KR100425924B1

KR100425924B1 - 표고버섯 균사체 배양액으로부터 균체외 고분자 물질의생산방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR100425924B1
Application number: KR10-2001-0004116A
Authority: KR
Inventors: 윤종원; 송치현; 이광무; 이상철
Original assignee: 종근당건강 주식회사; 송치현; 윤종원
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2001-01-29
Publication date: 2004-04-03
Also published as: KR20010106150A

Abstract

본 발명은 표고버섯(Lentinus edodes) 균사체 배양액으로부터 균체외 고분자 물질(Exo-polymer)의 생산방법 및 그 용도에 관한 것으로 표고버섯 균사체를 감자 덱스트로스 브로스에 접종하고 pH 4∼7, 온도 20∼30℃에서 1vvm의 속도로 공기를 공급하면서 50∼150rpm으로 교반하여 5∼10일간 액체배양 다음 상기 배양액을 5,000∼15,000×g로 10∼30분간 원심분리한 후 상층액을 에탄올 처리하여 침전물을 획득하고 동결건조한 다음 증류수에 용해한 후 원심분리하고 투석함으로써 분리한 균체외 고분자 물질인 수용성 다당류는 당 37.3%, 단백질 5.3% 및 미확인 물질 57.5%로 조성된 글리코펩타이드로써 스트렙토조토신(streptozotocin)에 의해 당뇨병이 유도된 랫트(diabeitc rats)에 투여시 혈중 포도당, 총콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

표고버섯 균사체 배양액으로부터 균체외 고분자 물질의 생산방법 및 그 용도 {A process for preparation of exo-polymers from submerged mycelial culture of Lentinus edodes and the use of the same}

본 발명은 표고버섯 균사체의 배양액으로부터 균체외 고분자 물질의 생산방법 및 그 용도에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 본 발명은 표고버섯 균사체를 최적조건에서 액체배양하여 상층액을 획득하고 에탄올 처리함으로써 균체외 고분자 물질인 수용성 다당류를 생산하는 방법 및 상기 균체외 고분자 물질의 혈당강하제 및 혈중지질강하제로써의 용도에 관한 것이다.

Chihara 등[Chihara, G., Maeda, Y., Hamuro, J., Sasaki, T., and Fukuoka, F., Nature, 17, 687-688(1969)]이 표고버섯 균사체(Lentinus edodes)의 항암활성을 보고한 이래 표고버섯 균사체의 다른 질병들에 대한 다양한 효과가 입증되었고[kabir, Y., Yamaguchi, M., and Kimura, S.,J. Nutr. Sci. Vitaminol., 33, 341-346 (1987); Kaneda, T., and Tokuda, S.,J. Nutr. Rep. Int., 26, 167-173 (1966); Jeong, H., Lee, J. W., and Lee, K. H.,Kor. J. Mycol.18, 145-148 (1990); Lee, J. W., Chung, C.H., Jeong, H., and Lee, K. H.,Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 6, 571-577 (1990)] 오랜 기간 동안 내복약으로 사용되었다. 표고버섯 균사체의 혈당강화효과는 김 등[Kim, M.Y., Park, M.H., and Kim, G.H.,J. Kor. Nutr., 30, 743-750 (1997)]에 의해 보고되었으며 이들은 쥐의 혈장내 혈중 포도당과 중성지방함량을 감소시킴을 입증하였다. 또한, Kiho등[Kiho, T., Sobue, S., and Ukai, S.,Carbohydr. Res.251, 81-87(1994)]은 아그로시브 실린드라세(Agrocybe cylindracea), 트레멜라 푸시폼스 (Tremella fucifomes), 코리뎁스 신엔시스(Cordyceps sinensis) 및 페스탈로티옵시스 속(Pestalotiopsissp.) 과 같은 다양한 버섯들의 혈당강하 효과를 보고하였다.

Hikino 등[Hikino, H., Ishiyama, M., Suzuki, Y. and Konno, C.,Planta medica., 55, 423-428(1989)]은 가노더르마 루시둠(Ganoderma lucidum) 균사체의 열수 추출물과 에탄올 추출물의 혈당강하효과를 보고하였다. 윤 등은[Yuan, Z. M., He, P. M., Cui J. H., and Takeuchi, H.,Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 1898-1903(1998)] 아우리쿠라리아 속(Auricularia auricula-judaeQuel) 균주의 자실체로부터 획득한 수용성 다당체의 혈당강하 효과에 대해 연구한 바 있다.

그러나, 상기와 같은 고분자 물질들은 모두 균사체 또는 자실체로부터 획득한 균체내 고분자 물질(endo-polymer)이다. 최근에 균사체 또는 자실체가 아닌 균사체의 액체 배양물로부터 획득한 생체활성(bioactive)을 지닌 균체외 고분자 물질에 대한 연구가 진행되고 있다. 이는 배양액으로부터 균체외 고분자 물질을 생산하는 것이 정제공정을 간편화할 수 있기 때문이다. 그러나, 지금까지 표고버섯 균사체로부터 분리한 다양한 생체활성 성분이 많이 연구 되고있으나 표고버섯 균사체에 의해 생산되는 혈당강하 및 혈중지질강하 효과가 있는 균체외 고분자 물질에 대해서는 연구된바가 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 표고버섯 균사체를 배양한 후 배양액을 원심분리하여 상층액을 획득하고 에탄올 처리하여 균체외 고분자 물질을 획득한 다음 당뇨가 유발된 랫트에 투여하여 혈당강하 효과를 확인하고 표고버섯 균사체의 균체외 고분자 물질의 생산을 위한 최적 배양조건을 확립한 후 상기 본 발명 수용성 다당류의 당과 단백질 함량을 조사함으로써 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 표고버섯 균사체의 액체 배양물로부터 균체외 고분자 물질의 생산방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균체외 고분자 물질의 혈당강하제 및 혈중지질강하제로써의 신규한 용도를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 표고버섯 균사체를 종균배양한 다음 플라스크 또는 발효기에서 배양한 후 배양액을 원심분리하여 상층액을 획득하고 에탄올 처리함으로써 스트렙토조토신에 의해 당뇨가 유발된 랫트에 농도별로 투여하여 혈당강하 효과를 확인하고 표고버섯 균사체의 균체외 고분자 물질의 생산을 위한 최적조건을 확립한 후 상기 본 발명 수용성 다당류의 당과 단백질 함량을 조사함으로써 달성하였다.

도 1은 본 발명 표고버섯 균사체의 액체 배양액으로부터 균체외 고분자 물질의 획득방법을 도시한 개략도이다.

도 2는 본 발명 표고버섯 균사체로부터 분리한 균체외고분자 물질의 당뇨가 유발된 랫트에서 혈장 포도당 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명 표고버섯 균사체의 플라스크 배양시 균사체 성장과 균체외 고분자 물질의 생산에 미치는 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명 표고버섯 균사체의 플라스크 배양시 균사체 성장과 균체외 고분자 물질의 생산에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프이다.

도 5는 5L 발효기에서 표고버섯 균사체의 배양시 시간의 경과에 따른 균사체와 균체외고분자 물질의 생산을 나타낸 그래프이다.

본 발명은표고버섯 균사체의 종균을 배양한 다음 균질화하여 접종원을 제조하고 감자 덱스트로스 브로스가 들어있는 5L 발효기에 접종하여 최종부피를 3L로 조절하고 배지내 pH 5, 배양온도 25℃에서 공기공급속도를 1vvm으로 하여 100rpm으로 교반하면서 10일간 액체배양한 후 배양액을 원심분리하여 상층액을 획득하고 에탄올 처리하여 침전물을 획득한 다음 투석하여 수용성 다당류를 분리하는 단계; 상기 단계의 수용성 다당류를 스트렙토조토신으로 당뇨가 유도된 랫트에 농도별로 투여하여 사료섭취량, 체중변화, 혈장내 포도당 농도, 콜레스테롤 농도, 중성지방, GPT 및 GOT 함량을 효소-키트로 분석하는 단계; 표고버섯 균사체(Lentinus edodes)를 감자 덱스트로스 브로스 200mL가 들어있는 500mL 플라스크에 접종하여 배지의 pH 및 배양온도를 달리하고 120rpm으로 교반하면서 25일간 배양하고 균사체 성장과 균체외 고분자 물질의 생성을 조사함으로써 최적배양조건을 확립하는 단계:상기 단계에서 생산한 균체외 고분자 물질의 당과 단백질 함량을 로우리법과 기체크로마토그래피로 분석하는 단계로 구성된다.

상기 단계에서 표고버섯 균사체의 종균배양은 감자 덱스트로스 브로스에 접종하여 100∼150rpm으로 교반하면서 5∼15일간 배양하였다.

상기 단계에서 본배양시 종균의 접종량은 0.5∼2.0%로 하였다.

본 발명 표고버섯 균사체의 최적 배양조건은 5L 발효기에서 배양시 최종 배양액 부피를 3L로 조절하고 온도 20∼30℃, pH 4.0∼7.0에서 50∼150rpm으로 교반하면서 10∼30일간 배양하였으며 바람직하게는 온도 20∼25℃, pH 4.5∼5.5조절하였다.

상기 단계에서 표고버섯 균사체 액체배양액은 5,000∼15,000×g로 10∼30분간 원심분리하여 상층액을 획득하였으며 바람직하게는 10,000∼11,000×g로 15∼25분간 원심분리하였다.

상기 단계에서 배양액으로부터 획득한 상층액에 상층액 부피의 3∼5배의 에탄올을 처리하여 침전물을 획득하고 침전물을 동결건조한 후 증류수에 용해하여 투석함으로써 균체외 고분자 물질을 제조하였다.

상기 단계에서 균사체 배양시 사용한 배지는 미국 Difco사에서 구입하여 사용하였으며 당뇨유발을 위하여 사용한 스트렙토조토신(STZ)는 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.

혈중 포도당, 중성지방, 콜레스테롤, GPT 및 GOT 측정은 Asan Pharm. Co. Ltd.(한국)에서 구입한 효소-키트를 사용하였다

아미노산 분석은 아미노산분석기(Pharmacia Biotech. Ltd., Model:Biochrom 20)을 사용하였고 나트륨 형태의 이온교환수지(Pharmacia Biotech, No 3906)를 사용하였다.

당분석은 모세관 컬럼(Supelco Inc.)이 장착된 기체크로마토그래피(Varian Co., Gas Chromatography 3600)를 사용하였다.

동물실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며 그룹의 평균은 던컨 다중검사 시험에 의해 비교하여 p<0.05수준에서 유의성을 검증하였다.

본 발명에서 사용한 표고버섯 균사체(Lentinus edodes)는 시드니 대학 미생물학과의 K. Y. Cho로부터 분양받아 감자 덱스트로스 아가 슬랜트에 접종하여 4℃에서 보관하였으며 3개월마다 계대배양(subculture)하였다.

본 발명에서 사용한 실험동물은 한국 화학연구소로부터 스프라그-도레이 (Spargue-Dawley) 웅성 랫트를 공급받아 사용하였다. 동물실험실의 온도는 22±2℃, 습도 55±5%로 유지하였으며 12시간 간격으로 명암조절하였다. 사료는 표준사료(삼양사, 한국)를 급여하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만,본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 표고버섯 균사체의 배양 및 수용성 다당류의 분리

표고버섯 균사체의 액체 배양물로부터 균체외 고분자 물질인 수용성 다당류를 분리하기 위하여 균주를 접종하였다. 균주의 접종은 송 등[Song, C. H., Cho, K. Y., and Nair, N. G.,Mycologia, 79, 866-876 (1987)]의 방법을 사용하였으며 표고버섯 균사체의 종균배양은 감자 덱스트로스 브로스에 균사체를 접종하고 25℃에서 120rpm으로 교반하면서 10일간 배양하였다. 배양이 완료되면 균사체 펠렛(pellet)이 포함된 배양액 50mL를 얼음 수욕에서 3분간 믹서(sorvall omni-mixer)로 균질화하였다. 상기 균사체 현탁액 1%(v/v)를 본 실시예의 접종원으로 사용하였다. 표고버섯 균사체의 액체배양은 500mL 플라스크와 5L 발효기를 사용하여 배양하였다. 플라스크 배양시에는 120rpm으로 교반하면서 14∼30일간 배양하였고 5L 발효기 배양은 배양부피를 3 L로 하고 교반속도 100rpm, 공기공급속도 1vvm, pH 5로 조절하면서 25℃에서 배양하였다. 배양액은 10,447×g에서 20분간 원심분리하여 획득하였으며 상기 상층액에 상층액 부피의 4배의 에탄올을 처리하여 침전물을 획득하고 동결건조 후 10mg/mL의 농도로 증류수에 용해하고 10,447×g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 획득한 다음 투석함으로써 수용성 다당류를 분리하였다. 액체배양액으로부터 균체외 고분자 물질 및 균사체 획득방법은 도 1에 도시하였다.

실시예 2: 본 발명 수용성 다당류의 혈당강하 효과 및 혈중지질강하 효과 조사

상기 실시예 1에서 제조한 본 발명 수용성 다당류의 혈당강하 효과를 조사하였다. 실험동물로 사용한 랫트는 스트렙토조토신을 근육 주사한 다음 5일 후에 소변에서의 포도당 양성반응에 의해 당뇨가 유발되었음을 확인하고 인슐린 의존형 당뇨(insulin dependent diabetes mellitus) 모델로 사용하였다. 각 그룹의 랫트에 대조구로서 셀라인(saline)을 투여하였고 실험구로 균체외 고분자 물질을 7일간 50∼200mg/체중kg으로 경구투여한 다음 에테르 마취에 의해 치사시켰다. 사료섭취량과 체중은 매일 기록하였다.

상기 대조군 그룹과 실험군 그룹의 혈액시료를 채취하고 1,100×g에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장내 포도당, 콜레스테롤, 중성지방, 글루타믹 피부릭 트랜스아미나제(GPT) 및 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(GOT)함량을 효소-키트(enzymatic-kit)로 분석하였다.

실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 균체외 고분자물질(이하 EPs)을 각기 다른 농도로 급여한 랫트의 체중은 약간 증가하였으나 대조군 식이 그룹에 비해 유의적인 차이가 없었다. EPs를 급여한 5그룹의 사료 섭취율 또한 대조군 그룹에 비해 유의적인 차이가 없었다. 일반적으로, 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 당뇨랫트는 체중이 감소하며 혈당강하 처리를 하였을 때 회복되었다. 모든 그룹의 체중은 약간 증가하였고 EPs의 경구투여가 전반적인 행동양식에 변화를 주지 않았고 사망한 동물도 없었다. 따라서, EPs의 경구투여는 랫트에 무해함을 알 수 있었다.

본 발명 표고버섯 균사체의 균체외 고분자 물질의 투여에 따른 STZ 유도된 당뇨 랫트의 사료섭취율과 체중변화

그룹	사료섭취율(g/day)	체중증가량(g/week)
대조군(셀라인급여)	25.20±6.51^NS	18.99±6.46^NS
50mg/kg	23.27±5.74	21.45±7.76
100mg/kg	19.28±5.72	22.74±6.48
150mg/kg	20.89±5.62	24.67±8.36
200mg/kg	20.39±5.43	22.49±7.44
〔주〕평균±표준편차(n=8)NS: 유의성없음

표고버섯 균사체의 균체외 고분자 물질(EPs)가 당뇨랫트의 혈장 포도당, 중성지방 및 총 콜레스테롤 농도에 미치는 영향을 셀라인(saline)을 급여한 대조군 랫트와 비교 조사한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 랫트에 100mg/체중kg을 투여한 경우 혈중 포도당 농도가 가장 많이 감소하였는데 대조군에 비해 20% 감소하였다.

EPs의 투여농도를 150mg/체중kg 또는 200mg/체중kg으로 증가시켰을 때 부가적인 영향은 나타나지 않았다. 표고버섯 균사체의 균체외 고분자 물질의 혈당강하효과는 췌장 β-세포의 기능을 EPs가 교정하였기 때문이라고 사료된다. 스트렙토조토신 처리는 췌장샘의 β-세포를 선택적으로 파괴함으로써 인슐린 분비를 억제한다. 표고버섯의 EPS는 췌장의 β-세포의 손상을 회복시키고 인슐린 생성을 촉진시키므로 혈장내 포도당 농도를 감소켰으리라 추정된다. Gray와 Flat[Gray, A. M., Flatt, P. R.,J. Endocrinol., 157, 259-266(1998)]의 아가리쿠스 캠페스트리스 (Agaricus campestris) 수용성 추출물에 대한 연구는 상기 추정을 뒷받침해 준다. 즉, 버섯의 수용성 추출물은 스트렙토조토신을 복강투여한 마우스에서 2-디옥시글루코스 전이(2-deoxyglucose transport), 글루코스 옥시데이션(glucose oxidation) 및 글루코스에서 글리코겐으로의 합성을 촉진하며 또한, BRIN-BD11 췌장 세포주의 인슐린 분비를 촉진한다고 한다. Kiho 등은 페스탈로티옵시스 속(Pestalo- tiopsissp.)의 균체외 다당류의 경구투여에 의한 혈당강하 효과를 조사한 결과 100mg/체중kg 투여한 후에 48시간까지 포도당 농도가 유의적으로 감소함을 관찰하였으나, 투여량이 고농도인데 비해 낮은 혈당강하 효과를 보이는 단점이 있다.

본 실시예에서 혈중 중성지방과 총 콜레스테롤 농도는 표 2에 나타낸바와 같이 본 발명 EPs를 당뇨 랫트에 200mg/체중kg의 농도로 투여하였을 때 대조군에 비해 각각 44.5%, 25.1%로 유의적으로 감소하였다. EPs 200mg 이상은 EPs가 점도가 높기 때문에 용매부피의 한계로 인해 조사하지 못하였다.

본 발명 표고버섯 균체외 고분자물질의 투여에 따른 STZ로 유도된 당뇨 랫트의 혈장내 중성지방과 총콜레스테롤 함량 변화

그룹	중성지방(mg/dL)	총 콜레스테롤함량(mg/dL)
대조군(셀라인 투여)	105.79±4.00^d)	100.12±4.55^b)
50m/kg	91.12±7.07^c)	80.87±3.91^a)
100mg/kg	74.02±3.84^b)	86.06±3.22^a)
150mg/kg	73.28±3.46^b)	82.73±4.80^a)
200mg/kg	58.68±2.91^a)	75.00±4.69^a)
〔주〕평균±표준편차(n=8)같은 줄안의 각기 다른 문자는 던컨다중검정시험법에 의해 유의적 차이를 나타냄(p<0.05)

혈장 중성지방과 콜레스테롤은 당뇨 랫트에 있어서 당뇨정도와 관련이 있다.자유지방산의 증가와 지단백 리파아제(LPL) 활성의 감소는 결과적으로 혈액내 혈장의 중성지방과 VLDL(very low density lipoprotein)의 농도를 조사함으로써 알수 있다. 간으로부터 혈장안으로의 VLDL의 분비와 LPL의 활성으로 인한 말초세포에서의 제거는 인슐린에 의해 조절된다. 스트렙토조토신을 처리한 당뇨 랫트에 있어서 저농도의 인슐린은 LPL 기능에 영향을 주고 중성지방이 고농도가 되도록 한다. EPs는 인슐린 생성을 촉진함으로써 LPL을 유도하고 혈장 중성지방을 감소시킨다. 혈장내 중성지방을 감소시킴으로써 EPs는 혈장내 총 콜레스테롤을 감소시킬 수 있다. 간 효소인 HMG-CoA 환원효소 억제제의 활성의 감소로 인해 콜레스테롤의 간내 생합성을 억제함으로서 콜레스테롤 강하 효과가 있게된다. HMG-CoA 환원효소 억제제로써 켐팩틴과 메비오린과 같은 몇가지 약물의 효과는 상기 주장을 뒷받침해준다. 이와 같은 약은 HMG-CoA 환원효소를 억제하고 LDL 수용기의 합성을 증가시킴으로써 혈장 콜레스테롤을 감소시킨다. 따라서, 표고버섯 균사체의 EPs도 상기와 같은 역할을 함으로써 혈장 총 콜레스테롤을 감소시킬 수 있다. EPs에 의한 혈당강하와 지질강하효과는 또 다른 면에서 설명될 수 있는데 장내 점착성을 증가시킴으로써 효율적인 흡수를 위한 장내 융모로의 영양분 이동을 감소시켜 혈장 포도당, 중성지방 및 콜레스테롤을 감소시킨다. 이와 같은 EPs의 효과는 구아검 또는 펙틴과 같은 수용성 식이섬유소의 점착성과 비교할 수 있다.

한편, GOT와 GPT는 독성물질, 간경변, 간염 및 간암과 같은 간내 대사변화에 의해 증가된다. GOT와 GPT는 간손상의 정도를 측정할 수 있는 표식으로 사용되어 왔다. 본 발명에서 혈장내 고농도의 중성지방과 콜레스테롤은 스트렙토조토신에 의해 간접적으로 또는 혈장 포도당의 증가로 인해 직접적으로 간에 손상이 입혀 간기능을 저해한다. 따라서, 각각 다른 EPs 농도에 따른 GOT/GPT 값은 혈장 포도당 농도와 관련이 있다. 본 발명 표고버섯 EPs의 투여에 따른 GOT, GPT활성은 표 3에 나타낸 바와 같으며 EPs를 100mg/체중kg 투여했을 때 GOT, GPT활성이 가장 낮았다.

본 발명 표고버섯 균사체 균체외 고분자 물질의 투여에 따른 STZ로 유도된 당뇨 랫트의 혈장내 GPT와 GOT변화

그룹	GPT(Karmen Unit: IU/L)	GOT(Karmen Unit: IU/L)
대조군(셀라인 투여)	212.26±4.01^b)	268.77±3.75^c)
50mg/kg	195.05±3.63^a)	262.43±2.04^c)
100mg/kg	188.05±3.17^a)	240.13±4.71^a)
150mg/kg	190.16±2.47^a)	251.66±3.58^b)
200mg/kg	195.57±2.82^a)	262.48±2.26^c)
〔주〕평균±표준편차(n=8)같은 줄안의 각기 다른 문자는 던컨다중검정시험법에 의해 유의적 차이를 나타냄(p<0.05)

실시예 3: 표고버섯 균사체의 최적 배양조건의 확립

표고버섯 균사체의 최적 배양조건을 확립하기 위하여 균사체 성장과 EPs 생산을 위한 최적 pH와 온도를 조사하였다. 균사체는 500mL 배양 플라스크에 배양 부피를 200mL로 하여 120rpm으로 교반하면서 25일간 배양하였다. pH를 최적화하기 위하여 배지의 pH를 멸균하기 전에 3.0∼8.0으로 조절하여 25℃에서 배양하였다. 또한, 표고버섯 균사체의 최적 배양 온도를 결정하기 위하여 배지의 pH를 5로 유지하고 균사체 배양온도를 20∼35℃의 범위로 조절하였다. 배양 후 획득한 EPs와 균사체를 동결건조하고 건조중량을 결정하였다.

실험 결과, 도 3에 나타낸바와 같이 표고버섯 균사체(L.edodes)는 산성뿐만 아니라 중성 pH인 pH 7에서도 성장하였으며 pH 5.0일 때 균사체 성장(건조 균사체 농도: 7.97g/L)과 EPs(건조 EPs 농도:3.20g/L)의 생산이 최대로 나타났다.

온도의 영향은 도 4에 나타낸 바와 같이 균사체 성장은 30℃에서 배양할 때 최대로 나타나 건조균사체 농도가 8.87g/L였으며 EPs 생산은 20℃에서 배양할 때 최대로 나타나 건조 EPs 농도가 2.22g/L였다. 20℃이하의 온도에서는 균사체의 성장이 감소하였고 EPs 생산도 감소하였다.

EPs의 축적형태를 조사하기 위하여 5L 발효기에서 표고버섯 균사체를 배양하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이 최대 균사체 수율은 정지기에 들어서기 전인 18일에 도달하였으며 EPs 축적은 계속 되어 배양 24일에 최대값이 되었다. 일반적으로 미생물에 의한 세포표면의 EPs의 축적은 대수기 동안 이루어지고 정지기에 이르면 방출된다고 알려져 있다. 액체배양중의 균사체 성장속도와 더블링 타임(dubling time)은 각각 0.012h^-1, 55.67h였다. 표고버섯 균사체의 배양액으로부터 EPs는 배양종료일인 24일에 건조중량으로 2.8g/L 생산되었다. 배양 27일후 부터는 EPs 생산이 점차적으로 감소하였다. 상기와 같이 생산물이 감소한 이유로는 Haug과 Larsen[Haug, A., and Larsen, B.,Carbohydr. Res., 17, 297-308(1971)]에 의하면 가수분해효소의 생산으로 인하여 생산물인 EPs가 가수분해되었기 때문이라고 사료된다.

실시예 4: 본 발명 균체외 고분자 물질인 수용성 다당류의 당과 단백질 함량을 분석

상기 실시예 3에서 제조한 본 발명 균체외 고분자 물질의 당과 단백질 함량을 분석하였다. 총 단백질은 로우리[Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, L., and Rindall, R. J.,J. Biol. Chem., 193, 256(1951)]법으로 분석하였으며 표준물질로는 소 혈청 알부민을 사용하였다. 아미노산 조성은 121℃, 24시간동안 밀폐된 튜브에 6M 트리플루오로아세트산을 첨가하여 가수분해시킨 다음 아미노산 분석기(Pharmacia Biotech. Ltd., Model: Biochrom 20)로 분석하였다. 아미노산 분석기는 이온 교환 수지가 충진된 고속 나트륨형태(high performance Na-form)의 내경 4.6mm×길이 200mm이며 압력은 56.1kg_f/cm², 온도 48∼89℃ 구배로 하였다. 총 탄수화물 함량은 표준물질로 포도당과 갈락토오즈(1:1, w/w)를 사용하여 페놀황산방법에 의해 분석하였다. 요산(uronic acid)함량은 표준물질로써 갈락토우론산을 사용하여 m-하이드록시디페닐 방법[Blumenkrantz, N., and Asboe-Hansen, G.,Anal. Biochem., 54, 484(1973)]으로 분석하였다. 액체배양액으로부터 분리한 정제하지 않은 다당류는 Jones과 Albersheim의 방법[Jones, T. M., and Albersheim, P. O.,Plant Physiol., 49, 926 (1972)]으로 가수분해하고 아세틸화하였다.

당 성분은 기체크로마토그래피(Varian Co., Gas Chromatography 3600)로 분석하였다. 분석 조건으로는 컬럼은 길이 30m×내경 0.25mm의 퓨즈드 실리카 캐피랄리 컬럼(Supelco Inc.)을 사용하였고 검출기는 FID(flame ionization detector)을 사용하였다. 온도는 260℃로 조절하였고 운반기체는 질소(15psi), 수소(15psi)를 사용하였다. 머무름시간(retention time)은 30분 이였으며 주입은 등온형태(isothermal)로 하였다.

실험 결과, 표 4와 표 5에 나타낸바와 같이 표고버섯 균사체의 균체외 고분자물질은 단백질이 5.36%, 탄수화물 37.3% 및 미지물질 57.5%로 분석되었다. EPs의 단백질은 트레오닌, 세린, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 발린 및 루신과 같은 주요한 아미노산 17종류로 구성되어 있었다. EPs의 탄수화물은 만노스 42.6%, 포도당 34.6%, 갈락토오스 11.5%, 과당 3.4%, 리보스 4.3%, 아라비노스 2.5% 및 자일로스 1.0%로 구성되어 있는 당과 단백질의 글리코펩타이드 형태임을 알 수 있었다. 총 요산 함량은 5.2%였다.

본 발명 표고버섯 균사체의 균체외 고분자물질의 아미노산조성

아미노산	조성(%)
아스파르트산	1.78
트레오닌	12.88
세린	12.31
글루타민산	9.87
프롤린	2.49
글리신	10.49
알라닌	9.32
시스테인	1.45
발린	7.30
메티오닌	2.22
이소루신	4.43
루신	7.05
티로신	1.87
페닐알라닌	5.25
히스티딘	1.47
리신	6.13
알기닌	2.67

당	조성(%)
만노스	42.64
갈락토스	11.51
포도당	34.57
과당	3.43
리보스	4.32
아라비노스	2.49
자일로스	1.04

Kiho 등 [Kiho, T., Itahashi, S., Sakushima, M., Matsunga, T., Usui, S., Ukai, S., Mori, H., Sakamoto, H., and Ishiguro, Y.,Biol. Pharm. Bull., 20, 118-121(1997)]은 페스탈로티옵시스 속(Pestalotiopsissp.)으로부터 혈당 강하 균체외 고분자물질이 갈락토오스와 만노스가 1:9의 몰 비율로 조성되어 있는 분지형갈락토만난으로 구성되어 있음을 언급한 바 있다. 반면 Cheung [Cheung, P.C.K.,Nutr. Res., 16, 1953-1957 (1996)]은 균체외 다당류가 β-글루칸 형태임을 보고하였다. 본 발명자들은 EPs의 분석을 통해 몇가지 단백질을 검출하였으나 Kiho등이나 Cheung은 혈당강하능이 있는 발효액 분획 중에서 어떠한 단백질도 검출하지 못했다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 표고버섯 균사체의 최적배양조건을 확립함으로써 액체 배양액으로부터 균체외 고분자 물질을 제공하는 효과가 있으며 글리코펩타이드를 유효성분으로 함유한 표고버섯 균체외 고분자 물질은 당뇨가 유발된 랫트에서 혈중 포도당, 총콜레스테롤 및 중성지방을 강하시키는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

(a) 표고버섯 균사체를 감자 덱스트로스 브로스에 접종하고 25℃에서 100∼150rpm으로 교반하면서 5∼15일간 종균 배양하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 종균 배양액을 얼음 수욕상에서 균질화하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 균질화한 종균 0.5∼2.0%를 5L 발효기에 접종하여 최종배양액 부피를 3L로 조절하고 공기공급속도 1vvm, pH 4∼7, 온도 20∼30℃에서 50∼150rpm으로 교반하면서 10∼30일간 배양하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 배양액을 5,000∼15,000×g로 10∼30분간 원심분리하여 상층액을 분리하는 단계;

(e) 상기 (d)단계의 상층액에 상층액 부피의 3∼5배의 에탄올을 처리하여 침전물을 획득하고 증류수에 용해한 다음 5,000∼15,000×g로 10∼30분간 원심분리하여 상층액을 획득하고 투석하여 수용성 다당류를 분리하는 단계로 결합됨을 특징으로 하는 표고버섯 균사체의 액체 배양물로부터 균체외 고분자 물질의 생산방법.
제 1항 기재의 방법에 의해 생산되고 균체외 고분자 물질로서 글리코펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈당강하제용 또는 혈중지질강하제용 조성물.