KR100437507B1 - 신규의콜라겐제제 - Google Patents

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KR100437507B1
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Abstract

콜라겐과 유효량의 혼화성 세포독성 약물을 포함하며, 약 45℃ 이하의 단일 콜라겐 전이온도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물이 개시되어 있다. 이러한 조성물은 주사 부위에서 세포독성 약물의 보유능력이 개선되며 광학적으로 반투명하다.

Description

신규의 콜라겐 제제
종양과 같은 여러가지 세포 장애의 치료는 세포독성 약제와 관련이 있다. 이들 약제는 여러 가지 방법으로, 간혹 세포의 복제 및/또는 생존에 필수적인 세포 기능을 간섭하는 방법으로 그의 활성을 나타낸다. 대부분의 경우는 아니지만 많은 경우에 세포독성 약제는 자연상에 존재하는 세포에 특이적이지 않으며, 통상의 세포에 비해 비정상적인 세포가 더 급속하게 증식하기 때문에 그 효과를 나타내기가 쉽다. 포유 동물 숙주의 여러 가지 신체 장기는 세포의 재생이 비교적 느린 반면에 줄기 세포 (stem cell)의 빠른 증식과 관련된, 예를 들면 골수와 같은 기타 장기들도 있다. 그러므로 세포독성제는 느리게 재생되는 세포에 치명적으로 작용할 수 있을 뿐 아니라 면역 시스템에 특히 치명적으로 작용할 수 있다.
비정상적인 세포에 대하여 세포독성 약물 활성을 나타내는 방법이 미국 특허(U.S.Reissue Patent) 제RE33,375호 (Luck 및 Brown 특허)에 개시되어 있는데, 전술한 특허에는 콜라겐과 같은 생리학적으로 허용가능한 단백질성 매트릭스에 분산된 세포독성제를 고체 세포 성장, 또는 기존의 또는 제거된 고체 세포 성장 영역에 도입함으로써 비정상적인 고체 세포 성장과 관련이 있는 세포 장애를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 상기 특허에는 이 방법에 의하면 투여 위치에서 떨어져 있는 세포 상에서 세포독성 효과가 감소된 고체 세포 성장을 개선하는 효과를 나타낸다는 것이 개시되어 있다. 전술한 특허의 개시 내용은 본 명세서에 참고자료로서 인용되어 있다.
럭과 브라운 (Luck & Brown)에 의해 제조된 생리학적으로 허용가능한 단백질성 매트릭스는 고체 세포 성장에 대해 효과적이지만 광학적으로는 불투명하다. 이 제제가 투명 내지는 반투명하다면 약학적으로 더 효과적일 것이다.
럭 등에 의해 개시된 방법의 잇점에도 불구하고, 투여 위치로부터 떨어져 있는 세포 상에서 세포독성 효과가 더 감소되면 더 바람직하다. 또한 약학적으로 더 유용한 조성물의 제제가 더 바람직하다.
본 발명은 신규의 콜라겐/세포독성 약제 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 조성물은 종래에 개시된 콜라겐/세포독성 약제 조성물에 비하여 주사 부위에서 놀라울 정도로 현저하게 개선된 약제 보유능력을 갖는다.
도 1은 6.5중량%의 콜라겐을 포함하는 수성 조성물을 30-70℃에서 DSC 스캔한 결과를 나타내는 도면이다. 스캔 결과로부터 이 조성물이 두개의 콜라겐 전이온도를 가지며, 제1 전이온도는 약 44℃이고 제2 전이온도는 약 53℃인 것을 알 수 있다.
도 2는 2.2중량%의 콜라겐 및 3.3중량%의 플루오로우라실을 포함하는, 실온에서 보관된 수성 조성물을 30-70℃에서 DSC 스캔한 결과를 나타낸 도면이다. 이스캔 결과로부터 이 조성물이 두개의 전이온도를 가지며 제1 전이온도는 약 42℃이고 제2 전이온도는 약 45-46℃에서 숄더 (should)를 나타낸다.
도 3은 2.2중량%의 콜라겐 및 3.3중량%의 플루오로우라실을 포함하는 수성 조성물을 30-70℃에서 DSC 스캔한 결과를 나타낸 도면이다. 조성물 제조후 이 조성물을 약 4℃의 냉장고에서 24시간 이상 보관하였다. 냉장고에서 꺼낸 조성물은 광학적으로 반투명하였으며, DSC 스캔한 결과로부터 이 조성물이 약 42.5℃에서 단일한 콜라겐 전이 온도를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 4는 실온에서 제조된, 6.5중량%의 콜라겐을 포함하는 수성 조성물을 20-80℃에서 DSC 스캔한 결과를 나타낸 도면이다. 스캔 결과로부터 이 조성물이 두개의 콜라겐 전이온도를 가지며, 제1 전이온도는 약 43℃이고 제2 전이온도는 약 53℃인 것을 알 수 있다.
도 5는 2.2중량%의 콜라겐과 16.7mg/mℓ의 메토트렉세이트를 포함하는 수성 조성물을 30-65℃에서 DSC 스캔한 결과를 나타낸 도면이다. 조성물 제조후 이 조성물을 실온에서 1달 동안 보관하였으며, 보관후 이 조성물은 광학적으로 불투명하였다. DSC 스캔 결과로부터 이 조성물이 두개의 콜라겐 전이온도를 가지며, 제1 전이 온도는 약 43℃이고 제2 전이온도는 약 52℃인 것을 알 수 있다.
도 6은 2.2중량%의 콜라겐과 16.7mg/mℓ의 메토트렉세이트를 포함하는 수성 조성물을 30-65℃에서 DSC 스캔한 결과를 나타낸 도면이다. 조성물 제조후 이 조성물을 4℃의 냉장고에서 1달 동안 보관하였다. 조성물을 냉장고에서 꺼내본 결과 이 조성물은 광학적으로 반투명하였으며 이 물질의 온도를 실온으로 상승시키더라도반투명성을 유지하였다. DSC 스캔 결과로부터 이 조성물이 약 43℃의 단일한 콜라겐 전이온도를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 7A-7E는 2중량%의 콜라겐과 0.4중량%의 시스플라틴을 포함하며 실온에서의 보관 시간이 각각 0시간 (도 7A), 1시간 (도 7B), 2시간 (도 7C), 4시간 (도 7D) 및 8시간 (도 7E)인 수성 조성물을 30-70℃에서 DSC 스캔한 결과를 나태는 도면이다. DSC 스캔 결과로부터 조성물 제조후 시간이 경과함에 따라 대부분의 조성물은 약 61℃에서 콜라겐 전이 온도를 가지며, 일부는 약 46℃에서 콜라겐 전이온도를 갖는 것을 알 수 있다.
도 8은 2.2중량%의 콜라겐과 33.3mg/mℓ의 플루오로우라실을 포함하는 수성 콜라겐 조성물에 대해 서로 다른 세개의 온도에서 흡광도를 측정함으로써 광학적 불투명도에 따른 효과를 설명하기 위한 그래프이다.
도 9는 플루오로우라실의 함량이 서로 다른 수성 콜라겐 조성물을 2-8℃에서 보관한 다음 흡광도를 측정함으로써 광학적 불투명성에 따른 효과를 설명하기 위한 그래프이다.
도 10은 pH 값이 서로 다른 수성 콜라겐 조성물을 2-8℃에서 보관한 다음 흡광도를 측정함으로써 광학적 불투명성에 따른 효과를 설명하기 위한 그래프이다.
도 11은 서로 다른 종류의 성분을 0.25M로 첨가한 수성 콜라겐 조성물을 2-8℃에서 보관한 다음 흡광도를 측정함으로써 광학적 불투명성에 따른 효과를 설명하기 위한 그래프이다.
도 12는 본 명세서에 개시된 조성물을 이용하여 주사한 다음, 주사 위치에서의 플루오로우라실의 보유능력이 개선되었음을 설명하기 위한 도면이다.
발명의 개요
본 발명은 세포독성 약제를 포함하는 단백질성 콜라겐 조성물로서 종래의 조성물에 비해서 주사 위치에서의 약물 보유능력이 더 우수할 뿐 아니라 약학적으로 더 유용한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 단백질성 콜라겐 조성물은 그의 단일 전이 온도가 약 45℃ 미만인 것을 특징으로 한다. 이와는 달리, 종래의 단백질성 조성물은 45℃보다 높은 단일 전이 온도를 가지거나, 하나는 45℃보다 낮고 다른 하나는 45℃보다 높은 이중 전이 온도를 갖는다. 첨부된 도면에 의해 설명된 바와 같이, 두개의 전이온도는 디퍼런셜 스캐닝 칼로리메트리 (Differential Scanning Calorimetry: DSC) 곡선 상에서 두개의 서로 다른 피크로 나타나거나 45℃보다 높은 온도 또는 그보다 낮은 온도에서의 숄더 (shoulder)로서 나타난다.
놀랍게도, 종래의 단백질성 콜라겐 조성물을 본 발명의 콜라겐 조성물로 전이시키면 주사 부위에서의 약물 보유능력이 개선되며, 약학적으로 더 우수한, 광학적으로 반투명한 조성물이 제공된다는 것이 발견되었다.
따라서, 조성물의 일 실시예로서, 본 발명은 약 30-100%의 콜라겐을 함유하는 단백질 성분 및 유효량의 혼화성 세포독성 약물을 포함하며, 상기 콜라겐은 약 5-100mg/mℓ의 농도로 수성 매질에 분산되어 비정질 유동체 (amorphous flowable mass)를 제공하는 단백질성 조성물에 있어서, 상기 단백질성 조성물 중의 콜라겐이 약 45℃ 이하의 단일 전이 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 조성물에 관한 것이다.
조성물의 다른 실시예로서, 본 발명은 수성 콜라겐 조성물에 관한 것으로서, 약 5-75mg/mℓ의 농도로 수성 매질에 분산되어 있어서 비정질 유동체를 제공하는 콜라겐을 약 30-100% 함유하는 단백질 성분 및 상기 조성물이 약 10℃ 또는 그 이하로 냉각될 경우에 광학적으로 반투명하게 되도록 하는 유효량의 혼화성 세포독성 약물을 포함하는 것을 특징으로 수성 콜라겐 조성물에 관한 것이다.
방법의 일예로서, 본 발명은 종양성 변병 또는 이를 둘러싸는 조직의 치료 방법에 있어서, 병변 위치 또는 병변을 둘러싸는 조직에 안전하게 투여할 수 있는단백질성 조성물을 도입하며, 상기 조성물은 수성 매질에 분산된 콜라겐을 충분한 농도의 혼화성 세포독성 약물이 균일하게 분산된 비정질 유동체로서 포함하며 상기 콜라겐이 약 45℃ 이하의 단일 전이 온도를 가짐으로써 상기 약물이 인접 환경으로 방출되어 도입 부위로부터 떨어져있는 위치에서는 현저한 약물 농도를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 치료 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태에 대한 상세한 설명
본 발명은 신규의 콜라겐/세포독성 약물 조성물에 관한 것이다. 일 양태에 있어서, 본 발명의 콜라겐 조성물은 약 45℃ 이하의 단일 콜라겐 전이 온도를 갖는 것을 특징으로 한다. 다른 양태에 있어서, 본 발명의 콜라겐 조성물은 광학적으로 반투명한 것을 특징으로 한다. 그러나 본 발명을 상세하게 개시하기에 앞서 먼저 다음의 용어들을 정의하기로 한다:
정의
본 명세서에서 사용되는 하기의 용어들은 다음과 같이 정의된다.
용어 "전이 온도"는 수성 콜라겐 조성물 중의 콜라겐의 상 변화가 진행되는 온도를 의미한다. 상변화는 통상 조성물 중의 콜라겐의 원섬유 크기가 변하는 것이며, 수성 콜라겐 조성물에 대한 통상의 DSC 스캔에서의 피크에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 이를 위해서는 DSC 10 인스트루먼트 (DSC 10 instrument: TA Industries(New Castle, Delaware, USA) 제품)를 이용하여 25psi의 질소 (N2)에서 분당 10℃로 가온함으로써 전이 온도를 측정한다.
용어 "단일 전이 온도"는 수성 콜라겐 조성물 중의 콜라겐이 30-70℃의 온도 범위에 걸쳐서 DSC 스캔에서 단일의 흡열성 피크를 나타내는 것을 의미한다. 이러한 관점에서 볼 때, 피크중에 숄더가 나타나는 DSC 스캔은 단일 전이 온도 이상을 갖는 것을 추정될 수 있다.
용어 "혼화성 세포독성 약물"은 수성 콜라겐 조성물 중의 콜라겐에 교차결합하지 않는 세포독성 약물을 의미한다. 세포독성 약물이 수성 콜라겐 조성물 중의 콜라겐과 교차결합하게 되면, 하기 실시예에 개시된 바와 같이, 세포독성 약물의 존재하에 실온에서 시간이 경과함에 따라 콜라겐의 전이 온도 변화가 측정되는 것을 쉽게 알 수 있다. 구체적으로는, 콜라겐에 세포독성 약물이 교차결합하게 되면 시간이 경과함에 따라 콜라겐의 전이 온도가 높아지며 약물이 콜라겐과 혼화가능하지 않은 것으로 판명된다.
적당한 혼화성 세포독성 약물의 예로는 플루오로우라실, 메토트렉세이트 등과 혼화성 세포독성 약물의 혼합물을 들 수 있으나, 이는 어디까지나 예에 불과할 뿐이다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 특정의 혼화성 세포독성 약물 또는 이러한 약물의 혼합물이 중요하지는 않다. 콜라겐과 적당히 교차결합함으로써 본 발명의 목적에 맞는 콜라겐과의 혼화성이 없는 세포독성 약물의 예로는 시스-디아미노 디클로로플라디늄 (II)을 들 수 있으나, 이는 어디까지나 예에 불과할 뿐이다.
용어 "유효량의 혼화성 세포독성 약물"은 콜라겐 조성물이 약 45℃ 이하의 단일 콜라겐 전이 온도를 유지하면서 치료되어야 할 질병 상태에 대하여 치료학적으로 충분히 효과적일 수 있는 양의 혼화성 세포독성 약물 또는 그의 혼합물을 의미한다.
용어 "광학적으로 반투명"이란 가시광선 영역에서 충분히 투명한 것을 의미하는데, 410nm 내지 1mm의 파장을 갖는 광을 이용하여 조성물 샘플을 측정할 경우 0.60D 단위 미만의 흡광도를 나타낸다.
조성물
본 명세서에 개시된 조성물은 비정질이며, 광학적으로 불투명하고, 주사가능하며, 점성이 있고, 약 45℃ 이하의 단일 전이 온도를 가지고 있으므로 실질적으로는 투여 위치로부터 멀리 흘러가지 않고 국소적인 부분에 머물러있을 수 있다. 종래의 콜라겐 조성물에 비하여 본 발명의 조성물의 중요한 잇점은 세포독성 약물을 주사 부위 (예를 들어 종양 부위)에 머물러있게 함으로써 상대적으로 환자의 다른 부위로 약물이 전이될 가능성을 감소시킨다는 것이다. 즉, 약물의 순환 혈류 농도가 낮은 상태를 유지할 수 있다. 이러한 방법으로 인하여, 콜라겐 부재하에서 세포 독성 약물을 직접 투여하는 것에 비하여 개선된 치료 효과를 얻을 수 있다; 즉, 병든 세포상에서의 세포독성 효과가 감염가능성이 있는 정상 세포에 비하여 크다.
종래의 콜라겐 조성물에 비해 본 발명에 따른 조성물의 또 다른 중요한 잇점은 이들 조성물이 가시광선에 대하여 광학적으로 반투명하므로 약학적으로 보다 양호한 생성물 제공한다는 것이다. 즉, 일반적으로 광학적으로 반투명한 생성물은 환자에게 주사하는 용도로 사용되는 경우에 광학적으로 불투명한 생성물에 비하여 약학적으로 더 양호한 것으로 나타난다.
임의의 이론적 근거를 제한하는 것은 아니지만, 광학적 반투명성뿐 아니라주사 위치에서의 혼화성 세포독성 약물의 보유능력 개선은 콜라겐이 약 45℃ 이하의 단일 전이 온도를 갖는 조성물과 관련이 있는 것으로 판단된다. 이러한 조성물은 섬유를 쪼개어 더 작은 소섬유를 형성하는 콜라겐 섬유내로 약물을 확산시킴으로써 형성되는 것으로 판단된다. 작은 소섬유를 갖는 콜라겐 조성물은 점도가 높고 광학적으로 반투명하다. 임의의 이론적 근거를 제한하는 것은 아니지만, 조성물의 높은 점도와 함께 세포독성 약물의 콜라겐 매트릭스로의 전달 감소는 주사 부위에서의 조성물 및 약물의 보유능력이 개선된 것과 관련이 있는 것으로 판단된다.
본 발명의 콜라겐 조성물을 형성하는 한가지 방법은 유효량의 혼화성 세포독성 약물을 포함하는 통상의 콜라겐 조성물을 약 10℃ 이하의 온도 (바람직하게는 약 0-10℃)에서 약물이 콜라겐 섬유내로 확산될 수 있을 정도의 충분한 시간 동안 냉각하는 것이다. 첨부된 도면에서 설명된 바와 같이, 콜라겐 섬유가 더 작은 소섬유로 분열되는 것은 콜라겐 조성물 중의 콜라겐 전이 온도가 변하는 것과 콜라겐 조성물이 광학적으로 반투명한 조성물로 전환되는 것으로부터 알 수 있다.
냉각된 조성물은 광학적으로 불투명성을 유지하며 조성물이 실온으로 환원되는 경우에도 단일한 콜라겐 전이 온도가 약 45℃ 이하를 갖는다는 사실로부터 명백하게 알 수 있듯이, 온도를 저하시켜서 본 명세서에 개시된 조성물을 제조하는 방법은 주위 온도하에서 비가역적 (또는 가역적이더라도 그 가역 반응이 수개월 또는 수년에 걸쳐 일어남)이다.
단일의 콜라겐 전이 온도가 약 45℃ 이하인 조성물을 형성하는 다른 방법으로는, 고주파음에 의한 분해처리 (sonication) 및 기타의 균질화 방법을 이용하여고농도의 특정 혼화성 세포독성 약물을 포함하는 수성 조성물 중의 콜라겐의 섬유 크기를 분해시킨 다음, 주위 조건에서 장시간 동안 보관하는 방법을 예로 들 수 있다. 그러나 그러한 조성물을 쉽고 신속하게 형성할 수 있다는 점에서 약 45℃ 이하의 단일 콜라겐 전이 온도를 형성하는데 효과적인 냉각 단계를 채용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 개시된 조성물은 약 30-100%의 콜라겐을 함유하는 단백질 성분, 혼화성 세포독성 약물, 및 콜라겐이 분산되어 있고 약물이 용해, 분산 또는 콜라겐과 혼합되어 있는 약리학적으로 허용가능한 수성 매질을 포함하는 단백질성 물질로 이루어져 있다. 다른 물질들은 경우에 따라 존재하여 조성물의 유용성을 전반적으로 향상시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물에서 사용된 콜라겐은 소, 돼지 또는 사람과 같은 임의의 포유동물 숙주 소스 (host source)로부터 유래할 수 있거나, 필요시에는 다른 기법, 예를 들어 재조합 DNA 기법에 의해 제조될 수 있다. 사용되는 콜라겐은 천연 콜라겐이거나 트로포콜라겐, 아텔로콜라겐 등과 같은 변형된 콜라겐일 수 있다. 이들 콜라겐은 비면역원성이거나, 면역원성이거나 약간만 면역원성이다.
포유동물에 투여하기 위한 콜라겐 또는 그 유도체를 정제된 형태로 제조하는 여러 가지 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 적당한 방법들이, 예를 들면 미국 특허 제3,949,073호에 개시되어 있으며, 그 내용이 본 명세서에 인용되어 있다. 관심의 대상이 되고 있는 것은 어린 암소 또는 송아지로부터 수득되어 정제된 소의 콜라겐이다. 정제화는 통상 각종 매질, 예를 들어 묽은 아세트산으로부터 분산 또는 침전시킴으로써 이루어진다. 몇몇의 경우에는 이종발생성 콜라겐을 채용하여 주사 부위에서의 면역원성 반응을 개선하거나 면역원성 첨가제를 사용할 수 있다. 추가로, 본 명세서에서 사용하기 적당한 콜라겐은 다수의 제조업자들로부터 상업적으로 구입될 수도 있다. 통상, 상업적으로 구입된 이러한 소스는 단백질 성분이 약 30-100%의 콜라겐과 함께, 예를 들어 피브로겐, 알부민 또는 이러한 단백질의 유도체를 포함하는 나머지량의 단백질 성분을 포함하는 단백질성 물질을 포함한다.
수성 조성물에 충분량의 단백질 성분을 사용하여 콜라겐 농도가 약 5-100mg/mℓ, 바람직하게는 약 5-75mg/mℓ가 되도록 한다. 사용된 소정량의 콜라겐은 조성물이 적당한 압력 하에서는 유동적이지만 환자의 특정 부위에 투여된 후에는 그다지 유동적이지 않을 정도의 소정 점도를 갖는 콜라겐 조성물로부터 선택된다. 바람직하게는 조성물이 20℃에서 약 1,000-약 50,000센티포이즈의 점도 및 15.8sec-1의 전단속도를 갖도록, 보다 바람직하게는 조성물이 20℃에서 약 4,000-약 20,000센티포이즈의 점도 및 15.8sec-1의 전단 속도를 갖도록, 더욱 바람직하게는 20℃에서 약 5,000-약 20,000 센티포이즈의 점포 및 15.8sec-1의 전단속도를 갖도록 충분량의 콜라겐을 사용한다.
유효량의 혼화성 세포독성 약물 역시 본 명세서에 개시된 수성 콜라겐 조성물에 사용된다. 통상, 세포독성 약물의 유효량은 약물마다 다른데, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 보다 상세하게는, 수성 콜라겐 조성물 중의 혼화성 세포독성 약물의 양을 조금씩 달리한 조성물을 냉각하고 24시간 이상 보관하여 단일 콜라겐 전이 온도가 약 45℃ 이하인 조성물을 제공하는데 필요한 혼화성 세포독성 약물의 최소량을 결정한다.
혼화성 세포독성 약물은 약물, 종양의 특성에 따라, 그리고 협동 작용이 약학적으로 지시되는지에 따라 단독으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 혼화성 세포독성 약물은 플루오로우라실, 메토트렉세이트 또는 그의 혼합물이다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 플루오로우라실은 조성물 중에서 약 20mg/mℓ를 초과하는 농도로, 보다 더 바람직하게는 약 20-60mg/mℓ의 농도로 사용되는 반면에, 메토트렉세이트는 조성물 중에서 10mg/mℓ 이상, 보다 바람직하게는 약 10-60mg/mℓ의 농도로 사용된다.
혼화성 세포독성 약물은 복합체 형성, 염 형성, 공조 복합화 등과 같은 비공유 결합을 통해 콜라겐에 결합하거나 비결합하지만, 어떠한 결합도 약물의 생리학적 활성을 크게 감소시키거나 콜라겐 섬유를 교차결합시키지 않아야 한다. 혼화성 세포독성 약물은, 예를 들면 콜라겐 이외의 담체로부터의 약물을 효소 분해(enzymatic cleavage), 예를 들어 가수분해함으로써 혼화성 세포독성 약물을 변성시킬 수 있다.
임의로는, 조직을 둘러싸는 종양성 병변내로 주사액이 주입됨에 따라 약물의 이동을 감소시키기 위한 각종 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 혼화성 세포독성 약물은 지질, 인지질, 펩티드, 아미노산, 당 등과 같은 특이적인 리간드에 커플링될 수 있다. 이러한 변형은 각각의 약물에 따라서 달라짐으로써 수성 매질 중에서의 약물의 용해도를 변화시키고 콜라겐과의 비공유 상호작용을 제공한다. 또한, 필요에 따라서는 약물 방출 속도를 감소시키면서 약물과 단백질의 상호작용을 제공하는 여러 가지 약리학적으로 허용가능한 벌킹제 (bulking agent) 또는 농축제가 사용될 수 있다. 이러한 물질의 예로는 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite)와 같은 무기 물질 및 카르보하이드레이트, 예를 들어 아가로오즈, 메틸셀룰로오즈 및 셀룰로오즈 같은 유기 물질을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 혼화성 세포독성 약물과 혼합된 다른 약물을 더 포함하으로써 생리학적 발작을 감소시키고 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 특히 중요한 것은 혈관수축제 또는 교감신경흥분제와 같이 성장 및/또는 통로구 (passage opening)에 관한 국소적 맥관구조를 제한하는 제제이다. 이러한 제제의 예로는 카테콜 아민, 예를 들어 에피네프린 및 노르에피테프린, 디피베프린, 붕산에피네프린, 에르고트 알칼로이드, 프로스타글란딘, 안지오텐신 등을 들 수 있다. 조직 구조에 영향을 미치는 다른 제제로는 펩티다아제 파파인, 키모파파린, 트립신, 아밀라아제, 콜라게나아제 및 키모트립신과 같이 스트로마를 손상시킬 수 있는 효소가 포함된다. 또는 예를 들면 폴리소르베이트, 암포테리신 B, 디메틸설폭사이드와 같은 비이온성 세제 및 프로카인과 같은 마취제와 같이 세포 투과성에 영향을 미치는 제제를 사용할 수 있다. 특히 바람직한 실시예에 있어서, 에피네프린을 콜라겐 조성물과 함께 사용하며 사용하기 직전에 조성물에 가한다.
이종발생성 콜라겐 외에도 다른 물질을 포함시킴으로써 면역원성 반응, 예를 들면 마크로파지, 헬플러 T-세포 (helper T-cell) 등의 증식과 침입을 개선할 수있다. 이러한 보조제의 예로는코리네박테리움 파르븀 (Corynebacterium parvum), 바실러스 칼메테-구에린 (Bacillus Calmette-Guerin)세포벽 또는 세포벽 구조물 제제,마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis)균주 등을 들 수 있다. 참조 문헌으로서 하기의 것들을 들 수 있으며, 그 내용이 본 명세서에 인용되어 있다: Miyata 등, Cancer Res., 43:4670-4675 (1983); Bier 등,Arch Otorhinolaryngol, 236:245-255 (1982); 및 Mehanjhlin 등,Cancer Res., 38:1211-1316 (1978).
세포독성 활성을 개선하기 위하여, 방사핵종인 테크네튬 또는 이리듐과 같은 방사성 펠릿; 미소니다졸과 같은 방사능 증감제; 메틸화된 크산틴과 같은 복구 저해제; 저산소 세포에서만 활성화되는 생환원제; 인터페론과 같은 면역변형제, 인터류킨-2와 같은 림포카인, 종양 괴사 팩터, 종양 생장 펙터-β등, 및/또는 혈관조영상 콘트라스트 매질과 같은 여러 가지 보조 물질이 콜라겐에 혼합될 수 있다.
콜라겐, 세포독성 약물 및 임의의 보조제를 식염수, 인산염 완충 식염수, 증류수와 같은 생리학적으로 허용가능한 수성 매질에 균일하게 분산시켜서 콜라겐 조성물을 형성한다. 수성 매질을 충분량 사용함으로써 비정질 분산액이 완만한 압력 하에서 유동가능하도록 한다. 통상, 수성 매질은 전체 조성물의 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상이 되도록 하여 유동성 혼합물을 제공하는 것이 바람직하나, 약 99.5%를 초과하지는 않아야 한다. 수성 매질의 양은 혼화성 세포독성 약물(들)의 특성, 다른 물질들의 존재 여부 등에 따라 결정된다.
여러 가지 목적에 알맞은 기타의 첨가제들이 조성물 중에 포함될 수 있다. 이러한 첨가제들은 조성물의 안정성 보호, pH 조절 등과 같은 특성을 제공한다. 그러한 첨가제의 예로는 포스페이트 및 아세테이트 흡광도, 메틸 또는 프로필 파라벤, 폴리에틸렌 글리콜 등을 들 수 있다. 이러한 첨가제들을 통상 조성물 총량의 2중량% 미만, 바람직하게는 약 1중량% 미만의 양으로 첨가할 있으며, 각각의 첨가제 함량은 0-약 1중량%이다.
본 명세서에 개시된 조성물은 콜라겐을 포함하는 단백질성 물질, 혼화성 세포독성 약물 및 생리학적으로 허용가능한 수성 매질을 살균 분위기 하에서 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이때, 혈관수축제 또는 교감신경흥분제와 같은 임의의 보조제가 첨가될 수 있으나, 안정성 문제를 고려할 때 이들 첨가제를 사용 직전에 조성물에 첨가하는 것이 바람직하다. 콜라겐은 통상 사용되어질 수성 매질 총량의 적어도 일부와 혼합된 간편한 형태로 제공될 수 있다. 혼합됨에 따라 균일한 분산제가 얻어질 수 있다는 점에서 이들 조성물은 충분히 효능을 발휘할 수 있다. 혼화성 세포독성 약물을 교반하에 콜라겐성 분산액에 가하여 약물을 균일하게 분산시킬 수 있다. 필요에 따라서는 임의의 물질을 동시에 또는 연속하여 가할 수 있다. 무균 상태를 유지함으로써 공정을 살균 조건하에 실시할 수 있다.
여러 가지 성분들을 혼합물에 균일하게 분산시킨 후에, 혼합물을 적당한 용기에 넣고 밀봉한다. 이때, 조성물을 가시광선 범위에서 광학적으로 불투명하며 30-70℃ 범위에서 작동하는 DSC 스캔 상에서 두개의 전이 온도를 나타낸다. 첫번째 전이온도는 약 45℃이고, 두번째 전이온도는 약 55℃이다.
일 태양에 있어서, 이 조성물을 약 10℃ 이하의 온도로 냉각시킨다. 충분한 시간 동안 냉각시켜서 콜라겐 섬유가 혼화성 세포독성 약물에 의해 더 작은 소섬유로 분열되도록 하는데, 이는 조성물 중의 콜라겐의 전이 온도 프로파일이 약 45℃ 이하의 단일 전이 온도로 변화하는 것으로써 확인할 수 있다. 또한, 냉각되면서 콜라겐 조성물은 광학적으로 반투명한 조성물로 전환된다. 약 45℃ 이하의 단일 전이 온도를 갖는 조성물로 전환되면 필요에 따라 조성물을 실온으로 가온하여도 소망하는 단일 전이 온도가 유지될 수 있다.
전술한 바와 같이 콜라겐 조성물이 광학적으로 반투명한 조성물로 전환되는 다른 실시에가 사용될 수도 있다.
유용성
본 조성물은 비정상 고체 종양, 세포 성장, 또는 비정상 종양 세포를 포함할 수 있는 인접 조직과 관련이 있는 다양한 종양성 병변의 화학요법적 (세포독성) 치료에 사용된다. 이 조성물을 종양 또는 종양 부위 (병변에 인접한 조직)와 같은 병변, 또는 종양이 제거되어진 위치, 종양이 이미 제거된 부분에 인접한 조직에 주사한다. 본 조성물은 주사용으로서 유동성을 가지고 있으나, 일단 조직에 주사되면 안정한 위치를 갖는다. 즉, 일단 주입된 콜라겐은 기계적 분열에 내성을 가지며 현저하게 이동하지 않는다. 주사후, 세포독성 약물은 인접한 부위로 방출되며 세포독성 활성이 필요하지 않은 다른 부위의 약물 이동을 방지한다.
종양의 예로는 기저세포암, 편평상피암, 흑색종, 연조직 육종, 일광성 가화증, 카포시 육종, 악성 피부림프종, 보웬병, 빌름스 종양, 간암, 결장암, 뇌종양, 균상식육종, 호치킨 림프종, 진성 다혈구증, 마성과립구성 백혈병, 림프종, 귀리세포 육종 등과 같은 암종, 육종 및 흑색종을 들 수 있다. 종양은 첨형콘딜롬(condylomata acuminata: 생식기 사마귀)과 같은 양성 성장 (benign growth)를 포함한다.
본 조성물을 종양에 투여하여 종양 위치에 세포독성량의 혼화성 세포독성 약물을 제공한다. 종양 부위에 투여되는 세포독성 약물의 양은 약물의 특성, 종양의 크기 및 기타 여러 가지 고려사항에 따라 달라지는데, 바람직하게는 0.01-100mg/kg(숙주 체중), 더 바람직하게는 0.5-30mg/kg(숙주 체중)이다. 혈관수축제가 사용될 경우에 그 사용량은 통상 혼화성 세포독성 약물의 약 1-약 50중량%이다. 각각의 종양에 있어서, 세포독성 약물의 구체적인 사용량은 치료되어질 종양, 사용되어질 혼화성 세포독성 약물의 종류 및/또는 특성, 세포독성 약물의 상대적 운동성 등과 같은 여러 요인에 따라 달라진다. 그러한 요인들은 당해 분야에서는 이미 잘 알려져 있다.
종양 부위에서의 혼화성 세포독성 약물의 약효지속시간 및 상기 약물에 대한 종양의 반응과 같은 용인에 따라서 본 발명의 조성물을 하나 또는 그 이상 투여할 수 있다. 투여는 주사기, 카테터 또는 종양으로 유동성 조성물을 도입할 수 있는 그외의 편리한 수단에 의해 실시될 수 있다. 투여는 3일마다, 일주일마다, 보다 덜 빈번하게는 이주일 또는 한달 간격으로 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 투여 방법의 예로서 단일 전이 온도가 약 45℃ 이하인 플루오로우라실을 포함하는 조성물의 투여를 들 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 콜라겐 중의 플루오로우라실 농도는 약 20-약 60mg/mℓ이다. 병변의 크기에 따라서는 하나 또는 그 이상의 부위에 주사할 수 있다. 직경이 약 18-30게이지인 주사바늘을 사용하는 것이 편리하다. 여러번 주사하기 위해서는 구멍이 뚫린 원형판(template)을 사용할 수 있다. 혼화성 세포독성 약물의 투여량은 100mg/환자의 ㎡ 미만, 바람직하게는 약 0.01-100mg/환자의 ㎡이다.
본 발명의 방법은 임상적으로 관련이 있는 종양 또는 병변에서 특히 유용하다. 본 조성물은 부피가 100㎣를 초과하거나, 특히 150㎣를 초과하는 종양의 경우에 치료 효과가 크다.
또한, 본 발명의 방법은 약물 투여의 결과로서 국소적인 염증을 감소시킨다. 그러므로, 국소 또는 인접한 조직은 약물에 의해 크게 영향을 받지 않는다. 또한, 투여 부위로부터의 약물 유입 농도가 낮기 때문에 약물을 고농도로 추여하여도 약물 투입 부위로부터 멀리 떨어져 있는 정상 조직 또는 림프구에 부작용을 일으키지 않을 수 있다.
본 발명은 다른 치료 방법과 병행하여 사용할 수 있다는 잇점이 있다. 혼화성 세포독성 약물을 포함하는 수성 콜라겐 조성물을 투여하기 전 및/또는 후에 병변을 방사선 치료할 수 있다. 방사선 조사량은 병변, 노출 기간, 환자의 상태 등에 따라 달라지는데 약 20-250rad/분, 통상은 50-150rad/분이다. 고열 (열)이 보조 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 보조 치료는 통상 약 43℃ 이상으로 약 5-100분 동안 가열함으로써 이루어질 수 있다.
하기의 실시예는 청구된 본 발명을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
특별한 언급이 없는한, 모든 온도는 섭씨 온도이다. 또한, 이들 실시예에서별다른 언급이 없는한 사용된 약어들은 통상 다음과 같은 의미로 간주된다:
cispiatin = 시스-디아미노 디클로로르플라디늄 (II)
cps = 센티포이즈
DSC = 디퍼런셜 스캐닝 칼로리메트리
플루오로우라실 = 5-플루오로우라실 [5-플루오로-2,4-(1H,3H)-피리미딘디온][5FU]
g = 그램
M = 몰
mg = 밀리그램
mm= 밀리그램
mℓ = 밀리리터
OD = 광학 밀도
RT = 실온
실시예
하기의 실시예에 있어서, 실시예 1-3은 실온 또는 10℃ 미만으로 냉장된, 각종 세포독성 약물을 포함하는 수성 콜라겐 조성물의 콜라겐 전이온도에 대한 효과를 설명하기 위한 것이다.
실시예 4는 콜라겐 및 플루오로우라실 (33.3mg/mℓ)을 포함하는 수성 콜라겐 조성물을 서로 다른 세개의 온도에서 저장하고 흡광도를 측정함으로써 온도가 광학적 불투명성에 미치는 영향을 설명하기 위한 것이 반면, 실시예 5는 서로 다른 플루오로우라실의 농도가 흡광도에 미치는 영향을 설명하기 위한 것이다.
실시예 6은 메토트렉세이트를 포함하는 수성 콜라겐 조성물의 광학적 투명성을 얻기 위한 방법을 설명하기 위한 것이다.
실시예 7 및 8은 수성 콜라겐 조성물의 흡광도를 측정하여 광학적 불투명성에 미치는 영향을 설명하기 위한 것으로서, 실시예 7은 콜라겐과 서로 다른 흡광도를 포함하며 pH가 서로 다른 수성 콜라겐 조성물의 경우이며, 실시예 8은 콜라겐과 서로 다른 첨가제를 포함하는 수성 콜라겐 조성물의 경우이다.
실시예 9는 본 발명의 조성물이 환자에게 주사되는 부위에서 개선된 약물 보유 효과를 나타낸다는 것을 설명하기 위한 것이다.
실시예 1 - 플루오로우라실을 포함하는 수성 콜라겐 조성물이 콜라겐 전이 온도에 미치는 영향
무균 조건하에 소정량의 성분들을 혼합하여 6.5중량%의 콜라겐, 0.1M의 인산나트륨 및 0.045M의 염화나트륨을 포함하는 수성 콜라겐 조성물을 제조하였다. 상기 생성되는 조성물 소정 분획을 샘플 홀더 (DSC 팬)에 가하고 샘플 홀더를 용접 밀봉한 다음, 홀더를 디퍼런셜 스캐닝 칼로리메터 (Differntial Scanning Calorimeter: Model No. DSC 10, TA Instruments (New Cascle, Delaware, USA) 제품)에 넣어 생성되는 조성물에 대한 DSC 스캔을 실시한다. 조성물에 의해 과다한 히트 오버 베이스라인 (heat over baseline)이 흡수되거나 방출될 경우에 칼로리메터는 온도를 기록함으로써 콜라겐 조성물에서의 상 변화와 관련이 있는 전이 온도를 측정한다.
본 조성물의 DSC 스캔을 분당 10℃의 속도로 30-70℃에서 실시하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1로부터, 수성 콜라겐 조성물이 하나는 약 44.2℃이고 다른 하나는 53.3℃인 두개의 전이 온도를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
플루오로우라실이 혼합되며, 생성되는 조성물이 콜라겐 (2.2중량%), 플루오로우라실 (33.3mg/mℓ), 0.033M의 인산나트륨 및 0.015M의 염화나트륨을 포함하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 하여 두개의 수성 조성물을 추가로 제조하였다. 무균 조건하에, 6.5중량%의 콜라겐, 0.1M의 인산나트륨 및 0.0475M의 염화나트륨을 포함하는 1부피의 수성 콜라겐 조성물을 스태틱 믹서를 통해 재순환시키고 자석으로 교반하면서 주위 조건으로 균일해질 때까지 혼합하여 조성물을 제형화하였다. 제형후, 두 조성물 모두 광학적으로 불투명하였다.
이어서, 제1 조성물은 실온에서 보관하고 제2 조성물은 약 2-8℃의 온도로냉장 보관하였다. 24시간 이상 보관후, 제1 조성물은 여전히 광학적으로 불투명한 반면, 제2 조성물을 광학적으로 반투명해졌다. 이들 각각의 샘플에 대한 DSC 스캔을 전술한 바와 같은 방법으로 실시하였다. 스캔 결과를 도 2 및 3에 각각 도시하였다.
구체적으로는, 도 2로부터 알 수 있듯이 플루오로우라실을 포함하며 실온에서 보관된 수성 콜라겐 조성물은 제1 전이온도가 약 42℃이고 제2 전이온도의 숄더가 약 45-46℃인 두개의 콜라겐 전이온도를 나타낸다. 이에 반하여, 도 3으로부터 알 수 있듯이 조성 및 보관 기간은 상기의 조성물의 경우와 동일하나 냉장 보관된 수성 콜라겐 조성물은 약 42.5℃의 단일 콜라겐 전이 온도를 갖는다.
전술한 바에 덧붙여서, 플루오로우라실을 포함하며 실온에서 보관된 콜라겐 조성물, 그리고 2-8℃에서 보관된 수성 콜라겐 조성물의 20℃에서의 점도를 비교하였을 뿐 아니라 410nm 파장의 광을 이용하는, 경로가 1mm인 마이크로큐벳을 통해 이들 조성물의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다:
Figure pct00001
본 실시예의 결과로부터 볼 때, 플루오로우라실은 혼화성 세폭독성 약물이다.
실시예 2 - 메토트렉세이트를 포함하는 수성 콜라겐 조성물이 콜라겐 전이온도에 미치는 영향
무균 조건하에 소정량의 성분들을 혼합하여 6.5중량%의 콜라겐, 0.1M의 인산나트륨 및 0.045M의 염화나트륨을 포함하는 수성 콜라겐 조성물을 제조하였다. 상기 생성되는 조성물 소정 분획을 샘플 홀더 (DSC 팬)에 가하고 샘플 홀더를 용접 밀봉한 다음, 홀더를 디퍼런셜 스캐닝 칼로리메터 (Differntial Scanning Calorimeter: Model No. DSC 10, TA Instruments (New Cascle, Delaware, USA) 제품)에 넣어 생성되는 조성물에 대한 DSC 스캔을 실시한다. 조성물에 의해 과다한 히트 오버 베이스라인 (heat over baseline)이 흡수되거나 방출될 경우에 칼로리메터는 온도를 기록함으로써 콜라겐 조성물에서의 상 변화와 관련이 있는 전이 온도를 측정한다.
본 조성물의 DSC 스캔을 분당 10℃의 속도로 30-70℃에서 실시하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1로부터 알 수 있듯이 수성 콜라겐 조성물은 하나가 약 43℃이고 다른 하나가 53℃인 두개의 전이 온도를 나타낸다.
플루오로우라실이 혼합되며, 생성되는 조성물이 콜라겐 (2.2중량%), 메토트렉세이트 (16.7mg/mℓ), 0.033M의 인산나트륨 및 0.015M의 염화나트륨을 포함하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 하여 두개의 수성 조성물을 추가로 제조하였다. 무균 조건하에, 6.5중량%의 콜라겐, 0.1M의 인산나트륨 및 0.045M의 염화나트륨을 포함하는 1부피의 수성 콜라겐 조성물을 2부피의 메토트렉세이트 용액과 주위 조건에서 균일해질 때까지 혼합하여 제형화하였다. 혼합 어댑플러 (mixing adapler)에 의해 연결된 두개의 실린지 사이를 반복하여 이동시킴으로써 혼합하였다. 이어서,제1 조성물은 실온에서 보관하고 제2 조성물은 약 2-8℃의 온도로 냉장 보관하였다. 약 1달 동안 보관후, 제1 조성물은 여전히 광학적으로 불투명한 반면, 제2 조성물을 광학적으로 반투명해졌다. 이들 각각의 샘플에 대한 DSC 스캔을 전술한 바와 같은 방법으로 실시하였다. 스캔 결과를 도 5 및 6에 각각 설명하였다.
구체적으로는, 도 5로부터 알 수 있드시 메토트렉세이트를 포함하며 실온에서 보관된 수성 콜라겐 조성물은 제1 전이온도가 약 42℃이고 제2 전이온도가 약 52.4℃인 두개의 콜라겐 전이온도를 나타낸다. 이에 반하여, 도 6으로부터 알 수 있듯이 조성 및 보관 기간은 상기의 조성물의 경우와 동일하나 냉장 보관된 수성 콜라겐 조성물은 약 43℃의 단일 콜라겐 전이 온도를 갖는다.
본 실시예의 결과로부터 볼 때, 메토트렉세이트는 혼화성 세포독성 약물이다.
실시예 3 - 시스플라틴을 포함하는 수성 콜라겐 조성물의 콜라겐 전이온도에 대한 효과
시스플라틴을 조성물에 혼합하여 생성되는 조성물이 콜라겐 (2.2중량%), 시스플라틴 (4mg/mℓ), 0.033M의 인산나트륨 및 0.015M의 염화나트륨을 포함하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같은 방법으로 수성 콜라겐 조성물을 제조하였다. 이 조성물을 실온에서 보관하고 0, 1, 2, 4 및 8시간째에 본 조성물 소정 분획에 대하여 DSC 스캔을 실시하였다. 스캔 결과를 도 7A (0시간 째의 스캔), 7B (1시간 째의 스캔), 7C (2시간 째의 스캔), 7D (4시간 째의 스캔) 및 7E (8시간 째의 스캔)에 나타내었다.
구체적으로, 이들 도면으로부터, 초기 전이온도가 46-53℃였다가 시간이 지남에 따라 43℃에서만이 마이너 피크가 남아있는, 약 61℃의 주 전이온도로 변하는 것을 알 수 있다. 시간이 지남에 따라 전이온도가 증가하는 것은 수성 콜라겐 조성물 내에서 시스플라틴이 콜라겐에 교차결합 (즉, 공유결합)하는 것과 관련이 있는 것으로 추정된다.
본 실시예로부터 볼 때, 시스플라틴은 혼화성 세포독성 약물이 아니다.
실시예 1-3으로부터, 모든 세포독성 약물이 아니라 특정의 세포독성 약물이 콜라겐과 혼화가능하며 수성 콜라겐 조성물이 약 45℃ 이하의 단일 전이온도를 갖도록 한다. 세포독성 약물이 콜라겐 조성물에서 혼화가능한지의 여부는 조성물을 실온에서 유지할 경우 수회에 걸쳐 조성물의 표준 DSC 스캔을 통해 결정될 수 있다.
이와는 달리, 혼화성은 사용되어질 세포독성 물질을 포함하는 콜라겐 조성물에 대하여 약 45℃ 이하의 단일 전이온도가 생성됨으로써 결정될 수 있다. 사용되어질 세포독성 약물은 본 발명의 방법 및 조성물에서 혼화성인 것으로 판단되는 약물이다.
실시예 4 - 보관 온도가 플루오로우라실을 포함하는 수성 콜라겐 조성물의 광학적 불투명성에 미치는 영향
무균 조건하에 소정량의 성분을 혼합하여 콜라겐 (2.2중량%), 플루오로우라실 (33.3mg/mℓ), 0.033M의 인산나트륨 및 0.015M의 염화나트륨을 포함하는, 세종류의 동일한 수성 콜라겐 조성물을 제조하였다. 각 조성물의 분획 (0.5mℓ)을 10분동안 서로 다른 온도에서 경로가 1mm인 마이크로큐베트에 넣는데, 이때 제1 분획은 약 12℃에서, 제2 분획은 약 8℃에서, 그리고 제3 분획은 약 4℃에서 보관하였다. 이어서, 마이크로큐베트를 통하여 흡광도 (410nm에서의)를 측정함으로써 각 샘플의 광학적 불투명성을 30초 간격으로 측정하였다. 이 실시예의 결과를 도 8에 나타내었는데, 도 8에서 알 수 있듯이 4℃ 또는 8℃에서 수성 콜라겐 조성물을 보관하면 보관 기간에 걸쳐 샘플의 흡광도가 현저하게 감소하였는데, 이는 샘플의 광학적 투명성이 향상되었음을 나타내는 것이다. 이와는 달리, 12℃에서 보관된 수성 콜라겐 조성물은 샘플의 흡광도가 현저하게 감소하였다. 이러한 결과로부터 플루오로우라실을 포함하는 수성 콜라겐 조성물은 낮은 보관 온도, 약 10℃ 이하, 바람직하게는 약 8℃ 이하에서 보관될 경우에 광학적 투명성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 5 - 세포독성 약물의 농도가 수성 콜라겐 조성물의 광학적 불투명성에 미치는 영향
조성물에 혼합되는 플루오로우라실의 양을 각각 16.65mg/mℓ, 22.2mg/mℓ 및 33.3mg/mℓ로 하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 하여 동일한 수성 콜라겐 조성물을 제조하였다. 생성되는 조성물의 소정 분획 (0.5mℓ)을 경로가 1mm인 마이크로큐베트에 넣고 4℃에서 10분 동안 보관한 다음, 마이크로큐베트를 통하여 흡광도(410nm에서의)를 측정함으로써 각 샘플의 흡광도를 30초 간격으로 측정하였다. 각각의 경우에 흡광도가 낮을수록 410nm에서의 광학적 투명성은 좋아진다.
이 실시예의 결과를 도 9에 나타내었는데, 도 9로부터 알 수 있듯이 플루오로우라실 (33.3mg/mℓ)을 포함하는 콜라겐 조성물은 22.2mg/mℓ 또는 16.65mg/mℓ의 플루오로우라실을 포함하는 콜라겐 조성물에 비하여 흡광도가 현저하게 낮다. 이러한 결과로부터 플루오로우라실을 포함하는 수성 콜라겐 조성물에 있어서, 광학적 반투명성을 나타내는데는 유효량의 플루오로우라실이 필요하다는 것을 알 수 있다.
두번째 연구는 불투명한 수성 콜라겐 조성물을 투명하게 만드는데 필요할 플루오로우라실의 양을 결정하기 위하여 실시되었다. 구체적으로는, 수성 콜라겐 조성물을 제형화시켜서 콜라겐 (21.7mg/mℓ), 0.033M의 인산 완충제를 포함하며 플루오로우라실의 양은 서로 다른 수성 콜라겐 조성물을 제조하였다. 각각의 조성물을 약 2-8℃에서 17일 동안 보관한 다음, 조성물의 광학적 외관을 주기적으로 측정하였다. 이 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Figure pct00002
상기의 데이터로부터, 플루오로우라실은 20mg/mℓ의 농도에서 불투명한 콜라겐 조성물에 대하여 약간의 투명 효과를 발휘하기 시작한다는 것을 알 수 있다.
실시예 6 - 수성 콜라겐 조성물에서 광학적 투명성을 얻기 위한 다른 방법
이 실시예의 목적은 몇몇의 실시예에서 수성 콜라겐 조성물에 대하여 광학적투명성을 얻기 위한 다른 방법이 특정의 혼화성 세포독성 약물에 대하여 사용될 수 있다는 것을 설명하기 위한 것이다. 구체적으로는, 이 실시예에 있어서 콜라겐 조성물 중의 메토트렉세이트의 농도는 변하며 콜라겐 조성물을 2℃ 내지 8℃, 또는 실온에서 1-3일 동안 보관하였다. 3일째의 결과는 1일 후에 발견된 결과와 동일하였으므로 표 3에는 1일째의 결과만을 나타내었다.
Figure pct00003
상기 결과로부터, 메토트렉세이트에 있어서는 메토트렉세이트의 농도가 고농도이면서 냉장보관하였을 때 광학적 투명성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 그러나, 메토트렉세이트 농도가 10mg/mℓ 및 16.7mg/mℓ인 경우에는 냉장 보관시에 광학적 투명성이 개선되었음을 알 수 있다.
실시예 7 및 8의 목적은 투명성이 조성물 중의 다른 성분이 아닌 유효량의 혼화성 세포독성 약물의 존재와 관련이 있다는 것을 설명하기 위한 것이다. 구체적으로는, 상기 실시예 1의 플루오로우라실 제제는 pH가 9.3 (플루오로우라실을 가하기 전에는 7.3)이기 때문에 pH가 세포독성 약물을 포함하지 않는 광학적으로 불투명한 콜라겐 조성물에 대하여 현저한 투명성 효과를 나타내는지를 알아보기 위하여실시예 7을 실시하였다.
상기 실시예 2의 콜라겐 조성물에 플루오로우라실을 가하면 인산염 완충제와 염화나트륨의 농도가 변하기 때문에, 플루오로우라실 이외의 다른 성분이 존재하면 광학적으로 불투명한 콜라겐 조성물에 대하여 현저한 투명성 효과가 나타나는지를 알아보기 위하여 실시예 8을 실시하였다.
실시예 9 - 완충제 및 pH가 광학적으로 불투명한 콜라겐 조성물의 투명화에 미치는 효과
6.5중량%의 콜라겐, 0.1M의 인산나트륨 및 0.045M의 염화나트륨을 포함하도록 제형화되었으며, 제형화 후에 pH 값이 7.3인 제1 수성 콜라겐 조성물을 제조함으로써 제1 연구를 실시하였다. 제2 수성 콜라겐 조성물은 6.5중량%의 콜라겐, 0.1M의 붕산나트륨 및 0.045M의 염화나트륨을 포함하도록 제형화되었으며, 제형화 후의 pH 값은 9.1이었다. 이어서, 상기 두개의 조성물의 각각의 분획 (0.5mℓ)을 약 2-8℃에서 경로가 약 1mm인 마이크로큐베트에 10분 동안 보관하였으며, 마이크로큐베트를 통해 흡광도 (410nm에서의)를 측정함으로써 각 샘플의 광학적 불투명도를 15초 간격으로 측정하였다. 각각의 경우에 흡광도가 낮을수록 410nm에서의 광학적 투명도는 높아진다.
이 분석의 결과를 표 10에 나타내었는데, 표 10으로부터 알 수 있듯이 두개의 조성물 모두는 보관 기간 동안 흡광시에 물질 변화를 나타내지 않았으며, 이로써 pH나 완충제는 세포독성 약물을 포함하지 않는 광학적으로 불투명한 콜라겐 조성물에 현저한 투명화 효과를 나타내지 못하는 것을 알 수 있다.
0.33M 인산칼륨 완충제 및 21.7g의 콜라겐을 포함하는 콜라겐 조성물을 제조함으로써 제2 연구를 실시하였다. 조성물의 pH를 약 5, 7, 8 및 9로 조절하여야 할 필요가 있는 경우에 HCl 또는 NaOH를 가하여 용액의 pH를 조절하였다. 조성물을 실온 또는 2-8℃에서 보관하였다. 보관후 1일 및 11일째에 이들 조성물의 광학적 외관을 평가하였다. 그 측정 결과를 표 4에 나타내었다:
Figure pct00004
상기 표 4의 결과로부터 알 수 있듯이, 콜라겐 조성물이 pH 5에서는 중성 또는 염기성 pH를 갖는 콜라겐 조성물에 비하여 덜 불투명하기는 하지만, pH가 광학적으로 불투명한 콜라겐 조성물의 투명화에 현저한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 실온 또는 2-8℃에서 보관하는 동안 어떠한 샘플에 대해서도 투명화가 관찰되지 않았다.
실시예 8 - 첨가제가 광학적으로 불투명한 콜라겐 조성물의 투명화에 미치는 영향
서로 다른 첨가제를 이용하여 첨가제가 불투명한 수성 콜라겐 조성물의 투명화에 미치는 영향을 관찰하였다. 구체적으로는, 첨가제인 우레아, 슈크로오즈, 염화나트륨, 글리세롤 및 를루오로우라실을 6.5중량%의 콜라겐, 0.25M의 첨가제 및 충분량의 붕산나트륨을 포함하며 pH가 9.1인 서로 다른 조성물에 혼합하였다.
이어서, 각 조성물의 분획 (0.5mℓ)을 2.8℃에서 경로가 mm인 마이크로큐베트에 10분 동안 보관한 다음, 마이크로큐베트를 통해 흡광도 (410nm에서의)를 측정함으로써 각 샘플의 광학적 불투명도를 15초 간격으로 측정하였다. 각각의 경우에 흡광도가 낮을수록 410nm에서의 광투명도는 우수하다. 이 분석 결과를 도 11에 나타내었는데, 도 11에서 알 수 있듯이, 플루오로우라실은 약 2-8℃에서 보관하는 동안 콜라겐 조성물의 투명화에 큰 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.
실시예 9 - 주사 부위에서의 혼화성 세포독성 약물의 보유능력 개선
본 발명에 따라 제조된 광학적으로 반투명한 플루오로우라실/콜라겐 조성물의 주사부위에서의 보유능력을 광학적으로 불투명한 플루오로우라실 조성물과 비교하였다.
광학적으로 반투명한 플루오로우라실/콜라겐 조성물의 제조
콜라겐 (22.4mg/mℓ), 플루오로우라실 (33.3mg/mℓ), 0.033m의 인산나트륨 및 0.015m의 염화나트륨을 포함하며 pH가 9.3인 수성 콜라겐 겔 조성물을 실린지 (공칭 충전량: 0.9mℓ)에 넣어 약 2-8℃의 온도에서 24시간 이상 보관하여 광학적으로 반투명한 조성물을 수득하였다.
에피네프린 (1mg/mℓ), 에데테이트 디소듐 (0.5mg/mℓ), 소듐 메타비설파이트(1.5mg/mℓ) 및 염화나트륨을 포함하는 수용액을 제2 실린지 (공칭 충전량: 0.1mℓ)에 보관하였다. 플루오로우라실 겔 실리지를 에피네프린 용액 실린지에 연결하고 두개의 실린지를 연결하는 혼합 어댑터를 통하여 조성물이 균질해질 때까지 실린지에서 실린지로 내용물을 전달함으로써 병변에 주사할 최종 겔을 제조하였다. 생성되는 광학적으로 반투명한 겔 제제는 플루오로우라실 (30mg/mℓ), 에피네프린 (0.1mg/mℓ), 콜라겐 (20mg/mℓ), 0.03M의 인산나트륨, 염화나트륨 (1.6mg/mℓ), 에데테이트 디소듐 (0.05mg/mℓ), 소듐 메타비설파이트 (0.15mg/mℓ)를 포함하며 pH가 약 9이다. 겔은 제조한지 1시간 내에 사용되었다.
광학적으로 불투명한 플루오로우라실/콜라겐 조성물의 제조
콜라겐 (65mg/mℓ), 0.1M의 인산나트륨 및 0.045M의 염화나트륨을 포함하며 pH가 약 7.2로 조절된 수성 콜라겐 겔 조성물을 제1 용기 (예비 충전된 실린저 내에서 0.3mℓ)에 보관하였으며, 이 조성물은 보관 전과 후에 모두 광학적으로 불투명하였다.
에피네프린 (1mg/mℓ), 에데테이트 디소듐 (0.5mg/mℓ), 소듐 메타비설페이트(1.5mg/mℓ) 및 염화나트륨 (8mg/mℓ)을 포함하는 수용액을 제2 용기에 보관하였다.
플루오로우라실 (50mg/mℓ)을 포함하는 수용액을 제3 용기에 보관하였다.
균질해질 때까지 세 용기의 내용물을 혼합하여 병변에 주사하게될 최종 겔을 제조하였다. 생성되는 광학적으로 불투명한 겔 제제는 플루오로우라실 (30mg/mℓ), 에피네프린 (0.1mg/mℓ), 콜라겐 (20mg/mℓ), 0.03M의 인산나트륨, 염화나트륨 (1.6mg/mℓ), 에데테이트 소듐 (0.05mg/mℓ), 소듐 메타비설페이트 (0.15mg/mℓ)를 포함하며 pH 값은 약 9이다. 광학적으로 불투명한 겔 조성물은 제조후 1시간 내에사용되었다.
보유능력 조사
전술한 바와 같이 제조된 광학적으로 불투명한 콜라겐 조성물 및 광학적으로 반투명한 콜라겐 조성물에 대한 국소 보유능력을 쥐에 이식 및 성장된 선천성 섬유성 육종 (RIF-1)을 이용하여 평가하였다. 이 평가에 있어서, 종양 세포를 옆구리를 통해 피하 주사하여 생성되는 종양의 크기가 눈에 보일수 있을 정도 (통상 약 0.5㎤)가 될 때까지 성장시킨 다음, 동물에게 전술한 콜라겐 조성물중 하나를3H-표지화된 플루오로우라실과 함께 종양내 주사하여 치료하였다. 0-24시간 사이의 적당한 시기에 종양을 절개하고 조직을 동화시킨 다음, 조직 중의3H의 양을 실틸레이션 카운팅 (scintillation counting)에 의해 측정하였다. 종양 함량/시간 곡선 (AUC) 아래의 면적을 계산하여 약물에 대한 조직의 누적 노출의 측정치로서 사용하였다.
이 연구의 결과를 도 12에 나타내었는데, 도 12에는 주사 위치에서의 표지화된 플루오로우라실의 보유능력이 시간의 경과에 따라 도식적으로 도시되어 있다. 구체적으로는, Y축은 종양에서의 표지화된 플루오로우라실의 보유능력 (투여량의 %로 표시)을 나타내는 반면에, X축은 초기 투여한 후로의 시간을 나타낸다. 이러한 결과로부터, 광학적으로 투명한 조성물은 광학적으로 불투명한 조성물보다 30-50% 높은 종양 AUC를 제공한다는 것을 알 수 있다. 이 연구에서 AUC의 상대 표준오차는 25-35%의 범위에 있는 것으로 측정되었다. 따라서, 이 결과로부터 광학적으로 불투명한 조성물과 동일한 농도의 플루오로우라실을 포함하는 광학적으로 투명한 콜라겐 겔은 광학적으로 불투명한 조성물에 비하여 주사 부위에서의 세포독성 약물의 보유 능력이 더 우수한 것으로 나타났다.
또한, 도 12는 쥐에게 플루오로우라실 수용액을 복강내 투여할 경우의 종양 AUC를 나타낸다. 쉽게 알 수 있듯이, 이러한 투여 경로는 광학적으로 불투명하거나 광학적으로 반투명한 조성물을 사용하는 경우보다 훨씬 적합하지 않다.
광학적으로 반투명한 콜라겐 겔 조성물에 비하여 광학적으로 투명한 콜라겐 조성물에서의 플루오로우라실 약효가 더 개선된 것은 주사 부위로부터의 플루오로우라실의 유입으로 인한 부작용이 적기 때문인 것으로 판단된다.

Claims (20)

  1. 30-100%의 콜라겐을 함유하는 단백질 성분 및 유효량의 혼화성 세포 독성 약물을 포함하며, 상기 콜라겐 성분은 5-100mg/mℓ의 농도로 수성 매질에 분산되어 비정질 유동체 (amorphous flowable mass)를 제공하는 단백질성 조성물에 있어서, 상기 단백질성 조성물 중의 콜라겐이 45℃ 이하의 단일 전이온도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼화성 세포독성 약물이 플루오로우라실 및 메토트렉세이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포독성 약물이 플루오로우라실인 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 플루오로우라실의 농도가 수성 조성물 1mℓ당 20mg 내지 60mg인 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 세포독성 약물이 메토트렉세이트인 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 메토트렉세이트의 농도가 수성 조성물 1mℓ당 10mg 내지 60mg인 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 혈관수축제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혈관수축제가 에피네프린, 노르에피네프린, 붕산에피네프린 및 디피베프린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질성 조성물.
  9. 광학적으로 반투명한(translucent) 수성 콜라겐 조성물로서,
    단백질 성분이 수성 매질에 5-75mg/mℓ의 농도로 분산된 30-100%의 콜라겐을 포함하고 있어서 비정질의 유동체를 제공하는 단백질성 물질; 및
    상기 조성물을 10℃ 이하로 냉각하거나 주변 조건에서 충분한 시간 동안 보관할 때 상기 콜라겐 조성물이 광학적으로 반투명해질 정도로 충분한 양의 혼화성 세포독성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학적으로 반투명한 수성 콜라겐 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혼화성 세포독성 약물이 플루오로우라실 및 메토트렉세이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 광학적으로 반투명한 수성 콜라겐 조성물.
  11. 콜라겐이 45℃ 이하의 단일 전이온도를 갖도록 균일하게 분산되어 있는 충분한 농도의 혼화성 세포독성 약물을 포함하는 비정질 유동체로서 수성 매질에 분산되어 있는 콜라겐을 포함하는 단백질성 조성물을 병변 부위 또는 병변을 둘러싸는 조직에 투여함으로써,
    상기 약물이 인접 환경으로 서서히 방출됨에 따라 투여 부위로부터 멀리 떨어진 부위에서는 약물의 농도 상승이 방지되는 것을 특징으로 하는, 사람을 제외한 포유동물의 종양성 병변 또는 그를 둘러싸는 조직을 치료하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 혼화성 세포독성 약물이 플루오로우라실 및 메토트렉세이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 세포독성 약물이 플루오로우라실인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 플루오로우라실의 농도가 수성 조성물 1mℓ당 20mg 내지 60mg인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 세포독성 약물이 메토트렉세이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 메토트렉세이트의 농도가 수성 조성물 1mℓ당 10mg 내지 60mg인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 조성물이 병변 부근 또는 병변을 둘러싸고 있는 조직의 모세 혈관을 수축시키는 혈관수축제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 혈관수축제가 에피네프린, 노르에피네프린, 붕산에피네프린 및 디피베프린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 실온에서 광학적으로 반투명한 수성 콜라겐 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 단백질 성분이 수성 매질에 5-75mg/mℓ의 농도로 분산된 30-100%의 콜라겐을 포함하고 있어서 비정질 유동체를 제공하는 단백질성 물질을 가하는 단계;
    (b) 상기 조성물이 10℃ 이하로 냉각될 때 상기 콜라겐 조성물이 반투명하게 되도록 하는 유효량의 혼화성 세포독성 약물을 혼합하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 생성된 조성물을 충분한 시간 동안 10℃ 이하로 냉각시켜서 조성물이 광학적으로 반투명하게 되도록 하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 조성물을 실온으로 가온하는 단계를 포함하는, 실온에서 광학적으로 반투명한 수성 콜라겐 조성물의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 혼화성 세포독성 물질이 플루오로우라실 및 메토트렉세이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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