KR100436552B1 - 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법 - Google Patents

단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환된 미생물을 이용하여 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법은 단백질 분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하는 단계; 효모의 골기체에 존재하는 막단백질의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 코딩하는 유전자, 특정 아미노산 서열을 가지는 기질 부위를 코딩하는 유전자 및 효모의 인버타아제(invertase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하는 단계; 전기 두 가지 벡터를 이용하여suc2돌연변이종 효모를 동시에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하는 단계; 및, 전기 형질전환체를 자당을 유일한 탄소원으로 포함한 배지에서 배양하여 생존율을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 단백질 분해효소의 순수분리 및 정제과정이 필요하지 않고, 많은 비용이 소요되는 기질펩티드의 합성이 요구되지 않으므로, 간단하고, 경제적으로 단백질 분해효소의 유전자 동정 또는 특정 단백질 분해효소에 의해 절단되는 단백질의 유전자 동정에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법{A Method for Measuring Substrate Specificity of Protease}
본 발명은 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 형질전환된 미생물을 이용하여 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
단백질 분해효소는 생체 내의 여러가지 생리 작용에 관여하는 효소로서, 이들 효소의 생화학적인 특성을 이해하고 그 활성을 항진 혹은 억제하는 것은 인간의 질병 치료와도 매우 깊은 연관이 있다. 일반적으로, 하나의 단백질 분해효소의 분해활성의 연구에 가장 중심이 되는 것은 단백질 분해효소의 기질특이성이고, 이를 위하여, 먼저 단백질 분해효소를 순수분리 및 정제하고, 이를 특정 아미노산 서열을 가지는 기질펩티드와 반응시켜서 단백질 분해효소가 어떠한 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 절단하는 지를 측정하는 방법이 통상적으로 사용되고 있다.
그러나, 자연상태로 존재하는 단백질 분해효소 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 알려진 단백질 분해효소라 할지라도 효소의 순수분리 및 정제에는 많은 시간, 노력 및 비용이 소요되고, 기질특이성을 측정하기 위하여 사용되는 기질펩타이드는 대부분 특정 아미노산 서열과 분해시 발광 또는 형광을 나타내는 표지자를 포함하도록 합성된 인공적인 펩티드이기 때문에, 이들을 사용한 기질특이성의 연구는 막대한 비용과 노력이 소요되는 작업이므로, 효율적인 연구가 진행될 수 없었다. 이에, 단백질 분해효소의 순수분리 및 정제를 단순화하기 위하여 많은 노력이 계속되고 있으며, 기질특이성의 측면에서는 표지자의 검출효율을 향상시키는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 그러나, 합성된 기질펩티드의 사용에 따르는 많은 비용의 소요라는 근본적인 문제를 해결하지 못하는 실정이다.
따라서, 전술한 문제점을 해결하여, 간단하고 경제적으로 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 경제적으로 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 단백질 분해효소를 발현시키는 벡터와효모의 골기체에 존재하는 막단백질의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위, 기질 부위 및 효모의 인버타아제(invertase)를 각각 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 동시에 형질전환된suc2돌연변이종 효모를 이용하여, 단백질 분해효소의 기질특이성을 간단하고 경제적으로 측정할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 단백질 분해효소 발현벡터와 기질 발현 벡터로 동시에 형질전환된suc2돌연변이종 효모를 이용하여, 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법의 원리를 개략적으로 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 형질전환체의 자당에서의 생존성을 나타내는 사진이다.
본 발명의 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법은 단백질 분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하는 단계; 효모의 골기체에 존재하는 막단백질의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 코딩하는 유전자, 특정 아미노산 서열을 가지는 기질 부위를 코딩하는 유전자 및 효모의 인버타아제(invertase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하는 단계; 전기 두 가지 벡터를 이용하여suc2돌연변이종 효모를 동시에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하는 단계; 및, 전기 형질전환체를 자당을 유일한 탄소원으로 포함한 배지에서 배양하여 생존율을 측정하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법을 각 단계별로 나누에 상세히 설명하기로 한다.
제 1단계: 단백질 분해효소를 발현시키는 벡터의 작제
단백질 분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제한다: 이때, 벡터는 ADH, CUP 등의 효모의 프로모터를 포함하고,trp,leu,ade,ura등의 표지 유전자를 포함하는, 대장균과 효모에서 안정적으로 발현되는 셔틀벡터를 이용함이 바람직하다.
제 2단계: 기질을 발현시키는 벡터의 작제
효모의 골기체에 존재하는 막단백질의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 코딩하는 유전자, 특정 아미노산 서열을 가지는 기질 부위를 코딩하는 유전자 및 효모의 인버타아제(invertase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제한다: 이때, 골기체 표적 신호 부위는 효모의 골기체 단백질인 Ste13의 골기체 표적 신호 부위를 사용함이 바람직한데, Ste13 단백질의 N-말단에 존재하는 FQFND의 아미노산 서열을 가지고 있어, 골기체에 결합할 수 있다. 또한, 막횡단 부위는 약 18개의 소수성 아미노산으로 구성된 것을 사용함이 바람직하고, 효모의 인버타아제는 아미노산 532개로 구성된 단백질로서 자당을 분해하는 효소이다. 아울러, 벡터는 ADH,CUP 등의 효모의 프로모터를 포함하고,trp,leu,ade,ura등의 표지 유전자를 포함하는, 대장균과 효모에서 안정적으로 발현되는 셔틀벡터를 이용함이 바람직하다.
제 3단계: 형질전환체의 제조
전기 두 가지 벡터를 이용하여suc2돌연변이종 효모를 동시에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조한다: 이때, 사용되는suc2돌연변이종 효모는 자당을 포도당과 과당으로 분해하는 인버타아제가 결실된 돌연변이체로서, 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에서는 생존하지 못하지만, 전기 인버타아제가 발현되는 벡터로 형질전환될 경우, 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에서도 생존할 수 있다.
제 4단계: 생존율 측정
전기 형질전환체를 자당을 유일한 탄소원으로 포함한 배지에서 배양하여 생존율을 측정한다: 이때, 사용되는 배지로는 액체배지 또는 아가로스를 포함하는 고체배지를 사용함이 바람직하고, 배양조건은 25 내지 35℃에서 3 내지 10일간 배양함이 바람직하다.
본 발명의 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법의 원리는 도 1에도시되어 있다. 도 1은 본 발명의 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법의 원리를 개략적으로 나타내는 모식도이다.suc2돌연변이종 효모는 자당을 포도당과 과당으로 분해하는 인버타아제가 결실된 돌연변이체로서, 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에서는 생존하지 못하지만, 전기 인버타아제가 발현되는 벡터로 형질전환될 경우, 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에서도 생존할 수 있다. 본 발명에서는 인버타아제의 앞부분에 효모의 골기체에 존재하는 막단백질의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위 및 특정 아미노산 서열을 가지는 기질 부위가 연결된 융합단백질이 발현되도록 벡터를 작제하였다. 본 발명에서 기질로 사용되는 융합단백질은 효모의 골기체 단백질인 Ste13의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 포함한 부분, Kex2의 기질로 알려진 효모의 알파-팩터의 절단 부위 및 인버타아제로 구성된다. Ste13의 골기체 표적 신호 부위는 융합단백질의 81번째 아미노산에 있고, 막횡단부위는 융합단백질의 121 내지 139번째 아미노산에 위치하며, 기질부위는 융합단백질의 161 내지 171번째 아미노산에 있는 제한효소 절단부위에 위치하므로, 골기체의 내부에 존재하게 된다. 효모의 인버타아제는 융합단백질의 기질삽입부분 뒤쪽에 위치한다.
전기 벡터로suc2돌연변이종 효모를 형질전환시키면, 형질전환체에서 발현된 융합단백질이 골기체로 이동하여 골기체의 막에 결합된 형태로 존재한다. 이 상태에서는, 융합단백질에 포함된 인버타아제가 세포밖으로 분비되지 못하므로, 형질전환체가 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에서 생존할 수 없다. 이때, 형질전환체에 삽입된 단백질 분해효소 벡터에서 발현된 단백질 분해효소가 골기체에서 전기 융합단백질의 기질 부위를 분해할 경우, 융합단백질의 골기체 결합부위와 인버타아제 부위가 각각 분리되며, 분리된 인버타아제는 세포밖으로 분비되어, 자당을 포도당과 과당으로 분해할 수 있으므로, 결과적으로 형질전환체가 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에서 생존할 수 있으나, 형질전환체에 삽입된 단백질 분해효소 벡터에서 발현된 단백질 분해효소가 골기체에서 전기 융합단백질의 기질 부위를 분해하지 못할 경우, 형질전환체가 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에서 생존할 수 없다. 따라서, 단백질 분해효소 발현벡터와 기질 발현벡터로 동시에 형질전환된 형질전환체를 자당이 유일한 탄소원으로 제공되는 배지에 배양하고, 그의 생존율을 측정하여, 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정할 수 있다.
이에, 전기 형질전환체를 사카로마이세스 세레비지에 SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-Kex2(Saccharomyces cerevisiae SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-Kex2)라 명명하고, 2001년 5월 31일 국제기탁기관인 생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 1024BP로 기탁하였다.
상술한 본 발명의 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법에 의하면, 단백질 분해효소의 순수분리 및 정제과정이 필요하지 않고, 많은 비용이 소요되는 기질펩티드의 합성이 요구되지 않으므로, 간단하고, 경제적으로 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: Kex2의 분해활성 측정
먼저, Kex2를 발현하기 위하여kex2유전자를 ADH 프로모터 하부에 연결한 플라스미드인 pADH-kex2를 작제하였다: yeast two-hybrid실험에서 주로 사용되고 있는 pGAD424 벡터의 GAL4부분을 HindIII를 이용해 제거하고, 필요한 제한효소 절단부위를 삽입시켜서 pADH 벡터를 제작하였다. kex2의 단백질 발현부분은 primer 1: 5-CTCGAGATGAAAGTGAGGAAATAT-3(서열번호 1), primer 2: 5-CTGCAGTCACGATCGTCCGGAAGA-3(서열번호 2)를 이용하고, 효모의 게놈 DNA를 주형로 사용해서 PCR을 수행하였다. 그 결과 2.4 kb의 kex2유전자를 얻을 수 있었다. 이어, 전기 유전자를 pADH 벡터에 XhoI과 PstI을 이용하여 삽입시켜서 pADH-kex2 벡터를 작제하였다.
또한, 기질로 사용되어지는 융합단백질은 효모의 골기체 단백질인 Ste13의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 포함한 부분, Kex2의 기질로 알려진 효모의 알파-팩터의 절단 부위, 그리고 인버타아제로 이루어져 있다. 이 융합단백질을 인코드하는 재조합 cDNA를 ADH 프로모터 하부에 연결한 플라스미드인 pADH-SteSubInv를 작제하였다. 좀 더 구체적으로, pADH-SteSubInv벡터는 pAS2 벡터를 기반으로 작제하는데, pADH벡터와 동일한 방법으로 GAL4부분을 제거하고, 인버타아제 부위와 Ste13부위를 삽입시켜서 작제하였다. 이때, 인버타아베 부위는 primer 3: 5-ACTAGTATGACAAACGAAACTAGC-3(서열번호 3)과 primer 4: 5-GACGTCGATAAAATGAAGGGAATG-3(서열번호 4)를 이용하고, 효모의 게놈 DNA를 주형로 사용해서 PCR을 수행하여, 수득한 1.5kb의 절편을 사용하고, Ste13의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 포함한 부분은 primer 5: 5- CTCGAGGTTGTTTTCTTCCAGCCTCATGAC-3(서열번호 5)와 primer 6: 5-GAATTCTGCCCAAACTAGAATCTCCTGC-3(서열번호 6)을 이용하고, 효모의 게놈 DNA를 주형로 사용해서 PCR을 수행하여, 수득한 절편을 사용하였다. 아울러, 알파-팩터의 절단 부위는 N-VVMYRREAEA-C(서열번호 7)의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 합성하여 이용하였다.
suc2, kex2돌연변이 효모를 전기 두 발현벡터로 동시에 형질전환시켜서, 형질전환체인 실험군 1을 제조하였다. 또한, 대조군으로서 kex2 유전자를 포함하지 않은 플라스미드(pADH)와 융합단백질의 유전자를 포함하지 않은 플라스미드(pADH-SteInv)로 동시에 형질전환시킨 실험군 2, pADH와 pADH-SteSubInv로 동시에 형질전환시킨 실험군 3 및 pADH-kex2와 pADH-SteInv로 동시에 형질전환시킨 실험군 4를 각각 제조하고, 이들 실험군 1 내지 4를 5%(w/v) 포도당이 함유된 YPD평판배지(yeast extract 1%(w/v), bacto-peptone 2%(w/v), dextrose 2%(w/v), agarose 1%(w/v))와 5%(w/v) 자당이 함유된 YPD평판배지에 각각 접종하고, 각각 30℃에서 7일간 배양하였다(참조: 도 2). 도 2는 각 실험군의 배양결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 실험군 1에서는 포도당과 자당을 사용할 경우, 모두 생존할 수 있었으나, 실험군 2 내지 4에서는 자당을 사용한 경우, 생존하지 못함을 알 수 있었으므로, 본 발명을 이용하여 Kex2의 활성을 특이적으로 탐지할 수 있음을 알 수 있었다.
이에, 전기 형질전환체를 사카로마이세스 세레비지에 SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-Kex2(Saccharomyces cerevisiae SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-Kex2)라 명명하고, 2001년 5월 31일 국제기탁기관인 생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 1024BP로 기탁하였다.
실시예 2: 기질특이성의 측정
본 발명은 효소의 기질특이성을 연구하는데 응용될 수도 있음을 증명하기 위하여, 전기 실시예 1에서 작제된 pADH-SteSubInv의 알파-팩터 부위의 아미노산을 치환시켜서, kex2의 기질특이성을 측정하였다: 즉, pADH-SteSubInv에서 기질로 사용된 알파-팩터의 절단 부위중 5번 및 6번에 해당하는 아미노산을 무작위로 치환한 플라스미드 라이브러리를 합성하고,suc2, kex2돌연변이 효모를 pADH-kex2로 1차 형질전환시킨 다음, 전기 라이브러리를 형질전환체에 도입하여 다시 2차 형질전환시켰다. 이어, 2차 형질전환체를 5%(w/v) 자당이 함유된 YPD평판배지에 각각 접종하고, 각각 30℃에서 4일간 배양한 다음, 생존하는 효모를 선별하여, 이들이 함유하는 알파-팩터의 염기서열을 확인하였다. 그 결과, 6번 위치에는 아미노산이 D, E, A, V, P, S, Q, K, R 및 H가 위치할 수 있으나, 5번위치에는 오로지 R만이 위치할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 종래에 알려진 kex2의 기질특이성 결과와 동일한 결과이므로, 본 발명은 단백질 분해효소의 기질특이성 확인 실험에 유용하게 응용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 형질전환된 미생물을 이용하여 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 단백질 분해효소의 순수분리 및 정제과정이 필요하지 않고, 많은 비용이 소요되는 기질펩티드의 합성이 요구되지 않으므로, 간단하고, 경제적으로 단백질 분해효소의 유전자 동정 또는 특정 단백질 분해효소에 의해 절단되는 단백질의 유전자 동정에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 효모의 골기체 단백질인 Ste13의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 포함한 부분, Kex2의 기질로 알려진 효모의 알파-팩터의 절단 부위 및 인버타아제를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 재조합 cDNA를 ADH 프로모터 하부에 연결한 플라스미드 pADH-SteSubInv.
  3. kex2 유전자를 ADH 프로모터 하부에 연결한 플라스미드 pADH-kex2와 제 2항의 pADH-SteSubInv로 동시형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-Kex2(Saccharomyces cerevisiae SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-Kex2, KCTC 1024BP).
  4. (ⅰ) 단백질 분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하는 단계;
    (ⅱ) 효모의 골기체에 존재하는 막단백질의 골기체 표적 신호 부위와 막횡단 부위를 코딩하는 유전자, 특정 아미노산 서열을 가지는 기질 부위를 코딩하는 유전자 및 효모의 인버타아제(invertase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하는 단계;
    (ⅲ) 전기 두 가지 벡터를 이용하여suc2돌연변이종 효모를 동시에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
    (ⅳ) 전기 형질전환체를 자당을 유일한 탄소원으로 포함한 배지에서 배양하여 생존율을 측정하는 단계를 포함하는, 단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    단백질 분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터는 pADH-kex2인
    것을 특징으로 하는
    단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    골기체 표적 신호 부위는 Ste13의 골기체 표적 신호 부위인 것을
    특징으로 하는
    단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서,
    효모의 골기체에 존재하는 막단백질의 골기체 표적 신호 부위와
    막횡단 부위를 코딩하는 유전자, 특정 아미노산 서열을 가지는
    기질 부위를 코딩하는 유전자 및 효모의 인버타아제(invertase)를
    코딩하는 유전자를 포함하는 벡터는 pADH-SteSubInv인 것을
    특징으로 하는
    단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법.
  8. 제 4항에 있어서,
    형질전환체는 사카로마이세스 세레비지에 SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-
    Kex2(Saccharomyces cerevisiae SEY6210/pSTE-KR-SUC, pCUP-Kex2, KCTC
    1024BP)인 것을 특징으로 하는
    단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법.
  9. 제 4항에 있어서,
    형질전환체의 배양은 25 내지 35℃에서 3 내지 10일간 배양하는
    것을 특징으로 하는
    단백질 분해효소의 기질특이성을 측정하는 방법.
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