KR20010051853A - 다양한 핵산 중합효소를 사용하는 핵산 염기 서열분석방법 및 이에 사용되는 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 ddNTP 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 핵산 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서, 디데옥시뉴클레오티드에 대한 친화도가 상이한 2종 이상의 핵산 중합효소를 동시에 함유하는 혼합물에 핵산을 첨가하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 분리하여 분석함으로써 핵산 염기 서열을 분석하는 방법과 이에 사용되는 키트에 대한 것이다.
Description
본 발명은 핵산 서열 분석 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것으로, 1회의 핵산 염기 서열 분석을 통하여 핵산 전부분의 염기서열을 보다 정확하게 분석할 수 있는 핵산 염기 서열 분석 방법 및 이에 사용되는 키트에 대한 것이다.
현재까지 알려진 핵산 염기 서열 분석을 위한 일반적인 방법은 생거(Sanger)의 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법(dideoxynucleotide termination method)이다. 생거의 방법은, 핵산 중합효소를 사용하여 3' 위치 탄소에 히드록시기(-OH)가 결합된 데옥시뉴클레오티드(dNTP)를 기질로 사용하여 사슬을 확장시키고, 3' 위치 탄소에 히드록시기가 결합되지 아니한 디데옥시뉴클레오티드(ddNTP)를 기질로 사용하여 사슬확장반응을 종결시킨다.
이러한 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석 방법에서는 주형 핵산에 상보적인 핵산 절편을 구성하는 기질로 4종류의 dNTP 즉, 데옥시구아노신트리포스페이트 (dGTP), 데옥시아데노신트리포스페이트 (dATP), 데옥시티미딘트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시시티딘트리포스페이트(dCTP)가 사용되며, 상보 핵산 절편의 중합반응을 종결시키는 기질로서 4종류의 ddNTP 즉, 디데옥시구아노신트리포스페이트 (ddGTP), 디데옥시아데노신트리포스페이트 (ddATP), 디데옥시티미딘트리포스페이트 (ddTTP) 및 디데옥시시티딘트리포스페이트 (ddCTP)가 사용된다. ddNTP는 dNTP와 달리 3' 위치 탄소에 결합된 히드록시기가 존재하지 아니함으로 인하여, ddNTP가 생성중인 핵산 절편의 말단에 결합되는 경우에는 더 이상의 핵산 사슬 확장이 일어날 수 없게 된다.
따라서, 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석 방법에서는 말단에 ddNTP가 결합된 다양한 길이의 핵산 절편들이 만들어진다. 생거법에서는, 주형 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 갯수에 해당하는 숫자의 다양한 종류의 상보 핵산 절편이 생성되며 이들을 전기영동법을 통하여 분자량 순서대로 분리한 후, 각 핵산 절편의 말단 염기를 분석하여 주형 핵산 전체의 염기서열을 분석한다.
그러나, 이러한 생거의 방법이 편리함에도 불구하고 현재까지는 상보 핵산 절편 생성 반응의 반응진행도(processivity)의 한계로 인하여 통상 500 내지 700 염기쌍의 핵산밖에 정확하게 분석할 수 없다는 문제점이 있다. 예를 들면, 인간의 상보 핵산은 평균 2Kb 정도인데, 이를 완전하게 분석하기 위해서는 이를 분할하여 3번 이상의 염기 서열 분석 과정을 거쳐야 하므로 많은 시간과 노력 및 비용이 소요된다.
또한, 대규모 유전체의 염기 서열 분석의 방법으로 알려진 쇼트건(Shotgun)법 즉, 장쇄의 핵산을 다수의 핵산 절편으로 분할하여 염기서열을 분석한 후, 이들을 컴퓨터 상에서 중복 부위를 대비하여 전체 유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 있어서도 1회의 염기 서열 분석 과정으로 분석할 수 있는 핵산절편의 길이를 더 크게할 수 있다면 전체 핵산 염기서열을 분석하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있다.
통상적인 생거의 사슬종결법에서는 단일의 핵산 중합효소가 사용되기 때문에 주형 핵산의 20내지 30번째 염기쌍에 대응되는 비교적 단쇄의 상보 핵산 절편과 주형 핵산의 600내지 700번째 염기쌍에 대응되는 비교적 장쇄의 상보 핵산 절편들은 적게 생성되고, 통상 40내지 500번째 염기쌍에 대응하는 상보 핵산 절편이 많이 생성된다.
따라서, 비교적 단쇄의 핵산 절편들과 비교적 장쇄의 핵산 절편의 농도가 낮아 핵산의 중간 부위 염기 서열에 비하여 양 말단 부위의 염기서열은 분석하기 어렵기 때문에, 생거법으로 1회의 염기 서열 분석을 통하여 분석할 수 있는 핵산의 길이의 제한이 있다. 그러므로, 주형 핵산의 양 말단 부위 염기 서열을 보다 정확하게 분석할 수 있도록 하여 1회의 서열 분석을 통하여 완전하게 분석할 수 있는 핵산의 길이를 보다 크게 할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래의 생거법에 따른 핵산 염기 서열 분석 방법을 개량하여 핵산 양 말단부위의 염기서열을 용이하게 분석할 수 있도록 함으로써, 1회의 염기서열 분석으로 종래의 방법보다 더 장쇄의 핵산 서열을 분석할 수 있는 방법 및 이에 사용되는 키트를 제공하는 것이다. 상기의 본 발명의 목적은 종래의 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서, 통상적인 핵산 중합효소보다 ddNTP에 대한 친화도가 높은 핵산 중합효소와 통상적인 핵산 중합효소보다 ddNTP에 대한 친화도가 낮은 핵산 중합효소로 이루어진 2종 이상의 핵산 중합효소를 혼합 사용하는 핵산 염기 서열분석 방법을 제공함으로써 달성된다.
즉, ddNTP에 대한 친화도가 높은 중합효소는 비교적 단쇄의 핵산 절편을 많이 생성시키며, ddNTP에 대한 친화도가 낮은 중합효소는 비교적 장쇄의 핵산 절편을 많이 생성시킨다. 그러므로, ddNTP에 대한 친화도가 상이한 중합효소들을 혼합사용하여 핵산 염기 서열을 분석하면 주형 핵산의 10내지 1000염기쌍 이상까지에 대응하는 다양한 길이의 상보 핵산 절편이 골고루 생성되어 보다 장쇄의 핵산 서열 분석이 가능해진다.
도 1은 ddNTP에 대한 통상적인 효소친화도를 갖는 종래의 핵산 중합효소 (dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배인 중합효소)를 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리한 결과이다.
도 2는 ddNTP에 대한 효소친화도가 높은 핵산 중합효소(dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도의 0.5배인 중합효소)를 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리한 결과이다.
도 3은 ddNTP에 대한 효소친화도가 낮은 핵산 중합효소(dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도의 8,000배인 중합효소)를 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리한 결과이다.
도 4는 상기 도 1 내지 도 3의 ddNTP에 대한 효소 친화도가 서로 상이한 3종의 핵산 중합효소를 동시에 함유하는 핵산 중합효소 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편들을 전기영동으로 분리한 결과이다.
도 5는 상기 도 2 내지 도 3의 ddNTP에 대한 효소 친화도가 서로 상이한 2종의 핵산 중합효소를 동시에 함유하는 핵산 중합효소 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편들을 전기영동으로 분리한 결과이다.
본 발명의 방법은 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석에 있어서 dNTP에 대한 친화도에 비하여 ddNTP에 대한 친화도가 더 높은 중합효소와 dNTP에 대한 친화도에 비하여 ddNTP에 대한 친화도가 더 낮은 중합효소를 혼합 사용하는 것을 특징으로 한다. 종래의 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석에 사용되는 중합효소의 dNTP에 대한 친화도와 ddNTP에 대한 친화도 사이의 비율은 약 3,000으로서, dNTP가 중합효소에 의해서 사슬 확장 반응이 진행중인 상보 핵산 절편의 말단에 반응하는 빈도가 ddNTP가 중합효소에 의해서 사슬 확장 반응이 진행중인 상보 핵산 절편의 말단에 반응하여 사슬 확장을 종결시키는 빈도의 3,000 배에 해당한다.
본 발명에 있어서의 "효소 친화도"는 특정 중합효소가 사슬 확장 반응이 진행중인 핵산 절편의 말단에 ddNTP 또는 dNTP가 결합하는 반응 빈도에 기여하는 정도를 상대적인 값으로 나타낸 것을 의미한다. 본 발명에서는 (주)바이오니아에서 생산하는 TopTMDNA 중합효소의 ddNTP 및 dNTP에 대한 효소 친화도를 기준으로 하여 사용되는 효소의 ddNTP와 dNTP에 대한 친화도를 설명한다.
본 발명의 방법에서는 사슬 확장 반응에 기여하는 dNTP의 반응 결합 빈도가 사슬 확장 반응의 종결에 기여하는 ddNTP의 반응 결합 빈도에 비해 3,000배 미만이거나, 바람직하게는 1,000배 이하, 보다 바람직하게는 0.5배 이하인 중합효소와 사슬확장 반응에 기여하는 dNTP의 반응 결합 빈도가 사슬 확장 반응의 종결에 기여하는 ddNTP의 반응 결합 빈도에 비해 3,000배를 초과하거나, 바람직하게는 5,000배 이상, 보다 바람직하게는 8,000배 이상인 중합효소를 사용한다.
따라서, 본 발명의 방법은 생거법에 의한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서, dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만이거나, 바람직하게는 1,000배 이하, 보다 바람직하게는 0.5배 이하인 중합효소와 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하거나, 바람직하게는 5,000배 이상, 보다 바람직하게는 8,000배 이상인 중합효소를 함께 함유하는 뉴클레오티드 혼합물들을 제조하는 단계;
상기 뉴클레오티드 혼합물들 각각에 염기 서열을 분석하고자 하는 핵산과 프라이머를 첨가하여 상보 핵산 절편들을 생성시키는 단계; 그리고,
상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리하여 말단에 결합된 염기를 분석하여 상기 핵산의 염기서열을 인식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적인 핵산 서열 분석용 키트는, dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만이거나, 바람직하게는 1,000배 이하, 보다 바람직하게는 0.5배 이하인 중합효소와 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하거나, 바람직하게는 5,000배 이상인, 보다 바람직하게는 8,000배 이상인 중합효소를 함께 함유한 뉴클레오티드 혼합물들이 채워진 4가지의 밀폐용기들로 구성된다. 즉, ddATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 완충용액, 안정화제, ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만이거나, 바람직하게는 1,000배 이하, 보다 바람직하게는 0.5배 이하인 중합효소 및 ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하거나, 바람직하게는 5,000배 이상, 보다 바람직하게는 8,000배 이상인 중합효소로 채워진 밀폐용기;
ddGTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 완충용액, 안정화제, ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만이거나, 바람직하게는 1,000배 이하, 보다 바람직하게는 0.5배 이하인 중합효소 및 ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하거나, 바람직하게는 5,000배 이상, 보다 바람직하게는 8,000배 이상인 중합효소로 채워진 밀폐용기;
ddCTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 완충용액, 안정화제와 ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만이거나, 바람직하게는 1,000배 이하, 보다 바람직하게는 0.5배 이하인 중합효소 및 ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하거나, 바람직하게는 5,000배 이상, 보다 바람직하게는 8,000배 이상인 중합효소 채워진 밀폐용기; 그리고,
ddTTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 완충용액, 안정화제와 ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만이거나, 바람직하게는 1,000배 이하, 보다 바람직하게는 0.5배 이하인 중합효소 및 ddNTP에 대한 친화도가 dNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하는, 바람직하게는 5,000배 이상인, 보다 바람직하게는 8,000배 이상인 중합효소로 채워진 밀폐용기들로 구성된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 보통의 범위가 하기 실시예의 내용으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 150nM의 ddGTP를 혼합하여 제조된 뉴클레오티드 혼합물과 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 1.754μM의 ddATP를 혼합하여 제조된 뉴클레오티드 혼합물과 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 3.02μM의 ddTTP를 혼합하여 제조된 뉴클레오티드 혼합물과 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP와 1μM의 ddCTP를 혼합하여 제조된 뉴클레오티드 혼합물 각각에, ddNTP에 대한 친화도가 높은 중합효소로서, Thermo Sequenase(USB사 제품, dNTP에 대한 효소 친화도가 ddNTP에 대한 효소 친화도에 비하여 0.5배인 중합효소), ddNTP에 대한 친화도가 낮은 중합효소로서, Tfi mutant DNA 중합효소(대한민국 특허출원 98-13408호, dNTP에 대한 효소친화도가 ddNTP에 대한 효소친화도에 비하여 8,000배인 중합효소)를 첨가하였다. 또한, 대조용으로, 상기 뉴클레오티드 혼합물들 각각에 ddNTP에 대한 통상의 친화도를 가지는 중합효소로서 Top DNA polymerase((주)바이오니아 제품, dNTP에 대한 효소 친화도가 ddNTP에 대한 효소 친화도에 비하여 3,000 배인 중합효소)를 첨가하였다.
이렇게 제조된 혼합물들에 주형 핵산과 프라이머를 첨가하여 상보 핵산 절편 생성반응을 진행시킨 뒤, 생성된 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리하여 말단 염기를 분석하였다. 주형 핵산으로서는 1.5 μg의 pUC 19 플라스미드 DNA, 프라이머로서는 M13 Universial Forward 17mer(5'-gtaaaacgacggccagt,30pmoles), 및 증류수를 가하여 40 μg의 상보 핵산절편 생성반응용 혼합물을 제조하였다. 상보 핵산 절편들의 생성반응을 순차적으로 94℃에서 240초, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃ 60초를 30회 반복시킨 후, 마지막으로 72℃에서 300초간 한번 더 진행시켰다. 종결용액(2.5% 브로모페놀블루, 2.5% 자일렌 시아놀, 10mM NaOH)을 40μl 가하여 상보핵산절편의 생성반응을 종결시켰다. 이렇게 제조된 상보 핵산 절편들을 8M의 요소(urea), 6% 아크릴아마이드 겔을 사용하여 전기영동법으로 분자량 순서대로 분리시킨 후, 은 염색법(silverstar staining kit;(주)바이오니아 제품)으로 염기서열을 분석하였다.
실시예 2.
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인 (Betain) 안정화제, Thermo Sequenase 2.5 unit와 Tfi mutant DNA 중합효소 2.5 unit의 핵산 중합효소 혼합물 5 unit(1unit은 37℃에서 1시간동안 핵산 1 μg을 반응시킬 수 있는 양을 의미한다.), 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP로 이루어진 dNTP 혼합물과 150nM의 ddGTP를 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인 (Betain) 안정화제, Thermo Sequenase 2.5 unit와 Tfi mutant 2.5 unit의 핵산 중합효소 혼합물 5 unit, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP로 이루어진 dNTP 혼합물과 1.754μM의 ddATP를 밀폐용기에 채우고;
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인 (Betain) 안정화제, Thermo Sequenase 2.5 unit와 Tfi mutant DNA 중합효소 2.5 unit의 핵산 중합효소 혼합물 5 unit, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP로 이루어진 dNTP 혼합물과 3.02μM의 ddTTP를 밀폐용기에 채우고; 그리고,
10배로 희석시킨 완충용액(500mM 트리스-HCl, 20mM MgCl2), 5M 베타인 (Betain) 안정화제, Thermo Sequenase 2.5 unit와 Tfi mutant DNA 중합효소 2.5 unit의 핵산 중합효소 혼합물 5 unit, 3μM의 dGTP, 30μM의 dATP, 30μM의 dTTP, 30μM의 dCTP로 이루어진 dNTP 혼합물과 1μM의 ddCTP를 밀폐용기에 채워서, 4종류의 밀폐용기들로 구성된 본 발명의 핵산 염기 서열 분석 키트를 제작하였다.
이렇게 제조된 핵산 서열 분석 키트의 각각의 밀폐용기에 주형 DNA로서는 pUC 19 플라스미드 DNA, 1.5 μg, 프라이머로서는 M13 Universial Forward 17mer(5'-gtaaaacgacggccagt, 30pmoles), 및 증류수를 가하여 40 μg의 상보 핵산 절편 생성 반응용 혼합물을 제조하였다. 이렇게 제조된 혼합물을 실시예 1의 방법에 따라 상보 핵산 절편을 생성시키고 염기 서열을 분석하였다.
도 1은 ddNTP에 대한 통상의 친화도를 가지는 종래의 핵산 중합효소(Top DNA polymerase, 5unit)를 함유한 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리시킨 결과이다.
도 2는 ddNTP에 대한 친화도가 높은 핵산 중합효소(Tfi mutant DNA polymerase, 5unit)를 함유한 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리시킨 결과이다.
도 3은 ddNTP에 대한 친화도가 낮은 핵산 중합효소(Thermo Sequenase, 5 unit)를 함유한 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리시킨 결과이다.
도 4는 ddNTP에 대한 친화도가 상이한 3종의 핵산 중합효소(도 1, 도 2, 도 3에서 사용된 효소)를 각각 2unit, 2unit, 1unit씩 동시에 함유하는 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리시킨 결과이다.
도 5는 ddNTP에 대한 친화도가 상이한 2종의 핵산 중합효소(도 2, 도 3에서 사용된 효소)를 각각 2.5 unit씩 동시에 함유하는 혼합물을 사용하여 생성시킨 상보 핵산 절편을 전기영동으로 분리시킨 결과이다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법 및 키트를 사용하면 10내지 1,000 염기쌍을 갖는 핵산의 염기 서열을 용이하게 분석할 수 있어서 1회의 염기 서열 분석을 통하여 종래의 방법에 비해 더욱 장쇄의 핵산 염기 서열을 분석할 수 있다.
Claims (24)
- 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에 있어서,dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만인 중합효소와 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하는 중합효소를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물들을 제조하는 단계;상기 혼합물에 염기 서열을 분석하고자 하는 핵산과 프라이머를 첨가하여 상보 핵산 절편들을 생성시키는 단계; 그리고,상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리하여 말단에 결합된 염기를 분석하여 상기 핵산의 염기서열을 인식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 혼합물들이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 1,000배 이하인 중합효소와 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 5,000배 이상인 중합효소를 함유하는 것들임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 혼합물들이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 0.5 배 이하인 중합효소와 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 8,000배 이상인 중합효소를 함유하는 것들임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 혼합물들이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배인 중합효소를 추가로 더 포함하는 것들임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 혼합물들이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 1,000배 내지 5,000배인 중합효소를 추가로 더 포함하는 것들임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 혼합물들이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 0.5배 내지 8,000배인 중합효소를 추가로 더 포함하는 것들임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들을 분자량 순서대로 분리함에 있어서 전기영동법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 상보 핵산 절편들의 말단에 결합된 염기를 분석함에 있어서 은 염색법을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 방법.
- 완충용액, 안정화제, dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 ddATP 및 중합효소가 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 ddGTP 및 중합효소가 채워진 밀폐용기; 완충용액, 안정화제, dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 ddCTP 및 중합효소가 채워진 밀폐용기와 완충용액, 안정화제, dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 ddTTP 및 중합효소가 채워진 밀폐용기들로 이루어진 핵산 서열 분석 키트에 있어서,상기 중합효소가 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배 미만인 중합효소와 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배를 초과하는 중합효소 혼합물로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
- 제 19항에 있어서, 상기 중합효소가 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 1,000배 이하인 중합효소와 5,000배 이상인 중합효소의 혼합물로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
- 제 19항에 있어서, 상기 중합효소가 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 0.5 배 이하인 중합효소와 8,000배 이상인 중합효소 혼합물로 이루어진 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
- 제 19항에 있어서, 상기 중합효소 혼합물이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 3,000배인 중합효소를 추가로 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
- 제 20항에 있어서, 상기 중합효소 혼합물이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 1,000배 내지 5,000배인 중합효소를 추가로 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
- 제 21항에 있어서, 상기 중합효소 혼합물이 dNTP에 대한 친화도가 ddNTP에 대한 친화도에 비하여 0.5배 내지 8,000배인 중합효소를 추가로 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 분석 키트.
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