KR100430311B1 - 다양한 뉴클레오티드 혼합물을 사용한 핵산 염기 서열분석 방법 및 이에 사용되는 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 ddNTP 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서, 데옥시뉴클레오티드와 디데옥시뉴클레오티드의 몰비율이 서로 상이한 2종 이상의 뉴클레오티드 혼합물들을 각각 사용하여 상보 핵산 절편들을 생성시킨 후, 이들을 혼합하여 1회의 분리과정을 통하여 분자량 순서대로 분리하여 말단의 염기를 분석함으로써 보다 장쇄의 핵산의 염기 서열을 보다 정확하게 분석하는 방법과 이에 사용되는 키트에 대한 것이다.
Description
본 발명은 ddNTP 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서, 데옥시뉴클레오티드와 디데옥시뉴클레오티드의 몰비율이 서로 상이한 2종 이상의 뉴클레오티드 혼합물들을 각각 사용하여 상보 핵산 절편들을 생성시킨 후, 이들을 혼합하여 1회의 분리과정을 통하여 분자량 순서대로 분리하여 말단의 염기를 분석함으로써 보다 장쇄의 핵산의 염기 서열을 보다 정확하게 분석하는 방법과 이에 사용되는 키트에 대한 것이다.
현재까지 알려진 핵산 염기 서열 분석을 위한 일반적인 방법은 생거(Sanger)의 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법(dideoxynucleotide termination method)이다. 생거의 방법은, 핵산 중합효소를 사용하여 3' 위치 탄소에 히드록시기(-OH)가 결합된 데옥시뉴클레오티드(dNTP)를 기질로 사용하여 사슬을 확장시키고, 3' 위치 탄소에 히드록시기가 결합되지 아니한 디데옥시뉴클레오티드(ddNTP)를 기질로 사용하여 사슬 확장 반응을 종결시킨다.
이러한 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석 방법에서는 주형 핵산에 상보적인 핵산 절편을 구성하는 기질로서 4종류의 dNTP 즉, 데옥시구아노신트리포스페이트(dGTP), 데옥시아데노신트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시시티딘트리포스페이트(dCTP)가 사용되며, 상보 핵산 절편의 중합반응을 종결시키는 기질로서 4종류의 ddNTP 즉, 디데옥시구아노신트리포스페이트 (ddGTP), 디데옥시아데노신트리포스페이트 (ddATP), 디데옥시티미딘트리포스페이트 (ddTTP) 및 디데옥시시티딘트리포스페이트(ddCTP)가 사용된다. ddNTP는 dNTP와 달리 3' 위치탄소에 결합된 히드록시기가 존재하지 아니함으로 인하여, 생성중인 DNA 절편의 말단에 ddNTP가 결합되는 경우에는 더 이상의 핵산 사슬 확장이 일어날 수 없게 된다.
따라서, 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석 방법에서는 말단에 ddNTP가 결합된 다양한 길이의 핵산 절편들이 만들어진다. 생거법에서는, 주형 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 갯수에 해당하는 숫자의 다양한 종류의 상보 핵산 절편이 생성되며 이들을 전기영동법을 통하여 분자량 순서대로 분리한 후, 각 상보 핵산 절편의 말단 염기를 분석하여 주형 핵산 전체의 염기 서열을 분석한다.
그러나, 이러한 생거의 방법이 편리함에도 불구하고 현재까지는 상보 핵산 절편 생성반응의 반응진행도(processivity) 한계로 인하여 통상 500내지 700 염기쌍의 핵산 밖에 정확하게 분석할 수 없다는 문제점이 있다. 예를 들면, 인간의 상보 핵산은 평균 2Kb 정도인데, 이를 완전하게 분석하기 위해서는 이를 분할하여 3번 이상의 염기 서열 분석 과정을 거쳐야 하므로 많은 시간과 노력 및 비용이 소요된다.
또한, 대규모 유전체의 염기서열 분석의 방법으로 알려진 쇼트건(Shotgun)법 즉, 장쇄의 핵산을 다수의 핵산 절편으로 분할하여 염기서열을 분석한 후, 이들을 컴퓨터 상에서 중복 부위를 대비하여 전체 유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 있어서도, 1회의 서열 분석 과정으로 분석할 수 있는 핵산 절편의 길이를 더 크게할 수 있다면 전체 핵산 염기서열을 분석하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있다.
통상적인 생거의 사슬종결법에서는 dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율이 단일한 뉴클레오티드 혼합물이 사용되기 때문에, 주형 핵산의 20내지 30번째 염기쌍에 대응하는 비교적 단쇄의 상보 핵산 절편과 주형 핵산의 600내지 700번째 염기쌍에 대응하는 비교적 장쇄의 상보 핵산 절편들은 적게 생성되고, 주로 주형 핵산의 40내지 500번째 염기쌍에 대응하는 핵산 절편이 많이 생성된다.
따라서, 비교적 단쇄의 핵산 절편들과 비교적 장쇄의 핵산 절편의 농도가 낮아서 핵산의 중간 부위 염기 서열에 비하여 양 말단 부위의 염기서열은 분석하기 어렵기 때문에, 생거법으로 1회의 염기 서열 분석을 통하여 분석할 수 있는 핵산 길이의 제한이 있다. 그러므로, 주형 핵산의 양 말단 부위 염기 서열을 보다 정확하게 분석할 수 있도록 하여 1회의 서열 분석을 통하여 완전하게 분석할 수 있는 핵산의 길이를 보다 크게할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래의 생거법에 따른 핵산 염기 서열 분석 방법을 개량하여 핵산 양 말단부위의 염기서열을 용이하게 분석할 수 있도록 함으로써 1회의 염기서열 분석으로 종래의 방법보다 더 장쇄의 핵산 서열을 분석할 수 있는 방법 및 이에 사용되는 키트를 제공하는 것이다.
도 1 은 dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율 즉, ddGTP/dGTP가 0.05이고, ddATP/dATP가 0.058이며, ddTTP/dTTP가 0.1이고, ddCTP/dCTP가 0.033인 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편들을 전기영동법으로 분리한 결과이다.
도 2 는 dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율 즉, ddGTP/dGTP가 0.15이고, ddATP/dATP가 0.174이며, ddTTP/dTTP가 0.3이고, ddCTP/dCTP가 0.099인 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편들을 전기영동법으로 분리한 결과이다.
도 3 는 dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율 즉, ddGTP/dGTP가 0.005이고, ddATP/dATP가 0.0058이며, ddTTP/dTTP가 0.01이고, ddCTP/dCTP가 0.0033인 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편들을 전기영동법으로 분리한 결과이다.
도 4 는 상기 도 1내지 도 3의 경우에서 생성된 상보 핵산 절편들을 혼합하 여 전기영동법으로 분리한 결과이다.
도 5 는 상기 도 2와 도 3의 경우에서 생성된 상보 핵산 절편들을 혼합하여 전기영동법으로 분리한 결과이다.
종래의 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서는, dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율이 약 0.02인 뉴클레오티드 혼합물이 사용된다. 따라서, 종래의 사슬종결법에 따른 핵산 염기 서열 분석에는 ddGTP/dGTP 몰비율이 0.02내지 0.05이고, ddATP/dATP 몰비율이 0.02내지 0.058이며, ddTTP/dTTP 몰비율이 0.02내지 0.1이고, ddCTP/dCTP 몰비율이 0.02내지 0.033인 뉴클레오티드 혼합물들이 사용되고 있다.
본 발명의 방법에서는 ddNTP의 양을 종래기술의 경우 보다 증가시켜 dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율 즉, ddGTP/dGTP 몰비율이 0.05를 초과하거나, 바람직하게는 0.1이상, 보다 바람직하게는 0.15이상이고, ddATP/dATP 몰비율이 0.058을 초과하거나, 바람직하게는 0.116이상, 보다 바람직하게는 0.174이상이며, ddTTP/dTTP 몰비율이 0.1을 초과하거나, 바람직하게는 0.2이상, 보다 바람직하게는 0.3이상이고, ddCTP/dCTP 몰비율이 0.033을 초과하거나, 바람직하게는 0.066이상, 보다 바람직하게는 0.099이상인 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 비교적 단쇄의 상보 핵산 절편을 생성시키고, 이와 별도로 ddNTP의 양을 종래의 경우보다 감소시킨 뉴클레오티드 혼합물 즉, dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율 즉, ddGTP/dGTP 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.01이하, 보다 바람직하게는 0.005이하이고, ddATP/dATP 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.0116이하, 보다 바람직하게는 0.0058이하이며, ddTTP/dTTP 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.015이하, 보다 바람직하게는 0.01이하이고, ddCTP/dCTP 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.0066이하, 보다 바람직하게는 0.0033이하인 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 비교적 장쇄의 상보 핵산 절편을 생성시킨 후, 이렇게 제조된 상보 핵산 절편들을 혼합하여 1회의 분리 과정을 통하여 상보 핵산 절편들을 분자량 순서에 따라 분리한 후에 상보 핵산 절편 각각의 말단의 염기를 분석한다.
이러한 본 발명의 방법을 통하여 주형 핵산 양 말단 부위의 염기서열을 보다 정확하게 분석하여 종래의 생거법으로 서열분석이 가능한 범위인 40내지 500 염기쌍 범위보다 더 장쇄의 핵산의 염기 서열 분석이 가능하게 된다.
본 발명에 있어서, dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율이 높은 뉴클레오티드 혼합물은 비교적 단쇄의 핵산 절편들을 많이 생성시키며, dNTP에 대한 ddNTP의 몰비율이 낮은 뉴클레오티드 혼합물은 비교적 장쇄의 핵산 절편들을 많이 생성시키게 되어 주형 핵산의 10내지 1,000염기쌍에 대응하는 다양한 길이의 상보 핵산 절편을 얻을 수 있다. 이렇게 제조된 다양한 길이의 상보 핵산 절편들을 혼합하여, 1회의 분리 과정을 통하여 분자량 순서대로 분리시켜 상보 핵산 절편의 말단 염기를 분석한다. 이러한 본 발명의 방법을 통하여 주형 핵산의 10내지 1,000염기쌍 이상까지 보다 정확하게 분석할 수 있어서 보다 장쇄의 핵산 서열 분석이 가능해진다.
따라서, 본 발명의 방법은 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서, dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.05를 초과하거나, 바람직하게는 0.1이상, 보다 바람직하게는 0.15이상이고, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.058을 초과하거나, 바람직하게는 0.116이상, 보다 바람직하게는 0.174이상이며, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.1을 초과하거나, 바람직하게는 0.2이상, 보다 바람직하게는0.3이상이고, dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.033초과, 바람직하게는 0.066이상, 보다 바람직하게는 0.099이상인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하는 단계;
dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.01이하, 보다 바람직하게는 0.005이하이고, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.116이하, 보다 바람직하게는 0.0058이하이며, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.015이하, 보다 바람직하게는 0.01이하이고, dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.0066이하, 보다 바람직하게는 0.0033이하인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하는 단계;
상기 뉴클레오티드 혼합물들 각각에 염기서열을 분석하고자 하는 핵산과 프라이머를 첨가하여 상보 핵산 절편들을 생성시키는 단계;
상기에서 생성된 상보 핵산 절편들을 혼합하여 분자량 순서대로 분리시키는 단계; 그리고,
상기의 분자량 순서대로 분리된 상보 핵산 절편의 말단에 결합된 염기를 분석하여 핵산의 염기서열을 인식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적인 핵산 서열 분석용 키트는 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.05를 초과하거나, 바람직하게는 0.1이상, 보다 바람직하게는 0.15이상인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 밀폐용기;
dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.058을 초과하거나, 바람직하게는 0.116이상, 보다 바람직하게는 0.174이상인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 밀폐용기;
dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.1을 초과하거나, 바람직하게는 0.2이상, 보다 바람직하게는 0.3이상인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 밀폐용기;
dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.033을 초과하거나, 바람직하게는 0.066이상, 보다 바람직하게는 0.099이상인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 밀폐용기와 그리고,
dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.01이하, 보다 바람직하게는 0.005이하인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 밀폐용기;
dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.0116이하, 보다 바람직하게는 0.0058이하인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 밀폐용기;
dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.015이하, 보다 바람직하게는 0.01이하인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 밀폐용기;
dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.02미만이거나, 바람직하게는 0.0066이하, 보다 바람직하게는 0.0033이하인 뉴클레오티드 혼합물을 함유하는 용액이 채워진 8종류의 밀폐용기들로 구성된다.
즉, 본 발명의 핵산 염기 서열 분석용 키트는 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 몰수에 비해 0.05배를 초과하거나, 바람직하게는 0.1배 이상, 보다 바람직하게는 0.15배 이상의 양의 ddGTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기;
완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dATP의 몰수에 비해 0.058배를 초과하거나, 바람직하게는 0.116배 이상, 보다 바람직하게는 0.174배 이상의 양의 ddATP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기;
완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dTTP의 몰수에 비해 0.1배를 초과하거나, 바람직하게는 0.2배 이상, 보다 바람직하게는 0.3배 이상의 양의 ddTTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기;
완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dCTP의 몰수에 비해 0.033배를 초과하거나, 바람직하게는 0.066배 이상, 보다 바람직하게는 0.099배 이상의 양의 ddCTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기와
완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 몰수에 비해 0.02배 미만이거나, 바람직하게는 0.01배 이하, 보다 바람직하게는 0.005배 이하의 양의 ddGTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기;
완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dATP의 몰수에 비해 0.02배 미만이거나, 바람직하게는 0.0116배 이하, 보다 바람직하게는 0.0058배 이하의 양의 ddATP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기;
완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dTTP의 몰수에 비해 0.02배 미만이거나, 바람직하게는 0.015배 이하, 보다 바람직하게는 0.01배 이하의 양의 ddTTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 그리고,
완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dCTP의 몰수에 비해 0.02배 미만이거나, 바람직하게는 0.0066배 이하, 보다 바람직하게는 0.0033배 이하의 양의 ddCTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기들, 즉, 혼합비율이 서로 상이한 뉴클레오티드 혼합물들로 각각 채워진 8종류의 밀폐용기들로 제조된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 보통의 범위가 하기 실시예의 내용으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 450nM의 ddGTP를 혼합하여 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.15인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하고, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 5.262μM의 ddATP를 혼합하여 dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.174인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하고, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 9.06μM의 ddTTP를 혼합하여 dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.3인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하고, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 3μM의 ddCTP를 혼합하여 dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.099인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하였다.
또한, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 15nM의 ddGTP를 혼합하여 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.005인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하고, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 175.4nM의ddATP를 혼합하여 dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.0058인뉴클레오티드 혼합물을 제조하고, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 0.302μM의 ddTTP를 혼합하여 dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.01인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하고, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 0.1μM의 ddCTP를 혼합하여 dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.0033인 뉴클레오티드 혼합물을 제조하였다.
이렇게 제조된 혼합물들에 10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 프라이머 및 주형 핵산을 첨가하여 상보 핵산 절편 생성 반응을 진행시킨 뒤, 생성된 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리하여 말단 염기를 분석하였다. 주형 핵산으로서는 pUC 19 플라스미드 DNA 1.5 ㎍, 프라이머로서는 M13 Universial Forward 17mer(5'-gtaaaacgacggccagt, 30pmoles), 및 증류수를 가하여 상보 핵산 절편 생성 반응혼합물의 총량을 40㎍으로 제조하였다. 상보 핵산 절편들의 생성반응을 순차적으로 94℃에서 240초, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃ 60초를 30회 반복시킨 후, 마지막으로 72℃에서 300초간 한번 더 진행시켰다. 종결용액(2.5% 브로모페놀블루, 2.5% 자일렌 시아놀, 10mM NaOH)을 40㎕ 가하여 상보 핵산 절편의 생성반응을 종결시켰다. 이렇게 제조된 상보 핵산 절편들을 8M의 요소(urea), 6% 아크릴아마이드 겔을 사용하여 전기영동법으로 분자량 순서대로 분리시킨 후, 은 염색법(silverstar staining)으로 염기서열을 분석하였다.
실시예 2.
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 450nM의 ddGTP를 혼합하여 제조한 dGTP에대한 ddGTP의 몰비율이 0.15인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 5.262nM의 ddATP를 혼합하여 제조한 dATP에대한 ddATP의 몰비율이 0.174인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 9.06μM의 ddTTP를 혼합하여 제조한 dTTP에대한 ddTTP의 몰비율이 0.3인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 3μM의 ddCTP를 혼합하여 제조한 dCTP에대한 ddCTP의 몰비율이 0.1인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 15nM의 ddGTP를 혼합하여 제조한 dGTP에대한 ddGTP의 몰비율이 0.005인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 175.4nM의 ddATP를 혼합하여 제조한 dATP에대한 ddATP의 몰비율이 0.0058인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 0.302μM의 ddTTP를 혼합하여 제조한 dTTP에대한 dTTP의 몰비율이 0.01인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고; 그리고,
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 0.1μM의 ddCTP를 혼합하여 제조한 dCTP에대한 ddCTP의 몰비율이 0.0033인 뉴클레오티드 혼합물들을 밀폐용기에 채워서 8종류의 밀폐용기들로 구성된 본 발명의 핵산 염기 서열 분석 키트를 제작하였다.
이렇게 제조된 핵산 서열 분석 키트의 각각의 밀폐용기에 주형 DNA로서는pUC 19 플라스미드 DNA 1.5 ㎍, 프라이머로서는 M13 Universial Forward 17mer(5'-gtaaaacgacggccagt, 30pmoles), 및 증류수를 가하여 40㎍의 상보 핵산 절편 생성 반응용 혼합물을 제조하였다. 이렇게 제조된 혼합물을 실시예 1의 방법에 따라 반응시켜 상보 핵산 절편들을 생성시키고 이들을 혼합하여 염기 서열을 분석하였다.
실시예 3.
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 450nM의 ddGTP를 혼합하여 제조한 dGTP에대한 ddGTP의 몰비율이 0.15인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 5.262nM의 ddATP를 혼합하여 제조한 dATP에대한 ddATP의 몰비율이 0.174인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 9.06μM의 ddTTP를 혼합하여 제조한 dTTP에대한 ddTTP의 몰비율이 0.3인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 3μM의 ddCTP를 혼합하여 제조한 dCTP에대한 ddCTP의 몰비율이 0.1인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 15nM의 ddGTP를 혼합하여 제조한 dGTP에대한 ddGTP의 몰비율이 0.005인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 175.4nM의 ddATP를 혼합하여 제조한 dATP에대한 ddATP의 몰비율이 0.0058인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 0.302μM의 ddTTP를 혼합하여 제조한 dTTP에대한 ddTTP의 몰비율이 0.01인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 0.1μM의 ddCTP를 혼합하여 제조한 dCTP에대한 ddCTP의 몰비율이 0.0033인 뉴클레오티드 혼합물들을 밀폐용기에 채우고:
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 150nM의 ddGTP를 혼합하여 제조한 dGTP에대한 ddGTP의 몰비율이 0.05인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 1.754μM의 ddATP를 혼합하여 제조한 dATP에대한 ddATP의 몰비율이 0.058인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 3.02μM의 ddTTP를 혼합하여 제조한 dTTP에대한 ddTTP의 몰비율이 0.1인 뉴클레오티드 혼합물을 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인(Betain) 안정화제, TopTMDNA 중합효소, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 1μM의 ddCTP를 혼합하여 제조한 dCTP에대한 ddCTP의 몰비율이 0.033인 뉴클레오티드 혼합물들을 밀폐용기에 채워서 12종류의 밀폐용기들로 구성되는 본 발명의 핵산 염기 서열 분석 키트를 제작하였다.
이렇게 제조된 핵산 서열 분석 키트의 각각의 밀폐용기에 주형 DNA로서는pUC 19 플라스미드 DNA 1.5 ㎍, 프라이머로서는 M13 Universial Forward 17mer(5'-gtaaaacgacggccagt, 30pmoles), 및 증류수를 가하여 40㎍의 상보 핵산 절편 생성 반응용 혼합물을 제조하였다. 이렇게 제조된 혼합물을 실시예 1의 방법에 따라 반응시켜 상보 핵산 절편들을 생성시키고 이들을 혼합하여 염기 서열을 분석하였다.
도 1은 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.05이고, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.058이며, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.1이고, dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.033인 뉴클레오티드 혼합물로 제조된 서열 분석 키트를 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동법으로 분리시킨 결과로써, 40내지 500 염기쌍에 대응하는 핵산 절편들을 볼 수 있다.
도 2는 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.15이고, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.174이며, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.3이고, dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.1인 뉴클레오티드 혼합물로 제조된 서열 분석 키트를 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동법으로 분리시킨 결과로써, 20내지 300 염기쌍에 대응하는 핵산 절편들을 볼 수 있다.
도 3은 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.005이고, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.0058이며, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.01이고, dCTP에 대한 ddCTP의몰비율이 0.0033인 뉴클레오티드 혼합물로 제조된 서열 분석 키트를 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동법으로 분리시킨 결과로써, 100내지 1,000 염기쌍에 대응하는 핵산 절편들을 볼 수 있다.
도 4는 도 1내지 도 3의 반응물을 혼합하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리시킨 결과로써 20내지 1,000 염기쌍에 대응하는 핵산 절편들을 볼 수 있다.
도 5는 도 2와 도 3의 반응물을 혼합하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리시킨 결과로써 20내지 1,000 염기쌍에 대응하는 핵산 절편들을 볼 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법 및 키트를 사용하면 10내지 1,000 염기쌍을 갖는 핵산의 염기 서열을 용이하게 분석할 수 있어서 1회의 염기 서열 분석을 통하여 종래의 방법에 비해 더욱 장쇄의 핵산 염기 서열을 분석할 수 있다.
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- 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서,dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.15이상인 뉴클레오티드 혼합물, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.174이상인 뉴클레오티드 혼합물, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.3이상인 뉴클레오티드 혼합물, dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.099이상인 뉴클레오티드 혼합물들과 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.005이하인 뉴클레오티드 혼합물, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.0058이하인 뉴클레오티드 혼합물, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.01이하인 뉴클레오티드 혼합물, dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.0033이하인 뉴클레오티드 혼합물들을 포함하는 핵산 절편 생성 반응 용액들을 제조하는 단계;상기 상보 핵산 절편 생성 반응 용액들 각각에 염기서열을 분석하고자 하는 핵산과 프라이머를 각각 첨가하여 상보 핵산 절편들을 생성시키는 단계;상기에서 생성된 상보 핵산 절편들을 각 뉴클레오티드 종류별로 혼합하여 분자량 순서대로 분리시키는 단계; 그리고,상기의 분자량 순서대로 분리된 상보 핵산 절편의 말단에 결합된 염기를 분석하여 핵산의 염기서열을 인식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
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- 제 3항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편 생성 반응 용액들이 각각 dGTP에 대한 ddGTP의 몰비율이 0.02내지 0.05 인 뉴클레오티드 혼합물과, dATP에 대한 ddATP의 몰비율이 0.02내지 0.058인 뉴클레오티드 혼합물과, dTTP에 대한 ddTTP의 몰비율이 0.02내지 0.1인 뉴클레오티드 혼합물과, dCTP에 대한 ddCTP의 몰비율이 0.02내지 0.033인 뉴클레오티드 혼합물을 포함하는 상보 핵산 절편 생성 반응 혼합물들을 추가로 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
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- 제 3항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편 혼합물을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
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- 제 6항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편 혼합물을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
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- 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 몰수에 비해 0.15배이상인 양의 ddGTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dATP의 몰수에 비해 0.174배이상인 양의 ddATP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dTTP의 몰수에 비해 0.3배이상인 양의 ddTTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dCTP의 몰수에 비해 0.099배이상인 양의 ddCTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기와 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 몰수에 비해 0.005배이하인 양의 ddGTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dATP의 몰수에 비해 0.0058배이하인 양의 ddATP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dTTP의 몰수에 비해 0.01배이하인 양의 ddTTP로 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dCTP의 몰수에 비해 0.0033배이하인 양의 ddCTP로 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기로 구성된, 혼합비율이 서로 상이한 뉴클레오티드 혼합물로 채워진 8종류의 밀폐용기들로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
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- 제 21항에 있어서, 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 몰수에 비해 0.02배 내지 0.05 배인 양의 ddGTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dATP의 몰수에 비해 0.02배 내지 0.058 배인 양의 ddATP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dTTP의 몰수에 비해 0.02배 내지 0.1 배인 양의 ddTTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 밀폐용기; 그리고, 완충용액, 안정화제, DNA 중합효소와 dGTP, dATP, dTTP, dCTP 및 dCTP의 몰수에 비해 0.02배 내지 0.033 배인 양의 ddCTP로 이루어진 뉴클레오티드 혼합물이 채워진 4종류의 밀폐용기들을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
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|---|---|---|---|---|
| KR900001860A (ko) * | 1988-07-12 | 1990-02-27 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | Dna 시퀀싱 |
| US5002868A (en) * | 1988-07-20 | 1991-03-26 | Atom Sciences, Inc. | DNA sequencing process using stable isotopes |
| US5427911A (en) * | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Yale University | Coupled amplification and sequencing of DNA |
| EP0535587A1 (en) * | 1991-09-30 | 1993-04-07 | Beckman Instruments, Inc. | Process for optimizing nucleotide sequence determination |
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