에 대하여 비감수성의 환자를 인터페론 감수성으로 하기 위한 유전자 치료 및 그에 유용한 벡터를 제공하는데에 있다.
도 1은 MxA 유전자의 프로모터 영역의 염기서열을 도시한 도면,
도 2는 HhaI를 사용한 RFLP의 전기 영동,
도 3∼6은 4종류의 SNP(T형, G형, A형, C형)을 갖는 MxA 프로모터의 각각에 대해서 Hela 세포내에서의 인터페론 α에 대한 응답성을, 상기 프로모터의 지배하에 있는 루시페라아제 활성을 지표로서 비교한 결과를 도시한 그래프, 및
도 7은 유전자를 도입한 Ptnk 벡터의 구조를 모식적으로 도시한 도면이다.
상기 과제는 이하에 설명하는 본 발명에 의해 달성된다.
본 발명의 제 1 측면에 따르면, 하기의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위한 폴리뉴클레오티드가 제공된다:
(at)하기 서열목록의 서열번호 1에 도시되는 폴리뉴클레오티드,
(bt)상기 (at)에 도시되는 폴리뉴클레오티드 중의 455위를 제외한 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 부가된 수식 폴리뉴클레오티드,
(ct) 서열번호 1의 441∼455 위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(dt) 서열번호 1의 449∼459 위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(et)그것들의 상보사슬.
본 발명의 제 2 측면에 따르면, 하기의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위한 폴리뉴클레오티드가 제공된다:
(ag)하기 서열목록의 서열번호 2에 도시되는 폴리뉴클레오티드,
(bg)상기 (ag)에 도시되는 폴리뉴클레오티드 중의 455위를 제외하고 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 부가된 수식 폴리뉴클레오티드,
(cg)서열번호 2의 441∼455위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(dg)서열번호 2의 449∼459위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(eg) 그것들의 상보사슬.
본 발명의 제 3 측면에 따르면, 하기의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위한 폴리뉴클레오티드가 제공된다:
(aa)하기 서열목록의 서열번호 3에 도시되는 폴리뉴클레오티드,
(ba)상기 (aa)에 도시되는 폴리뉴클레오티드 중의 455위를 제외한 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 또는 부가된 수식 폴리뉴클레오티드,
(ca)서열번호 3의 441∼455위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(da)서열번호 3의 449∼459위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(ea)그것들의 상보사슬.
본 발명의 제 4 측면에 따르면, 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위한 폴리뉴클레오티드가 제공된다:
(ac)하기 서열목록의 서열번호 4에 도시되는 폴리뉴클레오티드,
(bc)상기 (ac)에 도시되는 폴리뉴클레오티드 중의 455위를 제외한 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 또는 부가된 수식 폴리뉴클레오티드,
(cc)서열번호 4의 441∼455위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(dc)서열번호 4의 449∼459위에 도시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(ec)그것들의 상보사슬.
본 발명의 제 5 측면에 따르면, 인터페론을 투여할 개체에 대하여 인터페론 요법의 유효성을 예측하는 방법으로서,
1)적어도 하나의 인터페론 응답서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시료를 상기 개체로부터 채취하는 공정과,
2)적어도 하나의 상기 인터페론 응답서열에 대해서 3′말단으로부터 2번째에 위치하는 뉴클레오티드를 결정하는 공정을 구비한 방법이 제공된다.
이 방법에서 상기 뉴클레오티드가 티민이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효한 것으로 예측할 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오티드가 구아닌, 아데닌 또는 시토신이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하지 않을 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 제 6 측면에 따르면 인터페론을 투여할 개체에 대해 인터페론 요법이 유효한지의 여부를 예측하기 위한 시험약으로서, 청구항 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 시험약이 제공된다.
본 발명의 제 7 측면에 따르면, MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자를 검출하기 위한 프로브로서, 청구항 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브가 제공된다.
본 발명의 제 8 측면에 따르면, 인터페론의 유효성을 예측하기 위한, 상기 폴리뉴클레오티드의 사용이 제공된다.
본 발명의 제 9 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 (at)∼(et) 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인터페론 비감수성의 개체에 인터페론 감수성을 부여하기 위한 벡터가 제공된다.
본 발명의 제 10 측면에 따르면, 인터페론 비감수성의 개체에 인터페론 감수성을 부여하기 위한 방법으로서, 인터페론 비감수성의 개체에 대해서, 본 발명에 의한 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 11 측면에 따르면, 인터페론 비감수성의 개체에 인터페론 감수성을 부여하기 위한 의약을 제조하는데 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 (at)∼(ec) 중 어느 하나의 사용이 제공된다.
본 발명의 제 12 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 (at)∼(ec) 중 어느 하나가 도입된 비인간 유전자 도입 동물이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드는 인터페론 의존성 단백질인 사람 MxA 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, 본 발명자에 의해 이 폴리뉴클레오티드의 455위에 존재하는 1염기다형(single nucleotide polymorphism)(이하, SNP라고 함)이 인터페론 요법의 효과에 대한 응답성에 관여하고 있는 것이 처음으로 발견되었다.
각각의 폴리뉴클레오티드의 441∼456위에는 인터페론 응답서열(interferon-stimulated response element)(이하, ISRE라고 함)이 존재하고 있다.
서열번호 1의 441∼456위의 ISRE의 염기서열은 「GGTTTCGTTTCTGCTC」(서열번호 5)이고, ISRE의 15번째(서열번호 1의 455위에 상당한다. 서열번호 1에서의 455위는 전사개시부위를 +1로 하는 통상의 표기에 의하면 -88위에 상당한다)가 티민이다.
서열번호 2의 441∼456위의 ISRE의 염기서열은 「GGTTTCGTTTCTGCGC」(서열번호 6)이고, ISRE의 15번째(서열번호 2의 455위에 상당한다. 서열번호 2에서의 455위는 전사개시부위를 +1로 하는 통상의 표기에 의하면 -88위에 상당한다)가 구아닌이다.
또한, 서열번호 3의 441∼456위의 ISRE의 염기서열은 「GGTTTCGTTTCTGCAC」(서열번호 7)이고, ISRE의 15번째(서열번호 3의 455위에 상당한다. 서열번호 3에서의 455위는 전사개시부위를 +1로 하는 통상의 표기에 의하면 -88위에 상당한다)는 아데닌이다.
서열번호 4의 441∼456위의 ISRE의 염기서열은 「GGTTTCGTTTCTGCCC」(서열번호 8)이고, ISRE의 15번째(서열번호 4의 455위에 상당한다. 서열번호 4에서의 455위는 전사개시부위를 +1로 하는 통상의 표기에 의하면 -88위에 상당한다)는 시토신이다.
이하 본 명세서를 통하여 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 455위를 SNP 부위(SNP site)라고 한다.
이 ISRE의 SNP 부위 이외의 영역은 각 서열모두 공통이다. 이 ISRE의 15번째의 뉴클레오티드가 티민인 ISRE(서열번호 5)를 갖는 HCV 감염자는 인터페론 요법이 유효한 것에 비해, 15번째의 뉴클레오티드가 티민인 ISRE(서열번호 5)를 갖지 않는 HCV 감염자는 인터페론 요법이 유효하지 않은 것이 본 발명자들에 의해 역학적으로 실증되었다.
즉, 실시예에 상술되어 있는 바와 같이, 455위의 뉴클레오티드가 구아닌인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 호모접합으로 갖는(이하 G/G 호모라고 약칭) HCV 감염자는 455위의 뉴클레오티드가 티민인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와, 455위의 뉴클레오티드가 구아닌인 서열번호 1의 프로모터 영역을 헤테로 접합으로 갖는(이하, G/T 헤테로로 약칭) HCV 감염자, 또한 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 호모 접합으로 갖는(이하, T/T 호모라고 약칭) HCV 감염자와 비교하여, 인터페론 요법이 유효하지 않다는 것이 실증되었다.
또는 455위의 뉴클레오티드가 티민이 아닌 MxA 유전자의 프로모터 영역을 호모접합으로 갖는 HCV 감염자(이하, non-T/non-T 호모라고 약칭)는 T/non-T 헤테로 또는 T/T 호모의 HCV 감염자와 비교하여, 인터페론 요법이 유효하지 않는 것이 드러났다. non-T/non-T 호모의 조합으로서는 G/G, G/A, G/C, A/A, A/C, C/C가 있다. T/non-T 조합으로서는 T/G, T/A, T/C가 있다.
따라서, 인터페론 요법의 실시에 앞서, 예를 들어 HCV 감염자가 갖는 사람 MxA 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 ISRE에서의 SNP 부위의 뉴클레오티드를 결정함으로써, 상기 HCV 감염자에 대해서 인터페론 요법의 유효성을 검지할 수 있다.
상기 발견에 기초하여 본 발명에 의하면 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위한 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 인터페론을 투여할 개체에 대해서 인터페론 요법이 유효한지의 여부를 예측하는 방법이 제공된다. 또한, 피험자가 상기 어떤 SNP를 갖고 있는지를 검출하기 위한, 본 발명에 의한 폴리뉴클레오티드의 프로브로서의 사용이 제공된다.
또한, 인터페론 비감수성의 개체에 인터페론 감수성을 부여하기 위한 유전자 요법이 제공된다.
또한, 실험동물로서 유용한, 상기 뉴클레오티드를 포함하는 비인간 유전자 도입 동물이 제공된다.
이하, 본 발명의 각각의 측면에 대해서 개별적으로 설명한다.
<인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위한 폴리뉴클레오티드>
본 명세서에서 「폴리뉴클레오티드」라는 것은 2개 이상의 뉴클레오시드가 인산 에스테르 결합으로 결합되어 이루어진 물질을 의미한다. 「뉴클레오시드」에는 데옥시리보뉴클레오시드 및 리보뉴클레오시드가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에서 「폴리뉴클레오티드」라는 것은 펩티드 핵산, 몰포리노핵산, 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고 핵산 등의 인공합성핵산도 지칭하는 것으로 한다.
또한, 본 명세서에서 「프로모터 영역」이라는 것은 TATA박스 등의 전사개시반응에 직접 관여하는 영역만을 가리키는 것은 아니고, 상기 영역의 근방 또는 먼 곳에 존재하여 전사개시반응의 효율에 영향을 주는 조절서열을 포함하는 서열도 지칭하는 것으로 한다. 따라서, 「프로모터 영역」이라는 용어에는 전사개시반응에 관여하는 서열만, 조절서열만, 그리고 그 양자가 연결된 서열이 포함되는 것에 유의해야한다.
또한, 「ISRE」라는 것은 인터페론 α,β,γ 또는 ω의 자극에 의해 유도되는 유전자의 전사조절영역에 존재하는 약 12∼15개의 뉴클레오티드로 이루어진 염기서열을 의미한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 이하의 (a)∼(e)가 포함된다.
(a)서열번호 1,2,3,4 중 어느 하나에 도시되는 폴리뉴클레오티드.
(b)상기 (a)에 도시되는 폴리뉴클레오티드에 있어서 455위를 제외한 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 부가된 수식 폴리뉴클레오티드.
결실의 예로서는 128위, 133위, 152위, 508위 및 543위의 결실, 치환의 예로서는 330위의 치환(G→T), 542위의 치환(C→G), 부가의 예로서는 501위에의 부가(C)를 들 수 있다.
부가에 의한 수식 폴리뉴클레오티드의 다른 예로서는 상기 서열번호 1,2,3,4의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 단편에, 프로모터, 증폭제, 상류 활성화 서열, 사일렌서, 상류 억제 서열, 감쇠조절인자, 폴리 A 테일, 핵이행 시그널, Kozak 서열, ISRE, 약물내성인자, 시그널 펩티드의 유전자, 막관통 영역의 유전자, 루시페린, 녹색형광 단백질, 피코시아닌, 서양 와사비 퍼옥시다아제를 포함하는 마커 단백질의 유전자, 인터페론 응답성 단백질의 유전자, 비인터페론 응답성 단백질의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 연결되어 이루어진 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
또한, 서열번호 1,2,3,4에 나타나는 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열 중 인터페론 요법의 유효성에 관여하고 있는 것은 455위에 위치하는 SNP 부위에 존재하는 1개의 뉴클레오티드이므로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 455위의 SNP부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 단편이어도 좋다. 이 폴리뉴클레오티드는 11개의 뉴클레오티드 이상 30개의 뉴클레오티드 이하인 것이 바람직하다. 폴리뉴클레오티드 단편의 길이가 과도하게 길면, 1개의 뉴클레오티드의 차이를 식별하는 것이 곤란해진다. 한편, 기체(基體)에서 폴리뉴클레오티드의 길이가 과도하게 짧으면 시료중에 포함되는 폴리뉴클레오티드의 염기서열의 결정이 곤란해진다.
특히 바람직한 폴리뉴클레오티드로서는 하기의 (c)∼(e)를 들 수 있다.
(c)상기 455위의 SNP 부위를 포함하는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드의 단편으로서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4의 441∼456위에 상당하는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8에서 나타나는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(즉 상기 ISRE)를 포함하는 단편.
(d)상기 455위의 SNP 부위를 포함하는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드의 단편으로서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 449∼459위에 상당하는 서열번호 9, 10, 11, 12의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단편. 특히 (d)는 상기 SNP를 거의 중심으로 하고 전후 동등한 길이의 염기서열을 포함하는 것이므로, 고정밀도로 염기서열의 결정이 이루어진다. 또한 정밀도가 높은 검출을 실시하기 위해서는 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 447∼461위에 상당하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단편이 바람직하다.
또한, 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드로서는
(e)상기 (a)∼(d)에 나타나는 폴리뉴클레오티드의 상보사슬이어도 좋다.
상기 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8로 나타나는 서열(즉 상기 ISRE)의 상보사슬은 서열번호, 13, 14, 15, 16으로 나타나는 서열이다.
상기 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12로 나타나는 서열의 상보사슬은 각각 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20으로 나타나는 서열이다.
<인터페론 요법이 유효한지의 여부를 예측하는 방법>
본 발명에 의하면 인터페론 요법의 실시에 앞서, 어느 HCV 감염자의 상기 SNP의 뉴클레오티드를 결정함으로써 상기 HCV 감염자에 대해서 인터페론 요법이 유효한지의 여부를 예측할 수 있다. 지금까지는 어느 개체에 대해서 인터페론 요법이 유효한지의 여부를 사전에 판단할 수 없었으므로, 그러한 예측이 가능해진 의의는 매우 크다.
그 때문에, 본 발명은 인터페론을 투여할 HCV에 감염된 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효한지의 여부를 예측하는 방법으로서,
1)서열번호 1의 폴리뉴클레오티드, 또는 441∼456위의 염기서열을 갖는 상기 폴리뉴클레오티드의 단편을 함유하는 시료를 상기 개체로부터 채취하는 공정,
2)상류측에 위치하는 상기 ISRE에 대해서 3'말단으로부터 2번째에 위치하는 뉴클레오티드를 결정하는 공정, 및
3)상기 뉴클레오티드가 티민이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하다고 예측하는 공정을 구비한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법의 공정 3)을 대신하여 상기 뉴클레오티드가 구아닌, 아데닌 또는 시토신이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하지 않을 가능성이 높다고 예측하는 공정을 구비하는 방법을 제공한다.
또한, 인터페론 요법의 적응증은 C형 간염에 한정되지 않으므로, 본 발명은 인터페론을 투여할 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효한지의 여부를 예측하는 방법으로서,
1)적어도 1개의 인터페론 응답서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시료를 상기 개체로부터 채취하는 공정,
2)적어도 1개의 상기 인터페론 응답서열에 대해서 3'말단으로부터 2번째에 위치하는 뉴클레오티드를 결정하는 공정 및
3)상기 폴리뉴클레오티드가 티민이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하다고 예측하는 공정을 구비한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법의 공정 3)을 대신하여 상기 뉴클레오티드가 구아닌, 아데닌 또는 시토신이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하지 않을 가능성이 높다고 예측하는 공정을 구비하는 방법을 제공한다.
본 방법을 적용할 개체는 인터페론 요법이 유효한 질환, 바람직하게는 인터페론 α, β 또는 ω가 유효한 질환에 걸린 환자일 수 있다. 또한, 상기 개체는 건강한 자이어도 좋다. 인터페론 α, β 또는 ω가 유효한 질환에는 C형 간염 외에, 교모세포종, 수모세포종, 성상세포종, 피부악성 흑색종, B형 간염, 신장암, 다발성 골수종, 모상 세포 백혈병, 만성골수성 백혈병, 아급성 경화성 범뇌염, 바이러스성 뇌염, 면역억제환자의 전신성 대상포진 및 수두, 상인두미분화암, 청력저하를 수반하는 바이러스성 내이감염증, 포진성 각막염, 편평콘딜로마, 첨형 콘딜로마, 아데노바이러스 및 포진 바이러스 감염에 의한 결막염, 성기포진, 순측포진, 자궁경암, 암성 흉수증, 각화극세포종, 기저세포암, δ형 만성활동성 간염이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법을 실시하기 위해서는 우선 본 방법을 적용할 개체로부터 인터페론 응답서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시료를 채취한다. 본 발명의 방법의 대상이 되는 「개체」는 사람, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 양 및 원숭이를 포함하는 임의의 포유동물일 수 있지만 사람이 가장 바람직한 개체이다.
「인터페론 응답서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드」는 인터페론 응답성 단백질을 코드하는 유전자의 상류에 존재하는 제어서열(프로모터 영역 등)을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 것은 「인터페론 응답서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드」는 서열번호 1∼4의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 441∼456위의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드의 단편이다.
폴리뉴클레오티드는 체내에 널리 포함되어 있으므로 개체로부터 채취한 임의의 시료가 「인터페론 응답서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시료」가 될 수 있다. 바람직한 시료는 혈액이다.
개체로부터 시료를 채취한 후, 통상은 상기 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 추출하는 조작을 실시한다. 생체성분으로부터 폴리뉴클레오티드를 추출하는 방법으로서는 예를 들어 페놀 추출, 에탄올 침전 외에, 임의의 추출방법을 사용할 수 있다. mRNA을 추출하는 경우에는 올리고 dT 컬럼에 가하여도 좋다.
폴리뉴클레오티드의 양이 적을 때에는 필요에 따라서 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 조작을 실시해도 좋다. 증폭조작은 예를 들어 역전사 중합효소 반응(RT-PCR)을 포함하는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라고 약칭)에 의해 실시할 수 있다.
필요에 따라서 추출조작 및/또는 증폭조작을 실시한 후에는 적어도 하나의 인터페론 응답서열의 3'말단으로부터 2번째의 뉴클레오티드의 종류를 결정한다.
뉴클레오티드의 종류를 결정하는 데에는 가장 일반적으로는 결정할 뉴클레오티드를 포함하는 인터페론 응답서열을 끼고 있는 프라이머 대를 사용하여, 인터페론 응답서열을 증폭한 후, 또는 증폭하지 않고 상기 인터페론 응답서열의 염기서열을 결정하면 좋다.
결정할 뉴클레오티드가 제한효소의 인식부위 중에 존재하고 있는 경우에는제한효소단편 장다형법을 사용해도 좋다. 예를 들어, 상기 MxA 유전자의 프로모터 영역의 다형을 결정하는 경우, 455위의 뉴클레오티드가 구아닌인 서열번호 3의 ISRE는 염기서열 GCGC를 특이적으로 인식하여 절단할 수 있는 제한효소 HhaI에 의해 절단되는 것에 비해, 455위의 뉴클레오티드가 구아닌이 아닌 경우에는 HhaI에 의해 절단되지 않는다. 따라서, 서열번호 1의 455위의 뉴클레오티드를 동정하는 경우에는 HhaI를 사용한 RFLP법을 사용할 수 있다.
그 밖에, 다형을 결정하는 방법으로서는 PCR-SSP(PCR-특이적 서열 프라이머)법, 도트플롯법과 PCR을 조합한 PCR-SSO(PCR-서열 특이적 올리고뉴클레오티드)법 및 PCR-SSCP법 등의 주지의 방법을 사용할 수도 있지만 이에 한정되지 않는다.
또한, 도트 플롯법이라는 것은 서열이 이미 알려진 프로브 핵산사슬을 사용하여 시료중에 포함되는 특정의 서열을 가진 핵산사슬을 검출하는 하나의 방법이다. 이 방법은 예를 들어 기판상의 유기박막에 1사슬 핵산의 시료를 고정화하고 다음에 형광물질 등으로 표지한 1사슬의 프로브 핵산사슬의 용액을 이 박막상의 시료에 접촉시킨다. 시료가 프로브 핵산사슬과 상보적인 서열을 갖고 있으면 프로브 핵산사슬과 교잡하여 2사슬을 형성하므로, 기판상에 고정된다. 따라서, 세정에 의해 미반응의 핵산사슬을 제거한 후, 프로브에 붙인 표지를 검출함으로써 프로브에 대하여 상보적인 서열을 갖는 시료핵산사슬을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 MxA 단백질의 다형 유전자의 검출에서의, 본 발명에 의한 폴리뉴클레오티드의 프로브로서의 사용도 포함하는 것이다. 또한, 청구항 제 1 항∼청구항 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는, 인터페론을투여할 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효한지의 여부를 예측하기 위한 시험약도 또한 본 발명에 포함된다.
상기와 같은 방법에 의해 인터페론 응답서열의 3'말단으로부터 2번째의 뉴클레오티드의 종류를 결정하고, 상기 뉴클레오티드가 티민이면, 인터페론 요법이 유효하다고 예측할 수 있다. 또는, 이와 같은 방법에 의해 상기 뉴클레오티드가 구아닌, 아데닌 또는 시토신이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하지 않을 가능성이 높다고 예측할 수 있다.
<유전자 치료>
상기와 같이 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하기 위해서는 그 개체가 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 가질 필요가 있다.
(at)하기 서열목록의 서열번호 1에 나타나는 폴리뉴클레오티드,
(bt)상기 (at)에 도시되는 폴리뉴클레오티드 중의 455위를 제외한 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 또는 부가되는 수식폴리뉴클레오티드,
(ct)서열번호 1의 441∼455위에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(dt)서열번호 1의 449∼459위에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(et)그의 상보사슬
따라서, 상기 뉴클레오티드 (at)∼(et)는 인터페론 요법이 유효하지 않은 개체에 대해서 이 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 상기 개체를 인터페론 감수성으로 하고, 인터페론 요법을 유효하게 하기 위한 유전자 치료에 사용할 수 있다.
즉, 본 발명에는 인터페론 비감수성의 개체에 인터페론 감수성을 부여하기 위한 방법으로써, 인터페론 비감수성의 개체에 대하여 상기 폴리뉴클레오티드 (at)∼(et) 중 어느 하나를 도입하는 것을 포함하는 방법이 포함된다. 또한, 청구항 제 1 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 인터페론 비감수성의 개체에 인터페론 감수성을 부여하기 위한 벡터가 포함된다. 또한, 인터페론 비감수성의 개체에 인터페론 감수성을 부여하기 위한 의약의 제조에 있어서, 청구항 1에 기재된 폴리뉴클레오티드의 사용이 포함된다.
또한, 상기 본 발명의 벡터는 이것을 적절한 숙주로 형질전환하여 발현시킴으로써 인터페론 감수성을 부여하는 단백질을 제조하기 위해서도 사용할 수 있다.
<유전자 도입 동물>
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하면 상법에 의해 비인간 유전자 도입 동물을 제작할 수 있다. 이 비인간 유전자 도입 동물은 인터페론의 기능을 연구하기 위한 실험동물로서 유용하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1
본 실시예에서는 MxA 유전자의 프로모터 영역의 -88위(서열번호 1의 염기서열에서는 455위에 상당한다)의 뉴클레오티드가 티민인 유전자(이하 MxA(T)로 표기함)를 헤테로 또는 호모접합으로 갖는 HCV 감염자는, 상기 뉴클레오티드가 구아닌인 유전자(이하 MxA(G)로 표기함)를 호모접합으로 갖는 HCV 감염자에 비해 인터페론 요법에 대한 응답성이 좋을 것은 실증했다.
<피험자>
조직학적으로 만성 c형 간염이라고 증명되어, 인터페론 요법을 실시하고 있는 115명의 환자와, 항 HCV 음성의 건강한 자 42명이 본 연구에 참가했다. 이 사람들은 전원 일본인이고 서로 혈연관계는 없다.
115명의 환자 중 52명의 환자는 인터페론 요법 종료후의 적어도 6개월의 추적 기간 중, 혈청 알라닌아미노트랜스퍼라아제의 레벨이 정상적인 범위에 있고, 또한 HCV의 RNA가 항상 음성인 지속적 응답자(이하, SR로 표기함)이고, 63명의 환자는 ALT 레벨에 관계없이, 추적기간중에 HCV의 RNA가 양성 그대로이고, 또는 c형 간염을 재발한 비응답자(이하 NR으로 표기함)였다. 모든 환자에는 총용량 300만 유닛을 초과하는 인터페론 α 및/또는 β를 투여했다.
<MxA 유전자 분석>
환자와 건강한 대조군으로부터 채취한 PBMC로부터 핵산을 추출했다. 상기 핵산을 PCR에 제공하고, MxA 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 599 뉴클레오티드의 DNA를 증폭했다.
PCR의 개략은 이하와 같다.
0.05㎍의 핵산을 Taq-Gold(퍼어킨엘머), 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 #MXAF01(전방프라이머, -569∼-540위) 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 #MXAF02(역전프라이머, +30∼+1위)와 혼합한 후(-569∼-540위는, 서열번호 1의 염기서열의 47∼76위에 상당한다), ［95℃ 10분］, ［95℃ 10초, 68℃ 60초］×55, ［72℃ 7분］의 사이클 조건에서 반응시켰다. PCR 산물을 직접 해독함으로써 157개의 시료 중 12개를 서열결정했다.
서열결정에 의해 증폭한 영역중의 SNP 부위를 동정한 후, 대립유전자의 뉴클레오티드를 식별 가능하게 검출하기 위한 RFLP 시스템을 구축했다. 전체 환자의 599 뉴클레오티드의 PCR 산물을 HhaI(GCG↓C)로 소화하고, 아가로스겔 중에서 전기영동하여 482 뉴클레오티드의 밴드 및 533 뉴클레오티드 밴드 중 어느 하나 또는 양자가 생성되는지의 여부를 조사했다.
<통계분석>
이에츠의 보정을 실시하여 또는 실시하지 않고 피셔의 정확한 확율 테스트에 의해 그룹 데이터를 비교했다. p<0.05를 통계학적으로 유의라고 간주했다.
<결과>
12개의 샘플의 서열결정을 실시함으로서 MxA 유전자의 프로모터 영역중에 다형부위가 동정되었다. 상기 프로모터 영역의 -88위에는 SNP가 존재하고(G와 T), 상기 SNP는 도 1에 도시되어 있는 ISRE에 유사한 영역중에 포함되어 있었다.
계속하여 HhaI에 의한 RFLP에서는 전 157개의 샘플에 대해서 MxA 유전자의 유전자형을 결정했다. 상기 분석에서는 다형부위에 구아닌을 갖는 시료는 전기영동겔에 482 뉴클레오티드의 밴드를 나타냈다. 이에 비해, 구아닌이 티민으로 치환되면, HhaI가 인식하는 제한부위가 소실되므로, 533뉴클레오티드의 밴드를 나타냈다. 다형부위가 구아닌인 프로모터 영역과 다형부위가 티민인 프로모터 영역을 헤테로 접합으로 갖는 경우에는 482 뉴클레오티드의 밴드와 533 뉴클레오티드의 밴드가 모두 검출된다(도 2 참조).
표 1에 나타나 있는 바와 같이 NR군에서는 환자의 62%가 상기 다형부위가 구아닌인 프로모터 영역을 호모접합으로 갖고 있었지만(G·G호모), SR군에서는 환자의 31%가 G·G 호모였다(p=0.0009; SR 대 NR). 반대로 NR군에서는 환자의 35%가 상기 다형부위가 구아닌인 프로모터 영역과 상기 다형부위가 티민인 프로모터 영역을 헤테로 접합으로 갖고 있었지만(G·T 헤테로), SR군에서는 환자의 60%가 G·T 헤테로였다(p=0.0082; SR 대 NR). T·T호모의 환자는 각각, NR군에서 3.2%, SR군에서 10%였다(p=0.2956; SR 대 NR).
상기 다형부위가 구아닌인 프로모터 영역을 갖는 대립유전자의 빈도는 SR군에서는 0.606이었던 것에 비해 NR군에서는 0.794였다(p=0.0018; SR 대 NR).
MxA 프로모터의-88위의 다형 SR 환자(n=52) NR(n=63) 건강한 대조군(n=42) p:SR 대 NR
대립유전자 빈도
G 0.606 0.794 0.714 0.0018
T 0.394 0.296 0.286 0.0018
접합형
G·G호모 16(31%) 39(62%) 20(48%) 0.0009
G·T헤테로 31(60%) 22(35%) 20(48%) 0.0082
T·T호모 5(10%) 2(3.2%) 2(4.8%) 0.2956*
*이에츠의 보정을 실시했다
또한, NR군에 비해 SR군에서는 G·G 호모의 개체가 유의로 적다는 상기의 결과는 환자가 감염된 HCV의 유전자형에 의존하지 않는 것도 분명해졌다.
MxA 프로모터의 -88위에 위치하는 SNP의 접합형 SR환자 NR환자 p:SR 대 NR
유전자형이 1b인 HCV에 감염된 환자 n=18 n=42
G·G 호모 5(28%) 26(62%) 0.0321*
G·T 헤테로 12(67%) 14(33%) 0.0170
T·T 호모 1(5.6%) 2(4.8%) 0.6051*
유전자형이 2a 또는 2b의 HCV에감염된 환자 n=34 n=21
G·G 호모 11(32%) 13(62%) 0.0318
G·T 헤테로 19(56%) 8(38%) 0.1999
T·T 호모 4(12%) 0 0.2722*
*이에츠의 보정을 실시했다
표 2로부터 밝혀진 바와 같이 유전자형이 1b인 HCV에 감염된 환자군(HCV 1b군)과 유전자형이 2a 또는 2b인 HCV에 감염된 환자군(HCV 2a/2b군)에서는, 모두 NR군은 62%가 G·G호모의 개체인 데에 비해 SR군은 각각 28% 및 32%가 G·G 호모의 개체였다. 표 2에 나타낸 결과로부터 환자가 감염된 HCV의 유전자형에 상관없이 SR군에서는 G·G호모의 개체가 유의로 적은 것이 분명해졌다(HCV 1b군; p=0.0321, HCV 2a/2b 군; p=0.0318).
이상, 본 실시예에 의해 상기 다형부위가 티민인 MxA 프로모터 영역을 헤테로 접합 또는 호모접합으로 갖고 있는 HCV 감염자는 감염된 HCV의 유전자형에 상관없이 인터페론 요법에 높은 응답성을 나타내는 것이 실증되었다.
또한, 본 실시예에는 상기 다형 부위가 구아닌이 아닌 MxA 프로모터 영역을 헤테로 접합 또는 호모 접합으로 갖고 있는 HCV 감염자는 인터페론 요법에 높은 응답성을 나타내는 것도 시사하고 있다.
또한, 상기 다형 부위는 ISRE중에 존재하므로 이것은 c형 간염 이외의 환자에 대해서도 적합하다고 할 수 있다.
실시예 2:
실시예 1에서 밝혀진 바와 같이 MxA 프로모터의 SNP가 T형인 HCV 감염자는 인터페론 투여에 의한 간염의 치료효과가 높다. 한편, 그 SNP가 G형인 경우에는 치료효과가 낮다. 이 이유로서 ISRE의 기능을 하기 위한 염기서열인 T형은 인터페론의 자극에 올바르게 응답하지만 G형은 그 서열과 1염기만 다르므로, 인터페론의 자극에 응답하지 않고 MxA 단백질의 생성량이 낮기 때문이라고 해석된다.
이와 같은 상황으로부터 생각하면 MxA 프로모터의 SNP가 c형 및 A형의 HCV 간염의 환자도 G형과 동일하게 인터페론에 MxA 프로모터는 응답하지 않고 그 치료효과는 낮은 것으로 추정된다.
이것을 증명하기 위해 MxA 프로모터의 하류에 루시페라아제 유전자를 갖는 플라스미드를 구축하고 이것을 인간세포(헬라 세포 및 난소암 세포)에 트랜스펙션했다. 그리고, 4종류의 SNP(T형, G형, A형, C형)을 갖는 MxA 프로모터의 각각에 대하여 이것이 인터페론에 응답한 결과로서 생산되는 루시페라아제 활성을 조사했다.
그 결과를 도 3∼도 6에 도시한다. 도 3은 인터페론 α를 사용하여 헬라 세포내에서 유도한 예, 도 4는 인터페론 α를 사용하여 난소암 세포내에서 유도한 예, 도 5는 인터페론 β를 사용하여 헬라 세포내에서 유도한 예, 도 6은 인터페론 β를 사용하여 난소암 세포내에서 유도한 예이다. 또한, 이 도면에서 +는 인터페론을 첨가한 경우의 루시페라아제 활성을 나타내고, -는 인터페론을 첨가하지 않았을 때의 루시페라아제 활성을 나타내고 있다. 이들의 결과는 모두 3회의 실험의평균값이고 그 표준편차를 막대로 표시했다.
도면으로부터 알 수 있는 바와 같이 어떤 경우에도 T형의 MxA 프로모터가 가장 높은 값을 나타내고, A형과 C형의 SNP를 갖는 HCV 간염의 환자는 G형의 경우와 동일하게 인터페론 및 인터페론에 대한 응답이 낮다. 따라서 인터페론에 의한 치료효과가 낮은 것이 예측된다.
실시예 3
본 실시예에서는 MxA 유전자를 도입한 배성간세포(이하, ES세포라고 표기함)에 의한 MxA 단백질의 생성에 대해서 설명한다.
MxA 유전자의 프로모터 영역의 -88의 염기가 T의 유전자(MxA(T)) 및 G의 유전자(MxA(G))를 포함하는 영역을 프라이머 #MXAF01(서열번호 5), #MXAR02(서열번호 6)을 사용하여 PCR법에 의해 증폭했다.
다음에, 증폭산물을 인산 칼슘법으로 각각 ES 세포에 트랜스펙트했다. 반응조건은 모두 이미 알려진 조건에 따랐다. 이 세포에 IFN-α를 작용시켜 MxA 단백질의 생산량을 노던블롯으로 비교했다.
그 결과 MxA(G) 유전자를 도입한 세포에서는 유전자를 도입하고 있지 않은 세포와 비교하여 약 1.2배량의 MxA 단백질의 생성을 확인할 수 있었다. 한편, MxA(T)유전자를 도입한 세포에서는 대조군 세포의 약 2.5배, MxA(G) 유전자를 도입한 세포와 비교하여 약 2배의 MxA 단백질량을 나타내는 것을 알 수 있었다.
본 실시예에 의해 ES 세포중에 MxA(T) 유전자를 도입함으로써 MxA 단백질을 다량으로 생성할 수 있는 것이 밝혀졌다.
본 실시예의 결과로부터 MxA(T)유전자를 도입한 ES세포를 사용함으로써 인터페론이 유효한 질병에 대한 유전자 치료의 가능성이 시사되었다.
또한, MxA 유전자를 도입한 ES 세포를 이용하면 키메라 동물을 작성할 수 있다. 또한, 키메라 동물을 교배하면 유전자 도입 동물을 얻을 수도 있다.
실시예 4: ES세포에의 유전자 도입
ES 세포는 ES/LIF 배지에서 배양한 후, 전기천공법으로 유전자의 도입을 실시했다. 전기천공법의 조건을 이하에 나타냈다.
<액조성>: 20m㏖/L-HEPES(pH 7.3), 137m㏖/L-NaCl, 5m㏖/L-KCl, 0.7m㏖/L-Na2HPO4, 6m㏖/L-글루코스, 0.1m㏖/L-2-메르캅토에탄올
<조건>: 450v, 250μF, 10분, 실온, 4㎜ 큐벳
전기천공법 후, 세포를 ES/LIF 배지로 옮기고 이미 알려진 방법에 따라 200μg/L의 아미노글리코시드 인산전달효소(G418)와 2μ㏖/L의 간시클로비어(GANC)를 사용하여 유전자가 도입된 세포를 선택했다. 얻어진 세포로부터 DNA의 추출을 실시하여 서던교잡으로 목적 단편이 도입되어 있는 것을 확인했다.
본 실시예에 의해 전기천공법을 사용하여 ES 세포에 유전자를 도입할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 5
본 실시예에서는 벡터로의 MxA 유전자의 도입에 대해서 설명한다.
MxA 유전자의 프로모터 영역의 -88의 염기가 티민인 유전자(MxA(T)) 및 구아닌인 유전자(MxA(G))를 포함하는 영역을 프라이머 #MXAF01(서열번호 5), #MXAR02(서열번호 6)을 사용하여 PCR법에 의해 증폭했다. 다음에 증폭산물을 pNTK 벡터에 따라 도입했다(도 7). 반응조건은 모두 이미 알려진 조건에 따랐다. 벡터는 제한효소로 직쇄로 절단한 후 세포로의 도입에 이용했다.
MxA 유전자가 도입된 벡터를 사용하면 표적 세포에 MxA 유전자를 도입하여 인터페론에 대한 응답성을 개선할 수 있었다.
실시예 6
본 실시예에서는 MxA 유전자를 도입한 ES 세포에서의 MxA 단백질 생성을 설명한다.
MxA(T) 또는 MxA(G) 유전자를 도입한 이 세포에 IFN-α를 작용시켜 MxA 단백질의 생산량을 비교했다. 노던블롯팅으로 비교를 실시한 결과, MxA(G) 유전자를 도입한 세포에서는 어떤 작용도 하지 않고 있는 세포와 비교하여 약 1.5배의 MxA 단백질 생성을 확인할 수 있었다. 한편 MxA(T) 유전자를 도입한 세포에서는 대조군 세포의 약 4.5배, MxA(G) 유전자를 도입한 세포와 비교하여 약 3배의 값을 나타낸 것을 알았다.
이상의 결과로부터 MxA(T) 유전자를 도입한 ES 세포를 사용함으로써 인터페론이 유효한 질병에 대한 유전자 치료를 실시할 수 있을 가능성이 시사되었다.
본 발명은 환자에 대한 인터페론 요법의 유효성을 예측하기 위해 유용한, MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자를 제공하고, 상기 MxA 유전자 프로모터영역의 다형 유전자를 사용하여 환자에 대한 인터페론의 유용성을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 MxA 유전자 프로모터 영역의 다형 유전자 중 인터페론 감수성의 원인인 다형 유전자를 사용하여 인터페론에 대하여 비감수성의 환자를 인터페론 감수성으로 하기 위한 유전자 치료 및 그에 유용한 벡터를 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA <120> Single nucleotide polymorphism in the promoter region of MxA gene and use thereof <130> A000001162 <140> <141> <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 581 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120 ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgctcccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 2 <211> 581 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120 ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcgcccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 3 <211> 581 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120 ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcacccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 4 <211> 581 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120 ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcccccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggtttcgttt ctgctc 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggtttcgttt ctgcgc 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggtttcgttt ctgcac 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggtttcgttt ctgccc 16 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ttctgctcccg 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ttctgcgcccg 10 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ttctgcacccg 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ttctgcccccg 10 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gagcag aaacgaaacc 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gcgcag aaacgaaacc 16 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gtgcag aaacgaaacc 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gggcag aaacgaaacc 16 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 cgggagcagaa 10 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 cgggcgcagaa 10 <210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cgggtgcagaa 10 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 cgggggcagaa 10 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 21 acacacccgt ttccaccctg gagaggccag 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 22 tgcgcagtgc tggagtgcgg cctccgctct 30

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  6. C형 간염 바이러스에 감염된 개체에 대해서 인터페론 요법의 유효성을 예측하는 방법에 있어서,
    1)서열번호 5 내지 서열번호 8로 나타내어지는 인터페론 응답서열들 중 적어도 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시료를 상기 개체로부터 채취하는 공정과,
    2)적어도 하나의 상기 인터페론 응답서열에 대해서 3' 말단으로부터 2번째에 위치하는 뉴클레오티드를 결정하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스에 감염된 개체에 대해서 인터페론 요법의 유효성을 예측하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    3)상기 뉴클레오티드가 티민이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하다고 예측하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    3)상기 뉴클레오티드가 구아닌, 아데닌 또는 시토신이면, 상기 개체에 대하여 인터페론 요법이 유효하지 않을 가능성이 높다고 예측하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 인터페론 응답서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법:
    (1)하기의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:
    (at) 하기 서열목록의 서열번호 1에 나타나는 폴리뉴클레오티드,
    (ct) 서열번호 1의 441∼456위에 상당하는 서열번호 5에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (dt) 서열번호 1의 449∼459위에 상당하는 서열번호 9에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (et) 서열번호 13 및 서열번호 17에 나타나는 그것들의 상보사슬.
    (2)하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:
    (ag) 하기 서열목록의 서열번호 2에 나타나는 폴리뉴클레오티드,
    (cg) 서열번호 2의 441∼456위에 상당하는 서열번호 6에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (dg) 서열번호 2의 449∼459위에 상당하는 서열번호 10에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (eg) 서열번호 14 및 서열번호 18에 나타나는 그것들의 상보사슬.
    (3)하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:
    (aa) 하기 서열목록의 서열번호 3에 나타나는 폴리뉴클레오티드,
    (ca) 서열번호 3의 441∼456위에 상당하는 서열번호 7에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (da) 서열번호 3의 449∼459위에 상당하는 서열번호 11에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (ea) 서열번호 15 및 서열번호 19에 나타나는 그것들의 상보사슬.
    (4)하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:
    (ac) 하기 서열목록의 서열번호 4에 나타나는 폴리뉴클레오티드,
    (cc) 서열번호 4의 441∼456위에 상당하는 서열번호 8에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (dc) 서열번호 4의 449∼459위에 상당하는 서열번호 12에 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (ec) 서열번호 16 및 서열번호 20에 나타나는 그것들의 상보사슬.
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