KR100441202B1 - Ｈｐｖ ｅ６ 유전자를 발현하는 마우스 수정란 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유방암 발현 모델로 사용될 수 있는 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 형질전환 동물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 형질전환 동물은 β-카제인 프로모터와 기능적으로 연결된 인간 파필로마 바이러스(HPV)의 초기 유전자 중 하나인 E6 유전자가 염색체 내에 통합되어 있으며, 유방암이 비교적 늦게 발현되기 때문에 종양인자(tumorgen) 및 종양치료약의 스크리닝에 효과적으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 형질전환된 동물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유선암 동물모델로 사용될 수 있는 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 형질전환된 동물에 관한 것이다.
현대사회의 다변화와 산업화에 따른 기술의 발전은 다양한 인체 질환을 발생시켰으며 이들을 치료하기 위한 새로운 약제 및 치료방법의 개발, 그리고 약품·식품의 안전성 시험 및 난치병인 암의 정복을 위한 새로운 시험계의 개발이 지속되고 있다.
유방암은 전세계적으로 많은 여성들에게서 발병하는 질환으로서, 이를 극복하기 위해 많은 연구가 진행되고 있으나, 아직 효과적인 치료제가 개발되지 못하고 있다.
사람 파필로마 바이러스(Human Papiloma virus: HPV)는 인체에서 후두암, 생식기암, 특히 남녀의 음경부종양, 자궁암 등 악성 종양을 유발하는 것으로 알려져 있다(1, 2). HPV의 초기 종양 유전자인 E6/E7 유전자는 발암 기작과 상당한 관련성이 있는 것으로 알려져 있으며, E6의 경우 p53과 상당한 관련성이 있으며, E7의 경우는 레티노블라스토마 Rb(retinoblastoma)와 밀접한 관계성이 있는 것으로 보고되어 있다(3, 4).
E6와 p53의 결합 및 E7과 Rb의 결합에 의해 세포주기의 조절이 파괴되고, 그로 인해 일반조직은 악성종양으로 발전한다고 보고되어 있다. HPV를 이용한 형질전환 마우스로는 E6/E7 유전자를 동시에 발현시켜 특정 암을 유발한 예가 보고된 바 있으나, 유선암을 유발시킨 예는 없다. E6/E7 유전자 혹은 E7 유전자 단독의 유전자를 MMTV 프로모터 등의 적절한 프로모터와 연결시켜 유선암을 유발시키고자 하는시도가 있었지만, 유선암 특이적으로 발현되지는 않고, 대신 침선(salivary gland), 임파종 또는 피부암 등과 함께 유발되는 것으로 보고되어 있다. E6 유전자 단독으로는 유선암 유발능력(potency)이 낮아서, 암유발 효과가 없는 것으로 인식되어 있어, 이를 이용한 종양 유발 연구가 별로 진행되지 않았다(5, 6).
다만, 최근에 미국특허 제 5,698,764호 및 제 5,709,844호에는 HPV의 E6 및 E7 유전자를 비롯한 초기 종양유전자(early region oncogene)를 케라틴 프로모터에 결합시킨 후, 동물의 염색체에 통합시켜 전이성 상피암을 유발시킨 형질전환 동물의 예가 언급되어 있다.
그러나, 종양유발 유전자라 하더라도, 이를 실험동물의 염색체 내에 통합시켜 실험모델용 형질전환 동물을 제작하고자 할 때, 반드시 목적하는 부위에서 암이 발생하는 것은 아니어서, 암이 유발되지 않을 수도 있고 전혀 엉뚱한 부위에 암이 유발되는 경우도 있다. 더욱이, HPV의 E6 유전자가 유선암의 발생과 관련이 있다고 보고되어 있으면서도, E6 단독으로는 암 유발능이 매우 낮은 것으로 알려져 있어, 이를 이용한 유선암 발현 연구가 활발히 진행되지 않았다.
한편, HPV E6/E7 유전자를 동시에 발현시키거나 혹은 E7 유전자를 단독으로 발현시킨 종래의 형질전환 마우스에서는 암화(癌化) 과정이 전기(前期)에 일어나기 때문에 종양의 치료약물을 스크리닝하는 데에는 이용될 수 있지만, 종양 유발인자를 스크리닝하거나 종양 유발인자인지의 여부를 확인하기 위한 목적으로는 이용하는 데에는 제한이 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 새로운 유선암 동물모델로 사용될 수 있는 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 형질전환 동물을 제공하는 것이다.
본 발명은 인간 파필로마 바이러스(HPV)의 E6 유전자의 발현에 의해 유선암을 발현시키는 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 형절전환 동물을 제공한다.
또한, 본 발명은 β-카제인 프로모터에 기능적으로 연결된(operably linked) HPV E6 유전자가 염색체 내에 통합되어 있는 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 유선암 모델 형질전환 동물을 제공한다.
상기한 본 발명의 특징 및 그 외의 다른 특징들은 후술하는 본 발명의 상세한 설명에 의하여 당업자에게 잘 드러날 수 있다.
도 1은 본 발명의 형질전환 마우스를 생산하기 위해 사용되는 HPV E6 유전자를 함유하는 pCHPVE6 카세트의 제작도이다.
도 2는 CHPVE6 형질전환 및 그의 표현형을 확인하기 위해 수행된 서던 블럿팅 결과로써 전기영동사진 및 성인 형질전환 마우스의 사진이다.
도 3은 종양이 발생한 형질전환 마우스와 종양이 발생하지 않은 형질전환 마우스의 유선(mammary gland)에서의 E6 전사체 발현을 비교한 전기영동결과이다.
도 4는 형질전환 마우스 TG32 계통에서의 E6 전사체가 조직-특이적으로 발현됨을 보여주는 전기영동결과이다.
도 5는 형질전환 마우스 TG32 계통에서 발생한 유선암의 조직학적 분석사진이다.
도 6은 형질전환 마우스 TG32 계통의 눈에서 발생한 암의 조직학적 분석사진이다.
본 발명은, 그의 염색체 내에 HPV의 E6 유전자가 통합되어 있고, 상기 유전자는 β-카제인 프로모터에 기능적으로 연결되어 있으며(operably linked), 상기 HPV E6 유전자의 발현에 의해 유선암이 발생하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란을 제공한다. 상기 염색체는 체세포 및 생식세포 염색체를 말한다.
HPV는 파필로마 바이러스 16과 같은 인간 파필로마 바이러스이면 어떤 종류이든 사용될 수 있다. E6 유전자는 HPV의 감염초기에 발현되는 종양유전자 중 하나로서, 그 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면 GENBANK와 같은 기관으로부터 서열에 관한 정보를 쉽게 입수할 수 있다. HPV의 E6 유전자는 사람에서 자궁암을 유발하는 것으로 알려져 있지만, 동물 모델에서 유선암을 발생하도록 한 예는 없었다. 본 발명에서는 적절한 프로모터의 조절하에 발현되어, 동물에서 유선암을일으킬 수 있는 전장(full-length) E6 유전자를 사용하였지만, 그의 단편 등도 사용될 수 있다. E6 유전자는 발현과정 중에 두가지 형태의 스플라이싱(splicing)을 수행하는데(도 1 참조), 본 발명의 E6 유전자는 이들 모두를 포함한다. E6 유전자의 염기서열은 모두 공지되어 있으며, 자연에서 분리된 것 혹은 합성한 것 모두를 이용할 수 있다.
본 발명에서 HPV의 E6 유전자가 특징적으로 동물의 유선조직에서 발현되도록 조절하기 위해서, 프로모터로는 β-카제인 프로모터를 사용한다. HPV의 E6 유전자는 이 프로모터에 기능적으로 연결되어 있고, 동물의 유선조직에서 발현되어 암을 발생시킨다. 한편, HPV E6 발현의 종결인자로는 HBS 종결인자를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동물로는 인간을 제외한 동물로서 예를 들면 마우스 혹은 랫트(rat)가 포함될 수 있으며, 형질전환 동물의 생산 성공확률 면에서 보면, 마우스가 바람직하다.
동물에서 조직 특이적으로 발현시키기 위해 재조합된 E6 유전자 카세트의 제한지도를 도 1에 나타내었다.
도 1에 도시한 바와 같이, 재조합된 유전자는 당업자에 주지된 형질전환법에 의해 동물의 염색체에 통합시킬 수 있다. 형질전환법의 예로는 수정란에 재조합 유전자를 미세주입하거나 혹은 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다. 실험을 하는 조작자의 안전성의 측면에서는, 수정란에 미세주입하는 방법이 보다 바람직할 수 있다. 이 경우, 염색체에 통합된 재조합 E6 유전자는 그 다음 세대의 자손으로 유전된다.
본 발명의 실험에서는 재조합 유전자를 순수분리하여 BDF1 마우스의 수정란에 미세주입한 후, 가임신한 ICR 마우스로 이식하여 새끼를 생산하였다. 생산된 새끼의 꼬리로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 이를 주형으로 하여 HBS 특이적인 프라이머를 이용한 PCR을 실시함으로써, 형질전환 마우스의 생산성공 여부를 확인하였다. 확인된 마우스를 계대유지하던 중 생후 약 17개월에서 유선암의 발병을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 형질전환 마우스는, E6/E7 암유발 유전자를 동시에 발현하는 종래 형질전환 마우스 혹은 E7 유전자를 단독으로 발현하는 마우스에 비해 암화과정 중 후기 단계에서 암이 발병한다. 따라서, 유선암의 치료약물에 대한 스크리닝 뿐만 아니라, 유선암을 일으키는 종양유발 인자의 스크리닝에도 효과적으로 이용될 수 있다.
이하, 대표적인 실시예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다.
유전자의 확보 및 재조합
실험에 사용된 유전자 중 HPV E6 유전자는 충남대학교 생물학과 세포생물학실에서 HeLa 세포로부터 PCR을 수행하여 합성한 것을 사용하였다. 랫트 β-카제인 프로모터는 생명과학연구소 유대열 박사 연구실에서 랫트 게놈 라이브러리를 검색하여 얻은 것을 사용하였다. 또한 HBS 종결 인자는 삼성생명과학 연구소의 이명식 박사로부터 제공받아 사용하였다. 유전자의 재조합은 프로모터, HPV E6 유전자, 종결인자의 순서대로 결합하여 실시하였다(도 1).
E6 유전자는 Genbank K02718에, 카제인 프로모터는 Genbank M10936에, 그리고 HBS 종결인자는 AF222323에 그 서열이 기재되어 있다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 형질전환 마우스를 얻기 위해 사용하는 HPV E6 융합 유전자 카세트(pCHPVE6)는, 랫트 β-카제인 조절 단위(프로모터/엑손 I/인트론 I) 2.8-kb, E6 ORF 476-bp 및 HBS 종결인자 458-bp를 포함한다. HPV16 E6 ORF는 화살표로 표시한 올리고누클레오티드 1 및 2를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 스플라이싱되지 않은 E6 및 스플라이싱된 단편 E6*(293-bp)/E6**(176-bp)에 어닐링된 올리고누클레오티드 1 및 2로부터 얻어지는 전사체의 예상 크기는 아래쪽 3개의 라인에 표시하여 놓았다. 스플라이싱되지 않은 mRNA는 E6 단백질을 생산하며, 단백질 E6* 및 E6**는 스플라이싱된 mRNA로부터 유래된 것임을 알 수 있다.
재조합 유전자의 클로닝은 제한효소 절단과 자동염기서열 분석을 통하여 확인하였다.
유전자의 순수분리 및 마우스 수정란에 미세주입
재조합 유전자는 박테리아에서 기원된 유전자 부위를 절단하여 제거하고, 진핵세포 발현 부위만을 수확하여 물에 녹여 사용하였다. 순수분리된 재조합 유전자는 4 ng/㎕의 농도로 희석하여 마우스(BDF1)의 수정란에 미세주입하였다. 유전자가 주입된 수정란은 가임신한 ICR 마우스에 전달하여 새끼를 생산하였다.
상기 재조합유전자의 진핵세포 발현부위를 형질전환시킨 트랜스지닉 마우스의 수정란, 즉 형질전환된 마우스(BDF1)의 수정란은 HPVE6로 명명한 후, 부다페스트 조약에 의거하여 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2001년 9월 12일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 10072BP를 수여받았다.
형질전환 마우스의 확인
생산된 새끼는 꼬리를 절단하여 게놈 DNA를 분리한 후, HBS 특이적 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 유전자의 삽입을 확인하였다(도 2). 확인된 HPV E6 형질전환 마우스는 정상 마우스와의 교배를 통해 E6 유전자가 후대로 전달됨을 확인하였다.
도 2에서, A는 세 계통의 형질전환 마우스(TG32, TG250, TG9)의 형질전환된 염색체를 서던 블럿팅 하이브리드화하여 분석한 결과이다. 마우스 꼬리 게놈 DNA 10㎍을 EcoRI 제한효소로 소화시킨 후 0.6% 아가로스 겔에서 분리하고, 니트로셀룰로스 필터로 옮겼다. 프로브로는32P-표지화 HPV 삽입물을 사용하였다. 또한 형질전환시키지 않은 계통의 마우스 (FVB, BDF1)의 게놈 DNA에 대한 결과도 도시하였다. 형질전환되지 않은 마우스의 게놈 DNA에 대한 결과에서는, ◀로 표시된 밴드가 없는 것을 확인할 수 있다. 도2의 B는 DNA-PCR 분석에 의해 확인한 형질전환된 유전자(tansgene)이다. 형질전환된 유전자는 HBS-특이적 프라이머를 이용한 꼬리 DNA의 PCR 분석에 의해 확인할 수 있는데, 378-bp 산물을 생산해낸다. 각각의 형질전환된 마우스 계통(TG32, TG250, TG9) 및 형질전환되지 않은 마우스 계통 (BDF1)에서 얻은 상응하는 꼬리 DNA를 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동시켰다. 레인 M은 100-bp마커를 표시한다. 두 가지 실험 모두에서, TG32 계통의 마우스의 DNA에서만 밴드가 관찰되었다. 도2의 C는 성장한 CHPVE6 형질전환 마우스의 표현형의 사진으로서, 이 마우스는 유선에 큰 종양 덩어리를 갖는 형질전환 마우스 32 계통이다.
도 3은 종양이 발생한 형질전환 마우스 및 종양이 발생하지 않은 형질전환 마우스의 유선에 있는 E6 전사체를 비교한 전기영동결과이다. 정상적인 유선 및 종양이 있는 유선(TG32)에서 분리한 RNA를 올리고누클레오티드 1 및 2를 이용하여 역전사시켰다. PCR-증폭된 E6 전사체는 TG32 계통 마우스 (레인 2 및 레인 3)에서 전장 E6를 표시하는 단일 밴드를 나타내었고, TG250 계통 마우스 (레인 3)에서 스플라이싱된 E6*/E6**를 표시하는 삼중 밴드를 나타내었다. 형질전환되지 않은 마우스 (레인 1)도 나타내었다. RNA의 일정한 양을 보여주기 위하여 β-액틴(actin) 전사체를 나타내었다. 도 3의 B는 형질전환 마우스의 유선에 있는 E6 전사체의 상대적인 농도를 나타낸 것이다. 유선에 존재하는 전사체 농도는 코닥 전기영동 서식화 및 분석 시스템 120을 이용하여 정량분석하였다.
형질전환 마우스에서 HPV E6 유전자의 발현 확인
형질전환 마우스 중에 암이 유발된 2마리의 마우스 (생후 17개월)의 각 조직을 분리하여 HPV E6 유전자의 조직내 발현 정도를 확인하였다. 랫트 β-카제인 프로모터는 글루코코르티코이드 혹은 프로락틴 등에 반응하는 유전자 부위를 포함하고 있어 이들 호르몬이 출현하는 조직에서 발현이 유도될 것으로 추정하였다. 각 조직에서 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하여 유전자의 발현을 조사하였다.
도 4는 TG32 계통 마우스에 존재하는 E6 전사체의 조직-특이적 발현을 나타낸다. RNA (5 ㎍)를 역-전사한 후 분리된 부분표본 cDNA를 E6 ORF에 특이적인 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 간 및 폐에서는 전장(full-length) 및 스플라이싱된 E6 전사체 모두가 검출되었지만, 다른 조직에서는 전장 E6 만이 검출되었다. β-액틴의 354-bp cDNA 단편은 모든 조직에 존재하고 있는데, 이를 대조군으로 이용하였다. 도 4에서, Br은 뇌, Lu는 폐, He는 심장, Li는 간, Sp는 비장, Ki는 신장, Ov는 난소, Ut는 자궁, Ma는 유선, Tu는 유선종양 및 Ad는 부신을 의미한다. 도 4의 B는 TG32 마우스의 여러 조직에서의 E6 전사체를 정량한 결과이다. 여러 조직에서의 E6 전사체의 발현은 유선에서의 발현 정도에 대한 상대치로서 계산한 값이다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 폐와 간은 3가지 스플라이싱형이 모두 관찰되었지만 나머지 조직에서는 하나의 형태(전장 E6)만이 관찰되었다. 조직 중에는 유선, 뇌, 심장, 자궁, 부신 등에서 많은 발현이 관찰되었고 나머지 조직에서는 매우 적은 발현 양을 나타내었다. 이런 결과는 조직-특이적 프로모터를 사용했을 경우에도 암 유발이 조직 특이적으로 나타나지 않는 경우가 있음을 보여준다.
형질전환 마우스에서의 유선암의 발생 및 유선암의 조직학적 관찰
생성된 형질전환 마우스는 프로락틴(prolactin) 호르몬의 생성을 위하여 계속 임신을 유도하였으며 그 결과 생후 약 17개월에 유선암의 생성을 관찰하였다(도 5 참조). 유선암을 앞발 오른쪽에 생성되었으며 약 21개월에는 눈에서 돌출되는 암을 관찰하였다(도 6 참조).
형질전환 마우스에서 유선암의 형성을 직접 관찰할 수 있었다. 형성된 종양 조직을 미세절단 및 염색하여 관찰한 결과 유선의 발전에 의해 형성된 암임을 확인할 수 있었다.
암으로 발전된 조직은 표피층이 불규칙적이고 응축된 핵을 가진 세포들이 두껍게 분포하고 있는 것을 확인할 수 있다. 유선암 조직은 정상 유선 조직에 비해 유선 조직의 표피 세포들이 비대화되어 있으며, 핵이 불규칙적 형태를 이루고 있으며 농축되어 있다. 눈물샘에서 발생한 암은 표피세포가 높은 분열상을 나타내며 이형암 조직을 나타낸다. 또한 표면층이 여러 층으로 분화되어 있음을 관찰할 수 있었다.
도 5는 TG32 계통의 마우스의 유선 종양을 조직학적으로 분석한 사진이다. A는 정상적인 BDF1 마우스의 유선인데 정상적인 외관을 갖고 있으며, 종양이 없는 것을 보여주고 있다 (×10). B는 BDF1의 정상적인 유선이다 (×20). C는 TG32 계통 마우스의 유선 종양을 보여주는데, 높은 유사분열 활성을 보여주고 있으며 불규칙한 형태를 갖고 있다 (×10). D는 유선 종양의 ×20 사진이다.
도 6은 TG32 계통의 마우스의 눈에서 발생한 누선(눈물샘) 암의 조직학적 외관을 보여주는 사진이다. A는 BDF1의 잘 조직된 정상적인 누선 세포이고 (×10), B는 정상적인 세포의 ×20배 사진이다. C 및 D는 TG32 계통 마우스의 누선을 보여주는데 표면을 따라 빽빽하게 찬 다층의 형태를 갖는다 (각각 ×10 및 ×20).
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 랫트의 β-카제인 프로모터를 이용하여 HPV E6 암유전자를 유선조직에서 특이적으로 발현시킴으로써 유선암을 유발하는 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란 및 형질전환 모델 동물을 개발하였으며, 이 모델 동물은 암의 발생이 암화과정의 후기에 일어나기 때문에, 유선암 치료용 약물의 스크리닝 뿐만 아니라 종양발생 물질(tumorgen)을 스크리닝하는데 유용하게 이용될 수 있다.
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Claims (5)
- 염색체 안에 β-카제인 프로모터에 기능적으로 연결된 HPV E6 유전자가 통합되어 있고, 상기 염색체를 마우스 대리모에 이식하여 성체로 발생시킴으로써 HPV E6 유선암을 유발하도록 제조된 수탁번호 KCTC 10072BP의 마우스 수정란.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 염색체는 체세포 및 생식세포의 염색체임을 특징으로 하는 형질전환된 마우스 수정란.
- 삭제
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